一种牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产生物技术领域，具体涉及一种牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检 测方法。
【背景技术】
[0002] 牙鲜（Paralichthys olivaceus)，隶属于硬骨鱼纲（Osteichthyes)，鱗形目 (Pleuronectiformes)，鱗亚目（Pleuronectoidei)，牙鲜科（Paralichthyidae)，牙鲜属 (Paralichthys)，为暖温性底层凶猛海鱼，个体大的可达800mm以上，它具有个体大、肉质 细嫩、脂满味美、易消化等特点，同时牙鲆又具有生长快、繁殖能力强、洄游性小、回归性强 的特点，是中国、日本等国重要的海水增养殖鱼类。
[0003] 牙鲆雌雄个体生长速度差异显著，在生产中，养殖全雌牙鲆比养殖普通牙鲆能大 幅度提高了养殖产量，产生更大的经济效益。通过人工诱导雌核发育技术，能在短时间内生 产全雌牙鲆并应用于养殖生产中。
[0004] 雌核发育技术虽然能快速实现牙鲆的全雌化，但雌核发育的后代仅具有母本的遗 传信息，这就在无形中排除了父本遗传信息的作用。在杂交一代中，某些性状的父本效应要 高于母本效应，因此，有效的将父本的优良性状传递到杂交子代中对最大限度的利用杂交 优势具有不可忽视的作用。
[0005] 传统的雄核发育诱导技术，需要对未受精的卵子进行灭活处理。灭活通常是利用 伽马射线、X射线或者紫外线照射来进行。虽然这些照射能有效的将卵子的遗传物质灭活， 但需要特定照射源，特别是伽马射线、X射线，除照射源外，另需特定的安全防护装备以确保 安全性。另外，所有的照射方法都需要卵子保护液来保护照射中的卵子的受精能力。综上 所述，利用照射灭活方法进行鱼类的雄核发育诱导不太具有便利性。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种牙鲆雄核发育双单倍体的 诱导及检测方法，本发明所建立的方法，只需对受精卵进行一定时间的冷休克处理，即可使 卵内核遗传物质失活，达到和射线照射灭活相同的效果。
[0007] 本发明所采用的技术方案为：一种牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法，包 括以下步骤：
[0008] 1)精子和卵子的采集：采集新鲜的牙鲆雄鱼精子和牙鲆雌鱼卵子；
[0009] 2)人工授精：用林格氏液对所述精子进行稀释，得到精子稀释液，将所述精子稀 释液和卵子进行混合，搅拌均匀后，向其中加入海水进行激活，得到经海水激活的精卵混合 物；
[0010] 3)冷休克处理诱导雄核发育单倍体：将经海水激活的精卵混合物转移至0-3°C的 海水中进行冷休克处理，冷休克处理后，转移至孵化缸内；
[0011] 4)诱导双单倍体：从孵化缸中选取上浮鱼卵，将所述上浮鱼卵转移至加压容器 中，加压至600-700kg/cm2,持续5-8分钟，缓慢泄压后，将所述上浮鱼卵转移至孵化箱内流 水孵化；即可得到含有雄核发育双单倍体个体的牙鲆群体。
[0012] 5)仔鱼倍性鉴定：对步骤3)和步骤4)中孵化得到的仔鱼分别进行倍性鉴定。
[0013] 林格氏液又被称为Ringer' s液，一种与哺乳动物的血液和淋巴大致等渗的盐溶 液，Ringer's溶液被广泛应用于组织、细胞和一些低等动物培养或保存。本发明中，林格氏 液为海水鱼用林格氏液。
[0014] 本发明中，经过冷休克处理后的受精卵会被诱导为雄核单倍体，所述雄核单倍体 在高静水压的环境下会被诱导为双单倍体，本发明操作简单，方便快捷，对比传统的雄核发 育诱导技术，具有明显优势。
[0015] 优选的，所述诱导及检测方法中，步骤5)仔鱼倍性鉴定的评判标准为：对步骤3) 中转移至孵化缸中孵化所得到的仔鱼用流式细胞仪进行倍性检测，检测结果中的单倍体， 即为雄核发育单倍体；对步骤4)孵化所得到的仔鱼，进行倍性检测，检测结果中的二倍体， 即为雄核发育双单倍体。
