一种用秋水仙素诱导玉米孤雌生殖的处理方法
【技术领域】
[0001]本发明属于玉米育种技术领域，特别是一种玉米自交系的选育方法。
【背景技术】
[0002]选育玉米自交系的常规方法，育成一个自交系至少需要经过7代以上的连续自交，对于遗传背景复杂的材料甚至要10代以上。为了加快自交系的选育速度，缩短育种周期和提高纯度，国内外通常采用的方法主要有:
1.秋水仙素诱导法
在玉米吐丝期，用秋水仙素作为染色体加倍处理剂处理花丝，使其不经过双受精而是通过孤雌生殖直接产生纯合的二倍体种子。
[0003]秋水仙素是常用的染色体加倍处理剂，其突出优点是诱导率高，因此在教学和科研中被广泛使用。然而，尽管秋水仙素诱导玉米孤雌生殖已是一种成熟的玉米自交系选育技术。但是该方法存在的两大问题，使其难以在育种上规模化应用:
一是安全问题。秋水仙素属于剧毒试剂，致癌性强。为了尽量避免与人体接触，现有技术均采取涂抹花丝或向花丝注射的方法。但涂抹时极易造成刮碰和药液滴落，注射时由于花丝间的空隙很小，用量难以掌握，极易造成药液溢出和流淌。因此，对人体健康威胁很大。
[0004]二是花粉污染问题。处理时，即使在严格的套袋条件下操作，或遮挡，或避开散粉时间，但花粉污染问题仍很严重，产生大量假种子，特别是在海南气候条件下。
[0005]此外，由于花丝生长紧密，注射时对药液的容纳量很少，一部分花丝不容易接触到药液；又由于花丝亲水性差，涂抹时不容易附着，难以达到理想的处理效果；为了保证安全，操作要求极其严格。因此，处理动作谨慎，速度慢、效率低，也是造成不能规模化应用的原因。
[0006]2.诱导法
用遗传诱导系Stock 6给被诱导的对象授粉，诱导玉米产生单倍体种子。之后再用秋水仙素等染色体加倍处理剂将其加倍成二倍体植株。此方法被认为是目前世界上最先进的方法。然而，仍存在以下问题:
(1)诱导产生的单倍体种子，需要利用标记性状对整个穗子上的种子逐粒进行筛选，从中挑选出通过诱导产生的单倍体种子，淘汰双受精种子。因此，工作量大、效率低、人工挑选枯燥乏味，难以实现机械化；
(2)对于一部分诱导对象，由于遗传背景、成熟度、籽粒形状、果皮厚度、籽粒着生位置等原因，还存在显色效果不佳甚至不显色的问题，因此难以辨认；
(3)用Stock6诱导产生的单倍体种子须再经过染色体加倍才能成为正常的二倍体，而加倍过程繁琐、且加倍率较低；
(4)在利用秋水仙素进行染色体加倍时，处理后的废液属于剧毒、致癌物质，需要严格的无害化处理；
(5)使用Stock6遗传诱导方法，需要人工授粉来完成。为了使诱导系与被诱导对象的花期相遇，要进行错期播种，调节父、母本的开花时间。但是，往往由于试验材料对光、温的反应不同，或因土壤、肥力差异等原因，容易发生花期不遇。
[0007]3.其他的试剂诱导法
用低毒的具有诱导染色体加倍作用的其他化学试剂如氟乐灵等处理花丝，诱导孤雌生殖直接产生二倍体种子。与Stock 6诱导法相比，具有对人畜安全、方法简单、操作容易、成本低、效率高等优点。
[0008]但是，与秋水仙素相比，这些试剂的诱导率相对较低，因此需要加大处理数量。工作量较大，成本提高。
【发明内容】
[0009]本发明要解决的技术问题是:(I)安全使用秋水仙素处理剂。既要利用秋水仙素高诱导率的优势，又要在操作方法上解决现有方法存在的安全问题；(2)解决化学诱导现有方法中普遍存在的花粉污染率高、假种子多的问题；(3)简化处理程序，使操作简单、易于规模化应用；(4)同时提高诱导率，减少药剂用量。
