生产蛋白酶的方法

专利名称：生产蛋白酶的方法
本申请是申请日为1991年10月24日，申请号为91111128.X，发明名称为“一种新的蛋白酶”的发明专利申请的分案申请。
本发明涉及一种新的蛋白酶，这种蛋白酶特异性地切割多肽的氨基酸序列上谷氨酸残基的羧基端的肽键，还涉及从芽孢杆菌属细菌中生产蛋白酶的方法，编码该蛋白酶的DNA序列，含有该DNA序列的表达载体，将该表达载体引入宿主中而获得的转化体，以及利用该转化体生产该蛋白酶的方法。
已知来源于金黄色葡萄球菌V8的菌株的V8蛋白酶是一种作用于蛋白质(即多肽)并且能特异性地切割谷氨酸(Glu)残基羧基端的肽键的酶(Gabriel R.Drapeau et al.,J.Biol.Chem.247,20,6720-6726,1972)。将这种酶分类为丝氨酸蛋白酶。C.Carmona等人已克隆了编码这种酶的DNA序列(Nucl.AcidsRes.,15,6757,1987)还已知一种类似的酶，一种对酸性氨基酸残基有特异性并且来源于放线菌灰色链霉菌的肽链内切酶(Norio Yoshida et al.,J.Biochem.104,3,451-456,1988)。其次，还有一种来源于枯草芽孢杆菌，特异性地作用于谷氨酸残基的蛋白内切酶也是已知的(Takuro Niidome,Norio Yoshida,Fusahiro Ogata,Akio Ito,and Kosaku Noda,J.Biochem.108,965-970,1990)；日本生物化学学会第62届全体会议摘要)。
前面所说的酶适用于为了进行蛋白质结构分析等而需要在前面所说的位点处对蛋白质进行特异性切割，或者当使用重组DNA技术生产特定融合蛋白形式的所需蛋白，其中通过切割获得所需蛋白时使用前面所述酶。在后一种情况，例如，当已产生的所需蛋白是一种融合蛋白形式，该融合蛋白中，所需蛋白通过一个谷氨酸残基与另一种蛋白质连接时，可利用这样一种酶切割而将所需蛋白分离。为此，除了上述的酶之外，非常希望能获得具有这种类型酶活性的其他蛋白酶。
本发明的新型蛋白酶克服了上面讨论的以及现有技术中的许多其他的缺陷和不足之处，这种酶来源于地衣形芽孢杆菌，该蛋白酶切割多肽的谷氨酸残基的羧基端的肽键。
在一个优选的实施例中，该蛋白酶来源于地衣芽孢杆菌ATCC NO.14580。
在一个优选的实施例中，该蛋白酶有下列性质(1)最适pH约8.0和(2)稳定的pH范围pH6.5～8.5，于25℃。
在一个优选的实施例中，该蛋白酶含有从SEQ ID NO:1中的+1位丝氨酶到+222位上的谷氨酰胺之间的氨基酸序列。
在一个优选的实施例中，该蛋白酶含有从SEQ ID NO:1中的+1位丝氨酸到+222位谷氨酰胺之间的氨基酸序列，并且切割多肽的谷氨酸残基的羧基端的肽键。
本发明的DNA序列编码上文所述的蛋白酶。
在一个优选的实施例中，该DNA序列含有从SEQ IDNO:1的605位胸腺嘧啶残基到1270位的腺苷残基之间的碱基序列。
在一个优选的实施例中，该DNA序列编码一种蛋白酶，该蛋白酶含有从SEQ ID NO:1的-94位N-甲酰甲硫氨酸到+222位上的谷氨酰胺之间的氨基酸序列。
在一个优选的实施例中，该DNA序列含有从SEQ ID NO:1的323位胸腺嘧啶残基到1270位的腺苷残基之间的碱基序列。
本发明的表达载体含有上文所述的DNA序列。
在一个优选的实施例中，该表达载体可在芽孢杆菌属细菌中表达。
本发明的转化体可通过将上述表达载体引入宿主中而得到。
在一个优选的实施例中，该宿主是芽孢杆菌属菌株。
制备本发明的蛋白酶的方法，包括在培养基中培养能生产上文所述蛋白酶的地衣形芽孢杆菌菌株以及从培养基中回收产生的蛋白酶。
制备本发明的蛋白酶的方法，包括在培养基中培养上文所述的转化体以及从培养基中回收产生的蛋白酶。
应说明白，在不超出本发明范围和精神的情况下，本领域内熟练技术人员可以容易地进行各种对他们来说是显而易见的修改。因此，本发明所附带的权利要求书的范围并不是为了限制说明书描述的内容，该权利要求书是用来包括所有存在于本发明中的可以被授予专利权的新颖性特征，包括所有那些与本发明相关的被本领域中熟练技术人员认为是其等同特征的内容。