[0016] 优选的，所述诱导及检测方法还包括：6)微卫星检测：使用微卫星引物对步骤3) 得到的雄核发育单倍体进行父本遗传检测；使用微卫星引物对步骤4)得到的雄核发育双 单倍体进行纯合性检验。
[0017] 上述鉴定和微卫星检测，方便统计出最终诱导成功的结果和比例，对操作流程及 参数做进一步优化。
[0018] 优选的，步骤1)中在采集雄鱼精子和雌鱼卵子后，避光保存，并在解剖镜和显微 镜下对精子和卵子进行筛选。在筛选过程中，选取透明、饱满、大小均一的卵子和游动时间 长的精子，也就是说，选取从生物学的角度上说，繁殖力强的精子和卵子。
[0019] 优选的，步骤2)中所述林格氏液与精子的体积比为1:30-1:50,且所述精子稀释 液和卵子的体积比为1:10-1:30 ;加入的海水温度为15-19°C。
[0020] 优选的，步骤3)经海水激活的精卵混合物在10秒内转移至0-3°C的海水中进行冷 休克处理，冷休克处理的时间为15-60分钟。
[0021] 优选的，步骤4)中孵化缸中的培育温度为15-19°C，培育45-71分钟后，进行洗卵， 并选取上浮鱼卵。经过数据分析，在实验室条件下，上述配比得到的效果较好。
[0022] 进一步的，步骤4)中所述上浮鱼卵转移至静水压机进行加压，并在30秒内达到所 需压力，持续5-8分钟缓慢泄压后，将所述上浮鱼卵转移至孵化箱内流水孵化；即可得到含 有雄核发育双单倍体个体的牙鲆群体。
[0023] 优选的，步骤5)中在对仔鱼裂解后，使用DAPI染色后，再进行倍性鉴定。
[0024] DAPI 即 4'，6-二脒基 _2_ 苯基吲噪（4,，6-diamidino_2-phenylindole)，是一种 能够与DNA强力结合的荧光染料。使用所述DAPI对DNA进行染色，再用激光激发检测荧光 含量，便可得出DNA的相对含量，从而得知倍性。
[0025] 优选的，步骤6)中微卫星检验使用的微卫星引物为：Polil359TUF、HLJYP38、 Polil446TUF、BDHYP181。
[0026] 雄核发育单倍体父本遗传检测使用微卫星引物Polil359TUF和微卫星引物 HLJYP38 ;雄核发育双单倍体纯合性检验使用微卫星引物Po 1 i 1446TUF和微卫星引物 BDHYP181。
[0027] 其中，微卫星引物Polil359TUF的序列为：
[0028] F :如 SEQ ID N0 :1 所示；R :如 SEQ ID N0 :2 所示；
[0029] 微卫星引物HLJYP38的序列为：
[0030] F :如 SEQ ID N0 :3 所示；R :如 SEQ ID N0 :4 所示；
[0031] 微卫星引物Polil446TUF的序列为：
[0032] F :如 SEQ ID N0 :5 所示；R :如 SEQ ID N0 :6 所示；
[0033] 微卫星引物BDHYP181的序列为：
[0034] F :如 SEQ ID N0 :7 所示；R :如 SEQ ID N0 :8 所示。
[0035] 上述微卫星检验属于现有技术，本行业技术人员可以轻易得到，在此就不再赘述。
[0036] 本发明的有益效果为：
[0037] 1、本发明运用雄核发育的方法，可以有效的固定父本的优良遗传性状，并快速的 给予纯化用于杂交种的制备，可最大限度的发挥杂种优势。
[0038] 2、本发明提供的雄核发育双单倍体的诱导及检测方法，只需对受精卵进行一定时 间的冷休克处理，即可使卵内核遗传物质失活，达到和传统的雄核发育诱导技术中射线照 射灭活相同的效果。
[0039] 3、传统的雄核发育诱导及检测方法在对卵子进行照射时，需要使用特定的保护液 来保护卵子的受精能力。不同鱼类的卵子需要不同的保护液，因此针对特定的鱼，需要进行 不同保护液保护效果的实验，费时费力。本发明所建立的方法，只需将卵子和精子进行正常 的受精，无需事先进行照射，同时也免除了保护液的使用。
[0040]