改进的全生育期人工病圃棉花品种黄萎病抗性鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及棉花黄萎病鉴定领域，具体涉及改进的全生育期人工病圃棉花品种黄 萎病抗性鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 黄萎病（VerticilliumdahliaeKleb.)是棉花生产中的主要病害。20世纪60年 代以后，随着棉花面积的扩大，引种和调种频繁，棉花黄萎病开始扩展蔓延，而且日益严重。 有效控制黄萎病危害是棉花高产、稳产的关键，种植抗病品种是控制其危害的最经济有效 措施，而选育抗病品种的核心是准确评价品种的抗病性。
[0003] 棉花品种抗黄萎病性鉴定方法分为苗期鉴定方法和成株期鉴定方法。苗期鉴定 方法虽然快捷，但鉴定过程中进行了人为的伤根，其鉴定结果仅能体现品种的苗期抗性， 与品种的真实抗性存在差异。由于棉花黄萎病是一种成株期病害，发生危害期为棉花的 现蕾初期到收获期，且不同品种对黄萎病的抗性与生育期相关，采用成株期鉴定能更真实 反应棉花品种的抗黄萎病性。目前，成株期鉴定一般采用重病田或人工病圃，重病田鉴定 由于不能控制病原菌的数量、发病不均匀等问题，只能用于育种材料的初筛，人工病圃成 株期鉴定方法是对品种进行把关鉴定最可靠方法，并于2009年发布实施了国家标准GB/T 22101. 5-2009。然而，人工病圃成株期鉴定方法的准确性和稳定性仍亟待提高。
【发明内容】
[0004] 本发明的发明人为解决上述技术问题，从接菌量和接种方法、病害分级方法和结 果评价方面改进现有的棉花品种鉴定方法，提出并完成本发明。
[0005] 在抗病鉴定的过程中，人工病圃成株期鉴定方法存在一些较突出的问题：①建立 人工病圃必要的接种技术不成熟，主要是接菌量不精确（每公顷450kg_750kg)、接菌方法 不科学，大面积撒施菌种，然后翻耕，容易出现菌种分布不均匀的现象，最终导致发病不均 匀；②病害调查的分级标准不科学，病害严重度与产量损失之间关系不密切，不能反应品种 对病害的耐受性和抗病性；③抗病性评价方法不科学，依据发病高峰期一个点的病情指数 评价品种的抗病性，不能体现棉花品种整个生育期的抗病性。
[0006] 根据本发明的改进的全生育期人工病圃棉花品种黄萎病抗性鉴定方法，包括以下 步骤：
[0007] (1)培养鉴定用病原菌
[0008] 在超净台上，将分离纯化的棉花黄萎病菌，从马铃薯琼脂培养基（PDA)平板上的 菌落边缘挑取2mm2的新鲜菌块，接种到查比克液体培养基（NaN03,2 . 00g;Κ2ΗΡ04,1. 00g; KCI，0. 50g;MgS04 · 7Η20,0· 50g;FeS04,0.Olg;蔗糖 30.OOg;用水定容至 1000ml)中，置于 25°C下，150r/min，黑暗培养6d备用。制作玉米沙粒培养基，具体为将沙子和玉米粉按质量 比1 :1混匀，加入质量比12%的水，取300g装入1000ml的克氏瓶，0.IMPa，高压湿热灭菌 30min，冷却到室温备用；吸取上述液体培养的棉花黄萎病菌菌液15ml转接至装有玉米沙 粒培养基的克氏瓶中，随后放入到25°C培养箱中静置培养7d，待黄萎病菌的菌丝布满后， 将培养物掏出，自然条件下风干备用。
[0009] (2)建立病圃及接种
[0010] 在一定规格的水泥池（水泥池高出地面20cm，内深60cm，无底）内装入多年（10 年以上）未种植棉花的沙土壤；病原菌接种方法为种沟接种法，播种前将病原菌按每米行 长5g接种物的接种量（分生孢子含量为1X10s个/g干菌种）均匀地撒入播种沟内，使病 原菌与土壤混合均匀。当年种植感病对照品种，以检测病圃发病均匀性及发病程度，如果发 病不均匀或发病程度不够，应进行混匀措施或补接菌种，再种植一年感病对照品种，直至感 病对照品种发病均匀及发病程度符合要求后方可用于棉花品种黄萎病抗性鉴定试验。
[0011] (3)调查棉花黄萎病病情
[0012] 棉花黄萎病分级标准为：〇级，棉株健康，无病叶，生长正常；1级，棉株三分之一以 下叶片表现病状；2级，棉株三分之一以上，三分之二以下叶片表现病状；3级，棉株三分之 二以上叶片表现病状，未枯死；4级，棉株枯死。
[0013] (4)评价棉花品种抗黄萎病性
[0014] 将整个生育期的不同时期多次黄萎病病情指数进行求病程曲线下面积，然后校正 得到相对病情指数，依据国家棉花品种黄萎病抗性级别划分标准进行棉花品种抗黄萎病性 的评价。
[0015]根据本发明的鉴定棉花黄萎病抗性的人工病圃法，在以下四个方面产生有益效 果：
