一种紫锥菊不定芽再生培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物生物技术领域，更具体地，涉及一种紫锥菊不定芽再生培养方法。
【背景技术】
[0002] 紫锥菊（AcAiflacea /wr/wrea L.)为菊科多年生草本植物，具有良好的免疫调节 作用，其提取物是近年来在国际上受到普遍重视的一种免疫促进剂和免疫调节剂。由于其 确切的功效，紫锥菊已经成为一种世界著名的药用植物。人们为了获得多品种的紫锥菊，已 经尝试将多种生物技术手段应用于紫锥菊上，如转基因、花药培养、染色体加倍。这些目的 的达成，都必须经过一个共同的步骤，即诱导培养物，产生不定芽。虽然现有技术中已有很 多研究针对紫锥菊不定芽再生而展开，但其再生效率并不理想。
[0003] 现有常用技术中，在紫锥菊外植体诱导不定芽再生时，通常采用是含有15~60 g/L鹿糖，0? 1~1. 5 mg/L BA及0~0? 15 mg/L NAA，以3~9 g/L琼脂固化的MS培养基， 在这种再生培养基的培养条件下，不同基因型紫锥菊外植体的不定芽再生效率差异很大， 除了部分基因型能够获得较合适再生效率外，其余大量基因型的再生效率很低，芽体的质 量也较差，严重制约了紫锥菊转基因、花药培养、染色体加倍等植物生物技术研究的开展， 限制了紫锥菊生物技术育种工作的进行。
[0004] 己酸二乙氨基乙醇酯（DA-6)是一种植物生长调节剂，通常用于田间栽培，目前也 有用于组织培养。在改良技术中，通过在原有培养基中添加特定浓度的DA-6有助于提升 不定芽的再生效率，但是，在培养部分生物量类型的外植体时，DA-6会抑制不定芽的再生效 率。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种紫锥菊 不定芽再生培养方法。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的： 一种高效的紫锥菊不定芽再生培养方法，是将二倍体紫锥菊外植体置于含有DA-6的 再生培养基中培养；当紫锥菊外植体是面积为16_2的叶片外植体时，再生培养基中DA-6 的浓度为〇. 〇lmg/L ;当紫锥菊外植体是面积为49mm2或100mm 2的叶片外植体时，再生培养 基中DA-6的浓度为0. 08mg/L ;当紫锥菊外植体是长度为4mm或9mm的叶柄外植体时，再生 培养基中DA-6的浓度为0. 01mg/L ;当紫锥菊外植体是长度为25mm的叶柄外植体时，再生 培养基中DA-6的浓度为0? 08mg/L ;当紫锥菊外植体是长度为9mm或25mm的根外植体时， 再生培养基中DA-6的浓度为0. 01mg/L。
[0007] 己酸二乙氨基乙醇酯（DA-6)是一种植物生长调节剂，通常用于田间栽培，很少用 于组织培养。申请人对某些特殊种质材料(各种不同倍性的紫锥菊）进行微繁殖时，发现培 养物对DA-6的加入非常敏感，在对部分生物量类型的外植体进行培养时，申请人在进一步 研究中却得到了不同于前期研究的实验结果，即DA-6会抑制不定芽再生，因此针对不同的 生物量类型，不同的外植体类型，需要摸索提高不定芽诱导率的最佳DA-6的浓度。
[0008] 优选地，本发明所述紫锥菊外植体在培养温度为25±4°C，光照强度为1000~ 2500 lux，光照时间为10~16 h/d的条件下培养7~60 d。
[0009] 更优选地，所述紫锥菊外植体在培养温度为25±4°C，光照强度为1000~2500 lux，光照时间为10~16 h/d的条件下培养35 d。
[0010] 优选地，所述再生培养基为添加有BA和NAA的MS培养基。
[0011] 现有技术中，通常用于组织培养诱导不定芽的植物生长调节剂是BA与NAA，前者 作为细胞分裂素来刺激细胞分裂，作为诱导再生途径的关键因子。在紫锥菊中，BA同样被 广泛应用于诱导不定芽。含有BA的再生培养基中，如果再添加DA-6,可以使BA诱导再生的 效果得到大大加强。 因此，更优选地，所述再生培养基是含有15~60g/L蔗糖、3~9g/L琼脂、0.01~ 0? 2mg/L NAA、0. 01 ~1. 50 mg/L BA 的 MS 培养基。
[0012] 与现有技术相比，本发明的有益效果： 本发明提供了一种高效的紫锥菊不定芽再生培养方法，即根据生物量不同和来源不同 的外植体，在培养基中添加不同浓度的DA-6,能够显著提升紫锥菊不定芽再生效率，并同时 克服在原有的单纯根据基因剂量和外植体来源添加DA-6的方法造成的部分生物量较小的 外植体再生效率受到抑制的问题，从而达到进一步提升不定芽再生效率的目的。该方法应 用前景广阔，具有很好的实际应用价值，能够产生较好的经济效益和社会效益。
【附图说明】
[0013] 图1为不同浓度DA-6对不同生物量叶片外植体不定芽再生效果的影响；1~5分别是 用0、0. 01、0. 08、0. 16、0. 32 mg/L的DA-6处理生物量较小（4X4 mm2)的叶片外植体；6~ 10分别是用〇、〇. 01、0. 08、0. 16、0. 32 mg/L的DA-6处理生物量中等（7X7 mm2)的叶片外植 体；11 ~15 分别是用 0、0? 01、0. 08、0. 16、0. 32 mg/L 的 DA-6 处理生物量较大（10X 10 mm2) 的叶片外植体。
[0014] 图2为不同浓度DA-6对不同生物量叶柄外植体不定芽再生效果的影响；1~5分 别是用〇、〇. 〇l、〇. 08、0. 16、0. 32 mg/L的DA-6处理生物量较小（4 mm)的叶柄外植体；6~ 10分别是用〇、〇. 01、0. 08、0. 16、0. 32 mg/L的DA-6处理生物量中等（9 mm)的叶柄外植体； 11~15分别是用0、0. 01、0. 08、0. 16、0. 32 mg/L的DA-6处理生物量较大（25 mm)的叶柄 外植体。
[0015] 图3为不同浓度DA-6对不同生物量根外植体不定芽再生效果的影响；1~5分别 是用0、0. 01、0. 08、0. 16、0. 32 mg/L的DA-6处理生物量较小（4 mm)的根外植体；6~10分 别是用〇、〇? 〇l、〇. 08、0. 16、0. 32 mg/L的DA-6处理生物量中等（9 mm)的根外植体；11~ 15分别是用0、0? 01、0. 08、0. 16、0. 32 mg/L的DA-6处理生物量较大（25 mm)的根外植体。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明，实施例将帮助更好地 理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。除非特别说明，实施例中采用的试剂和 方法为本领域常规使用的试剂和方法。
[0017] 所有无菌紫锥菊苗均在含有30 g/L蔗糖、0.01 mg/L NAA、以3~9 g/L琼脂固化 的MS培养基中，在培养温度为25±4°C，光照强度为1000~2500 lux，光照时间为10~16 h/d的条件下培养。
[0018] 实施例1 一、外植体准备：用剪刀从组培的完整紫锥菊苗上剪取叶片、叶柄和根各若干个。自来 水冲洗所采叶片、叶柄和根30分钟后，在超净工作台上把所有的叶片、叶柄