而产生截短的蛋白。
[0133] 还提供了编码功能降低的rin蛋白的核酸序列（基因组DNA、cDNA、RNA)，所述蛋 白例如如上文所定义的SEQIDN0:2、3或4中描述的rin蛋白或其变体（包括任何嵌合 或杂合蛋白、突变蛋白或截短蛋白）。由于遗传密码的简并性，不同的核酸序列可编码相 同的氨基酸序列。所提供的核酸序列包括天然存在的、人工或合成的核酸序列。在SEQID N0:5 (野生型cDNA，栽培种AilsaCraig的序列，Science2002,vol296,pp343,Genbank AF448522)和SEQIDN0:9(番茄栽培种Heinz1706的基因组序列，具有的内含子和外显子 如之前所述）中提供了编码Rin的核酸序列。
[0134] 可以理解，当序列以DNA序列显示时，也涉及RNA，RNA分子的实际碱基序列是相同 的，差异在于胸腺嘧啶（T)被尿嘧啶（U)置換。当本文提到核苷酸序列（例如DNA或RNA) 时，使用斜体，例如rin等位基因，而当本文提到蛋白时，不使用斜体，例如;rin蛋白。突变 体用小写字母（例如rin等位基因或rin蛋白），而野生型/功能性形式以大写字母开头 (Rin等位基因或Rin蛋白）。
[0135] 还提供了编码突变rin蛋白（即如上文所述的功能降低的rin蛋白）的核酸序列 (基因组DNA、cDNA、RNA)，以及含有所述突变体序列的植物和植物部分。例如，在野生型 Rin编码序列上含有一个或多个无义和/或错义突变的rin核酸序列，使得所编码的蛋白 在体内功能降低。还提供了带有其他突变的序列，例如剪切位点突变体（即导致前mRNA异 常剪切的基因组rin序列上的突变）、和/或移码突变、和/或ー个或多个核酸的插入（例 如，转座子插入）和/或缺失。
[0136] 很显然，可使用很多方法来鉴定、合成或分离rin核酸序列的变体或片段，所述方 法例如核酸杂交、PCR技术、计算机分析和核酸合成等。SEQIDN0:9的变体既可编码野生 型、功能性Rin蛋白，也可编码所述蛋白的任一种的功能降低的突变等位基因（例如通过例 如诱变产生的和/或通过方法例如TILLING或EcoTILLING或其他方法鉴定的）。
[0137]可将本发明的植物用于传统的植物育种方案中以产生更多的具有相同特征的植 物，或者用来将所述突变rin等位基因引入到相同或相近植物物种的其他植物株系或品种 中。
[0138]可通过本领域中已知的植物转化和再生技术使用本发明的突变rin核苷酸序列 来产生转基因植物。可选择"良种事件"（eliteevent)，其为将所述嵌合基因（包含与编 码功能降低的rin蛋白的核苷酸序列可操作地连接的启动子）插入到基因组中的具体位点 并且所述插入导致所需表型的良好表达的转化事件。
[0139] 如上所述的本发明的植物是突变rin等位基因的纯合型或杂合型的。为了产生含 有杂合形式的突变等位基因的植物，可使用自交。可通过传统的育种技术（例如杂交、自 交、回交等）将本发明的突变rin等位基因转移到任何其他番茄植物中。因此，可产生任何 类型的由于本发明的至少ー个突变rin等位基因的存在而具有延迟的成熟和/或更长的贮 藏期的番茄。可产生和/或鉴定在其基因组中含有至少ー个突变rin等位基因并产生与野 生型Rin蛋白相比具有降低的活性的rin蛋白的任何番茄。因此，所述番茄植物可以是任 何栽培番茄、任何商业品种、任何育种系等，其可以是确定的或不确定的、自由授粉的或杂 交的，可产生具有任何顔色、形状和大小的果实。可通过育种（与含有突变等位基因的植物 杂交并接着选择含有所述突变等位基因的后代）容易地将在具体的番茄植株中或在番茄 的性相容近缘种中产生和/或鉴定的突变等位基因转移到任何其他的番茄植株中。
[0140]可从表型上和/或使用分子工具来确定在任何番茄植物或植物部分中的本发明 的突变rin等位基因的存在或不存在和/或所述等位基因到植物后代的遗传（例如，使用 直接或间接的方法检测rin核苷酸或rin蛋白的存在或不存在）。
[0141]在一个实施方案中，在栽培植物中产生或鉴定所述突变等位基因，但是也可在野 生植物或非栽培植物中产生和/或鉴定所述突变等位基因，然后使用例如杂交和选择（任 选地使用种间杂交与例如胚胎拯救来转移所述突变等位基因）将其转移到栽培植物中。因 此，可在番茄或其他茄属种中产生（使用诱变技术诱变所述靶rin基因或其变体的人工 诱导突变）和/或鉴定（自发的或天然的等位基因变异）突变rin等位基因，然后通过 常规育种技术将其转移到栽培的茄属植物例如番茄中，所述茄属物种包括例如番茄的野 生近缘种，例如契斯曼尼番爺、智利番爺、多毛番爺、克梅留斯基番爺、S.IycopersicumX S.peruvianum、多腺番爺（S.glandulosum)、多毛番爺、小花番爺（S.minutum)、小花番爺 (S.parviflorum)、潘那利番爺、秘鲁番爺、S.peruvianumvar.humifusum和细叶番爺。术 语"常规育种技木"在本文包括育种者已知的杂交、自交、选择、双单倍体产生、胚胎拯救、原 生质体融合、通过中间物种的转移等，即除了遗传修饰之外的可转移等位基因的方法。