因此，本文描述的发明是为了实现下面的目的(1)提供一种具有能够在谷氨酸残基的羧基端对多肽进行特异性切割的酶活性的新型蛋白酶；和(2)提供一种编码该蛋白酶的DNA序列，含有该DNA序列的表达载体，将该表达载体引入宿主而获得的转化体，以及利用该转化体生产蛋白酶的方法。
本领域中的熟练技术人员通过参考下面所附带的附图，可以更好地理解本发明以及显而易见地明白发明的许多目的和优点。


图1-1到1-3显示本发明蛋白酸的DNA序列以及从该DNA序列推导出的氨基酶序列。
图2是用来说明构建本发明表达载体pHY300BLtt的示意图。
图3是描述在本发明的表达载体pHY300BLtt的构建过程中使用的往复性载体pHY300PLKtt的构建过程的示意图。
图4显示在从培养地衣形芽孢杆菌ATCC NO.14580的培养基中提取和纯化该酶的过程中从亲和柱子洗脱本发明酶的坐标图。
发明人曾经进行过多次研究，目的是从除上述的金黄色葡萄球菌等以外的微生物中获得具有在谷氨酸残基的羧基端切割肽的酶活性的蛋白酶。通过这些研究，发明人发现了一种从地衣形芽孢杆菌ATCC NO.14580中获得的具有前面所说特性的新型蛋白酶。而且，发明人还发现编码该蛋白酶的DNA序列，并且制备了含有该DNA序列的一种表达载体以及将该表达载体引入宿主中而获得的转化体，并发现了利用该转化体生产该蛋白酶的方法，从而完善了本发明。
本发明的蛋白酶(下文中称为BLase)是从芽孢杆菌属细菌，尤其是地衣形芽孢杆菌ATCC NO.14580中制备的。该菌株可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。Ⅰ．培养条件培养前面所说的细菌菌株不需要特殊的培养基，任何类型的常规培养基均适用于这种培养。例如，可以使用一种含有葡萄糖，黄豆粉，肉汁、玉米浸出液，和各种无机盐等的培养基。合适的培养基pH是5-9，最好是大约7.0，合适的培养基温度是15-50℃，最好约为28℃，并且用例如搅拌或振荡而好气性培养细菌约36小时。本发明的BLase酶主要是细胞外分泌的。Ⅱ．酶的收集可以单独或联合使用已知的酶收集和纯化方法从前面所说的肉汤培养液中收集和纯化本发明的酶。例如，将肉汤培养基进行挤压过滤，超滤，和离心分离，最后得到一种不含细胞的浓缩液。通过适当的纯化方法从该浓缩液中获得本发明的酶。例如，首先将前面所说的浓缩液通过离子交换层析进行初步纯化，然后用S-Sepharose进行层析，最后进行亲和色谱分析，从而获得本发明的酶。在下面显示的实施例1中，通过这种步骤得到了具有1.9×103到2.4×103u/mg活性(用下面所述的酶活性测定方法测定)的酶样品。该酶样品用于测定下面所述的酶特性。Ⅲ．测定酶活性的方法以Z-苯丙氨酸亮氨酸谷氨酸-pNA(其中Z是苄酯基，pNA是对-硝基苯胺基)作为底物，将它溶于50mM Tris-HCl(pH7.5，含有2mM CaCl2和2％DMF)，以使最终底物浓度达到0.2mM。将酶溶液加入这种混和物中，并在37℃使反应进行10分钟，然后在410nm下测定通过酶反应而释放到反应液里的对-硝基苯胺的吸收率。当该吸收率是1.0时所存在的酶活性定义为1单位(U)。Ⅳ．酶特性本发明BLase的酶特性和蛋白质化学特性如下(1)酶作用和底物特异性(ⅰ)制备表1中显示的合成底物，并将它的每一种溶于50mlTris-HCl(pH7.5，含有2mM CaCl2和表1所示量的二甲基甲酰胺(DMF)或二甲亚砜(DMSO))中以达到表1所示的浓度。然后在该溶液中加入本发明的酶，使反应在25℃进行。在410nm处测定酶反应过程中释放到反应液中的对-硝基苯胺的吸收值，并计算出每分钟内从1mg底物中释放出对-硝基苯胺的量(nmol)；所得结果显示于表1中。
表1
