一种延长芍药切花瓶插寿命的方法

一种延长芍药切花瓶插寿命的方法
【专利摘要】本发明属于园艺技术领域，具体涉及一种延长芍药切花瓶插寿命的方法。该方法是在芍药花朵处于硬蕾期时，在茎秆第3～4片复叶处进行剪切，迅速将伤口置于水中斜切茎秆基部，留取3片小叶2片复叶，将剪切好的芍药切花茎秆置于30～100mg·L?1纳米银溶液中，静置处理36h，而后瓶插于2％的蔗糖溶液中，瓶口用锡箔纸覆盖，防止水分蒸发。本发明方法操作简便，易于在生产上推广应用，对环境无污染，可回收再利用，生产成本较低；并能有效地提高了芍药切花瓶插的观赏品质。
【专利说明】
_种延长苟药切花瓶插寿命的方法
技术领域
[0001] 本发明属于园艺技术领域，具体涉及一种延长芍药切花瓶插寿命的方法。
【背景技术】
[0002] 芍药属于芍药科芍药属宿根草本植物，是中国的传统名花。作为一种名贵花卉，芍 药花大色艳、花型端庄、花香袭人，是作为切花的良好材料，近年来在国内外较为流行，广泛 应用于婚礼等喜庆场合，市场前景十分广阔。但由于芍药花期短暂，自然花期主要集中于4 ~5月，其切花脱离母体后，其自然瓶插寿命仅为7天左右，这造成芍药切花供应期短，显著 影响了芍药切花产业的发展。因此，找到一种能够使芍药切花保鲜、延长其瓶插寿命、增强 观赏效果的方法至关重要。
[0003] 芍药切花采后生理生化会发生很大变化。首先是水分亏缺，这是影响芍药切花瓶 插寿命的主要因素之一。保持苟药切花充足的水分对维持切花正常膨压与代谢活动都是必 要的，因此，维持花枝水分及水分导度是抑制切花早期衰老、延长瓶插寿命的主要因子。而 通过目前的研究得知，花枝导管堵塞是造成切花贮藏后期花枝吸水力下降的原因之一。其 次是膜脂过氧化，这是影响芍药切花衰老的又一主要因素。芍药切花采后的可溶性蛋白质 含量持续下降，超氧化物歧化酶(S0D)、过氧化物酶(P0D)、过氧化氢酶(CAT)等保护酶活性 下降，是其膜透性增大的重要原因之一。针对以上两个影响芍药切花衰老的主要生理生化 变化，目前在生产上主要采用物理和化学两种保鲜技术。物理保鲜技术主要是采用低温冷 藏，这种保鲜方法因使用范围和操作技术等限制，很难广泛使用。王荣花等在《杀菌剂和低 温贮藏对芍药切花保鲜及其生理变化的影响》一文中指出，4~10°C的预冷处理6h可以降低 切花的呼吸速率，延长瓶插寿命和1C藏保鲜期；但Waltona等人在《The dynamics of starch and sugar utilisation in cut peony(Paeonia lactiflora Pall.)stems during storage and vase life》中也指出，0°C的8周冷藏使得苟药切花的瓶插寿命缩短 了近4天。而与物理保鲜技术相比，前人对化学保鲜技术的研究更为深入。魏秀俭等在《苯甲 酸钠在芍药切花保鲜中的作用研究》中使用500mg/L的苯甲酸钠作为保鲜液可以延长瓶插 寿命2天;徐萌等在《不同植物生长调节剂对芍药切花保鲜效果的影响》一文中分别在30g/L 蔗糖+200mg/L 8-羟基喹啉+150mg/L柠檬酸中添加200mg/L多效唑和200mg/L矮壮素作为瓶 插液，芍药切花的瓶插寿命分别延长3天和2.8天。这几种物质虽然可以作为芍药切花保鲜 剂使用，但其瓶插寿命最多只能延长3天。中国发明专利(CN104255714 B)公开了一种牡丹、 芍药鲜切花保鲜液，它是由有益菌液、无水亚硒酸盐、抗氧化剂、锌盐和水构成。该发明能有 效延长牡丹、芍药鲜切花的观赏时间，并且具有安全、无毒、无污染的特点，但这种保鲜液成 分存在配置工艺复杂、成本较高等缺点。姚连芳等人在《采前喷钙采后贮藏对芍药月季瓶插 寿命影响》一文中分别于芍药切花采前一周、3天、2天重复喷钙处理3次，可延长其瓶插寿命 2~3天。这一方法处理次数多、操作繁琐、需要耗费较多的人力、物力。因此，发明一种高效、 经济、安全无毒、无污染、工艺简单的芍药切花保鲜剂及其操作方法就显得尤为必要。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于解决芍药作为切花生产时其瓶插寿命过短的问题，提供一种能 够显著延长芍药切花瓶插寿命的保鲜剂及其操作方法，该保鲜剂经济、安全无毒、无污染， 操作方法简便易行，可在生产上大规模推广应用。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] -种延长芍药切花瓶插寿命的方法，是在芍药花朵处于硬蕾期时，在茎杆第3~4 片复叶处进行剪切，迅速将伤口置于水中斜切茎杆基部，留取3片小叶2片复叶将剪切好的 芍药切花茎杆置于30~100mg · Γ1纳米银溶液中，静置处理36h，而后瓶插于2%的蔗糖溶液 中，瓶口用锡箱纸覆盖，防止水分蒸发。
