一种黑果腺肋花楸开放式组织培养快速育苗方法
【专利摘要】本发明提供一种黑果腺肋花楸开放式组织培养快速育苗方法，分化、继代、扩繁阶段的培养基创造性采用改良WPM培养基，且优化了各激素的类别和浓度比例；此外扩繁培养基中还加入了核黄素，因此，本发明方法获得的组培苗分化系数高，长的壮，生长质量高，培养周期短。在生根阶段采用添加抑菌剂的生根培养基，用开放式组培方法，不经过高温高压灭菌的情况下仍能保持60天以上不生菌，生根周期缩短至15?18天，生根系数提升至100％。整套方法提高了黑果腺肋花楸组培苗质量和生根效率，较常规方法缩短培育全程周期25?30天，还可以大幅降低生产成本。
【专利说明】
一种黑果腺肋花楸开放式组织培养快速育苗方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种黑果腺肋花楸开放式组织培养快速育苗方法，属于农业生物技术 领域。
【背景技术】
[0002 ]黑果腺肋花楸(Aron i a me 1 ano car pa)属蔷薇科腺肋花楸属落叶灌木。原产于美国 东北部，欧洲已有100余年的引种栽培历史，全球品种资源达30余个，分别适用于食用、药 用、园林绿化和适生于不同的气候、土壤条件。在欧美和东亚地区，该树种在园林绿化方面 的应用非常广泛；由果实加工的药品、保健饮料和食品在市场上非常普及和流行。20世纪90 年代初引入我国。其果实富含多种营养物质，花色苷、黄酮类化合物、多酚类物质，此外还含 有多种维生素、有机酸、三萜类化合物等，果实及其提取物对心治疗心脏病、高血压等心脑 血管疾病有特效。
[0003] 黑果腺肋花楸的各种繁殖方式有多种，采用组织培养的方式进行繁殖的还很少。 黑果腺肋花楸的组织培养技术尚不成熟，而且因各地实验环境不同，实验员设计实验的目 的和方向不同，培养基配方千差万别，培养基配方中基本培养基和激素比例不同也导致培 养出的瓶苗生长状况差异很大。目前，分化培养基配方大多采用MS作为基本培养基，加上不 同浓度比例的6-BA和萘乙酸，生根配方主要采用MS培养基作为基本培养基，加上不同浓度 比例的吲哚丁酸。鹿糖和琼脂的比例分别在千分之三十和千分六左右。这样在培养过程中 会出现瓶苗分化较多，但幼苗长势太弱且成丛生长，不利于后期的生根培养;而在生根培养 中，由于分化苗长势太弱，导致生根苗生根态势不好。且现有组培方法周期较长，不能满足 生产需要。现有黑果腺肋花楸组培快繁体系的研究基本上都是在实验室小规模扩繁、无菌 条件下进行的，尚未有大规模开放式快速培育黑果腺肋花楸的相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种黑果腺肋花楸开放式组织培养 快速育苗方法，通过改良分化培养基使组培苗分化系数高，长的壮;采用添加抑菌剂的生根 培养基，用开放式组培方法，成本低、周期短，且生根效果好。整套方法不仅缩短培育周期， 还可以大幅降低生产成本。
[0005] 本发明的技术方案是:一种黑果腺肋花楸开放式组织培养快速育苗方法，将外植 体消毒处理接种后，按如下步骤进行：
[0006] (1)分化培养
[0007] 分化培养基为：改良WPM+0.02mg/L NAA+lmg/L 6-BA+30g/L蔗糖+6g/U京脂粉；培 养条件:温度25°C ± 3°C，湿度25 %-50 %，光照强度30001x-60001x，光照时间10h-12h;培养 时间为15-20天；
[0008] 所述改良WPM配方为：硝酸钾190mg/L，硝酸铵400mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸 镁370mg/L，四水合硝酸钙684mg/L，硼酸6.2mg/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌 8 · 6mg/L，二水合钼酸钠 Ο · 25mg/L，五水合硫酸铜Ο · 25mg/L，C1QH13FeN2Na08 73 · 4mg/L，肌醇 lOOmg/L，甘氨酸2mg/L，VBiO · lmg/L，VB6〇 · 5mg/L，烟酸0 · 5mg/L;
