合个体；Lane中为中黄纯合个体）。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0032] 以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规 材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[0033] 实施例1
[0034] 1)首先克隆出高油酸大豆B1和普通油酸含量大豆BAY的GmFAD2-lB基因序列 (NCBIID为100805777,大豆基因组数据库序列编号为：Glyma20g24530)，利用DNAstar 软件进行序列比对首次发现了单碱基突变（序列比对结果见附图1)，该突变位点发生在 GmFAD-2-lB的409bp处，SNP突变为野生型BAY的C变成A3型的G。同时提供待测样品的 DNA〇
[0035] 2)根据步骤1)中突变位点设计dCAPS标记的上游引物FAD2-1B-F2D，下游引物 FAD2-1B-R2 (如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所示），利用以待鉴定材料的基因组DNA作为模 板进行GmFAD2-lB突变位点的PCR扩增，所采用的PCR反应体系（表1)及扩增程序如下：
[0036] 表1PCR反应体系
[0037]
[0038]PCR扩增条件为：94°C预变性4min，94°C变性40s，52°C退火30s，72°C延伸15s，共 40个循环，再72°C延伸4min，4°C保温。
[0039] 3)对步骤2)中的PCR产物进行酶切反应，取PCR产物为模板，分别加入lyl NEB4#buffer，0. 2y1Apal内切酶，最后用3. 8y1超纯水补齐至总反应体积101y1，37°C 过夜酶切。
[0040] 4)取步骤3)中的酶切产物5y1，加入1y1 6Xloadingbuffer，点样于制备好的 聚丙烯酰胺凝胶点样孔内进行电泳。
[0041] 其中，电泳所需试剂及具体反应流程如下。
[0042] 实验试剂：30%丙烯酰胺储存液（37. 5:1)避光保存；1. 5MTris-HClbuffer(pH 8.8) ;0.5MTris-HClbuffer(pH6.8) ;10%APS(过硫酸铵）；TEMED;1XTris-glycine电 泳缓冲液。
[0043] 配制分尚胶：根据具体胶板容量的大小配制相应体积的分尚胶，以l〇ml12% 分离胶为例，依次加入双蒸水3. 43ml;30%丙稀酰胺4ml;1.5MTris-HClbuffer(pH 8. 8)2. 5ml;10%APS60y1;TEMED13y1。灌胶之后在胶面上加入lml水保证胶面的平整。
[0044] 配制浓缩胶胶：以5ml12%浓缩胶为例依次加入双蒸水3ml;30%丙烯酰胺 700y1 ;1. 5MTris-HClbuffer(pH8. 8) 1. 25ml;10%APS25y1;TEMED20y1。灌胶之后 立即插入梳子。
[0045] 待浓缩胶凝固好后，将PCR扩增产物加样于非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳， 电泳条件为230V电泳2~3小时（具体时间根据目标片段大小），电泳结束后将胶置于EB 溶液中染色15分钟，用蒸馏水洗去残留的EB，于DNA凝胶成像系统中成像并统计带型。
[0046] 5)根据步骤4)中的凝胶成像结果检测出B1突变位点，如附图2所示，鉴定出箭 头所指的239bp条带的个体包含有B1突变位点。纯合的B1突变个体为239bp的单一条带 (箭头所指示的条带），包含有B1突变位点的杂合个体具有双条带（239bp和261bp)。
[0047] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此 技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保 护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种用于检测大豆脂肪酸脱氢酶合成基因BI型突变的引物，其特征在于，核苷酸序 列如 SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2 所示。2. -种利用权利要求1所述引物快速检测大豆脂肪酸脱氢酶合成基因Bl型突变的方 法，其特征在于，以待测样品的DNA为模板，以如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所示的核苷酸 序列为引物进行PCR扩增，在对所获得的扩增产物进行酶切，最后利用电泳鉴定酶切产物。3. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤如下： 1) 提取待测样品的DNA，备用； 2) 以步骤1)所得DNA为模板，以如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列为引 物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物； 3) 利用内切酶对步骤2)所得PCR扩增产物进行酶切处理，获得酶切产物； 4) 利用电泳鉴定步骤3)所得酶切产物。4. 权利要求3所述方法，其特征在于，步骤2)所述PCR扩增，扩增条件为：94°C预变性 4min，94°C变性40s，52°C退火30s，72°C延伸15s，共40个循环，再72°C延伸4min，4°C保温。5. 权利要求3所述方法，其特征在于，步骤3)所述酶切处理，是利用ApaI内切酶，在 37 °C下酶切过夜。6. 权利要求5所述方法，其特征在于，所述酶切，在10 y 1酶切体系中ApaI内切酶的用 量为0? 2 y 1。7. 权利要求3所述方法，其特征在于，步骤4)所述利用电泳进行鉴定，含有239bp条带 的样品的大豆脂肪酸脱氢酶合成基因发生Bl突变。8. 权利要求7所述方法，其特征在于，所述利用电泳进行鉴定，只含有239bp条带的样 品为大豆脂肪酸脱氢酶合成基因Bl突变纯合体，含有239bp和261bp条带的样品为大豆脂 肪酸脱氢酶合成基因Bl突变的杂合体。9. 权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤如下： 1) 提取待测样品的DNA，备用； 2) 以步骤1)所得DNA为模板，以如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列为 引物进行PCR扩增，扩增条件为：94°C预变性4min，94°C变性40s，52°C退火30s，72°C延伸 15s，共40个循环，再72°C延伸4min，4°C保温，获得PCR扩增产物； 3) 利用ApaI内切酶对步骤2)所得PCR扩增产物在37°C下酶切过夜，获得酶切产物； 4) 利用电泳鉴定步骤3)所得酶切产物，含有239bp条带的样品的大豆脂肪酸脱氢酶合 成基因发生Bl突变。10. 权利要求2-9所述任一方法，其特征在于，用于筛选和鉴定大豆脂肪酸脱氢酶合成 基因Bl型突变体。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测大豆脂肪酸脱氢酶合成基因B1型突变的引物及应用，属于植物分子标记开发和作物分子辅助选择技术领域。本发明提供引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示。同时，本发明还提供了一种利用该引物快速检测大豆脂肪酸脱氢酶合成基因B1型突变位点的方法，该方法是以待测样品的DNA为模板，以如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，在对所获得的扩增产物进行酶切，最后利用电泳鉴定酶切产物。本发明所涉及的引物和酶切鉴定反应能够快速并且准确地检测控制大豆高油酸含量的B1型突变位点，本发明可以大大缩短高油酸大豆材料的筛选周期，为高油酸大豆品种的培育提供了分子标记资源。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104962632
【申请号】CN201510386751
【发明人】任航, 南海洋, 张倩
【申请人】黑龙江富航农业科技有限公司
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年6月30日