一种结球甘蓝发育膨大小孢子分离的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种结球甘蓝发育膨大小孢子分离的方法。
【背景技术】
[0002]结球甘蓝(B rassica oleracea L.var.Capitata)又名卷心菜、洋白菜、包菜等。具有耐寒、抗病、适应性强、储耐运、产量高、品质好等特点，在我国各地普遍栽培，在蔬菜栽培和供应中占有重要地位。并且大量出口到国外，在蔬菜出口贸易中也占有相当重要地位。目前，我国结球甘蓝主栽品种大部分被国外公司垄断，具有自主知识产权的品种较少，究其原因是因为性状优异的育种资源缺乏。传统上，多代自交分离一般需要5~6年的时间才能获得纯合稳定的亲本材料。费力耗时。而游离小孢子培养方法可在1~2年内快速获得双单倍体纯系，比传统的方法缩短了 3?4年的时间。因此在优良自交系的创制和提高新品种选育效率等方面具有重要作用。同时，隐性性状也易于表达，丰富了育种资源。
[0003]自从Lichter (1982)首次获得油菜游离小孢子再生植株以来，国内外学者对小孢子培养技术进行了大量深入的研究。结球甘蓝游离小孢子培养最早见于Lichter (1989)和Takahata (1990)的报道。随后严准等(1999 )、唐青林等(2000 )、刘艳玲等(2006 )、袁素霞等(2009 )在提高甘蓝小孢子胚胎发生效率方面也做了很多工作，取得了一些成果。但由于基因型、发育时期、诱导条件等因素影响，小孢子胚胎发育效率较低，难以获得大量双单倍体材料，影响了小孢子培养技术在结球甘蓝遗传育种和基础研究中的进一步应用。
[0004]有关小孢子胚胎发育过程中的分子生物学、蛋白质组学等机理研究较少，究其原因是小孢子体积微小，要获得足够数量的试验材料需要做大量、重复的小孢子培养试验，而把发育膨大的小孢子与未发育的小孢子分尚开存在困难。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种结球甘蓝发育膨大小孢子分离的方法，该方法可以将发育膨大的小孢子分离出来，从而为小孢子胚胎发育机理研究提供试验分析材料。
[0006]—种结球甘蓝发育膨大小孢子分离的方法，包括以下步骤:
步骤I，取结球甘蓝花序，选取花蕾进行灭菌；
步骤2，在步骤I所得灭菌后的花蕾中加入NLN-13液体诱导培养基，研磨、过滤，滤液离心后取沉淀，再加入NLN-13液体培养基，得小孢子悬浮液；
步骤3，将步骤2所得小孢子悬浮液在避光条件下经热激处理后进行培养；
步骤4，将步骤3所得培养液依次经300?350目、450?600目滤网过滤，得发育膨大的小孢子。
[0007]作为上述发明的进一步改进，步骤I中所述花蕾处于单核晚期至双核早期，花瓣和花药长度比为0.8?1.2。
[0008]作为上述发明的进一步改进，步骤2中NLN-13培养基由NLN液体培养基IL和蔗糖 130 g 组成，pH 6.0 ?6.2。
[0009]作为上述发明的进一步改进，步骤3中热激处理条件为32°C?33°C、时间为Id?3do
[0010]作为上述发明的进一步改进，步骤3中培养条件为25±2°C、时间为Id?10d。[0011 ] 作为上述发明的进一步改进，步骤4中所述培养液是指在20倍显微镜下随机观察10个视野，统计发育小孢子数量须占全部小孢子的比例超过5%。
[0012]作为上述发明的进一步改进，步骤4中过滤过程采用真空抽滤，所用真空度为20_60kpao
[0013]本发明与现有技术相比，其显著优点在于:1.采用不同孔径微孔滤网过滤分离把发育膨大小孢子与未发育小孢子分尚开，所得发育膨大的小孢子数量占比可达85%以上，对照仅为20% ;2.通过大量重复进行小孢子培养操作、微孔滤网过滤分离，获得了足够数量的试验材料，为分子生物学、蛋白质组学研究提供了保障。
【具体实施方式】
[0014]下面通过【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0015]NLN 液体培养基其组成为:KN03 125mg，Ca (NO3) 2.4H20 500mg，MgSO4.7H20 125mg，KH2PO4 125mg，H3BO3 6.2mg，MnSO4.H2O 18.95mg，ZnSO4.7H20 8.6mg，Na2MoO4.2H20 0.25mg，CuSO4.5Η20 0.025mg，CoCl2.6H20 0.025mg，维生素 BI 0.5mg，维生素 B6 0.5mg，生物素0.05mg，叶酸 0.5mg，Na2EDTA 37.3mg，FeS04.7H20 27.8mg，肌醇 lOOmg，甘氨酸 2mg，烟酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，维生素B5 5mg，丝氨酸lOOmg，IL无菌水。
[0016]实施例1
一种结球甘蓝发育膨大小孢子分离的方法，包括以下步骤:
步骤1，取结球甘蓝生长健康、无病虫害的花序作为小孢子培养的供体植株，取花序上花瓣和花药长度比为0.8、单核晚期至双核早期的花蕾，将5.6wt.%次氯酸钠水溶液56mL、无水乙醇10mU洗洁精10滴加至IL无菌水中配制得到灭菌液，把结球甘蓝花蕾放入无菌培养皿中，加入灭菌液，放到摇床上摇动进行表面消毒20分钟，再在超净工作台上用无菌水荡洗3次后，备用；
步骤2，在超净工作台上将12个无菌花蕾置于无菌烧杯中，加入1mL NLN-13诱导培养基，用平头玻璃棒挤碎、研磨成悬浮液，悬浮液经300目无菌滤网过滤到50ml离心管中，盖紧，900rpm/min离心3min，离心后倒掉上清液，往沉淀中加入10ml NLN-13诱导培养基，按上述方法再离心2次，弃上清液，加入NLN-13诱导培养基40mL，得到小孢子混合悬浮液；步骤3，将4mL步骤2所得小孢子悬浮液加到60mm无菌培养皿中，用parafilm膜封口，后置于32.5°C恒温生化培养箱里、避光条件下热激处理I天；后取出置于25°C恒温培养箱中、避光条件下继续培养；
步骤4，培养3d后，显微镜观察发现小孢子胚胎发育率超