专利名称：一种植酸酶基因及其克隆的制作方法
技术领域：
本发明是一种植酸酶基因及其克隆，属于生物工程领域，特别涉及到无花果曲霉(A.ficuum)As3.324编码PYHA型植酸酶的基因及其克隆。
植物中总磷的60％-90％以植酸的形式存在，这些磷不能被人和单胃动物所利用，食物尤其是集约化畜牧业的饲料中需添加矿物质磷，这一方面是矿物质原料的浪费，另一方面未消化的植酸排出体外，造成土质和水质环境的磷污染。植酸还有强烈的抗营养作用，它能螯合矿物质和蛋白质，影响人及动物对微量矿物质元素的吸收，抑制蛋白质尤其是消化酶系的生物学活性。植酸酶能催化水解植酸，释放游离肌醇、磷酸及多磷酸中间产物。利用植酸酶对植酸的水解作用，能够提高人或单胃动物对植物性食品或饲料中磷的利用率，解除植酸的抗营养作用，而且有利于环境保护。植酸酶广泛存在于微生物特别是真菌中，但目前只有少数来自于不同微生物的植酸酶基因被测序克隆。无花果曲霉(A.ficuum)As3.324的植酸酶属于PHYA型植酸酶，其酶学性质特别是在pH2.5和pH5.5处有两个酶活性高峰，适合于在人或动物胃肠中作用。目前，野生型微生物包括无花果曲霉As3.324的产植酸酶水平较低，以至于微生物发酵生产的植酸酶成本很高。
本发明提供了无花果曲霉(A.ficuum)As3.324编码PHYA型植酸酶的基因phyAI序列及其相应的氨基酸序列。提供了含有As3.324植酸酶基因phyAI的克隆载体pUC19/phyA I和含有这种载体的大肠杆菌(E.coli)细胞JM109/pUC19/phyA I。利用本发明成果，可以构建植酸酶基因工程菌，提高微生物发酵产植酸酶的水平，降低植酸酶生产成本；还可用于植物尤其是经济农作物的基因转化，达到改善农作物品质的目的。
本发明以无花果曲霉(A.ficuum)NRRL3135的植酸酶基因phyA核苷酸序列作参考，设计并合成两条寡核苷酸引物，提取As3.324基因组DNA为模版，PCR方法合成phyAI，并对PCR产物测定核苷酸序列。将phyAI和克隆载体PUCl9分别用限制性内切酶切割，形成互补的粘性末端，T4DNA连接酶连接，形成phyAI克隆载体pUC19/phyAI。热激法将这个克隆载体导入感受态E.coli JM109，成为含有pUC19/phyAI的大肠杆菌细胞JM109/PUC19/phyAI。
无花果曲霉(A.ficuum)As3.324植酸酶基因phyAI核苷酸序列如下 其中 为转录起始密码， 为转录终止密码， 框线中序列为植酸酶活性位点编码序列，小写字母表示内含子序列。
根据以上核苷酸序列，推测A.ficuum As3.324植酸酶蛋白的氨基酸序列如下
441 LGRCT RDSFV KGLSF ARSGG461 DWAEC FAphyA I的结构基因全长1515bp，+46-+156的111个核苷酸为内含子序列，其中含有真菌内含子的特征保守序列，Donor序列GTATGC，Lariat序列GCTGAC，Acceptor序列CAG。phyA I共编码467个氨基酸，N端的19个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在第19位氨基酸Gly之后，在phyA I编码的氨基酸序列中存在10个潜在的N-糖基化位点，81-88位氨基酸为植酸酶的活性位点保守序列RHGARYPT。克隆载体pUC19/phyA I中含有phyA I全序列。受体大肠杆菌细胞JM109/pUC19/phyA I中含有克隆载体pUC19/phyA I。
phyA I是首次被提取、测序和克隆的无花果曲霉(A.ficuum) As3.324的植酸酶基因。因其所编码的植酸酶适合作用于在人和单胃动物的胃肠中作用，所以该基因的克隆可用于构建表达植酸酶的基因工程菌，提高微生物发酵产植酸酶的水平，降低植酸酶生产成本；还可用于植物尤其是经济农作物的基因转化，达到改善农作物品质的目的。
以下是本发明的最佳实施例实施例1Aficuum As3.324植酸酶基因phyA I的PCR扩增和测序用马铃薯培养基培养A.ficuum As3.324，30℃振荡培养24小时后收集菌体，液氮研磨菌体，以氯化苄为提取液提取As3.324基因组DNA。以A.ficuumNRRL3135的植酸酶基因phyA核苷酸序列作参考，设计并合成两条PCR引物如下
F15’-AGGTGGGATGAAGGGGTTAT-3’R15’-CAGCGGCCGCCTAAGCAAAACTCTCCGCCC-3’PCR反应条件如下Template1μlLA Taq 0.5μldNTP8μl2×GCIbuffer25μlF1(20pmol/μl) 1μlR1(20pmol/μl) 1μlddH2O up to 50μl94℃ 1′ 4℃PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用回收试剂盒D301CA(TaKaRa公司产品)回收约1.5Kb的DNA片断，对该DNA片断用Sanger链终止法测定其核苷酸序列，为无花果曲霉(A.ficuum)As3.324的植酸酶基因phyA I。
