°C的恒温培养箱培养48h (小时），待长出明显 菌斑时，挑取单菌落重复在YEB培养基（发根农杆菌培养基）平板上划线，同样放置在25°C 的恒温培养箱培养48h，待长出明显菌斑时，挑取单菌落接种在含有30mL YEB液体培养基 的三角瓶中，28°C，180rpm震荡培养12-15h，培养至浓度为OD6tltl (菌液吸光值）=0. 6-0. 8 为宜。然后将菌液转入50mL离心管中，6000r/min，离心10min，用MS液体培养基（配方见 附件，不添加琼脂）重悬至OD = 0. 6,菌悬液备用。
[0032] 第2步外植体的预培养；在无菌条件下，将生长15-20d(天）左右的马尿泡种子无 菌苗（子叶刚刚伸展且幼嫩，未长出真叶）取出，用解剖刀小心切去种子无菌苗根部和下胚 轴以上部分，将切好的下胚轴转接至MS固体培养基中（见附表），放置于22°C生化培养箱 中暗培养48h，完成对外植体即下胚轴的预培养阶段。
[0033] 第3步发根农杆菌浸染及共培养在无菌条件下，用镊子小心取出与预培养后的下 胚轴，放置于灭菌的干净的培养皿中，将菌悬液倒入培养皿中，期间不停震荡培养皿，浸染 9-10min，然后用镊子将浸染后的下胚轴取出，用灭菌滤纸除去表面多余菌液，然后接种在 MS固体培养基中，放置于28 °C生化培养箱，共培养48h。
[0034] 第4步除菌培养在无菌条件下，将完成共培养的下胚轴转接至含有500mg/L羧苄 青霉素的MS培养基中于22°C条件下进行暗培养，直到27d左右，下胚轴伤口愈伤组织处陆 续产生白色不定根，如果有污染继续接种在除菌培养基上，直到完全除菌，培养条件为22°C 暗培养。
[0035] 第5步发状根的分子鉴定参考CTAB法提取发根的基因组DNA。基因 组DNA被用作目的基因 RolB基因的扩增模板。RolB基因引物序列：F引物序列： 5' -TCTCGCGAGAAGATGCAGAA-3，R 引物序列：5，-TAAAGGTTGCCTGCAGGGG-3，cPCR 的反 应体系见附表3,扩增条件为94°C预变性8min，94°C，45sec ;53°C，30sec ;72°C，lmin ;35个 循环，72°C延长IOmin。扩增产物进行琼脂糖电泳。
[0036] 第6步发根系的扩繁和激素自主生长型的判断将经过分子鉴定的马尿泡发根系 剪取根尖3-4cm接种在无激素 MS培养基上，将能够持续快速生长的发根系在22°C条件下继 代培养，完成发根系的扩繁。
[0037] 第7步发根系的液体悬浮培养、逐级放大培养和发根的收获剪取发根根尖3-4cm 接种在30mL无激素 MS液体培养基中，22°C，IOOrpm黑暗条件下悬浮培养35-40d，剪取发根 根尖3-4cm接种在IOOmL无激素 MS液体培养基中，同样条件下逐级放大培养。将完成放大 培养的发根从三角瓶中取出，用滤纸吸干表面水分，在45°C烘箱中烘干，作为测定生物碱的 材料。
[0038] 第8步生物碱的测定生物碱的测定参考（Wang et al. 2002)方法，这里不做详细 说明。
[0039]
【主权项】
1. 藏药马尿泡自主发根体系的建立方法，其特征在于按照以下步骤进行： 步骤1:发根农杆菌的活化；将低温保存的发根农杆菌取出，在发根农杆菌培养基平 板上划线，然后放置在25°C的恒温培养箱培养48h，待长出菌斑时，挑取单菌落再次在发根 农杆菌培养基平板上划线，放置在25°C的恒温培养箱培养48h，待长出菌斑时，挑取单菌落 接种在含有30mL发根农杆菌液体培养基的三角瓶中，28°C，180rpm震荡培养12-15h，培养 至菌液吸光值浓度为OD 6qq= 0. 6-0. 8,然后将菌液转入50mL离心管中，6000r/min，离心 lOmin，用MS液体培养基重悬至OD = 0. 6,菌悬液备用； 步骤2 :外植体的预培养；将生长15-20d左右的马尿泡种子无菌苗取出，切去种子无菌 苗根部和下胚轴以上部分，将切好的下胚轴转接至MS固体培养基中，放置于22°C生化培养 箱中暗培养48h，完成下胚轴的预培养阶段； 步骤3 :发根农杆菌浸染及共培养；取出与预培养后的下胚轴，放置于灭菌的干净的培 养皿中，将菌悬液倒入培养皿中，期间不停震荡培养皿，浸染9-10min，然后将浸染后的下 胚轴取出，除去表面多余菌液，然后接种在MS固体培养基中，放置于28°C生化培养箱培养 48h ； 步骤4 :除菌培养；在无菌条件下，将完成共培养的下胚轴转接至含有500mg/L羧苄青 霉素的MS培养基中于22°C条件下进行暗培养，下胚轴伤口愈伤组织处产生白色不定根。
