在rin基因中具有非转基因改变的番茄植物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物生物技术和植物育种的领域。本发明提供了包含具有ー个或多个 突变的rin等位基因的番爺（SolanumIycopersicum)植物，所述突变导致产生与野生型 Rin蛋白相比具有降低的活性的突变rin蛋白。本发明提供了植物，与野生型Rin等位基因 纯合型番茄植物相比，所述植物的果实显示出更慢的果实成熟和/或更长的贮藏期。另外， 本发明提供了本发明的番茄植物的番茄果实、种子、花粉、植物部分和后代。本发明还提供 了本发明的植物果实的食品和食品产品。
[0002] 本发明还提供了内源性rin基因和由所述基因编码的rin蛋白，具有至少ー个人 エ诱导的非转基因突变。
[0003] 在另ー个实施方案中，本文提供了用来制备在其基因组中含有一个或多个突变 rin等位基因的番茄植物的方法。
【背景技术】
[0004] 番茄的育种的目的在于产生被最佳地改造为适于生长和贮藏条件的商业品种。育 种者面临的挑战是在收获后的果实硬度与消费者对味道质感和顔色的需求之间寻找ー种 改进的平衡。这些消费者的需求与果实成熟密切相关。果实成熟是ー个复杂的发育过程，负 责将含种子的器官转化成能吸引种子传播者（seeddispenser)和农业消费者的组织。和 果实成熟相关的变化--尤其是收获后软化--限制了新鲜番茄的贮藏期。
[0005] 对于番茄果实的生长和发育，可看出如下许多连续的阶段：花发育、授粉、接着发 生特征为高频率的细胞分裂的早期果实发育，而且所述果实的大小快速増大，这主要是由 于细胞扩增。在第三阶段结束吋，果实达到了绿熟期。在第四阶段期间，发生了果实成熟， 其由顔色和味道以及果实硬度和质感的变化来表征。
[0006] 番茄红素和胡萝卜素的累积导致了番茄果实的特征性红色的形成。一般而言，可 区分不同的着色阶段：绿熟期（maturegreen)、破色期（breaker)、粉红期（pink)和红熟期 (red)。在破色期阶段，开始了典型的红色色素沉积。红熟阶段或红熟收获果实阶段是这样 的阶段，其中所述果实在其主要部分上都达到了成熟的顔色。
[0007] 除了所述颜色改变，在果实成熟过程中，酶活性导致细胞壁的中间层状区域发生 降解，该降解导致表现为果实软化和果实质感丧失的细胞松弛。经常果实软化的測量方 式为对压缩的外部抵抗力，这可通过例如果实硬度计（penetrometer)或食品质地测定计 (texturometer)(例如，Instron3342SingleColumnTestingSystem)进行量化。
[0008] 对已知參与成熟的单个基因的修饰还没有获得正常成熟但具有最小的组织软化 的果实。
[0009]MADS-盒转录因子-成熟抑制子（RipeningInhibitor,Rin)是番爺果实成熟 的必需调节子，但是其影响成熟相关基因的表达的确切机制仍然不清楚。除了编码其调节 不受乙烯影响的必需因子外，所述Rin基因还编码触发跃变呼吸以及成熟相关的乙烯生物 合成所必需的基因调节组件。唯一报道的rin基因座中的突变是在育种系中自发地产生 (R.RobinsonandM.Tomes,Rep.TomatoGenet.Coop.I8,36 (I%8))。所述纯合的;rin突变 (rin/rin)有效阻碍了成熟过程并产生了绿色/黄色番茄果实，该绿色/黄色番茄果实不会 产生升高的乙烯水平并且也不会响应于外源乙烯而成熟。rin等位基因杂合型番茄在一段 延长的时期内保持硬实并成熟，使得能够进行エ业规模的处理以及扩大的递送和储藏机会 (Vrebalovetal，Science296,343-346(2002))。