*pNA:p-对硝基酰苯胺(ⅱ)选用氧化的胰岛素B链作为蛋白质底物，利用下面的步骤比较本发明的酶和从金黄色葡萄球菌中得到的V8蛋白酶作用该底物的情况。首先，将氧化的胰岛素B链溶于50mM碳酸氢铵(pH7.8)，加入本发明的酶或前面所说的Va蛋白酶以使酶/底物比例为1/100(W/W)，并在预定的时间内进行反应。然后利用一个装有Vydac蛋白C4(300)的4.6×250mm的柱子对反应混和物进行HPLC分析，用0.1％TFA中的0-50％的乙腈线性梯度浓度进行洗脱，乙腈浓度以1.67％/分钟的速度提高。肽的结构图谱分析表明，使用这两种酶中的任何一种，都切割谷氨酸残基羧基端肽键，并且由这两种酶诱导的酶水解产物彼此相同。
因此，前面所说的分析(ⅰ)和(ⅱ)的结果表明本发明的酶切割谷氨酸残基羧基端肽键，并且的确是一种谷氨酸特异性肽链内切酶。(2)最适pH和稳定的pH范围以Z-Phe Leu Glu-pNA作为底物溶于含有10％DMF和2mM CaCl2的50mM Tris-HCl中。然后，将本发明的酶加到该混和物中，反应在37℃进行15分钟，在410nm处测定由酶促反应释放到反应液中的对-硝基苯胺的吸收值。上述反应在各种pH值进行，结果表明酶反应的最适pH是8.0。
其次，将本发明的酶以几种不同的pH值在25℃下保温24小时，按照上述酶活性测定方法中所述的步骤将每一种经过这种处理的酶与底物进行反应。结果表明本发明酶的稳定pH范围约为4.0～10.0。在6.5～8.5pH范围内，酶活性维持在100％，在4.0到6.5以及8.5到10.0pH范围内，酶活性维持在80～100％。(3)热稳定性将本发明的酶在含有2mM氯化钙pH为7.8的缓冲液中于各种温度下维持15分钟。在每一种情况下，按照上述酶活性测定方法中所述的步骤将经过这种处理的酶与底物进行反应。结果表明在前面所述条件下，温度高达60℃本发明的酶仍是稳定的。当以同样条件将本发明的酶保持于不含氯化钙的溶液中，温度高达50℃该酶仍是稳定的。(4)抑制剂的作用本发明的酶可以完全被二异丙基氟磷酸(DFP)抑制。这一事实表明本发明的酶属于丝氨酸蛋白酶。
本发明的酶也完全被Z-Phe Leu Glu CH2Cl抑制。这一事实表明本发明的酶是一种谷氨酸特异性的肽链内切酶。
EDTA可部分抑制本发明的酶，最大抑制率约为72％。通过加入低浓度的金属离子(10-4到10-2的钙离子或镁离子等)可以使EDTA的抑制作用完全失效。
上述事实表明本发明的酶是一种典型的丝氨酸蛋白酶，其稳定性与金属离子的存在有关。(5)分子量利用15％凝胶(1.0mm)和RainbowTM蛋白质分子量标记物(Amersham)进行SDS-PAGE测定本发明酶的分子量。并计算出为26,000。从根据下文中描述的基因序列分析试验测定的氨基酸序列也可计算出该分子量，这种方法得到的值是23,567，与上述通过SDS-PAGE获得的值有些差异。但是，下文中描述的各种蛋白质化学分析结果(氨基酸组成，氨基末端序列，羧基末端附近的氨基酸组成)与从DNA序列推导出的结构非常一致。这一结果表明通过SDS-PAGE得到的分子量实际上稍微超过了其真正的值。(6)等电点用pharmacia FAST System(Pharmalite,pH3.0-10.0)测定本发明酶的等电点所得值在pH9.0以上，无法得到其正常值。(7)氨基酸组成用4M甲磺酸(含有0.2％的3-(2-氨基乙基)吲哚)，在110℃下使本发明的酶水解预定的时间期间(24,48或72小时)。然后利用Hitachi385型氨基酸分析仪对各自的水解产物分别进行氨基酸序列分析。该分析结果显示于表2，并校正了分析过程中发生的氨基酸降解。从本发明的酶的DNA序列计算出的氨基酸组成(描述于下文)也列于表2进行对比。两组结果明显地显示出良好的一致性。
表2氨基酸组成
(8)部分氨基酸序列(ⅰ)N-末端附近的氨基酸序列利用一种477A型蛋白质序列分析仪(Applied Biosystems)对本发明酶氨基末端附近的氨基酸序列进行分析。予先用DFP对所用的酶样品进行抑制。从氨基末端到第23位残基之间的氨基酸序列显示于表3中。
表3