[0007] 上述方法中，剪切好的芍药切花的花枝长度为30cm。
[0008] 本发明中所述的硬蕾期，是本领域技术人员所熟知的，例如按文献《芍药花蕾成熟 及开花的阶段划分与形态类型》(成仿云、高水平、于晓南，园艺学报，2009,36(4) :611-613) 划分。
[0009] 本发明的方法主要是通过提高S0D、CAT等保护酶活性的来清除芍药切花体内的自 由基，从而减少MDA、0'H2〇 2等有害物质的积累；与此同时，该方法有效抑制了芍药花茎末端 切口微生物繁衍，减轻茎杆导管的堵塞程度，从而很好地维持了切花体内的水分平衡，最终 延长了芍药切花的瓶插寿命。
[0010]本发明的有益效果体现在：
[0011] (1)该方法操作简便，易于在生产上推广应用，对环境无污染，可回收再利用，生产 成本较低。
[0012] (2)该方法实用效果显著，不仅能显著延长芍药切花的瓶插寿命(可达4天），还可 以增加花朵的直径和鲜重，改善植株本身的水分运输，有效地提高了芍药切花瓶插的观赏 品质。
[0013] (3)该方法主要是通过提高S0D、CAT等保护酶活性的来清除芍药切花体内的自由 基，从而减少MDA、0'H2〇2等有害物质的积累；与此同时，该方法有效抑制了芍药花茎末端切 口微生物繁衍，减轻茎杆导管的堵塞程度，从而很好地维持了切花体内的水分平衡，最终延 长了芍药切花的瓶插寿命。
【附图说明】
[0014] 图1是纳米银处理对芍药切花瓶插寿命的影响。
[0015] 图2是纳米银处理对芍药切花鲜重、花径的影响。
[0016]图3是纳米银处理对芍药切花生理指标的影响。
[0017] 图4是纳米银处理对芍药切花保护酶活性的影响。
[0018] 图5是Ag+在芍药切花不同部位的分布。
[0019] 图6是纳米银处理对芍药切花吸水量的影响。
[0020] 图7是芍药切花底部茎杆扫描电镜观察。
[0021] 图8是分离菌株菌落形态及分生孢子形态；1:1号分离物;2: 2号分离物;A:菌落正 面;B:菌落背面;C:分生孢子。
[0022]图9是分离菌株PCR电泳图；1:1号分离物;2:2号分离物。
[0023]图10是1号分离菌株序列Blast比对结果。
[0024]图11是2号分离菌株序列Blast比对结果。
【具体实施方式】 [0025] 实施例1
[0026] 以生产上栽培应用普遍的芍药品种'红艳争辉'（购于山东菏泽春秋园艺中心）为 试材来开展本研究工作，田间栽植于扬州大学园艺与植物保护学院芍药种质资源圃（32° 3〇1，119°254)中：
[0027] 1、纳米银溶液的配制:本发明所使用的纳米银为上海沪正纳米科技有限公司生产 (原浓度为l〇〇〇mg · I/1)，使用去离子水将其稀释成30和100mg · I/1，所有溶液现配现用。
[0028] 2、材料准备:选取无病虫害、发育程度一致、花朵处于硬蕾期(按文献《芍药花蕾成 熟及开花的阶段划分与形态类型》划分）的芍药植株，在茎杆第3~4片复叶处进行剪切，迅 速将伤口置于水中斜切茎杆基部，留取3片小叶2片复叶，花枝长度为30cm。
[0029] 3、处理:将剪切好的芍药切花茎杆置于30mg · I/1纳米银溶液中，以去离子水为对 照，静置处理36h，而后分别插于2%的蔗糖溶液中，瓶口用锡箱纸覆盖，防止水分蒸发，置于 室内正常环境条件下。
[0030] 4、芍药切花瓶插寿命观察及其他指标的测定：
[0031] (1)瓶插寿命观察:从瓶插当天开始，每天观测记录切花的外观变化，以花瓣出现 萎蔫脱落为瓶插寿命的终止，记录瓶插天数。
[0032] (2)形态指标的测定:在瓶插期间，每天同一时间使用游标卡尺(0-150,台州市新 上量量具有限公司）准确测量花朵直径，使用电子天平(T-500,常熟双杰测试仪器厂)精确 测量花朵鲜重。
