一种利用ssr标记快速鉴定常规棉花品种真实性的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农作物技术领域，尤其涉及一种利用SSR标记快速鉴定常规棉花品种真实性的方法。
【背景技术】
[0002]种子是农作物生产中重要的生产资料，品种的真实性及纯度与产业发展及农民收益休戚相关。棉花是我国重要的经济作物，黄河流域是我国第二大产棉区，该地区棉花种植以常规棉花品种为主，品种鉴定主要依赖于形态鉴定，受鉴定者经验及环境影响较大，此夕卜，以分子标记为基础构建指纹库的方法虽然鉴定结果可靠，但工作量较大，操作繁琐，市场应用有一定的局限性。因此，迫切需要一种快速、简便检测品种纯度和真实性的方法。本方法利用品种间多态性较高、扩增带型单一的SSR引物进行检测，待测样品与标准样品单粒种子DNA等量混合，根据检测精度要求，准备10?20份重复，根据带型的杂合度进行统计，从而确定品种的纯度及与标准样的匹配度，该方法简单易行，时效性高，适用于黄河流域常规棉花品种商业化开发过程中权的保护。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种利用SSR标记快速鉴定常规棉花品种真实性的方法，旨在解决棉花新品种权保护及产业化开发过程中品种鉴别及种子纯度控制的问题。
[0004]本发明是这样实现的，一种利用SSR标记快速鉴定常规棉花品种真实性的方法，所述利用SSR标记快速鉴定常规棉花品种真实性的方法包括以下步骤:
[0005]步骤一，利用生产的主推品种及育种骨干亲本资源，对棉花微卫星标记数据库进行筛选，从中选择扩增带型清晰、多态性高、带型单一的SSR标记组建引物库；
[0006]步骤二，将待检测样品与标准样品单粒种子混合，利用液氮研磨后装入1.5ml离心管中，准备10-20份重复；
[0007]步骤三，利用热酚法提取DNA，紫外分光光度计定量后，稀释到50ng/ul待用；
[0008]步骤四，利用步骤一的SSR引物进行PCR扩增，扩增体系为10ul，内含PCR缓冲液，1.5mmol/L MgCl2, 200 μ mol/L dNTPs，50ng 微卫星引物和 50 ?10ng 模板 DNA，TaqDNA聚合酶IU ;反应程序:先94°C变性3min ;然后35个循环的反应为94°C 30s, 56°C 30s，72°C 30s ;最后 72°C延伸 7min ；
[0009]步骤五，取2.5μ1扩增产物加入1.5ul Loading Buffer混匀上样，8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳约2小时后硝酸银染色；
[0010]步骤六，统计扩增产物的带型，根据公式:
[0011]R = n/(N+n) X 100% ；
[0012]R:待测样品的纯合度；n:纯和带型数；N:杂合带型数；
[0013]计算品种的纯合度。
[0014]进一步，所述PAGE胶检测扩增产物带型为纯合带型或杂合带型。
[0015]进一步，所述PCR 缓冲液为 10mmol/L Tris-HCl, pH 8.3，50mmol/L KC1。
[0016]进一步，所述1.5ul Loading Buffer 含 300mmol/L 的 EDTA PH 7.0，36% 的甘油，0.05%的二甲苯青，0.05%的溴酚蓝。
[0017]进一步，根据步骤六的结果确定品种的真实性和纯度:
[0018]R彡95%，待测样品为目标品种，且纯度非常好；
[0019]90%^ R < 95%,待测样品为目标品种，但有少量混杂；
[0020]80%^ R < 90%，待测样品可能为目标品种，但混杂严重；
[0021 ] R < 80%，待测样品不是目标品种或者混杂极为严重，生产上不建议使用。
[0022]本发明提供的利用SSR标记快速鉴定常规棉花品种真实性的方法，利用分子标记技术进行分析，结果准确、可靠；直接以种子为检测样品，减少田间取样过程；通过带型的杂合与否进行判断，结果较为直观、清楚。本发明的方法简单易行，时效性高，适用于黄河流域常规棉花品种商业化开发过程中品种权的保护。