(ⅱ)C-末端附近的氨基酸序列用羧基肽酶A(CPaseA)或羧基肽酶Y(CPase Y)作用于预先用DFP抑制的本发明酶的样品，用Hitachi 835型氨基酸序列分析仪测量这些反应释放出的氨基酸的量。但是，用前面所说的羧基肽酶中任一种都不能精确地测定本发明酶羧基端附近的氨基酸序列。但是，证实了羧基末端附近存在有谷氨酸，丝氨酸，丙氨酸和天冬酰胺。V．编码BLase的DNA序列的测定本发明说明书中所用的特定术语定义如下“寡聚核苷酸”是指一种短单链DNA分子。寡聚核苷酸可按已知的方法进行化学合成。除非另有说明，本发明过程中使用的寡聚核苷酸是化学合成的，并且是通过利用SephadexG50的凝胶色谱分析和利用反相硅胶柱的高效液相色谱分析(HPLC)进行纯化的。
“PCR”是“聚合酶链反应”的首字母缩略词，并且是指一种特定的DNA区的酶促扩增方法(Saiki et al.,Science,239,487-497,1988)。首先，将所要扩增的DNA通过热变性转变成单链形式，并将寡聚核苷酸引物(两种类型，即有意义和反意义链，每一种引物具有与所说单链DNA的3’-末端区互补的序列)退大到该单链DNA(即模板DNA)相应的3’-末端区域。接着，利用DNA聚合酶进行反应而完成从相应引物上DNA链的延伸。通过重复这种反应步骤，靶DNA能扩增100,000到1,000,000倍。
“Southeyn吸印试验”是一种用来测定由特定的限制性酶切割而获得的DNA片段是否含有一种特定基因的方法。Southern吸印试验的步骤是首先用一种限制性酶消化所要测定的DNA样品，该限制性酶特异性地识别双链DNA上的特定碱基序列并且在特定的位点处切割该DNA。将如此获得的消化产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用碱处理使其变性为单链DNA，并转移至尼龙滤纸上。另外，制备一种构成所需测定基因一部分的寡聚核苷酸或DNA片段并进行标记而获得一种探针。然后通过用该探针与尼龙滤纸上的单链DNA进行杂交而检测所需基因的存在。
“连接”是指在两个双链DNA片段之间形成磷酸二酯键。在该技术中，为了避免双链DNA片段的自身连接，采用常规方法对其中一个片段予先进行脱磷酸化处理(T.Maniatis et al.,“Molecular Cloning”,133-134,1982)。利用公知类型的缓冲液溶液和反应条件，用T4DNA连接酶完成连接反应。
“转化”是指一种通过将外源性基因(DNA)引入到所说细胞中而使该细胞(即宿主细胞)基因型发生转化的现象。已经历过这种转化过程的细胞被称之为“转化体”，其特征是能够使外源性DNA作为核外成份或以整合到所说细胞染色体中的形式进行复制。
另外，用于测定本发明的Blase的DNA序列的方法将按照所包含的步骤的顺序进行描述。通过联合使用PCR分析，South-ern吸印分析，直接的序列分析方法等对地衣形芽孢杆菌ATCC-NO.14580的基因组DNA进行分析而测定该DNA序列。(1)基因组DNA序列的PCR分析编码Blase的DNA序列可从例如基因组DNA获得。为了获得该DNA，首先，利用常规技术从经过培养的所述菌株细胞中分离出地衣形芽孢杆菌ATCC NO.14580的基因组DNA(M.Stahl et al.,J.Bacteriology,154,406-412,1983)。该基因组DNA用作为PCR分析的模板DNA。利用常规方法，根据上述第Ⅳ节第(8)项中测定的纯化酶氨基末端附近的氨基酸序列，和/或所说酶的部分水解获得的肽的氨基酸序列而合成用于PCR的寡聚核苷酸引物。例如，使用编码相应于从Blase氨基端开始计算第12位到第19位的氨基酸序列Thr Asn Thr Thr Ala Tyr ProTyr的寡聚核苷酸(见表3)作为有意义引物BL8(如SEQ ID NO:2所示)。该寡聚核苷酸是一个三嵌合聚体(tricosamer)，它编码直到C-末端酪氨酸残基的三联体密码子的第二个碱基的氨基酸序列。
