段培养的二倍体苗不同的植株(檀香三倍体，如图2);经茎尖染色体压片计数的方法，再次鉴定具细长叶片的苗为三倍体植株(图3)。
[0030]实施例2:
[0031]檀香三倍体植株的诱导方法，包括以下的步骤:
[0032](I)外植体选择及其消毒
[0033]采取华南植物园引种栽培20年龄檀香(Santalum album L.)的成熟鲜果，手工剥掉果肉，蒸馏水冲洗干净种子，然后将种子在超净工作台上先用体积分数75%酒精水溶液浸泡消毒lmin，再用质量分数0.1% HgCl溶液浸泡消毒12min，无菌蒸馏水冲洗5遍，最后将消毒后的种子置于超净工作台上的无菌滤纸上吹干。
[0034](2)种子预处理
[0035]无菌条件下用500mg/L的无菌赤霉素水溶液浸泡预处理种子20h，处理后的种子于超净工作台上用无菌水冲洗5遍，接着将其置于无菌滤纸上，用锋利的无菌手术刀片剥掉坚硬的外种皮，余下种子待用。
[0036](3)种胚诱导培养
[0037]诱导培养基，配方为每升含有6-BA 0.2mg、蔗糖20g、琼脂7.5g，余量为MS培养基，pH 5.5。按照上述配方，将其组份混合均匀后，调pH 5.5。再在每瓶中灌装诱导培养基25ml，灭菌备用。将步骤(2)剥去外种皮的种子(余下种子)接种至诱导培养基上，5粒/瓶，共30瓶，置于光照强度40 μ mo I m 2S S光照时间16h/d，培养温度(26±2°C )进行培养，培养4周，外植体可见绿色的芽点，继续培养I周，再继代培养于相同的培养基(诱导培养基)中诱导不定芽的分化与生长出无根幼苗，培养条件为光照强度40 μπιο? HT2s'光照时间16h/d，培养温度(26±2°C )。
[0038](4)多倍体的筛选与鉴定
[0039]当诱导出来的无根幼苗长高至4cm左右时，以檀香体外茎段培养的二倍体苗为对照，通过形态学观察比较初步筛选出与檀香体外茎段培养的二倍体苗不同的植株；经茎尖染色体压片计数的方法，再次鉴定具细长叶片的苗为三倍体植株。
[0040]实施例3:
[0041]檀香三倍体植株的诱导方法，包括以下的步骤:
[0042](I)外植体选择及其消毒
[0043]采取华南植物园引种栽培20年龄檀香(Santalum album L.)的成熟鲜果，手工剥掉果肉，蒸馏水冲洗干净种子，然后将种子在超净工作台上先用体积分数75%酒精水溶液浸泡消毒lmin，再用质量分数0.1% HgCl溶液浸泡消毒12min，无菌蒸馏水冲洗5遍，最后将消毒后的种子置于超净工作台上的无菌滤纸上吹干。
[0044](2)种子预处理
[0045]无菌条件下用400mg/L的无菌赤霉素水溶液浸泡预处理种子22h，处理后的种子于超净工作台上用无菌水冲洗4遍，接着将其置于无菌滤纸上，用锋利的无菌手术刀片剥掉坚硬的外种皮，余下种子待用。
[0046](3)种胚诱导培养
[0047]诱导培养基，配方为每升含有6-BA 0.3mg、蔗糖25g、琼脂7.5g，余量为MS培养基，pH 5.8。按照上述配方，将其组份混合均匀后，调pH 5.8。再在每瓶中灌装诱导培养基25ml，灭菌备用。将步骤(2)剥去外种皮的种子(余下种子)接种至诱导培养基上，5粒/瓶，共30瓶，置于光照强度40 μ mol πΓΥ1，光照时间12h/d，培养温度(26±2°C)进行培养，培养4周，外植体可见绿色的芽点，继续培养I周，再继代培养于相同的培养基(诱导培养基)中诱导不定芽的分化与生长出无根幼苗，培养条件为光照强度40 μπιο? HT2s'光照时间12h/d，培养温度(26±2°C )。
[0048](4)多倍体的筛选与鉴定
[0049]当诱导出来的无根幼苗长高至4cm左右时，以檀香体外茎段培养的二倍体苗为对照，通过形态学观察比较初步筛选出与檀香体外茎段培养的二倍体苗不同的植株；经茎尖染色体压片计数的方法，再次鉴定具细长叶片的苗为三倍体植株。
【主权项】
1.一种檀香三倍体植株的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤: 将檀香(Santalum album L.)成熟种子消毒后，在无菌条件下用250?500mg/L的赤霉素水溶液浸泡消毒后的檀香种子20?24h，然后取出种子用无菌蒸馏水冲洗，接着剥掉外种皮，余下种子接种至诱导培养基上，置于光照强度40?50 μ mo I nT2s4，光照时间12?16h/d，培养温度26±2°C进行培养，诱导出不定芽，不定芽接种至相同的诱导培养基上，置于光照强度40?50 μ mo I m 2S \光照时间12?16h/d，培养温度26±2°C进行继代培养，诱导不定芽分化与生长，然后进行多倍体筛选与鉴定获得檀香三倍体植株； 所述的诱导培养基每升含有6-BA 0.2?0.5mg、蔗糖20?30g和常量的琼脂，余量为MS 培养基，pH 5.5-5.8。
2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的消毒为将檀香种子在无菌条件下先用体积分数75%酒精水溶液浸泡消毒lmin，再用质量分数0.1% HgCl溶液浸泡消毒12min，无菌蒸饱水冲洗3_5遍。
3.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的取出种子用无菌蒸馏水冲洗，其冲洗次数为3?5次。
4.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的多倍体筛选与鉴定是诱导出的不定芽进行分化和生长出无根幼苗，无根幼苗长高至3?4cm时，以檀香体外茎段培养的二倍体苗作为对照，通过形态学观察比较初步筛选出与檀香体外茎段培养的二倍体苗不同的植株，经茎尖染色体压片计数的方法，再次鉴定具细长叶片的苗为三倍体植株。
【专利摘要】本发明公开了一种檀香三倍体植株的诱导方法。它是将檀香成熟种子消毒后，在无菌条件下用250～500mg/L的赤霉素水溶液浸泡消毒后的檀香种子20～24h，然后取出种子用无菌蒸馏水冲洗，接着剥掉外种皮，余下种子接种至诱导培养基上，置于光照强度40～50μmol m-2s-1，光照时间12～16h/d，培养温度26±2℃进行培养，诱导出不定芽，不定芽接种至相同的诱导培养基上，置于光照强度40～50μmol m-2s-1，光照时间12～16h/d，培养温度26±2℃进行继代培养，诱导不定芽分化与生长，然后进行多倍体筛选与鉴定获得檀香三倍体植株。本发明通过诱导檀香种子成三倍体植株，为进行檀香多倍体加倍研究，获得优良的檀香新品种，发展檀香产业提供有效技术途径之一。本发明具有操作简单易行，应用价值高等优点。
【IPC分类】A01H1-08, A01H4-00
【公开号】CN104585038
【申请号】CN201510058720
【发明人】张新华, 胡秀, 熊友华, 刘念, 马国华
【申请人】中国科学院华南植物园, 仲恺农业工程学院
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年2月4日