对孢囊线虫具有抗性的大豆的制作方法
【专利说明】对孢囊线虫具有抗性的大豆
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请案要求2012年5月30日提交的美国临时申请序列号61/653, 227的权益； 该临时申请通过引用整体并入本文。
[0003] 关于由联邦政府资助研究或研发的声明
[0004] 本发明根据由美国国家科学基金会植物基因组研宄计划颁发的授权号0820642 以及由美国国家科学基金会颁发的授权号DBI-O845196在政府支持下完成。政府对本发明 具有一定的权利。
[0005] 通过引用并入的材料
[0006] 序列表（其是本公开的一部分）包括包含本发明的核苷酸和/或氨基酸序列的计 算机可读形式。序列表的主题通过引用整体并入本文。 发明领域
[0007] 本公开大体上涉及在大豆中赋予对线虫的抗性的方法。
[0008] 发明背景
[0009] 大豆孢囊线虫给美国大豆生产者造成超过十亿美元的年产量损失且是全世界大 豆产区的持续性问题。造成该产量损失的线虫大豆异皮线虫（Heteroderaglycines)的致 害性群体已在大多数已知抗性来源上被鉴定。但赋予对大豆孢囊线虫的抗性的大豆基因先 前未被克隆过。
[0010] 属于异皮线虫属（Heterodera)和球孢囊属（Globodera)的孢囊线虫包括了在经 济上最重要类别的植物寄生线虫中的ー些。这些不同种属的线虫通过在宿主根内诱生专门 取食位点（合胞体）而作为强制定栖的内寄生物在某些宿主植物上选择性地取食。大豆 孢囊线虫（SCN)大豆异皮线虫（HeteroderaglycinesIchinohe)的宿主范围限于豆科植 物和ー些杂草。其始终是大豆（大豆（Glycinemax(L.)Merr.))上经济上最重要的病原体 (Koenning和Wrather, 2010)。侵染性二龄幼虫（J2)在土壤中自卵孵化且利用空心ロ矛 (螫针）刺穿植物根以用机械方式对植物细胞壁穿孔并分泌细胞壁消化酶，从而促进经根 皮层到维管结构附近的中柱鞘或内胚层细胞的细胞内迀移。一旦细胞被选择用于取食，线 虫便将ー套效应蛋白递送到细胞中，导致该细胞转化为独特的高度代谢活性取食细胞。现 已定栖的幼虫在其经过被划分为四个幼虫期（J1-J4)和性别二态性成虫生命期的25-30天 生命期长大时从该细胞取食。经雄性虫受精后，雌性成虫的子宫中留下数百个卵，且在其死 亡后形成允许卵在缺少宿主的情况下在土壌中存活数年的保护性孢囊。宿主植物遭受营养 物损失以及通过维管结构的输送減少，表现为生长较不旺盛和产量降低。
[0011] 其两性融合的生活方式和独特的生存策略使得用来控制SCN的当前措施复杂化。 杀线虫剂的使用是受限制的且对大豆生产者亦无成本效益。用于控制SCN的当前方法包括 非宿主作物轮作与抗病栽培品种的种植的组合。大豆育种者已成功研发出抗SCN栽培品 种。首批Rhg(对大豆孢囊线虫具有抗性）基因在1960年初被鉴定（Caldwell等人，1960 ; Matson和Williams, 1965)，且从此已发表了大量关于来自多种不同种质来源的对SCN具 有潜在抗性的QTL(数量性状基因座）的鉴定和定位的论文。在多种种质来源中染色体 18 (rhgl)和染色体8 (Rhg4)上的QTL经作图是一致的（Concibido等人，2004)。在一些来 源（诸如PI88788)中，rhgl对于全面抗性来说是足够的且展示不完全显性（Concibido等 人，2004)。在其它情况下，诸如大豆品种栽培品种（cv.)Forrest，对SCN的全面抗性既需要 rhgl又需要Rhg4,其中Rhg4展现显性基因作用（Meksem等人，2001)。