【附图说明】
[0023]图1是本发明实施例提供的利用SSR标记快速鉴定常规棉花品种真实性的方法流程图；
[0024]图2是本发明实施例提供的PAGE胶检测带型示意图；
[0025]图中:A:C1+CK ；B:C2+CK。
【具体实施方式】
[0026]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0027]下面结合附图1对本发明的应用原理作详细的描述。
[0028]如图1所示，本发明实施例的利用SSR标记快速鉴定常规棉花品种真实性的方法包括以下步骤:
[0029]SlOl:筛选品种间多态性较高、扩增带型单一的SSR引物，要求带型清晰、扩增稳定;
[0030]S102:将待检测样品与标准样品单粒种子混合，根据检测要求准备10-20份重复；
[0031]S103:采用热酚法提取种子DNA ；
[0032]S104:利用核心SSR引物进行PCR扩增；
[0033]S105:PAGE胶检测扩增产物带型(纯合带型或杂合带型)；
[0034]S106:根据杂合带型的比例确定品种的真实性和纯度，杂合带型低于10 V倩况下可认为与对照品种相同。
[0035]本发明的实施例具体步骤如下:
[0036]步骤一，利用生产上的主推品种及育种骨干亲本资源，对棉花微卫星标记数据库(CMD,Cotton Microsatellite Database)进行筛选，从中选择扩增带型清晰、多态性高、带型单一的SSR标记组建引物库；
[0037]步骤二，将待检测样品与标准样品单粒种子混合，利用液氮研磨后装入1.5ml离心管中，根据精度要求准备10-20份重复；
[0038]步骤三，利用现有技术的热酚法提取DNA，紫外分光光度计定量后，稀释到50ng/ul待用；
[0039]步骤四，利用步骤一的SSR引物进行PCR扩增，扩增体系为10ul，内含PCR缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50mmol/L KCl)，1.5mmol/L MgCl2,200 μmol/L dNTPs，50ng微卫星引物和50?10ng模板DNA，Taq DNA聚合酶1U。反应程序:先94°C变性3min ;然后35个循环的反应为94°C 30s，56°C 30s，72°C 30s ;最后72°C延伸7min ；
[0040]步骤五，取2.5 μ I 扩增产物加入 1.5ul Loading Buffer (含 300mmol/L 的 EDTAPH 7.0，36%的甘油，0.05%的二甲苯青，0.05%的溴酚蓝)混匀上样，8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳约2小时后硝酸银染色。；
[0041 ] 步骤六，统计扩增产物的带型，根据公式
[0042]R = n/(N+n) X 100%
[0043]R:待测样品的纯合度；n:纯和带型数；N:杂合带型数；
[0044]计算品种的纯合度；
[0045]步骤七，根据步骤六的结果确定品种的真实性和纯度:1)如果R多95%，待测样品为目标品种，且纯度非常好；
[0046]2)如果R < 95%，待测样品为目标品种，但有少量混杂；
[0047]3)如果R < 90%，待测样品可能为目标品种，但混杂严重；
[0048]4)如果R < 80%，待测样品不是目标品种或者混杂极为严重，生产上不建议使用。
[0049]通过以下的具体应用对本发明的应用效果做进一步的说明:
[0050]发明人在长期的棉花分子辅助育种实践中，利用黄河流域主推品种及课题组骨干亲本资源，对棉花微卫星标记数据库(CMD，Cotton Microsatellite Database)进行筛选，从中选择扩增带型清晰、多态性高、带型单一的23个SSR标记组建引物库。
[0051]对市场销售的2种包装鲁棉研36号进行真实性检测，由于只是一般的检测，选用4对引物，检测10个重复。