[0010] 由于这类突变在纯合时会导致成熟几乎完全停止，因此其仅能以杂合的形式用于 商业，使得能够发生较慢的成熟。但是，在所述突变体中杂合果实的味道发育和顔色不是最 佳的。因此，本发明的目的是鉴定突变的rin等位基因，所述突变的rin等位基因导致了延 迟的成熟和/或更长的贮藏期，而不会对果实质量、顔色和消费者需求产生所述负面影响。 由于所述突变等位基因编码具有降低的功能的突变rin蛋白（与现有rin突变体的完全功 能丧失不同），因此这类等位基因可以杂合形式和纯合形式导致番茄果实成熟。
【发明内容】
[0011] 因此，本发明的目的是产生和鉴定番茄种的栽培植物，所述栽培植物的果实具有 延迟的成熟和/或延长的收获后贮藏期，而对果实质量、顔色和消费者需求没有不良效应 或具有可接受的不良效应。
[0012] 因此，本发明涉及包含具有一个或多个突变的rin等位基因的番茄种的栽培植 物，所述突变导致产生与野生型Rin蛋白相比具有降低的活性的突变rin蛋白，但是当所述 突变等位基因以杂合或纯合形式存在吋，该突变rin蛋白含有足够的功能以使番茄果实成 熟到红熟阶段。
[0013] 一般性定义
[0014]术语"核酸序列"（或核酸分子）是指单链或双链形式的DNA或RNA分子，尤其是 编码本发明的蛋白质或蛋白质片段的DNA。"分离的核酸序列"是指这样的核酸序列，即其 不再处于分离出其的天然环境中，例如，在细菌宿主细胞中或者在植物细胞核或质体基因 组中的核酸序列。
[0015] 术语"蛋白质"或"多肽"可互換使用并且指的是由氨基酸链组成的分子，不管具 体的作用模式、大小、三维结构或来源。因此，Rin蛋白的"片段"或"部分"也可被称为"蛋 白质"。"分离的蛋白质"用于指不再处于其天然环境中的蛋白质，例如在体外或者在重组的 细菌或植物宿主细胞中。
[0016] 术语"基因"意指含有可操作地连接到适合的调节区（例如，启动子）的区（转录 区）--其在细胞中被转录成为RNA分子（例如mRNA或RNAi分子）--的DNA序列。因 此，基因可包含数个可操作地连接的序列，例如，启动子、含有例如參与转录起始的序列的 5'前导序列、（蛋白质）编码区域（cDNA或基因组DNA)和含有例如转录终止位点的3'非 翻译序列。基因可以是外源基因（在原来的种中）或是嵌合基因（例如，转基因或同源转 基因（cisgene)) 〇
[0017] "基因的表达"是指在其中可操作地连接至合适的调节区（尤其是启动子）的DNA 区被转录成RNA的过程，所述RNA具有生物学活性，S卩，其能够被翻译成有生物学活性的蛋 白质或多肽（或活性肽片段）或其本身具有活性（例如，在转录后基因沉默或RNAi中）。 所述编码序列可以是有义方向的并编码所需的、有生物学活性的蛋白质或多肽、或活性肽 片段。
[0018] "活性蛋白质"或"功能性蛋白质"是具有体外（例如通过体外活性測定）和/或 体内（例如通过所述蛋白赋予的表型）可测量的蛋白质活性的蛋白质。"野生型"蛋白质 是指野生型植物中存在的完全功能性蛋白质。本文的"突变蛋白质"是在编码所述蛋白质 的核酸序列中含有一种或多种突变的蛋白质，其中所述突变导致（所述突变核酸分子编码 的）"功能降低"或"功能丧失"的蛋白，例如在体内测量的，例如通过所述突变等位基因赋 予的表型测量的。