[0010]本发明采用的技术方案如下:
1.诱导剂配制
配制常规的秋水仙素(COL)诱导剂，或以秋水仙素为主与二甲基亚砜(DMSO)、青鲜素(MH)复配而成的诱导剂。
[0011]2.诱导前果穗处理
在吐丝前对雌穗套袋；待花丝完全吐出时摘掉纸袋，在雌穗花苞由顶部向下接近雌穗幼穗的位置横向切掉部分花苞。呈现中间是花丝，周围是苞叶的圆形断面；用弧形刻刀在断面上切掉一截花丝，切割的深度为8 — 15mm，做到既切掉花丝又不切漏周围的苞叶，即在断面上形成深度为8— 15mm的空洞。
[0012]3.注入诱导剂
为防止药剂与人体接触，将诱导剂装入封闭严密的器具如移液枪或注射器。之后向空洞内注入诱导剂，充满且药液覆盖或润湿整个断面为止。最后将纸袋套回，完成处理过程。
[0013]由于花粉遇到处理液后会因吸收药液而膨胀死亡，断面上即使有花粉落入也不会造成任何污染。因此，彻底解决了花粉污染问题，确保种子真实可靠。处理时，不需要密封、遮挡或隔离，整个过程在完全开放条件下自由操作。
[0014]4.收获与繁殖
种子成熟时收获，即得到基因型纯合的二倍体种子；下一季播种，套袋自交，根据表型进行真伪和优劣鉴定，选择优良植株，得到单穗。并可以其作父本在此代提前测配；将收获的果穗继续播种下一代，种成穗行，根据植株、果穗、籽粒等性状的一致性鉴别出纯合穗行，选择符合育种目标的穗行收获，即获得纯合的玉米自交系。可在此代进行大量测配。
[0015]本发明的积极效果如下:
1.解决了使用秋水仙素的安全问题
采用横断面挖洞施药，避免了现有技术由于涂抹时导致的刮碰和药液滴落，注射时的药液溢出、流淌等对人体健康造成的威胁。
[0016]2.解决了现有技术的花粉污染问题由于处理液淹没了全部花丝的顶部及覆盖整个切面，即使有花粉飘落也会由于花粉遇到处理液后吸水而膨胀死亡，彻底解决了现有技术中难以解决的花粉污染问题。
[0017]3.可在完全开放条件下自由操作
诱导处理时不需要在套袋、遮挡、空间隔离区或时间隔离条件，可以在完全开放条件下和在任何时间里自由操作。
[0018]4.适合规模化应用
由于使用安全、程序简便、操作简单容易，并且不受隔离区限制，因此可规模化应用。
[0019]5.诱导率提高
既利用了秋水仙素诱导率高的优势，又保证所有花丝都能与药液接触，还使药液停留时间延长，因而诱导率提尚。
[0020]6.节省药液
药液集中，且不流淌浪费。现有的秋水仙处理技术一般每穗需药液2ml左右，而此方法仅需Iml左右，可节省药液50%左右，降低了用药成本。
[0021]7.程序简单
直接形成二倍体种子。与Stock 6诱导单倍体技术相比，一是不需要染色体加倍过程；二是不需要当代种子鉴别；三是不存在种子鉴别困难等问题。
[0022]8.选育速度快
比常规玉米自交系选育方法的选育周期缩短5代以上。由于可确保诱导结籽的真实性以及诱导第一代植株能正常散粉，因此从诱导第一代开始就可以其作父本进行提前测配，杂交种选育速度比Stock 6诱导单倍体技术还要提前I代。
【具体实施方式】
[0023]实施例1
(I)配制诱导剂
将秋水仙素(COL)用水稀释成0.1%浓度的诱导剂。
[0024](2)选择处理试材
处理对象为玉米杂交种“辽单565”。
[0025](3)诱导前果穗处理
吐丝前对雌穗套袋。当花丝完全吐出后摘下纸袋，在雌穗花苞由顶部向下接近雌穗幼穗的