一种异源四倍体棉花的人工合成方法及其遗传分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及棉花遗传育种领域，具体涉及一种人工控制条件下的异源四倍体棉花 的人工合成方法，及该异源四倍体棉花遗传分析方法。
【背景技术】
[0002] 棉属（Gossypium)有51个种，其中46个为二倍体棉种（2n= 2X= 26)，5个为异 源四倍体棉种（2n= 4X= 52)分别为陆地棉（G.hirsutum，[AD] 1)、海岛棉（G.barbadense， [AD]2)、夏威夷棉（G.tomentosum, [AD]3)、黄褐棉（G.mustillinum, [AD]4)和达尔文棉 (G.darwinii, [AD]5) 〇
[0003] 长期以来，自然界中5个棉属异源四倍体种的供体种问题一直是棉属起源和进化 争论的热点。棉属异源多倍体也一直是研究多倍体中重复基因和重复基因组进化的良好 材料，为了进一步探讨异源四倍体棉种的起源和基因组进化机理，目前最有效最明了的探 索方法是将棉属异源四倍体棉种可能的A、D染色体组供体种，二倍染色体A组棉种草棉、 亚洲棉和二倍染色体D组棉种雷蒙德氏棉、瑟伯氏棉、旱地棉等进行远缘杂交，然后将杂种 Fl(AD)进行染色体加倍人工合成异源四倍体种质（AADD)，进一步与自然界已有的5个异源 四倍体棉种进行形态学、细胞遗传学和基因组学比较研究（SSR或SNP)，探索物种起源过程 中的遗传变化规律和新物种形成后存活、进化和基因组互作机理。同时也为异源四倍体棉 种基因组进化提供理论依据，为棉花育种提1?宝贵的中间材料。
[0004] 而目前四倍体棉花受到地域、气候等因素的限制，不能在其他地域进行生长，或繁 殖，导致优质棉花不能被大量推广，且使用成本高。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供异源四倍体棉花的人工合成方法，及 该异源四倍体棉花的遗传分析方法，克服异源四倍体棉花生长地域问题，同时为棉花起源 研究、育种生广提供宝贵素材。
[0006] 本发明为实现上述目的所采用的技术方案为：
[0007] -种异源四倍体棉花的人工合成方法，其包括以下步骤：
[0008] (1)预备供体材料：所述的供体材料包括为棉属染色体A组的棉种，及为棉属染色 体D组的棉种；
[0009] (2)在控制气候条件下对供体材料进行长期不间断直系纯化，进行单铃多代直系 纯化育种：在年平均温度为22. 5?25. 6°C，温度范围在10?35°C，年光照时数1780? 2600小时，太阳总辐射量4500?5800兆焦耳/平方米，年降水量1500?2500毫米，温 度-湿度指数65?70,光合有效辐射2100?2600MJ/m2的环境条件下，对供体材料进行一 年内3代以上单铃繁殖，经生长发育并结果后，待第一个铃吐絮时采摘，然后继续种植，以 此类推，并在繁殖过程把混杂株、变异株去除，经20?30代种植纯化后，留取高纯植株；
[0010] (3)对供体材料进行定株编码宿根保存；
[0011] (4)将分别对所获得的多代纯化后的A组、D组供体材料，通过远缘杂交得到Fl 代；
[0012] (5)以清晰稳定的父本特异性条带为判断依据，对各杂交后代进行真伪性鉴定，进 行遗传分析，鉴定为真的保留；
[0013] (6)将鉴定为真的Fl代通过人工诱变方法，进行基因突变处理；经筛选后，所得到 的杂交植株或杂交种子，即为AD杂交异源四倍体棉花。
[0014] 在步骤2)的棉花纯化育种种植过程中，还包括套袋保护作业的步骤：
[0015] 21)在棉花育苗期进行套袋保苗，该袋为聚乙烯、防老化剂和抗紫外线剂按重量比 为100 : 1 : 0.5的混合材料，经拉丝织造的筛网袋，保护棉花苗株免受风、雨、病、虫害及 鼠害，同时防止幼苗被强烈的阳光紫外线灼伤，无需喷洒农药以避免其对棉种纯度造成影 响；