[0052]将鲁棉研36号(标记为CK)与待测样品(分别标记为Cl和C2)种子单粒混合，准备10个重复，利用现有技术中改进的热酚法提取DNA。用引物库中的4对引物(DPL0431、NAU1269, JESPRO12, NAU2826)进行PCR扩增后PAGE胶检测扩增产物带型，如图2所示。
[0053]通过带型统计可以发现，Cl与CK的一致性(纯合度)为45%，因此Cl为不同于鲁棉研36号的其它品种，C2与CK的一致性为93%，说明C2为鲁棉研36号品种。
[0054]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种利用SSR标记快速鉴定常规棉花品种真实性的方法，其特征在于，所述利用SSR标记快速鉴定常规棉花品种真实性的方法包括以下步骤: 步骤一，利用生产上主推品种及育种骨干亲本资源，对棉花微卫星标记数据库进行筛选，从中选择扩增带型清晰、多态性高、带型单一的SSR标记组建引物库； 步骤二，将待检样品与标准样品单粒种子混合，利用液氮研磨后装入1.5ml离心管中，准备10-20份重复； 步骤三，利用热酚法提取DNA，紫外分光光度计定量后，稀释到50ng/ul待用； 步骤四，利用步骤一的SSR引物进行PCR扩增，扩增体系为10ul，内含PCR缓冲液，1.5mmol/L MgCl2, 200 μ mol/L dNTPs，50ng微卫星引物和 50 ?10ng模板DNA，Taq DNA 聚合酶IU ;反应程序:先94°C变性3min ;然后35个循环的反应为94°C 30s，56°C 30s，72°C 30s ；最后72°C延伸7min ； 步骤五，取2.5 μ I扩增产物加入1.5ul Loading Buffer混勾上样，8%非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳2小时后硝酸银染色； 步骤六，统计扩增产物的带型，根据公式:R = n/(N+n) X 100% ； R:待测样品的纯合度；n:纯和带型数；N:杂合带型数； 计算品种的纯合度。2.如权利要求1所述的利用SSR标记快速鉴定常规棉花品种真实性的方法，其特征在于，所述PAGE胶检测扩增产物带型为纯合带型或杂合带型。3.如权利要求1所述的利用SSR标记快速鉴定常规棉花品种真实性的方法，其特征在于，所述 PCR 缓冲液为 1mmoI/L Tris-HCl，pH 8.3，50mmol/L KCl04.如权利要求1所述的利用SSR标记快速鉴定常规棉花品种真实性的方法，其特征在于，所述 1.5ul Loading Buffer 含 300mmol/L 的 EDTA PH 7.0，36% 的甘油，(λ 05% 的二甲苯青，0.05%的溴酚蓝。5.如权利要求1所述的利用SSR标记快速鉴定常规棉花品种真实性的方法，其特征在于，根据步骤六的结果确定品种的真实性和纯度: R≥95%，待测样品为目标品种，且纯度好； .90%^ R< 95%,待测样品为目标品种； .80 % R < 90 %,待测样品可能为目标品种； R < 80%，待测样品不是目标品种或者混杂极为严重。
【专利摘要】本发明公开了一种利用SSR标记快速鉴定常规棉花品种真实性的方法，首先筛选品种间多态性较高、扩增带型单一的SSR引物；将待检测样品与标准样品单粒种子混合，准备10-20份重复；采用热酚法提取种子DNA；利用核心SSR引物进行PCR扩增；PAGE胶检测扩增产物带型；根据杂合带型的比例确定品种的真实性和纯度。本发明利用品种间多态性较高、扩增带型单一的SSR引物进行检测，待测样品与标准样品单粒种子混合，提取DNA，准备10～20份重复，PCR扩增后PAGE胶检测，根据带型杂合度进行统计，确定品种的纯度及与标准样的匹配度，方法简单易行，时效性高，适用于黄河流域常规棉花品种商业化开发过程中品种权的保护。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104962640
【申请号】CN201510409202
【发明人】韩宗福, 孔凡金, 邓永胜, 王宗文, 王景会, 李汝忠
【申请人】山东棉花研究中心
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年7月14日