[0009] (2)继代培养
[0010] 培养基配方、培养条件及培养时间与步骤(1)分化培养相同；
[0011] (3)扩繁培养
[0012] 扩繁培养基为：改良WPM+0.02mg/L NAA+lmg/L 6-BA+300mg/L核黄素+30g/L蔗糖+ 68/1琼脂粉;培养条件:温度251€±3°(：，湿度25%-50%，光照强度300011-600011，光照时 间1 Oh-12h;培养时间为15-20天；
[0013] 所述改良WPM配方与步骤⑴分化培养基中相同；
[0014] (4)生根培养
[0015] 生根培养基为：l/2MS+0.5mg/L IBA+0.1 lmg/L GA+300mg/L核黄素+lml/L抑菌剂I +1 · 5ml/L抑菌剂Π +30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉；
[0016] 所述抑菌剂1:1.5%益培隆和2.5%氯霉素各取lml配制成1升抑菌剂I;
[0017] 所述抑菌剂Π :取对羟基苯甲酸乙酯20g，山梨酸钠15g，一水合柠檬酸三钾10g，配 制成1升抑菌剂Π ;
[0018] 培养条件:温度25°〇±3°(：，湿度25%-50%，光照强度300011-600011之间，光照时 间10h-12h，培养时间为15-18天。继续培养5-7天即可移栽。
[0019] 本发明生根培养阶段采用一次性餐盒代替组培瓶:将配制好的生根培养基不经过 高温高压灭菌，直接倒入800ml-次性圆型透明餐盒中，等培养基冷却凝固后即可进行接 种，每盒接种40颗。
[0020] 进一步地，为了提高组培苗的利用率和生根成功率，所述步骤(3)扩繁培养后，将 长势相对较弱的幼苗转到壮苗培养基中，进行壮苗培养；
[0021] 壮苗培养基为：改良WPM+0.2mg/L IAA+0.5mg/L GA+300mg/L核黄素+30g/L蔗糖+ 68/1琼脂粉;培养条件:温度251€±3°(：，湿度25%-50%，光照强度300011-600011，光照时 间10h-l 2h，培养时间15-20天；
[0022] 所述改良WPM配方与步骤(1)分化培养基中相同。
[0023]所述各培养基的pH值为5.8。
[0024]本发明具有如下有益效果：
[0025] 1、本发明配方不采用一般的MS培养基，而选用改良WPM培养基和1/2MS培养基，并 改良了各激素的类别和浓度比例。分化培养实现了瓶苗分化系数高(分化系数可达到10)， 瓶苗长的壮，生长质量高。且增加了壮苗培养基，瓶苗长得更壮，更有利于生根。
[0026] 2、生根系数提升至100%，并且生根条数也比常规培育方法的生根条数要多，生根 条数在6以上。本配方培养出的生根苗，根粗大，须根较少，且没有愈伤组织生成，可大大提 高后期炼苗的成活率。移栽驯化成活率高于92%。
[0027] 3、本发明加入了配方独特的抑菌剂，可使生根培养基在不经过高温高压灭菌的情 况下仍能保持60天以上不生菌，且接种生根苗不染菌，从而提高了组培效率。而与一般常用 的开放式组培中的抑菌剂相比，本发明方案中的抑菌剂对植物本身的伤害极低，且由于培 养基中加入核黄素，生根苗在培养基中生长时间缩短，抑菌剂对植物本身的伤害可以忽略。 本发明所用抑菌剂毒性极低，钠、钾离子更平衡，对黑果腺肋花楸组培苗的生长非常有利， 与常规组培（即常规不加抑菌剂的高压灭菌培养基，无菌室组培方法)生长的黑果腺肋花楸 相比，污染率相当，而组培苗生长情况更好。