[0033] (3)生理指标的测定：
[0034] ①相对电导率:取新鲜的样品，用去离子水洗净，使用直径lcm的打孔器打孔；取 〇. 2g放置于戴塞试管，加入20mL去离子水，每个处理重复3次;25 °C 80khz下超声15min，测定 电导率值记为R1;室温静置30min，煮沸15min，冷却后测定电导率值记为R2。计算公式:相对 电导率= R1/R2X100%。
[0035] ②可溶性蛋白含量、丙二醛含量、超氧阴离子自由基含量、过氧化氢含量、脯氨酸 含量的测定均参照试剂盒的说明书进行(南京建成生物工程研究所）。
[0036] (4)保护酶活性的测定:超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性的测定均参照试剂盒的 说明书进行(南京建成生物工程研究所）。
[0037] (5)离子运输与水分吸收测定：
[0038]① Ag+含量:采用ICP方法测定芍药植株中的Ag+含量。在瓶插第2、4、6、8天采取对照 芍药和纳米银处理植株的底部茎杆2cm、顶部茎杆2cm、花瓣和叶片，置于烘箱中杀青，而后 烘干至恒重。分别称取茎杆顶部和底部干样各〇.2g、花瓣和叶片各0.5g，将其放在灰化炉中 (HKKH3000，恒科煤质化验设备公司），每分钟升温15°C，700°C后保持5h直至样品全部灰化。 取出后冷却至室温，用lmL 98%HN〇3溶解灰分，将其转移到10mL容量瓶中，并用超纯水稀 释，使用混合纤维素酯微孔滤膜(孔径〇.45μπι)过滤，最终使用Optima 7300 DV电感耦合等 离子体光谱仪(美国PerkinElmer)测定苟药样品中Ag+含量。
[0039] ②吸水量:瓶插期间，每天同一时间测量瓶子+瓶插液的重量，记为W，则第η天吸水 量为 W(n)-W(n+1)。
[0040] (6)扫描电镜观察:取茎杆基部5mm固定在2.5%戊二醛溶液中，3h后用0.1M PBS缓 冲液冲洗3次，每次15min，经过50 %、70 %、85 %、95 %、100 %酒精梯度脱水，每次15min，丙 酮和无水乙醇混合液处理15min，C02临界点干燥，喷金，将其置于扫描电镜(XL-30ESEM，荷 兰Phi 1 ips)下观察茎杆底部堵塞情况。
[0041] (7)病原菌的鉴定：
[0042]①土豆培养基的配制:新鲜去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL。 将200g马铃薯在适量的水中煮沸，纱布过滤，滤液中加20g蔗糖并搅拌使其溶解，将滤液用 蒸馏水补足至l〇〇〇mL，加入20g琼脂，加热使琼脂完全融化后，高温高压（121°C、110kPa)灭 菌20min(LDZX-50XBS，上海申安医疗器械厂），而后用于真菌分离与保存。
[0043] ②病样采集:将瓶插芍药花枝的底部茎杆切下，浸没在0.5%次氯酸钠溶液中消毒 2min左右，然后用灭菌蒸馏水冲洗2~3次，用灭菌滤纸将组织块表面的水分吸干，将组织块 分散放置于土豆培养基中，25°C黑暗条件下培养3天，待长出菌落后立即纯化。
[0044] ③病原菌形态学特征观察:将分离纯化的菌落块接种至土豆培养基中，25°C黑暗 条件下培养3天，观察菌落形态。待培养基上生长出菌丝后，挑针刮取徒手切片，在显微镜下 观察其孢子形态，并拍照。
[0045]④病原菌分子生物学鉴定：gDNA提取参照真菌基因组DNA快速抽提试剂盒说明书 进行(上海生工生物工程有限公司）。采用ITS4(28S)和ITS5(18S)引物扩增整个ITS区序列， 包含其两端的18S rDNA、28S rDNA的部分序列和中间的ITS1、5.8S rDNA、ITS2的完整序列。 引物序列为：ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'（SEQIDN0·1)，ITS5 :5'-GGAAGGTAAAAGTC AAGG-3'（SEQ ID N0.2)。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并与 DL2000 Marker比对大小，切胶分离回收产物。将纯化后的PCR产物送至上海生物工程技术 服务有限公司进行测序，测得的序列采用NCBI网站在线工具BLAST (http:// WWW.ncbi .nlm.nih.gov/blast/)进行比对，根据比对结果，判断菌株的种类。