实施例2phyA I与克隆载体PUC19的重组phyA I和克隆载体PUC19分别用EcoR I/Pst双酶切。酶切条件如下
Eppendorf AEppendorf BddH2O 9μl ddH2O 13μl10×H 2μl 10×H 2μl0.1％BSA 2μl 0.1％BSA2μlPCR片段(1μg/μl) 5μl 质粒PUC19(1μg/μl) 1μlEcoR I 1μl EcoR I 1μlPst I 1μl Pst I 1μl37℃酶切3小时，电泳后分别回收两个目的片段，用T4DNA连接酶连接。连接条件如下ddH2O6μlPCR片段(0.1μg/μl) 1μlPUC19(0.05μg/μl)1μl10×T4DNA连接酶Buffer 1μlT4DNA连接酶(1U/μl) 1μl16℃连接1小时，电泳检测连接产物，回收其中约4.2Kb片段为含有phyA I的克隆载体pUC19/phyA I，用于转化大肠杆菌。
实施例3克隆载体pUC19/phyA I转化大肠杆菌JM109加入60μl解冻的感受态E.coli JM109和10μl连接液至Eppendorf中，冰上30秒，42℃50秒，冰上2分钟，加入37℃的LB培养基930μl，37℃震荡培养1小时。菌液与4μlIPTG及40μlX-gal混合后涂含有50mg/Ap的LB平板上，37℃培养过夜。挑选白色菌落做PCR检测，琼脂糖凝胶电泳中呈现1.5Kb特异带者为阳性转化菌落，为含有pUC19/phyA I的大肠杆菌JM109/pUC19/phyA I。从JM109/pUC19/phyA I中提取质粒，以PUC19的测序通用引物测定外源插入序列phyA I的核苷酸序列，与实施例1所述PCR测序结果一致。
权利要求
1.一种植酸酶基因，phyAI，其特征在于它是无花果曲霉(A.ficuum)As.3324编码PHYA型植酸酶的基因。
2.根据权利要求1所述植酸酶基因phyAI的核苷酸序列 466 TACAACTACA GCCTGGGCGC GGATGACCTG496 ACTCCCTTCG GAGAGCAGGA GCTGGTCAAC526 TCCGGCGTCA AGTTCTACCA GCGATACGAA556 TCGCTCACAA GAAACATTGT CCCGTTCATC586 CGATCCTCAG GCTCCAGCCG CGTGATTGCC616 TCTGGCAATA AATTCATCGA GGGCTTCCAG646 AGCACTAAGC TGAAGGATCC TCGTGCCCAG676 CCCGGCCAAT CGTCGCCCAA GATCGACGTG706 GTCATTTCAG AGGCCAGCAC ATCCAACAAC736 ACTCTCGATC CGGGCACCTG CACCGTTTTC766 GAAGATAGCG AATTGGCCGA TGACATCGAA796 GCCAATTTCA CCGCCACGTT CGTCCCCTCC826 ATTCGTCAAC GTCTGGAGAA CGACTTGTCT856 GGCGTGTCTC TCACGGACAC AGAAGTGACC886 TACCTCATGG ACATGTGCTC CTTCGACACC916 ATCTCCACCA GCACCGTCGA CACCAAGCTG946 TCCCCCTTCT GTGACCTGTT CACCCATGAA976 GAATGGATCA ACTACGACTA CCTCCAGTCC1006 CTGAACAAAT ACTACGGCCA TGGCGCAGGT1036 AACCCGCTCG GCCCGACCCA GGGCGTCGGC1066 TACGCTAACG AGCTCATCGC CCGTCTCACC1096 CACTCGCCTG TCCACGATGA CACCAGCTCC1126 AACCACACAT TGGACTCCAA CCCGGCTACT
3.根据权利要求1所述植酸酶基因phyAI的克隆载体PUC19/phyAI。
4.根据权利要求3所述克隆载体PUC19/phyAI的大肠杆菌(E.coli)受体细胞JM109/PUC19/phyAI。
全文摘要
本发明是一种植酸酶基因及其克隆,属于生物工程领域。本发明提供了一种来自于无花果曲霉(A.ficuum)As3.324编码PHYA型植酸酶的基因phyAI,提供了phyAI序列及其相应的氨基酸序列。提供了含有phyAI的克隆载体pUC19/phyAI和含有这种载体的E.coli细胞JM109/pUC19/phyAI。本发明可用于构建植酸酶基因工程菌,提高微生物发酵产植酸酶的水平;还可用于农作物的基因转化,达到改善农作物品质的目的。
文档编号C12N15/55GK1350060SQ00123168
公开日2002年5月22日 申请日期2000年10月24日 优先权日2000年10月24日
发明者张苓花, 安利佳, 袁晓东, 包永明, 王运吉 申请人:大连理工大学, 大连轻工业学院