[0019] "功能降低的rin蛋白"或"活性降低的rin蛋白"是指突变rin蛋白，当编码所述 突变蛋白的等位基因以纯合形式存在于番茄植物中时，所述突变rin蛋白仍然能使果实成 熟发生到红熟阶段。这类功能降低的rin蛋白可通过"部分敲除突变rin等位基因"（例 如，在其核酸序列中含有一个或多个突变的野生型Rin等位基因）的翻译来获得。在一方 面，所述部分敲除突变rin等位基因是野生型Rin等位基因，其包含优选地导致rin蛋白产 生的突变，在所述rin蛋白中至少ー个保守的和/或功能性氨基酸被置换成另一个氨基酸， 以使得生物学活性显著降低但不会完全消失。所述部分敲除突变rin等位基因也可能编码 显性负性rin蛋白，该蛋白能够对相同细胞内的其他Rin蛋白的生物活性产生不利影响。 所述显性负性rin蛋白可以是这样的rin蛋白，即所述蛋白仍然能够同野生型Rin蛋白一 样与相同的元件相互作用但是阻断了其功能的ー些方面。显性负性rin蛋白的实例为如下 的rin蛋白：其缺少对于激活和/或二聚化的关键的激活结构域和/或二聚化结构域或特 定的氨基酸残基，或者在所述激活结构域和/或二聚化结构域或特定的氨基酸残基中具有 修饰，但是仍然包含DNA结合结构域以使得不仅它们自身的生物学活性被降低或消失，而 且它们还通过与细胞中存在的的野生型蛋白和/或部分敲除rin蛋白竞争DNA结合位点来 降低细胞内的总rin活性。突变等位基因可能是"天然突变"等位基因（天然存在的突变 等位基因，例如，没有人工应用诱变剂的情况下而自发产生的）或是"诱导突变"等位基因 (其是由人工干扰诱导的，例如，通过诱变）。
[0020] "功能丧失的：Tin蛋白"是指突变rin蛋白，当编码所述突变蛋白的等位基因以 纯合形式存在于番茄植物中时（例如现有技术中存在的已有rin突变（其记载于例如 Vrebalovetal.2002,Science296:343-346；Itoetal. , 2008,PlantJ. 55:212-223 ； Marteletal.2011，PlantPhysiol157:1568-1579;并且AccessionLA3754 也具有现有 技术的rin/rin，其可从TGRC，TomatoGeneticsResourceCentre中获得），所述突变rin 蛋白无法使果实成熟发生到红熟阶段。
[0021] 编码蛋白质的核酸分子中的"突变"是与野生型序列相比的一个或多个核苷酸的 改变，例如通过置换、缺失或插入ー个或多个核苷酸。"点突变"是单个核苷酸的置換，或单 个核苷酸的插入或缺失。
[0022] "无义"突变是编码蛋白质的核酸序列中的（点）突变，由此ー个密码子变为终止 密码子。这导致在mRNA中存在提前终止密码子并导致截短的蛋白质。截短的蛋白质可能 具有降低的功能或失去功能。
[0023] "错义"或非同义突变是编码蛋白质的核酸序列中的（点）突变，由此ー个密码子 变为编码不同的氨基酸。所产生的蛋白可能具有降低的功能或失去功能。
[0024] "剪切位点"突变是编码蛋白质的核酸序列中的突变，由此前mRNA(pre-mRNA)的 RNA剪切被改变，产生了具有与野生型不同的核苷酸序列的mRNA和具有与野生型不同的氨 基酸序列的蛋白质。所产生的蛋白可能具有降低的功能或失去功能。
[0025] "移码"突变是编码蛋白质的核酸序列中的突变，由此mRNA的读码框被改变，产生 了不同的氨基酸序列。所产生的蛋白可能具有降低的功能或失去功能。
[0026] 调节序列中（例如基因的启动子中）的突变是例如通过置换、缺失或插入ー个或 多个核苷酸造成的与野生型序列相比的一个或多个核苷酸的改变，从而导致例如产生降低 的或不产生所述基因的mRNA转录产物。
[0027] "沉默"是指靶基因或基因家族的基因表达的下调或完全抑制。