[0028] 4、创造性的在黑果腺肋花楸的分化扩繁培养基和生根培养基中加入了一定浓度 的核黄素，不仅瓶苗的分化和生根效率大大提升，而且使每一代扩繁时间缩短了 5-10天，使 生根时间缩短了 12-15天，这在快速规模化生产中，大大的提高了效率，整过程培养周期为 65-80天，较常规方法缩短了 25-30天。同时由于培养时间的缩短，成本也会大大减少。
[0029] 5、使用800ml的一次性透明餐盒盛装生根培养基，无需灭菌，可以一次性接种40颗 左右瓶苗，操作更方便快捷。从而大大减少了时间和成本。本发明仅在组培的生根阶段，通 过提高速度，节约时间和成本，就可获得显著的经济效益。结合分化扩繁阶段，其经济效益 更是远远高于现有组培方法。
【附图说明】
[0030]图1为本发明方法分化、扩繁阶段组培苗长势情况。
[0031]图2为常规方法分化、扩繁阶段组培苗长势情况。
[0032] 图3为本发明方法生根培养阶段生根情况。
[0033] 图4为常规方法生根培养阶段生根情况。
[0034] 图5本发明生根培养基开放培养60天后污染情况。
[0035] 图6为添加1%的益培隆的生根培养基开放培养60天后污染情况。
[0036]图7为添加25mg/L的苯甲酸的生根培养基开放培养60天后污染情况。
[0037] 图8本发明生根培养基开放培养一周后的组培苗生长情况。
[0038] 图9为添加1%的益培隆的生根培养基开放培养一周后的组培苗生长情况。
[0039]图10为添加25mg/L的苯甲酸的生根培养基开放培养一周后的组培苗生长情况。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行 进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本 发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0041] 本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用 的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0042] 实施例一、一种黑果腺肋花楸开放式组织培养快速育苗方法，步骤如下：
[0043] 一、黑果腺肋花楸的外植体消毒处理
[0044] 1、采剪物候期的带有嫩芽的新鲜枝条，用流水冲洗干净。
[0045] 2、用果枝剪在水中斜剪成8-lOcm的茎段，确保每段上带有1-2个芽，放置在干净的 组培瓶内用流水冲洗半小时。
[0046] 3、在超净工作台内，将冲洗好的黑果腺肋花楸茎段倒入一瓶无菌水瓶中，震荡冲 洗1分钟，倒掉无菌水。
[0047] 4、倒入75%的酒精，震荡冲洗30秒，倒掉酒精。
[0048] 5、倒入无菌水，震荡冲洗1分钟，倒掉无菌水。
[0049] 6、倒入2%。的氯化汞溶液，滴入数滴吐温80，震荡冲洗9.5分钟，倒掉溶液。
[0050] 7、重复上述步骤5七遍。将消毒好的外植体置于瓶中，盖好盖子，备用。
[0051] 二、接种
[0052] 1、夹取消毒的外植体，放置在接种盘或者玻璃培养皿中，用手术剪剪去伤口处，并 用镊子轻轻掰掉芽，露出生长点。
[0053] 2、将茎段轻轻插入装有空白MS培养基（即普通MS培养基）的培养瓶中，保持茎段立 在培养基中，确保茎段的生物学下端朝下，每瓶可接种1-2颗，盖好瓶盖。
[0054] 3、接种后放入培养间内培养，培养间温度为25°C ±3°C，湿度为25%-50%，光照强 度应在30001x-60001x之间，光照时间在10h-12h之间。瓶苗排放整齐，瓶间距3cm左右即可。 [0055] 4、每天观察培养间接种的茎段污染情况。染菌率一般控制在20%以下。培养20-30 天左右，茎段的生长点处会慢慢长出新芽，待幼芽逐渐长大，便可以进行转瓶，进行分化培 养。
[0056]三、分化培养