2. 按照权利要求1所述藏药马尿泡自主发根体系的建立方法，其特征在于：所述MS液 体培养基配方为： NH4NO3 41. 25g，KNO3 47. 50g，KH2PO4 4. 25g，溶于 300mL 蒸馏水中，定容至 500mL 吸取 20mL/L ； CaCl2 ? 2H20 22g，定容至 500mL，吸取 10mL/L ; MgSO4 ? 7H20 18. 50g，定容至 500mL，吸取 10mL/L ; MnSO4 ? 4H20 2230mg 或 MnSO4 ? H2O 1690mg，ZnSO4 ? 7H20 860mg，H3BO3 620mg，KI 83mg， NaMoO4 ? 2H20 25mg，CuSO4 ? 5H20 2. 5mg，CoCl2 ? 6H20 2. 5mg，定容至 500ml，吸取 5mL/L ; 甘氨酸〇. lg，烟酸硫胺素〇. 〇〇5g，烟酸吡哆素0. 025g，烟酸0. 025g，定容至500mL，吸取 lOmL/L ； 肌醇5g，定容至500mL，吸取lOmL/L ; Na2-EDTA I. 865g，FeSO4 ? 7H20 I. 390g，定容至 500mL，吸取 10mL/L。
3. 按照权利要求1所述藏药马尿泡自主发根体系的建立方法，其特征在于：所述MS固 体培养基配方为：NH4NO 3 41. 25g，KNO3 47. 50g，KH2PO4 4. 25g，溶于300mL蒸馏水中，定容至 500mL 吸取 20mL/L ; CaCl2 ? 2H20 22g，定容至 500mL，吸取 10mL/L ; MgSO4 ? 7H20 18. 50g，定容至 500mL，吸取 10mL/L ; MnSO4 ? 4H20 2230mg 或 MnSO4 ? H2O 1690mg，ZnSO4 ? 7H20 860mg，H3BO3 620mg，KI 83mg， NaMoO4 ? 2H20 25mg，CuSO4 ? 5H20 2. 5mg，CoCl2 ? 6H20 2. 5mg，定容至 500ml，吸取 5mL/L ; 甘氨酸〇. lg，烟酸硫胺素〇. 〇〇5g，烟酸吡哆素0. 025g，烟酸0. 025g，定容至500mL，吸取 lOmL/L ； 肌醇5g，定容至500mL，吸取lOmL/L ; Na2-EDTA I. 865g，FeSO4 ? 7H20 I. 390g，定容至 500mL，吸取 lOmL/L ; 鹿糖30g/L ;琼脂7g/L。
【专利摘要】本发明公开了藏药马尿泡自主发根体系的建立方法，首先对发根农杆菌进行活化，将马尿泡种子无菌苗下胚轴转接至MS固体培养基中，放置于22℃生化培养箱中暗培养48h，完成下胚轴的预培养阶段；使用发根农杆菌浸染及共培养；转接至含有500mg/L羧苄青霉素的MS培养基中于22℃条件下进行暗培养，下胚轴伤口愈伤组织处产生白色不定根。本发明的有益效果是研发了高产东莨菪碱的马尿泡转基因发根生物反应器。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104855288
【申请号】CN201510236610
【发明人】周党卫, 雷天翔, 王环, 李松龄, 蔡晓剑, 沈建伟
【申请人】中国科学院西北高原生物研究所
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年5月11日