[0046] PCR反应体系：
[0047]
[0048] 反应条件：
[0049]
[0050] 5、结果：
[00511①纳米银处理对芍药切花瓶插寿命的影响
[0052]芍药切花在瓶插期间经历了由花蕾到初开、盛开、衰败的过程，这一过程大约为8 天时间。在使用30mg · Γ1纳米银处理后，芍药切花不仅提前到达初开期，而且花朵绽放的时 间更长，衰败时间比对照推迟了4天（图1)。而在使用100mg · Γ1，纳米银处理后，苟药切花的 瓶插寿命也延长了 2天。由此可见，纳米银处理能够延长芍药切花的瓶插寿命，但不同浓度 差异显著，下面将着重针对30mg · Γ1纳米银处理材料进行深入研究。
[0053] ②纳米银处理对芍药切花鲜重、花径的影响
[0054]图2为芍药切花瓶插期间鲜重、花径的变化情况，两者均总体上呈现了先上升后下 降的趋势。而就纳米银处理而言，芍药切花在瓶插的第1-2天时，两者的差异并不大，而后差 异逐渐变大，并且NS处理后的切花鲜重、花径一直高于对照，最大差异达到6.58g和3.52cm。
[0055] ③纳米银处理芍药切花生理指标的影响
[0056] 由图3可知，芍药切花在瓶插期间可溶性蛋白含量也呈现了先增加后减少的趋势， 只是对照的最高含量出现在第4天，而纳米银处理的最高含量出现在第6天。此外，在瓶插第 2和4天时，纳米银处理切花的可溶性蛋白含量一直低于对照，而后开始急剧增加，显著高于 对照，在瓶插第6天时差异最大，达到0.24gprot · L一、
[0057] 相对电导率是反映细胞膜的通透性、细胞受损程度的指标，通过测量芍药切花的 相对电导率可以直观地了解其细胞膜受损程度。在芍药切花的整个瓶插期间，纳米银处理 切花和对照的相对电导率均呈现一直上升趋势，其两者衰败期的值分别是花蕾期的1.63倍 和1.29倍。此外，对照切花的相对电导率一直高于纳米银处理，其高出的幅度范围在6.36% ~18.43%之间。
[0058] MDA含量反映芍药内脂质过氧化程度，间接地反映出细胞损伤程度，通过测量芍药 切花MDA含量可以直接地了解其膜脂过氧化程度。在芍药的整个瓶插期间，纳米银处理切花 和对照的MDA含量一直呈现上升趋势，在瓶插初期，两者的MDA含量分别为4.00nmol · mg一 iprot和7.18nmol · mgHprot。随着瓶插时间的增加，花朵衰败，此时的MDA含量分别达到了 8.73nmol · mg-brot和8.9nmol · mg-brot。对照切花的MDA含量一直高于纳米银处理，高出 约为3nmol · mg-iproto
[0059]植物体内产生超氧阴离子不能被及时清除造成膜脂过氧化，引起切花衰老。NS处 理切花和对照的超氧阴离子含量随着花的开放进程不断增加，两者初期的超氧阴离子含量 分别为16U · g-brot和29U · g-brot，衰败期的含量分别为蕾期的1.95倍和1.55倍。此外， 对照切花的超氧阴离子含量一直NS处理，高出幅度在80 %~95 %之间。
[0060] 在芍药的整个瓶插期间，纳米银处理切花和对照的h2〇2含量一直呈现上升趋势，瓶 插初期，纳米银处理切花和对照的H2〇2含量分别为136mmol · g-iprot和141mmol · g-iprot， 衰败期的含量分别为蕾期的1.95倍和1.55倍。而且对照切花的含量始终高于纳米银处理， 高出幅度约为3%-16%。
[0061] 脯氨酸的积累一定程度上反映了植物水分亏缺程度。图3显示的是整个瓶插过程 中纳米银处理切花和对照的游离脯氨酸含量的变化，两者整体都呈现上升趋势，初期含量 分别为35.8yg · g-_和45.3yg · g-_，瓶插末期两者的含量分别为初期的1.11倍和1.76 倍。对照切花的游离脯氨酸含量一直高于纳米银处理，高出量l〇yg · g^FW左右。
[0062] ④纳米银处理对芍药切花保护酶活性的影响