[0057] 1、夹取带有幼芽的茎段，用手术剪剪去上下两端的伤口，然后插入到分化培养基 中，分化培养基配方如下:改良WPM+0.02mg/L NAA+lmg/L 6-BA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉(琼 脂粉凝胶强度为1300g/cm2;
[0058] 本发明所述改良WPM配方为:硝酸钾190mg/L，硝酸铵400mg/L，磷酸二氢钾170mg/ L，硫酸镁370mg/L，四水合硝酸f丐684mg/L，硼酸6.2mg/L，四水合硫酸猛22.3mg/L，七水合硫 酸锌8 · 6mg/L，二水合钼酸钠0 · 25mg/L，五水合硫酸铜0 · 25mg/L，C1QH13FeN2Na08 73 · 4mg/L， 肌醇l〇〇mg/L，甘氨酸2mg/L，VBiO · lmg/L，VB6〇 · 5mg/L，烟酸0 · 5mg/L。下述改良 WPM配方与之 相同。
[0059] 2、将接种后的幼苗放置于培养间培养，培养间温度为25°C±3°C，湿度为25%-50%，光照强度应在30001x-60001x之间，光照时间在10h-12h之间。
[0060] 3、每天观察茎段生长状况，将污染苗清除并灭菌。
[0061 ] 4、培养15-20天左右，嫩芽逐渐长大，即可进行转接瓶，继代培养，培养基及培养条 件同步骤三-1至3。
[0062] 5、待15-20天左右，每颗嫩芽分化出4-5颗新芽，此时，外植体无菌体系已经建立成 功，可进行大规模的扩繁生产。
[0063]四、扩繁培养
[0064] 1、扩繁培养基为改良WPM+0.02mg/L NAA+lmg/L 6-BA+300mg/L核黄素+30g/L蔗糖 +6g/L琼脂粉;每瓶培养基接种5-7颗。改良WPM配方同上。
[0065] 2、接种后放入培养间内培养，培养间温度为25°C ± 3°C，湿度为25 %-50 %，光照强 度应在30001x-60001x之间，光照时间在10h-12h之间；培养周期为15-20天。
[0066]上述培养方法分化系数可达到10。扩繁培养后，可挑取长势相对较弱的幼苗转到 壮苗培养基中。
[0067] 五、壮苗培养
[0068] 1、壮苗培养基如下：改良WPM+0.2mg/L IAA+0.5mg/L GA+300mg/L核黄素+30g/L蔗 糖+6g/L琼脂粉。
[0069] 2、培养间内培养，培养间温度为25 °C ± 3 °C，湿度为25 % -50 %，光照强度应在 30001x-60001x之间，光照时间在10h-12h之间。壮苗培养20天左右，黑果腺肋花楸的组培苗 长势较好，可以进行生根培养。
[0070] 六、生根培养
[0071] 1、将分化培养基或壮苗培养基中的黑果腺肋花楸幼苗分成单颗，接到生根培养基 中。生根培养基如下：l/2MS+0.5mg/L IBA+0.11mg/L GA+300mg/L核黄素+lml/L抑菌剂 1 + 1.5ml/L抑菌剂Π +30g/L蔗糖+6g/U京脂粉(琼脂粉凝胶强度为1300g/cm2)，生根培养基配 好后无需灭菌，直接使用即可。
[0072] 抑菌剂1:1.5%的益培隆和2.5%氯霉素各取lml配制成1升抑菌剂I原液。
[0073]抑菌剂Π :取对羟基苯甲酸乙酯20g，山梨酸钠15g，一水合柠檬酸三钾10g，配制成 1升抑菌剂Π 原液。
[0074]为了降低成本加快培养速度，在生根培养时，使用市售的800ml的圆型一次性透明 餐盒代替组培瓶，配置好的生根培养基倒入餐盒中，无需经过高温高压灭菌，等培养基冷却 凝固后，进行接种，每盒一次可以接种40颗苗。
[0075] 2、将接种后的幼苗放置于培养间培养，培养条件:温度为25°C±3°C，湿度为25%- 50%，光照强度应在30001x-60001x之间，光照时间在10h-12h之间，培养15-18天，即有根生 出。幼苗生根率可达到100 %，平均每颗幼苗生根条数大于6。