[0142]在另ー个实施方案中，将含有突变rin等位基因的植物（例如番茄）与相同种或 相近种的另一植物杂交，以产生含有突变rin等位基因的杂交植物（杂交种子）。所述杂交 植物也是本发明的一个实施方案。
[0143]在一个实施方案中，提供了Fl代杂交番茄种子（S卩，可用于生长出Fl代杂交番茄 植物的种子），所述种子含有至少ー个本发明的rin等位基因。Fl代杂交种子是从两个近交 番茄亲本植株之间的杂交中收获的种子。所述Fl代杂种可包含本发明的一个或两个突变 rin等位基因。因此，在一个实施方案中，将本发明的植物用作亲本植物以产生Fl代杂种， 所述Fl代杂种的果实与野生型Rin/Rin植物相比具有延迟的成熟和/或更长的贮藏期。
[0144] 还提供了将突变rin等位基因转移到另ー植物的方法，所述方法包括提供在其基 因组中含有突变rin等位基因的植物，由此所述突变等位基因产生与野生型Rin等位基因 的纯合型番茄相比显示出更慢的果实成熟和/或更长的贮藏期的果实（如上所述），将所述 植物与另ー植物杂交并获得所述杂交的种子。任选地，可将从这些种子中获得的植物进ー 步自交和/或杂交，并选择这样的后代，即其含有所述突变等位基因且由于所述突变等位 基因的存在而产生与含有野生型Rin等位基因的植物相比具有延迟的成熟和/或更长的贮 藏期的果实。
[0145] 如所述，可以理解，其他诱变和/或选择方法可等同地用于产生本发明的突变 植物。例如可对种子进行辐射或化学处理以产生突变体群。也可使用rin的直接基因 测序来筛选诱变的植物群中的突变等位基因。例如，KeyPoint筛选是可用于鉴定含有 突变rin等位基因的植物的基于测序的方法（Rigolaetal.PloSOne,March2009,Vol 4(3) :e4761)。
[0146] 因此，提供了在果实中产生更低水平的野生型Rin蛋白的非转基因突变番茄植 物，或在果实中完全缺失野生型Rin蛋白和由于ー个或多个内源性rin等位基因中的ー个 或多个突变而在果实中产生功能降低的rin蛋白的非转基因突变番茄植物。可通过诱变方 法例如TILLING或其变型产生所述突变体，或者可通过EcoTILLING或任何其他方法鉴定所 述突变体。可将编码功能降低的rin蛋白的Rin等位基因分离并测序，或者可通过常规育 种方法将其转移到其他植物中。
[0147] 提供了所述植物或其后代的任意部分，包括基因组中含有本发明的突变rin等位 基因的收获的果实、收获的组织或器官、种子、花粉、花、子房等。还提供了其基因组中含有 突变rin等位基因的植物细胞培养物或植物组织培养物。优选地，所述植物细胞培养物或 植物组织培养物可再生为其基因组中含有突变rin等位基因的完整植物。本文还包括通过 对含有rin突变等位基因的单倍体细胞的染色体加倍产生的双单倍体植物（以及用于生长 出所述双单倍体植物的种子），和其基因组中含有突变rin等位基因的杂交植物（以及用于 生长出所述杂交植物的种子），由此所述双单倍体植物和杂交植物产生本发明的具有延迟 的成熟和/或更长的贮藏期的果实。
[0148] 优选地，所述突变植物还具有其他良好的农艺特征，即与野生型植物相比它们的 果实数目不减少和/或果实质量不降低。在一个优选的实施方案中，所述植物是番茄植株， 所述果实是番茄果实，例如具有任何形状、大小或顔色的加工的番茄、生鮮市场番茄。因此， 还提供了含有一个或两个突变rin等位基因的植物或植物部分的收获产品。所述产品包括 下游的经加工的产品，例如番茄糊、番茄酱、番茄汁、切开的番茄果实、灌装果实、干燥的果 实、去皮的果实等。可通过其基因组DNA中含有所述突变等位基因来鉴定所述产品。
[0149] 种子保藏
[0150] 实施例1的3种番茄TILLING突变体的代表性种子样本由NunhemsB.V.保藏并 根据布达佩斯条约按照ExpertSolution(EPC2000，Rule32(1))于2012年2月27日被 接受保藏在NCMBLtd(英国苏格兰阿伯丁郡AB21 9YA，巴克斯本，克莱伯斯通区，弗格森 大厦(FergusonBuilding,CraibstoneEstate,BucksburnAberdeen,ScotlandAB21 9 YA,UK))。种子被给予以下保藏号：NCMB41937 (突变体2558)、NCMB41938 (突变体5225) 和NCMB41939 (突变体 5996)。