[0012] 携帯Rhg基因的植物展示宿主与寄生虫之间的不相容相互作用。虽然携帯Rhg 基因的植物的根被侵染性J2穿透，但是取食细胞最终退化且大多数线虫在到达成虫阶段 之前死亡（Endo, 1965 ;Riggs等人，1973)。大豆孢囊线虫的遗传变异性是普遍的且在抗 性栽培品种上存活的线虫携帯未确定的ror(在抗性宿主上的繁殖）等位基因（Dong和 Opperman, 1997)，从而由于大豆抗性单作而导致在这块田地中的群体转变（Niblack等人， 2008)。对SCN具有抗性的理解是有限的，因为经鉴定具有潜在SCN抗性QTL的基因尚未被 克隆（Melito等人，2010;Liu等人，2010)。 发明概要
[0013] 在本公开的各个方面中提供对大豆孢囊线虫（SCN)具有抗性的大豆植物。
[0014] 本公开的ー个方面提供对大豆孢囊线虫（SCN)具有抗性的转基因大豆。所述抗 SCN大豆包括赋予抗性表型的丝氨酸羟甲基转移酶基因（GmSHMT)。在一些实施方案中， GmSHMT基因对大豆为外源性的且由此提供SCN抗性。在一些实施方案中，GmSHMT基因对大 豆为内源性的且转化增加了GmSHMT的表达，由此增加SCN抗性。
[0015] 在一些实施方案中，大豆植物用人工DNA构建体转化，所述人工DNA构建体包含以 下作为在5'到3'转录方向上可操作地相关联的组件：启动子，其在大豆中起作用；多核苷 酸，其包含选自由以下组成的组的序列：（a)SEQIDN0:1或具有丝氨酸羟甲基转移酶活性 的与其95%相同的序列；(b)编码SEQIDN0:2的多肽的核苷酸序列或具有丝氨酸羟甲基 转移酶活性的与其95%相同的序列；（c)在严格条件下与SEQIDN0:1的核酸序列杂交的 核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽，其中所述严格 条件包括在65°C下在包含6XSSC(0. 9M氯化钠和0. 09M柠檬酸钠）的溶液中孵育；及（d) 与（a)、（b)或（c)的所述多核苷酸序列互补的多核苷酸；及转录终止序列；其中该转基因 大豆表现出增加的SCN抗性。
[0016] 在一些实施方案中，大豆植物是包含含有突变R130P和Y358N的GmSHMT等位基因 的具有大豆孢囊线虫（SCN)抗性的农艺学优良大豆栽培品种。在一些实施方案中，大豆植 物通过以下方式来制备：(a)使第一大豆植物与第二大豆植物杂交，其中第一和第二植物 共同地包含产生SCN抗性表型的含有突变R130P和Y358N的GmSHMT等位基因，且其中第一 和第二植物共同地包含能够向所述植物的子代植物赋予农艺学优良特性的种质；及（b)分 析由杂交所得的子代大豆植物的农艺学优良特性和SCN抗性；以及（c)选择包含所述SCN 抗性表型和农艺学优良特性的至少第一子代植物以获得期望的植物。
[0017] 本公开的另一方面是本文所述任何抗SCN大豆植物的植物部分。
[0018] 本公开的另一方面是人工DNA构建体，其包括启动子，其在大豆中起作用；编码具 有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的多核苷酸；及转录终止序列。
[0019] 本公开的另一方面是增加大豆抗大豆孢囊线虫（SCN)的方法，其包括用本发明的 人工DNA构建体来转化植物。
[0020] 其它目标和特征将在部分程度上显而易见并且将在下文中部分地指出。
【附图说明】
[0021] 本领域技术人员应理解，下文所述附图仅出于说明目的。所述附图并非意在以任 何方式限制本发明教导的范围。