[0016] 22)在棉花花蕾期进行套袋保铃，该保铃袋为无纺布制成并在开口处设有绑绳，将 棉铃套入袋中后扎紧绑绳，保护棉铃免受风、雨、病、虫害及鼠害，无需喷洒农药以避免其对 棉种纯度造成影响。
[0017] 所述步骤（3)具体包括：
[0018] (31)种植棉花当年：按照播种期、种植密度和栽培管理方法进行栽培和管理；
[0019] (32)种植棉花第二季及以后：萌发新芽后，选留健壮芽培育成侧枝，并及时去除 赘芽；夏季打顶、修剪和抹除赘芽；冬季进行棉田中耕、培土并重施有机肥；
[0020] (33)对于不能收到种子的材料或即将衰老的植株，通过取嫩芽嫁接繁殖保存。
[0021] 所述步骤（4)具体包括：以经过纯化的棉属染色体A组的棉种为母本，以经过纯化 的棉属染色体D组的棉种为父本，进行种间杂交，并获得杂种；
[0022] 所述步骤（6)包括：
[0023] (61)对杂种Fl代进行种植培育；
[0024] (；62)用秋水仙碱水溶液，进行染色体加倍诱变；
[0025] (63)经筛选后得到异源四倍体棉花。
[0026] 所述种间杂交具体包括：用镊子去雄，授粉后用"小指"轻轻地在柱头周围敲打，助 推花粉粒与柱头加快且充分接触，节省识别时间进而减少外界环境的影响，提高成铃率。
[0027] 所述步骤（62)具体包括：
[0028] (621)对于获得种子数量极少的Fl代，或不可育的Fl代，待长出侧芽后，取侧芽进 行嫁接扩繁，并用〇. 3?0. 5%秋水仙碱水溶液，处理生长点2X12小时，进行生长点染色体 加倍诱变；
[0029] (622)对于获得种子数量较多的Fl代，用0. 05?0. 5 %的秋水仙碱水溶液，直接 对杂种浸泡12?24小时，进行染色体加倍诱变。
[0030] 对于获得种子数量较多的杂种Fl代，直接进行种子侵泡染色体加倍诱变。留取少 部分种子播种植苗，取大部分种子在25°C的黑暗环境中用0. 05?0. 5%的秋水仙碱水溶液 浸泡12?24小时，诱变种子播种营养钵中置于25°C的黑暗环境发芽，待第一片真叶平展后 搬至室外荫棚下，不可暴晒，温度控制在28°C，一天清水一天低浓度叶面肥喷晒促进植株生 长。
[0031]对于获得种子数量极少的杂种Fl代，须进行生长点染色体加倍诱变。待长出侧芽 后，取侧芽进行嫁接扩繁，待嫁接苗长高20-30cm后，切取顶端生长点继续嫁接扩繁，切除 原株生长点后加强水肥管理，待侧芽长有Icm后进行自然干旱，处缺水状态时，在25°C的黑 暗环境中用〇. 3?0. 5%秋水仙碱水溶液侵泡侧芽6?12小时，诱变植株置于室外荫棚下， 不可暴晒，温度控制在28°C，一天清水一天低浓度叶面肥喷晒促进植株生长。先干旱再泡药 目的是使苗吸收药液效果更佳。
[0032] 根据所述方法合成的异源四倍体棉花的遗传分析方法，其包括以下步骤：
[0033] (I)对杂交后的杂种Fl代进行培育，对Fl代的叶片进行形态学分析，初步判断是 否为杂株，杂株则保留，纯株则剔除；
[0034] (II)对Fl代获得种子较多的杂株种子，通过直接对种子进行染色体加倍诱变，然 后对加倍诱变结果采用形态学和细胞学进行观察分析，然后分别取亲本、杂种嫩叶，提取基 因组gDNA，并测量基因组的浓度和纯度；
[0035] 预备SSR引物，筛选出条带清晰、多态性好的SSR引物；
[0036] 用SSR引物对父本进行聚合酶链式反应PCR扩增，筛选出具有父本特异性条带的 引物，作为杂种鉴定的引物；
[0037] 以清晰稳定的父本特异性条带为判断依据，对各杂交后代进行真伪性鉴定，鉴定 为真的杂株则保留；
[0038] (III)对不可育的Fl代，