卵巢常温保存液及保存方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种卵巢保存液及卵巢保存方法。
【背景技术】
[0002] 随着生殖生物技术（如细胞核移植和转基因等胚胎工程技术）的深入研宄，以及 胚胎体外生产和胚胎移植商业化的发展，如何获得数量更多的高质量卵母细胞已成为重中 之重。卵巢的收集和运输一般需要较长的时间，如野外取得野生动物卵巢，城市间或国际间 运输雌性动物生殖细胞，屠宰场取得家畜卵巢等情况下，卵巢都会置于体外较长时间，导致 卵母细胞发育能力下降。
[0003] 尽管通过冷冻保存卵巢进行胚胎体外生产已经成功；但是解冻后卵母细胞成熟率 和胚胎发育能力较低，而且冷冻保存过程繁琐，需要冷冻和保持低温的设备，冷冻保存成本 较高。
[0004] 目前常温保存卵巢的最长时间仅为8小时左右，对于需要长途运输或者野外采集 的情况来说过于紧迫。一旦超过8小时可采集到的卵母细胞数量和质量大幅度下降，造成 了卵母细胞的极大浪费。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了解决目前常温保存卵巢的时间过短，影响卵母细胞数量和质 量的问题，而提供的一种卵巢常温保存液及卵巢常温保存方法。
[0006] 卵巢常温保存液包括磷酸盐缓冲液、葡萄糖和茶多酚；卵巢常温保存液以磷酸盐 缓冲液为基础液，卵巢常温保存液中葡萄糖的浓度为15mmol/L、茶多酚的浓度为20 ymol/ L0
[0007] 使用上述卵巢常温保存液的卵巢常温保存方法按以下步骤进行：
[0008] 一、去掉卵巢周围脂肪组织，再用生理盐水漂洗卵巢；
[0009] 二、将步骤一清洗干净的卵巢放入卵巢常温保存液中；即完成卵巢的常温保存。
[0010] 本发明中磷酸盐缓冲液（PBS)每升IL由Sg氯化钠、0. 2g氯化钾、I. 44g磷酸氢二 钠、0. 24g磷酸二氢钾和余量的蒸馏水组成，其pH值为7. 2。
[0011] 采用本发明卵巢常温保存液对卵巢进行常温（10~25°C )保存的时间均彡12h。 在15°C的常温条件下本发明卵巢常温保存液保存32小时的牛卵巢的卵母细胞成熟率，孤 雌激活后囊胚率仍能够达到与新鲜卵巢卵母细胞相同的发育能力，因此保证了卵母细胞数 量和质量，避免了卵母细胞的浪费，其保存时间4倍于现有技术。本发明卵巢常温保存液 中茶多酚不仅具有抗氧化的功能，葡萄糖也不单单是能量供给，而是通过葡萄糖和茶多酚 间的相互作用，有效地延长了常温条件下卵巢的体外保存时间，增加了卵母细胞采集数量， 提尚体外成熟后胚胎发育能力。
[0012] 本发明卵巢的常温保存方法简单，操作容易，无需其他制冷设备，特别适合野外收 集、采集野生动物卵巢，以及动物卵巢采集后需要常温长途运输的情况。
[0013] 本发明卵巢常温保存方法可以解决GV期卵母细胞在常温下保存，保存后成熟率 和发育率下降的问题，可直接保存卵巢组织，获得优质卵母细胞。
[0014] 本发明卵巢常温保存液具有高效、廉价、方便以及对细胞没有毒性的优点。
【具体实施方式】
[0015] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0016] 一：本实施方式卵巢常温保存液包括磷酸盐缓冲液、葡萄糖和茶 多酚；卵巢常温保存液以磷酸盐缓冲液为基础液，卵巢常温保存液中葡萄糖的浓度为 15mmol/L、茶多酷的浓度为20 y mol/L〇
[0017] 磷酸盐缓冲液（PBS)每升IL由8g氯化钠、0.2g氯化钾、I. 44g磷酸氢二钠、0.24g 磷酸二氢钾和余量的蒸馏水组成，其pH值为7. 2。
【具体实施方式】 [0018] 二：本实施方式与一的不同点是：卵巢常温保存液还 包括抗生素；卵巢常温保存液中抗生素为青霉素和链霉素，青霉素的浓度为0. 06g/L，链霉 素的浓度为〇.〇5g/L。其它与实施方式一相同。
[0019] 本实施方式加入抗生素，避免了微生物的滋生，更好的保证了卵巢的质量。
【具体实施方式】 [0020] 三：本实施方式与一或二的不同点是：卵巢常温保存 液还包括果糖；卵巢常温保存液中果糖的浓度为0. 12g/L。其它与实施方式一或二相同。
[0021] 本实施方式加入果糖，果糖能够较快地穿透细胞组织，抑制卵巢微生物生长，迅速 给卵巢组织提供能量。
【具体实施方式】 [0022] 四：本实施方式与一、二或三的不同点是：卵巢常温 保存液的渗透压为320~330m0smol/kg、pH值为7. 2。其它与实施方式一、二或三相同。
【具体实施方式】 [0023] 五：本实施方式卵巢的常温保存方法按以下步骤进行：
[0024] 一、去掉卵巢周围脂肪组织，再用生理盐水漂洗卵巢；
[0025] 二、将步骤一清洗干净的卵巢放入卵巢常温保存液中；即完成卵巢的常温保存。
【具体实施方式】 [0026] 六：本实施方式与五的不同点是：步骤二中卵巢保存 温度为10~25°C。其它步骤及参数与实施方式五相同。
【具体实施方式】 [0027] 七：本实施方式与五的不同点是：步骤二中卵巢保存 温度为15°C。其它步骤及参数与实施方式五相同。
【具体实施方式】 [0028] 八：本实施方式与五、六或七的不同点是：步骤二每 升卵巢常温保存液中保存卵巢40~50个。其它步骤及参数与实施方式五、六或七相同。
[0029] 本实施方式中所述卵巢为牛动物的卵巢，根据卵巢的体积可适当调整每升卵巢常 温保存液中保存卵巢的数量。
【具体实施方式】 [0030] 九：本实施方式与五至八之一的不同点是：步骤二卵 巢常温保存液还包括抗生素；卵巢常温保存液中抗生素为青霉素和链霉素，青霉素的浓度 为0. 06g/L，链霉素的浓度为0. 05g/L。其它步骤及参数与实施方式五至八之一相同。
【具体实施方式】 [0031] 十：本实施方式与五至九之一的不同点是：步骤二卵 巢常温保存液还包括果糖；卵巢常温保存液中果糖的浓度为0. 12g/L。其它步骤及参数与 实施方式五至九之一相同。
【具体实施方式】 [0032] 十一：本实施方式与五至十之一的不同点是：步骤二 卵巢常温保存液的渗透压为320~330m0smol/kg、pH值为7. 2。其它步骤及参数与实施方 式五至十之一相同。
[0033] 实施例1
[0034] 卵巢的常温保存方法按以下步骤进行：
[0035] 一、去掉卵巢周围脂肪组织，再用生理盐水漂洗卵巢；
[0036] 二、将步骤一清洗干净的卵巢放入卵巢常温保存液中；即完成卵巢的常温保存；
[0037]其中，步骤二中卵巢保存温度分别为5 °C、10 °C、15 °C、20 °C、25 °C、30 °C和37 °C;
[0038] 步骤二每升卵巢常温保存液中保存牛卵巢50个；
[0039] 步骤二卵巢常温保存液包括