一种用于检测大豆脂肪酸脱氢酶合成基因b1型突变的引物及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测大豆脂肪酸脱氢酶合成基因B1型突变的引物及应用， 属于植物分子标记开发和作物分子辅助选择技术领域。
【背景技术】
[0002] 大豆为人类提供重要的植物油份，并且大豆的含油量是大豆最重要的经济性状。 商品大豆油主要包括大约11 %的软脂酸（16:0)，4%的硬脂酸（18:0)，25%的油酸（18:1)， 52%的亚油酸（18:2)和4%的亚麻酸（18:3) (Fehr，2007)。中国各地区的气候、土壤、水质 等自然条件以及品种选育方向均存在差异，为大豆种质资源品质特性的丰富变异创造了条 件，有利于筛选优异脂肪酸组成的大豆种质（盖均镒等，2001)。不饱和脂肪酸为人体必需 脂肪酸，在人体新陈代谢中具
[0003] 有重要的生理功能，油酸可有效降低血液中总胆固醇和有害胆固醇含量，营养学 家称之为"安全脂肪酸"，亚油酸具有抑制癌症，预防糖尿病和减少体内脂肪，减少血液中胆 固醇量，防止动脉硬化的作用，亚麻酸具有溶血栓，降血压防血小板凝集，健脑抗衰老等作 用（陈学珍，2004)。在大豆油脂中的不饱和脂肪酸具有重要的生理保健作用，不饱和脂肪 酸中油酸的稳定性最好，提高其含量可以延长贮藏期，但由于亚油酸和亚麻酸分别含有2， 3个不饱和双键，容易使油脂氧化变质，造成豆油及其食品味道不佳，营养价值降低。另外， 由于饱和脂肪酸能量低，不易消化吸收，过多食用会导致肥胖病和心血管疾病（杨柳等， 2006)。因此，提高油酸含量，降低亚油酸含量是大豆品质育种的重要目标之一。
[0004] 在油脂的合成途径中，脂肪酸脱氢酶2 (FAD2)在油酸前体向亚油酸前体的转变过 程中起到了至关重要的作用（Okuley等，1994 ;Schlueter等，2007)，在发育的大豆种子中， 2 个脂肪酸脱饱和酶GmFAD2-lA(Glymal0g42470)和GmFAD2-lB(Glyma20g24530)表达水平 最高，因此这2个基因被认为是控制大豆油酸含量的候选基因，并且越来越多的研宄者通 过改造这2个目标基因来培育高油酸含量的优质大豆品种。基因工程和候选基因分子育种 策略被用来培育高于80%油酸含量的优质大豆（Buhr等，2002 ;H〇shin〇等，2010 ;Pham等， 2010)，这些研宄成果证明了在GmFAD2-lA和GmFAD2-lB基因中的突变程度越严重，大豆油 脂中的油酸含量越高，同时油脂的稳定性也越强。
[0005] 我国作为大豆的发源地，具有丰富的大豆种质资源。目前，我国作物种质资源库己 保存的大豆种质资源达3万余份，居世界之首（汪越胜，2002)。然而利用传统的油分鉴定 方法对数目庞大的大豆资源进行鉴定工作量大，周期长的问题，目前尚没有一种能够快速 并且准确地检测控制大豆高油酸含量的B1型突变位点的方法。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种用于检测大豆脂肪酸脱氢酶合成基因B1型 突变的引物，所采取的技术方案如下：
[0007] 本发明的一个目的在于提供一种用于检测大豆脂肪酸脱氢酶合成基因B1型突变 的引物，该引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所示。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述引物快速检测大豆脂肪酸脱氢酶合成 基因B1型突变的方法，该方法以待测样品的DNA为模板，以如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2 所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，在对所获得的扩增产物进行酶切，最后利用电泳 鉴定酶切产物。
[0009] 所述方法的步骤如下：
[0010] 1)提取待测样品的DNA，备用；