[0076] 3、继续培养5-7天即可移栽。
[0077]实施例二、本发明组培方法与常规MS培养基培养方法对比 [0078] 1.试验材料和方法
[0079] 1.1材料来源，试验材料取自某苗圃基地，以物候期黑果腺肋花楸的幼嫩茎段为外 植体。
[0080] 1.2试验方法
[0081 ]分别采用常规MS培养基，常规培养方法和本发明培养方法 [0082] 1.2.1本发明方法，即采用实施例一的方法。
[0083] 1.2.2常规方法
[0084]外植体消毒处理及接种与本发明方法相同。各阶段所用培养基及培养时间如下， [0085]分化培养阶段，培养基:MS+2mg/L ΒΑ+0 · 2mg/L NAA+30g/L蔗糖+8 · 5g/L琼脂粉，诱 导培养20-30天。
[0086] 继代培养阶段，分化形成愈伤组织后转入培养基:MS+lmg/L BA+0.015mg/L NAA+ 30g/L蔗糖+8.5g/L琼脂粉，继续培养20-30天。
[0087]扩繁培养阶段，培养基:MS+lmg/L BA+0.015mg/L NAA+30g/L蔗糖+8.5g//L琼脂粉， 培养20-30天。
[0088] 壮苗阶段，培养基:MS+lmg/L BA+0.015mg/L NAA+0.5mg/L GA+30g/L蔗糖+8.5g/L 琼脂粉，培养20-30天。
[0089] 生根培养阶段，培养基：1/2MS+0.04mg/L NAA+25g/L蔗糖+8.5g/L琼脂粉，培养20-30天。
[0090] 所用各培养基的pH值5.6~5.8,各阶段培养温度、湿度及光照等条件与本发明方 法相同。
[0091] 2.结果
[0092] 采用两种组配方法培养各阶段对比情况，见表1
[0093] 表1本发明组培方法与常规组培方法组培情况对比
[0094]
[0095]
[0096]实施例三、本发明生根培养基抑菌剂与常规抑菌剂抑菌效果对比 [0097] 1.试验方法
[0098]分别将长势一致的分化培养后的幼苗接入三种含不同抑菌剂的生根培养基中进 行生根培养，三种生根培养基中分别为本发明生根培养基和开放组培用的添加1%的益培 隆或25mg/L的苯甲酸作为抑菌剂的培养基。
[0099] 1.1本发明生根培养基：l/2MS+0.5mg/L IBA+0.11mg/L GA+300mg/L核黄素+lml/L 抑菌剂1+1.5ml/L抑菌剂Π +30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉(琼脂粉凝胶强度为1300g/cm2)，
[0100] 抑菌剂1:1.5%的益培隆和2.5%氯霉素各取lml配置成1升抑菌剂I原液。
[0101] 抑菌剂Π :取对羟基苯甲酸乙酯20g，山梨酸钠15g，一水合柠檬酸三钾10g，配置成 1升抑菌剂Π 原液。
[0102] 1.2添加1%的益培隆的生根培养基：l/2MS+0.5mg/L IBA+0.11mg/L GA+1%的益 培隆+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉(琼脂粉凝胶强度为1300g/cm2)
[0103] 1.3添加25mg/L的苯甲酸的生根培养基：l/2MS+0.5mg/L IBA+0.11mg/L GA+25mg/ L的苯甲酸+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉(琼脂粉凝胶强度为1300g/cm2)
[0104] 上述三种生根培养基配好后无需灭菌，直接使用即可。
[0105] 生根培养条件与实施例一的生根培养条件相同。
[0106] 2.结果
[0107] 三种含不同抑菌剂的生根培养基的组培苗的污染率、生根率、生根周期及对组培 苗的影响结果，见表2。
[0108] 表2三种含不同抑菌剂的生根培养基的比较结果
[0109]