[0022] 图1是说明Rhg4基因的定位克隆的一系列图式和序列表。图IA显不Rhg4基因座 的高密度遗传图谱。黑色水平线表示大约为300Kbp的Rhg4染色体区间。黑线下方的箭头 指出每个DNA标记的位置及其名称。黑色水平线上方的数字表示每ー标记相对于LRR-RLK 标记（先前描述于Liu等人2011中的在Rhg4基因座处的LRR-RLK基因）的位置，其被指定 为'0'位。蓝色箭头表示Essex(E)或Williams82(W)与Forrest(F)之间的多态性等位 基因，红色箭头表示具有在双重组体ExF74和FxW5093中出现的具有Forrest(F)等位基因 的DNA标记，且绿色箭头表示E、W和F之间的非多态性等位基因，其跨越大约IOOKbp的区 域。图IB显示通过使用GmSHMT探针筛选三个大豆BAC库（HindIII库、EcoRI库和BamHI BAC库；Meksem等人，2000)鉴定出BAC克隆 100B10。BAC克隆 100B10 涵盖标记LRR-RLK、 SHMT以及GmSHMT的部分序列（前两个外显子以及第二个内显子的一部分）。图IC显不 GmSHMT基因组DNA序列的基因模型。所述基因从起始密码子到终止密码子是2189bp且含 有三个外显子（红色框）和两个内显子（黑色线）。黑色线上方的数字指示相对于起始密 码子的第一个核苷酸的核苷酸位置。比较Forrest与Essex之间的GmSHMT基因序列以鉴 定出三个SNP(G389C、T1165A和G1473C)以及两个InDel(在1384C位和1385T位处）。图 ID显示Forrest与Essex之间的预测GmSHMT蛋白质序列的比较，其中用红色突显氨基酸差 异（R130P和Y358N)。
[0023] 图2是展示通过突变分析对GmSHMT的功能验证的图式、序列表和柱形图。图2A显 示使用大豆栽培品种Forrest的EMS诱变群体通过TILLING来筛选GmSHMT中的突变。基 因被划分为3个TILLING区间（1、2和3)以供筛选。鉴定出两个错义突变体F6266(E61K) 和F6756(M125I)。图2B显示包括来自Forrest的抗性野生型等位基因、来自供体亲本 PI548402 (Peking)的抗性等位基因、F6266和F6756Forrest突变等位基因以及来自栽培品 种Essex和Williams82的易感性等位基因的GmSHMT序列的氨基酸比对。比对上方的数字 对应于ForrestGmSHMT蛋白质序列内的氨基酸位置。箭头表示在SCN抗性品系与易感性 品系之间不同的两个氨基酸（R130P和Y358N)的位置以及通过EMS诱导的两个新Forrest 等位基因中突变（E61K和M125I)的位置。图2C显示GmSHMTTILLING突变体的SCN表型。 与抗SCN栽培品种Forrest(野生型）和易感SCN的栽培品种Essex相比，E61K和M125I 突变两者均产生了从抗性到中度易感性（在纯合子突变品系中FI多20% )以及从抗性 (FI< 10% )到中度抗性（在杂合子突变品系中FI介于10%与20%之间）的转变。
[0024] 图3是示出以28个植物引种（PI)中的GmSHMT鉴定的单倍型的表。对总共81个大 豆品系（植物引种、地方栽培品种和优良栽培品种）的SCN表型进行评分且以rhgl和Rhg4 基因座进行SNP基因分型（关于列表參见例如表1)。对此处所显示的28个品系的GmSHMT 的编码区测序。如果FI彡10%，则品系被分类为对SCN具有抗性（R)，且如果FI彡10%， 则品系被分类为对SCN具有易感性（S)。在Forrest中多态性位点是相对于起始密码子的 第一个核苷酸定位。红色框指示G到C以及T到A的转变，所述转变产生分别连接于SCN表型的氨基酸取代R130P和Y358N。
[0025] 图4是展示通过VIGS、RNAi和互补对GmSHMT的功能验证的一系列图形和图像。图 4A显示使用病毒诱导的基因沉默使GmSHMT沉默的大豆根中的SCN繁殖。在经BPMV(菜豆 莢斑點病毒（Beanpodmottlevirus))或含有SHMT基因序列片段的BPMV(BPMV-SHMT)接 种的抗SCNRILExF67和仅经BPMV接种的易感SCN的RILExF63上测量线虫繁殖。菱形 表示单个根系统上孢囊的数目。毎次处理使用至少十二株植物。进行四个独立的实验，其 等显示相似結果。给出来自ー个实验的代表性数据。不同字母表示在P〈〇. 0001下的显著 差异。图4B显示在对照根和GmS