[0063]纳米银处理切花和对照切花的S0D活性在瓶插期间的变化趋势相一致，总体呈现 先上升后下降的趋势，两者均在瓶插第4天达到最大值，分别为44.8U · mgiprot和40.2U · mgiprot，比对照高11.4%，并在整个瓶插期间纳米银处理切花的S0D活性要比对照的高（图 4)〇
[0064]纳米银处理切花和对照的CAT活性与S0D活性一样，呈现先上升后下降的趋势，纳 米银处理切花的最高活性出现在第8天，而对照的最高活性出现在第6天。两者蕾期的CAT活 性分别为2.12U · mg-^rot和0.62U · mg-^rot，而最高活性分别为蕾期的3.77倍和7.1倍。 纳米银处理切花的CAT活性一直高于对照，高出幅度范围在1.6~6.0U · mgiprot之间（图 4)〇
[0065]⑤纳米银处理对芍药切花离子运输与水分吸收的影响
[0066]通过对Ag+在芍药切花不同部位的分布检测，结果显示，纳米银处理的切花在整个 植株中均能检测到Ag+的存在，而对照中均未检测到Ag+或低于检测线（图5)。在纳米银处理 的切花不同部位中，底部茎杆的六8 +含量最高(44.26~87.34以8 1^)1)，而后是叶片（1.44 ~6.13yg · g-tW)和顶部茎杆(0.46~1.59yg · g-tW)，花瓣中的Ag+含量最低（0.35~0·82μ g · g^DW)，并且它们的含量均随着瓶插时间的推移而下降。
[0067]芍药切花瓶插期间，纳米银处理切花和对照的吸水量总体呈现下降趋势，瓶插第2 天，两者的吸水量分别为6.0g和5.2g，瓶插末期，两者的吸水量分别为蕾期的20 %和67 %， 但纳米银处理切花的吸水量普遍高于对照（图6)。
[0068]⑥芍药切花底部茎杆结构观察
[0069] A:对照瓶插0天;B:纳米银处理瓶插0天;C:对照瓶插8天;D:纳米银处理瓶插8天 [0070]采用扫描电镜对底部茎杆结构进行观察，无论是NS处理还是对照，两者的结构完 全一致（图7)。在瓶插初期，两者的导管组织结构清晰可见，几乎观察不到微生物的存在(图 7A、B)。而到了瓶插第8天，对照切花底部茎杆被大量微生物代谢物或菌丝所覆盖(图7C)，而 NS处理的底部茎杆几乎观察不到被微生物代谢物或菌丝所覆盖的现象(图7D)。
[0071]⑦芍药切花瓶插易滋生病原菌种类鉴定
[0072]将瓶插芍药切花的底部茎杆在土豆培养基平板上培养后，共分离出两种分离物 (图8)，1号分离物在平板上菌落初为灰白色，随后逐渐转变为灰黑色，生长迅速，8天左右即 可铺满平板。通过显微镜对1号分离物的分生孢子进行观察，发现分生孢子梗单生，直或略 弯，淡褐色，分生孢子倒棍棒形或卵形，具有1-6个纵膈膜，2-8个横膈膜，隔膜深褐色，推测 其为链格孢属菌(Alternaria sp. )。2号分离物在平板上菌落初为白色，随后渐渐转变黄白 色，并伴有白色粘液产出，生长迅速，8天左右也可铺满平板，通过显微镜对2号分离物观察， 发现2号分离物没有分生孢子，推测为茎点霉属菌(Phoma sp.)。
[0073]通过设计的ITS4、ITS5特异性引物对分离物进行PCR鉴定，产物通过琼脂糖凝胶电 泳检测，两者均获得约600bp的单一、明亮条带（图9)。随后便将目的条带回收测序，并将获 得的序列在NCBI上进行Blast比对，结果显示，确认1号分离物为链格孢属（Alternaria sp.)(图10)，2号分离物为茎点霉属(Phoma sp.)(图11)。
【主权项】
1. 一种延长芍药切花瓶插寿命的方法，其特征在于:在芍药花朵处于硬蕾期时，在茎杆 第3~4片复叶处进行剪切，迅速将伤口置于水中斜切茎杆基部，留取3片小叶2片复叶，将剪 切好的芍药切花茎杆置于30~lOOmg · Γ1纳米银溶液中，静置处理36h，而后瓶插于2%的蔗 糖溶液中，瓶口用锡箱纸覆盖，防止水分蒸发。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，剪切好的芍药切花的花枝长度为30cm。
【文档编号】A01G5/00GK106034774SQ201610462413
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】赵大球, 陶俊, 唐文慧, 刘定, 周思雨
【申请人】扬州大学