磷酸盐缓冲液、葡萄糖、茶多酚青霉素和链霉素；卵巢 常温保存液以磷酸盐缓冲液为基础液，卵巢常温保存液中葡萄糖的浓度为15mmol/L、茶多 酚的浓度为20 y mol/L，青霉素的浓度为0. 06g/L，链霉素的浓度为0. 05g/L。
[0040] 磷酸盐缓冲液（PBS)每升IL由8g氯化钠、0.2g氯化钾、I. 44g磷酸氢二钠、0.24g 磷酸二氢钾和余量的蒸馏水组成，其pH值为7. 2。
[0041] 实施例2
[0042] 实施例2与实施例1除所使用的卵巢常温保存液和保存温度不同之外，其余均相 同。
[0043] 实施例2卵巢常温保存液包括磷酸盐缓冲液、蔗糖和胡萝卜素；卵巢常温保存液 以磷酸盐缓冲液为基础液，卵巢常温保存液中蔗糖的浓度为〇. 15mol/L、胡萝卜素的浓度为 20mg/L；
[0044] 实施例2保存温度为15~25 °C。
[0045] 实施例3
[0046] 实施例3与实施例1除所使用的卵巢常温保存液和保存温度不同之外，其余均相 同。
[0047] 实施例3卵巢常温保存液包括磷酸盐缓冲液、蔗糖和维生素C;卵巢常温保存液 以磷酸盐缓冲液为基础液，卵巢常温保存液中蔗糖的浓度为〇. 15mol/L、维生素C的浓度为 400mg/L；
[0048] 实施例3保存温度为15~25 °C。
[0049] 实施例4
[0050] 采新鲜的牛卵巢。实施例4保存温度为15~25°C。
[0051] 对比试验：
[0052] 实施例1、实施例2和实施例3获得的卵巢均采用以下步骤进行处理：卵巢在25°C 恢复20min，将卵巢移入38°C生理盐水中。
[0053] 之后采用固定有18号针头的20ml注射器，吸取少量D-PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)，采用抽吸法采集卵巢表面直径为2~6mm卵泡中的卵母细 胞，在体视显微镜下收集可用于体外成熟的卵丘卵母细胞复合体（COCs)，COCs用洗卵液洗 涤3~5次；然后在培养皿中培养24h，1个卵母细胞/5 y 1成熟培养液，石蜡油覆盖液滴， 培养条件为CO2浓度为5 %、温度为38. 5 °C、饱和湿度。
[0054] 其中，成熟培养液为TCM-199培养液：基础培养液为TCM199 (Gibco, Grand Island，New York, USA)，添加胎牛血清浓度至 10% (V/V)、FSH 浓度至 0.05IU/ml、LH 浓度 至0. 05IU/ml、17 |3 -雌二醇浓度至I y g/ml、丙酮酸钠浓度至24. 2mg/L、EGF浓度至IOng/ ml、青霉素浓度至100IU/ml和硫酸链霉素浓度至100 y g/ml。
[0055] 把实施例1、实施例2和实施例3成熟培养后的COCs和实施例4新鲜的COCs 分别移入0.1% (w/v)的透明质酸酶中作用0.5分钟，用适当口径的微吸管反复吹 打，去净卵丘细胞。选择具有第一极体的成熟卵母细胞进行激活；I〇nomycin(Sigma， 1-0634)和 6-DMAP(Sigma，D-2629)用 DMSO 溶解，使用前用含有 3mg/ml BSA 和 5% FCS 的CRlaa(Rosenkrans et al.，1991)稀释到使用浓度。成熟卵母细胞在5ymol/L的 Ionomycin中室温处理5分钟，用CRlaa充分洗净，然后在含2mmol/L 6-DMAP的CRlaa中处 理4h。激活处理后，卵母细胞在不含6-DMAP的CRlaa中继续培养，每隔48h换半液，培养结 束后，在显微镜下检查实施例1、实施例2、实施例3和实施例4中牛卵母细胞胚胎发育的各 个阶段。
[0056] 以实施例4获得的新鲜牛卵母细胞的成熟率和孤雌激活后囊胚率为基准，测量在 维持该基准不降低的情况下，实施例1、实施例2和实施例3中卵巢可保存的最长时间。试 验结果如表1所示。
[0057]表1
【主权项】
1. 卵巢常温保存液，其特征在于卵巢常温保存液包括磷酸盐缓冲液、葡萄糖和茶多酚； 卵巢常温保存液以磷酸盐缓冲液为基础液，卵巢常温保存液中葡萄糖的浓度为15mmol/L、 茶多酚的浓度为20ymol/L〇
2. 根据权利要求1所述的卵巢常温保存液，其特征在于卵巢常温保存液还包括抗生 素；卵巢常温保存液中抗生素为青霉素和链霉素，青霉素的浓度为〇. 〇6g/L，链霉素的浓度 为 0? 05g/L。
3. 根据权利要求1所述的卵巢常温保存液，其特征在于卵巢常温保存液还包括果糖； 卵巢常温保存液中果糖的浓度为〇. 12g/L。
4. 根据权利要求1所述的卵巢常温保存液，其特征在于卵巢常温保存液的渗透压为 320 ~330m0smol/kg、pH 值为 7. 2〇
5. 使用权利要求1卵巢常温保存液的卵巢常温保存方法，其特征在于卵巢的常温保存 方法按以下步骤进行： 一、 去掉卵巢周围脂肪组织，再用生理盐水漂洗卵巢； 二、将步骤一清洗干净的卵巢放入卵巢常温保存液中；即完成卵巢的常温保存。
6. 根据权利要求5所述的卵巢常温保存方法，其特征在于步骤二中卵巢保存温度为 10 ~25°C〇
7. 根据权利要求5所述的卵巢常温保存方法，其特征在于步骤二中卵巢保存温度为 15。。。
8. 根据权利要求5所述的卵巢常温保存方法，其特征在于步骤二每升卵巢常温保存液 中保存卵巢40~50个。
9. 根据权利要求5所述的卵巢常温保存方法，其特征在于步骤二卵巢常温保存液还包 括抗生素；卵巢常温保存液中抗生素为青霉素和链霉素，青霉素的浓度为0. 06g/L，链霉素 的浓度为〇? 〇5g/L。
10. 根据权利要求5所述的卵巢常温保存方法，其特征在于步骤二卵巢常温保存液还 包括果糖；卵巢常温保存液中果糖的浓度为〇. 12g/L。
【专利摘要】卵巢常温保存液及卵巢常温保存方法。它涉及一种卵巢保存液及卵巢保存方法。解决了目前常温保存卵巢的时间过短，影响卵母细胞数量和质量的问题。卵巢常温保存液包括磷酸盐缓冲液、葡萄糖和茶多酚。常温保存方法：一、去掉卵巢周围脂肪组织，再用生理盐水漂洗卵巢；二、将步骤一清洗干净的卵巢放入卵巢常温保存液中。本发明卵巢常温保存液具有高效、廉价、方便以及对细胞没有毒性的优点。本发明卵巢的常温保存方法简单，操作容易，无需其他制冷设备，特别适合野外收集、采集野生动物卵巢，以及动物卵巢采集后需要常温长途运输的情况。
【IPC分类】A01N1-02
【公开号】CN104719285
【申请号】CN201510179000
【发明人】曹新燕, 许保增, 薛海龙, 李晓霞, 王世勇, 刁云飞, 魏海军, 赵伟刚, 赵蒙, 徐超, 杨义峰, 鞠妍, 宋兴超
【申请人】中国农业科学院特产研究所
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年4月16日