[0110]
【主权项】
1. 一种黑果腺肋花楸开放式组织培养快速育苗方法，其特征是，将外植体消毒处理接 种后，按如下步骤进行： (1) 分化培养 分化培养基为：改良WPM+0·02mg/L NAA+lmg/L 6-BA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉;培养条 件:温度25 °C ± 3°C，湿度25 % -50 %，光照强度30001 x-6000lx，光照时间1 Oh-12h;培养时间 为15-20天； 所述改良WPM配方为：硝酸钾190mg/L，硝酸铵400mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁 370mg/L，四水合硝酸钙684mg/L，硼酸6.2mg/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌 8 · 6mg/L，二水合钼酸钠0 · 25mg/L，五水合硫酸铜0 · 25mg/L，C1QH13FeN2Na08 73 · 4mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸2mg/L，VBiO · lmg/L，VB6〇 · 5mg/L，烟酸0 · 5mg/L; (2) 继代培养 培养基配方、培养条件及培养时间与步骤(1)分化培养相同； (3) 扩繁培养 扩繁培养基为：改良WPM+0·02mg/L NAA+lmg/L 6-BA+300mg/L核黄素+30g/L蔗糖+6g/L 琼脂粉；培养条件：温度25°C ± 3 °C，湿度25 % -50 %，光照强度3000lx-6000lx，光照时间 1 Oh-12h;培养时间为15-20天； 所述改良WPM配方与步骤(1)分化培养基中相同； (4) 生根培养 生根培养基为：1/2MS+0 · 5mg/L ΙΒΑ+0 · 1 lmg/L GA+300mg/L核黄素+lml/L抑菌剂 1 + 1 · 5ml/L抑菌剂Π +30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉； 所述抑菌剂1:1.5%益培隆和2.5%氯霉素各取lml配制成1升抑菌剂I; 所述抑菌剂Π :取对羟基苯甲酸乙酯20g，山梨酸钠15g，一水合柠檬酸三钾10g，配制成 1升抑菌剂Π ; 培养条件：温度25 °C ± 3 °C，湿度25 % -50 %，光照强度30001x-60001x，光照时间10h-12h，培养时间为15-18天。2. 如权利要求1所述黑果腺肋花楸开放式组织培养快速育苗方法，其特征是，所述步骤 (3)扩繁培养后，将长势相对较弱的幼苗转到壮苗培养基中，进行壮苗培养； 壮苗培养基为：改良WPM+0.2mg/L IAA+0.5mg/L GA+300mg/L核黄素+30g/L蔗糖+6g/L 琼脂粉；培养条件：温度25°C ± 3 °C，湿度25 % -50 %，光照强度3000lx-6000lx，光照时间 10h-l 2h，培养时间15-20天； 所述改良WPM配方与步骤(1)分化培养基中相同。3. 如权利要求1或2所述黑果腺肋花楸开放式组织培养快速育苗方法，其特征是，所述 各培养基的pH值为5.8。4. 如权利要求1或2所述黑果腺肋花楸开放式组织培养快速育苗方法，其特征是，所述 步骤(4)生根培养，将配制好的生根培养基不经过高温高压灭菌，直接倒入800ml-次性圆 型透明餐盒中，等培养基冷却凝固后即可进行接种，每盒接种40颗。
【文档编号】A01H4/00GK106069790SQ201610717231
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月24日
【发明人】李瑾, 纪瑞瑞, 李成刚
【申请人】济南浩隆生物科技有限公司