[0016] 1、接种方法科学，发病均匀一致。现有建立人工病圃接种病原菌一般采用棉籽培 养基或麦粒砂培养基，病原菌培养布满后易结成快，风干后不易粉碎，且棉籽有短绒存在， 风干粉碎后，容易结团，田间接种时不容易撒匀；本发明采用玉米沙粒培养基，病原菌培养 布满后，掏出风干即可，不需要粉碎，易于田间接种。现有建立人工病圃一般采用撒施翻耕 接种方法，即将培养好的菌种按面积撒施，然后翻耕，但在翻地和耙地过程中，混在表层土 壤中的病原菌容易被推移堆积而不均匀；本发明采用的接种方法为种沟接种法，将病原菌 按每米行长5g直接撒施在播种沟内，与土壤搅拌均匀后即可播种，病原菌在土壤中经过一 年的繁殖，随着当年的中耕、浇水、第二年的翻耕等农事操作，病原菌容易在整个病圃中混 匀，病圃发病均匀一直，有益于抗病鉴定结果的准确。
[0017] 2、病情调查分级标准科学、易掌握。病害调查分级标准是抗病鉴定的的重要环节， 以往的分级标准仅仅依据病斑面积占植株叶片面积的百分比来划分，没有体现与植株产量 之间的相关性，出现不同级别的病株之间产量差异不显著的或相同级别病株但产量差异显 著的现象，比如0级病株和1级病株之间产量差异不显著，同样的4级病株中有绝产的死株 也有产量略受影响的植株，不能反应棉株对病害的感病性和抗病性；本发明建立的病害分 级标准，是基于不同发病程度对棉株造成的产量损失不同建立的，不同级别之间的产量差 异显著，能充分体现不同发病程度病株对病害的感病性和抗病性；由于仅将死株定位4级， 实际应用中非常易于操作和掌握。
[0018] 3、充分反应棉花全生育期的抗病性，结果准确。棉花黄萎病是一种成株期病害，在 大田自然发病情况下，病害从现蕾前期到吐絮期均可发病危害，发生期长达1〇〇天，其病害 发展曲线呈"驼峰型"，历经棉花的苗期（后期）、蕾期、花期、花铃期、吐絮期（早期），几乎 覆盖了棉花的整个生育期。以往的研究表明不同棉花品种在不同生育期对黄萎病的抗性有 差异。以往的鉴定方法，一般采用发病高峰期的一次调查来评价品种的抗病性，也就是用发 病进程中的一个点的数据评价品种的抗病性，不能充分反应棉花整合生育期的抗病性。本 发明的方法将全生育期的病程曲线下面积（AUDPC)换算成相对病情指数，然后评价棉花品 种的抗病性，反应了棉花全生育期的抗性，结果准确可靠，适用于对国家（省）棉花品种区 域试验及其他试验的把关鉴定。
[0019] 4、经济、环保。本发明建立的人工病圃法，是建立一定规格的水泥池，可以防止病 原菌的传播及对环境的污染；本发明建立的种沟接种法，接种均匀一直，且当年即可达到鉴 定要求，当年可进行鉴定试验；且其接种量仅为原接种方法（撒施翻耕法）接种量的10%， 节省了人力物力。
【附图说明】
[0020] 图1显示种沟接种法现场。
[0021] 图2显示抗病对照和感病对照的发病情况。
[0022] 图3显示国家棉花品种区试试验中参试品种的发病情况。
【具体实施方式】
[0023] 一、前期准备工作
[0024] 1、鉴定用病原菌的培养方法
[0025] 在超净台上，将分离纯化的棉花黄萎病菌，从马铃薯琼脂培养基（PDA)平板上的 菌落边缘挑取2mm2的新鲜菌块，接种到查比克液体培养基（NaN03,2. 00g;K2HP04,1. 00g; KCI，0. 50g;MgS04 · 7Η20,0· 50g;FeS04,0.Olg;蔗糖 30.OOg;用水定容至 1000ml)中，置于 25°C下，150r/min，黑暗培养6d备用。制作玉米沙粒培养基，具体为将沙子和玉米粉按质量 比1 :1混匀，加入质量比12%的水，取300g装入1000ml的克氏瓶，0.IMPa，高压湿热灭菌 30min，冷却到室温备用；吸取上述液体培养的棉花黄萎病菌菌液15ml转接至装有玉米沙 粒培养基的克氏瓶中，随后放入到25°C培养箱中静置培养7d，待黄萎病菌的菌丝布满后， 将培养物掏出，自然条件下风干备用。
[0026] 2、建立人工病圃的建立方法
[0027] 建立一定规格的水泥池，水泥池高出地面20cm，内深60cm，无底。装入多年（10年 以上）未种植棉花的土壤。病原菌接种方法为种沟接种法，即按每米行长5g接种物（分生 孢子含量为1X10s个/g干菌种），将培养好的棉花黄萎病玉米沙粒培养物均匀地撒入播种 沟，使病菌与土壤混合均匀。当年种植感病对照品种，以检测病圃发病均匀性及发病程度， 正常情况下，采用上述接种方法，当年感病对照即可达到鉴定要求（病情指数50. 0左右）， 且发病均匀一致；如发现发病不均匀或发病程度不够，应进行混匀措施或补接菌种，再种植 一年感病对照品种，直至感病对照品种发病均匀及发病程度符合要求后方可用于棉花品种 黄萎病抗性鉴定试验。
[0028] 3、病圃的维护
[0029] 每年试验结束，及时将棉杆粉碎后混入土壤中，冬季禁止种植其它作物；试验过程 中如果发现感病对照的发病程度达不到要求，第二年应停止试验，接入适量的菌种，并种植 感病对照品种，直至感病对照品种发病均匀及发病程度符合要求后方可继续进行棉花品种 黄萎病抗性鉴定试验。
[0030] 4、对照品种的选择
[0031] 鉴定中选用一个感病对照和一个抗病对照。感病对照要求高度感病，选择标准为 正常年份病情指数能达到50. 0左右，且感病性稳定；抗病对照选用已推广应用的抗黄萎病 品种，正常年份病情指数在20. 0以下，且抗病性稳定。为减缓抗、感对照的抗性变异，可将 对照品种