[0011] 2)以步骤1)所得DNA为模板，以如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列 为引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
[0012] 3)利用内切酶对步骤2)所得PCR扩增产物进行酶切处理，获得酶切产物；
[0013] 4)利用电泳鉴定步骤3)所得酶切产物。
[0014] 优选地，步骤2)所述PCR扩增，扩增条件为：94°C预变性4min，94°C变性40s，52°C 退火30s，72°C延伸15s，共40个循环，再72°C延伸4min，4°C保温。
[0015] 优选地，步骤3)所述酶切处理，是利用Apal内切酶，在37°C下酶切过夜。
[0016] 更优选地，所述酶切，在10 y1酶切体系中Apal内切酶的用量为0.2 y1。
[0017] 优选地，步骤4)所述利用电泳进行鉴定，含有239bp条带的样品的大豆脂肪酸脱 氢酶合成基因发生B1突变。
[0018] 更优选地，所述利用电泳进行鉴定，只含有239bp条带的样品为大豆脂肪酸脱氢 酶合成基因B1突变纯合体，含有239bp和261bp条带的样品为大豆脂肪酸脱氢酶合成基因 B1突变杂合体。
[0019] 所述方法的具体步骤如下：
[0020] 1)提取待测样品的DNA，备用；
[0021] 2)以步骤1)所得DNA为模板，以如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列 为引物进行PCR扩增，扩增条件为：94°C预变性4min，94°C变性40s，52°C退火30s，72°C延 伸15s，共40个循环，再72°C延伸4min，4°C保温，获得PCR扩增产物；
[0022] 3)利用Apal内切酶对步骤2)所得PCR扩增产物在37°C下酶切过夜，获得酶切产 物；
[0023] 4)利用电泳鉴定步骤3)所得酶切产物，含有239bp条带的样品的大豆脂肪酸脱氢 酶合成基因发生B1突变。
[0024] 所述任一方法用于筛选和鉴定大豆脂肪酸脱氢酶合成基因B1型突变体。
[0025] 本发明有益效果：
[0026] 本发明是在克隆出的大豆脂肪酸脱氢酶合成基因GmFAD2-lB基础上，通过比较高 油酸大豆B1和普通油酸含量大豆BAY的GmFAD2-lB基因序列，首次发现了位于409bp处的 单碱基突变（C-G)，且该突变导致油酸含量变化。
[0027]本发明针对B1突变位点设计了 1套分子标记（上游引物FAD2-1B-F2D，下游引物 FAD2-1B-R2,如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所示）进行包含突变位点的PCR扩增，并利用核 酸内切酶Apal对扩增产物进行酶切反应，最后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对酶切产物进行 片段分离，最终鉴定出B1突变位点。其中，本发明所涉及的引物和酶切鉴定反应能够快速 并且准确地检测控制大豆高油酸含量的B1型突变位点，本发明可以大大缩短高油酸大豆 材料的筛选周期，为高油酸大豆品种的培育提供了分子标记资源。
【附图说明】
[0028] 图1为GmFAD-2-lB(大豆脂肪酸脱氢酶合成基因）B1型突变位点。
[0029] 图2为利用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定出B1突变位点；
[0030](其中鉴定到蓝色箭头所指片段包含B1突变位点，Lanel为A3XB1-1杂合个体；Lane2为A3XB1-2杂合个体，Lane3为A3XB1-3杂合个体；Lane4为A3XB1-4杂合个体； Lane5为A3XB1-5杂合个体；Lane6为A3XB1-6杂合个体；Lane7为A3XB2杂合个体； LanelO为A3XB1-7杂合个体；Lanel2为合丰XB2杂合个体；Lanel3为黑农XB1杂合个 体；Lanel4为中黄XB2-1杂合个体；Lanel5为中黄XB2-2杂合个体；LaneBl为B1纯合个 体；Lane34为He3e4e7 ;Lane合为合丰纯