[0151] 申请人要求，依据Rule32(1)EPC或具有类似条款和规章的国家或条约的相关法 规将所述生物材料及源自其的任何材料的样本只提供给指定的专业人员，直到授权公告或 者提交日起20年（如果所述申请被驳回、撤回或视为撤回）。
[0152] 在本申请未决期间，由美国专利办公室主任決定的有资格的人员可请求并获得所 述保藏。受37C.F.R. § 1.808(b)的制约，在专利授权时，保藏者针对所保藏材料的公众可 得性提出的所有限制都会被永久取消。所述保藏在最近一次请求之后会被維持30年或5 年的时间，或被維持到专利的有效寿命期，以较长时间为准，在此期间如果所述保藏一旦不 能存活，都要将其替换。申请人不会放弃任何本申请的专利或植物品种保护法（7USC2321 etseq.)授予的任何权利。
[0153] 实施例
[0154] 通用方法
[0155]通过服务公司（BaseClear,TheNetherlands,http://www.basedear.com/) 用与用于扩增的引物相同的引物直接测序PCR扩增产物。使用计算机程序（CLCBioMain WorkBench,Denmark,www.clcbio.com)比对所得到的序列以鉴定所述核苷酸改变。
[0156] 材料
[0157] 用于分析和诱变的水是在Milli-Q水整合系统-配有Q-gardT2筒和Quantum TEX筒的Milli-Q型ReferenceA+--中过滤的自来水。水阻カ为> =18M0hm。
[0158] 甲基磺酸乙酯（EMS)(纯）购于Sigma，产品编号为M0880。
[0159] 番茄成熟和/或贮藏时间或周期的测量
[0160] 可通过本领域已知的多种方法測量番茄成熟和/或贮藏时间或周期，所述方法例 如定期视觉评估果实和/或測量果实硬度或软化度、测量番茄果实中番茄红素的含量、果 实的乙烯生产、果实的顔色或任何替代方法，或者方法的组合。可例如通过评估以装配有适 当探针（例如3mm的探针）的果实硬度计测量的单位为例如0?Imm的变形阻力来测量果 实的硬度（Mutschleretal, 1992,Horscience27pp352-355)(Marinezetal1995Acta Horticulturae412pp463-469)。本领域中存在替代的方法，例如使用食品质地测定计 (Buietal. 2010!InternationalJournalofFoodProperties,第 13 卷，第 4 版）。例 如可适当使用Instron3342SingleColumnTestingSystem。
[0161]可通过新鲜番爺等级的美国标准（U.S.DeptofAgriculture, 1973,USstandards forgradesoffreshtomatoes,U.S.DeptAgr.Agr.Mktg.Serv.，WashingtonD.C.)用l：匕 色计测量颜色（Mutschleretal, 1992,Horscience27pp352-355)，或通过将所述颜色与 比色图表如英国皇家园艺学会（RHS)比色图表进行比较(www.rhs.org.uk)来对果实颜色 进行分类。
[0162] ロ丁丰艮据尸ishetal.Aquantitativeassaytorlycopenethatutilizes reducedvolumesoforganicsolvents.J.FoodCompos.Anal. 2002, 15, 309 - 317 的有机 溶剂的体积降低的方法来确定番茄红素含量。可将该方法用于测定在完整的番茄果实上 直接测量的番茄红素含量，并同时评估以下基本理化特征：颜色、硬度、可溶性固体、酸度和pH(Clementetal，J.Agric.FoodChem. 2008, 56,9813 - 9818)。
[0163] 可通过将果实放置在密闭空间中（例如在0. 51的玻璃容器（glassholder)中） 来測量乙烯释放。可在1小时后提取Iml容器气体并可使用配有合适的检测单元（例如火 焰离子化检测器）和合适的柱子（例如内径为3. 5mm并含有80/100目的活性氧化铝的3m 不锈钢柱）的气相色谱仪（例如Hewlett-Packard5890)对产生的乙烯气体量进行定量。 乙烯生产可表示为姆小时姆克果实放出的乙烯的纳升（nl)数（nlS^r1MMarinezetal 1995ActaHorticulturae412pp463-469)〇
[0164] 或者，如下文进ー步所述，可使用基于激光的乙烯检测器（ETD-300,SensorSense B.V. ,Nijmegen,theNetherland