[0028] 基因沉默方法中的"靶基因"是当嵌合沉默基因（或"嵌合RNAi基因"）被表达时 并且例如产生沉默RNA转录产物（例如，能够沉默内源性靶基因表达的dsRNA或发卡RNA) 时，其内源性基因表达被下调或被完全抑制（沉默）的基因或基因家族（或基因的ー个或 多个具体等位基因）。在诱变方法中，靶基因是待突变的内源性基因，导致了基因表达的改 变（降低或丧失）或所编码的蛋白质功能的改变（降低或丧失）。
[0029] 如本文使用的，术语"可操作地连接"是指处于功能性关系中的多聚核苷酸元件 的连接。当ー种核酸与另ー核酸序列置于功能性关系中时，该核酸被"可操作地连接"。例 如，如果启动子（或者更确切地说是转录调控序列）影响了编码序列的转录，则该启动子与 所述编码序列可操作地连接。可操作地连接意指所连接的DNA序列通常是相邻的，并且当 需要连接两种蛋白质编码区时所连接的DNA序列是邻近的且处于读码框中以产生"嵌合蛋 白"。"嵌合蛋白"或"杂合蛋白"是由不同的蛋白"结构域"（或基序）组成的蛋白，所述蛋 白本身不是天然存在的，但是连接后形成了显示了被连接的结构域的功能的功能性蛋白。 嵌合蛋白质也可以是天然存在的两个或多个蛋白质的融合蛋白。
[0030] 术语"食品"是被消耗以给机体提供营养支持的任何物质。通常，其是植物或动物 来源，并包括必需营养物质（例如，碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素、或矿物质）。所述物 质被生物体摄取并被生物体细胞吸收以努力产生能量、維持生命、或激发生长。术语食品包 括被消耗以给人类和动物机体提供营养支持的物质。
[0031] 术语"贮藏期"或"收获后贮藏期"是指在果实被认为不适合出售或食用（'坏的'） 之前给予果实的（平均）时间长度。贮藏期是产品能被储藏的时间段，在该时期内所定义的 具体比例货物的质量在预期的分配、储藏和展示的条件下仍然是可接受的。贮藏期受以下 几个因素影响：光和热的暴露、气体的传送（包括湿度）、机械应力、和例如微生物的污染。 通常围绕所述果实的硬度/柔软度參数对产品质量进行数学建模。可将贮藏期定义为植物 株系的果实开始变坏并且不适合出售或食用时所花费的（平均）时间，例如从植物的第一 果实进入破色期或转色期（turningstage)开始或从第一果实完全变红开始或从收获时开 始。在一个实施方案中，本发明的突变体具有比野生型植物的贮藏期显著更长的贮藏期，例 如，当植物在相同的条件下生长和果实被用相同的方式处理并在相同的条件下保存吋，从 第一果实处于破色期（或转色期、粉红期、红熟期或从收获时起）直到其开始变'坏'并且不 适合出售或食用的天数是显著更长的，例如，比对照植物（例如野生型Rin/Rin植物）的果 实的贮藏期长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天。因此，为了确定从特定阶段（例如， 从破色期或后期阶段）到变'坏'阶段所需要的天数，例如，可将野生型对照植物（在和突 变植物相同的条件下生长的并处于相同的发育阶段）的第一果实进入特定阶段（例如，破 色期或后期阶段）的那天认为是起点（第一天），从这天起果实被定期观察（以特定时间间 隔，例如1、2、3、4、5、或6天以后）直到第一果实经过完全成熟阶段并变'坏'的那天（如视 觉上和/或通过评估果实柔软度可測定的）（參见实施例）。
[0032] 在本申请中，与词语"贮藏期"结合使用的词语"改善的"、"増加的"、"更长的"和 "延长的"被互換使用并且所有都意指本发明番茄植