T TTABL8: 5′-AC AACAC AC GCTTACCC TAC CCG另外，根据用赖氨酰肽链内切酶分解纯化酶，随后进行序列分析而得到的肽并且是最可靠的序列合成另一个寡聚核苷酸引物。如下面的实施例2的描述，获得序列Gly Tyr Pro Gly AspLys(SEQ ID NO:8)，然后，用与编码该氨基酸序列的寡聚核苷酸互补的十八聚体作为反意义引物BL83(由SEQ ID NO:3表示)。
T A TC TBL83:5′-TT TC CC GGATA CCC G GA G然后，利用前面所述的基因组DNA，有意义引物BL8，以及反意义引物BL83进行PCR，从而延伸和扩增基因组DNA中的靶DNA链。如此获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到一个大约370bp的DNA片段。将该DNA片段引入一个合适的载体，并且在亚克隆后，利用Sanger技术测定该片段的碱基序列。组成制备反意义引物BL83的基本结构的前面所说的氨基酸序列Gly Tyr Pro Gly Asp Lys被识别为位于Blase的氨基酸序列的第131-136位。(2)基因组DNA的Southern吸印试验分析用SalⅠ限制性内切酶消化上面第(1)项中制备的来源于地衣形芽孢杆菌ATCC NO.14580的基因组DNA，在用琼脂糖凝胶电泳分离后，将得到的DNA片段吸印到尼龙滤膜上，通过Southern技术进行分析。用于杂交的探针是上面第(1)项中获得的BL8-BL83PCR产物，并已通过常规方法用32p-dCTp进行标记。与这种BL8-BL83产物发生阳性杂交的DNA片段被认为是一条与约3.1kb长度相对应的谱带。(3)通过PCR对基因组DNA进行序列分析用SalⅠ消化上述第(1)项中获得的地衣形芽孢杆菌ATCCNO.14580的基因组DNA，然后将这种消化产物引入一个合适的载体，例如，Puc119载体，用该已知DNA序列的一部分作为引物进行PCR。例如，使用定位于前面所说基因组DNA上游的pUC119DNA序列的一部分作为有意义引物RV(由SEQ ID NO:4所示)，并且使用与上述第(2)项中分析的375bpDNA片段3’末端附近的序列互补的一个DNA序列作为反意义引物B125(由SEQ ID NO:5所示)。
RV: 5′-CAGGAAACAGCTATGACB125: 5′ -TGTCCCAACAAGTGATGA通过PCR获得约1050bp的一个DNA片段。利用直接DNA序列分析方法可以测定该片段的碱基序列(Gibbs et al.,Pro.Natl.A-cad.Sci.U.S.A.,86,1919-1923,1989)。用这种方法，可以确认出编码Blase的氨基末端到该序列的中部的DNA序列。
接着，用下面的方法可以测定基因组DNA3’端的部分序列。首先，按上面描述的相同方法，用SalⅠ消化地衣形芽孢杆菌ATCC NO.14580的基因组DNA，分离出约3.1kb的片段。将该片段插入M13mp11，并进行PCR反应。用于该PCR反应的引物是上述第(2)项中分析的375bpDNA片段的部分片段；一种是有意义引物(由SEQ ID No:6所示)，定位于前面所说反意义引物B125的上游，另一种是反意义引物M4(由SEQ ID NO:7所示)，该引物具有与M13mp11的部分DNA序列互补的DNA序列，并且定位于该基因组DNA的上游。
B40: 5′-AAAACCGTCGCAACAGCCM4: 5′-GTTTTCCCAGTCACGAC前面所说的PCR反应产生一个约2.2kb的DNA片段。通过直接DNA序列分析法可以测定该DNA片段的碱基序列。以同样的方法，测定该基因组DNA的3’末端到中间部分的碱基序列。
以这种方式测定的Blase的全部DNA序列以及从该DNA序列测得的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:1和
图1中。从SEQID NO:1和
图1可以看出，来源于地衣形芽孢杆菌的为成熟蛋白编码的基因含有一个编码信号肽的序列(其中的信号肽由从-94位的N-甲酰甲硫氨酸残基到-1位的赖氨酸残基之间的94个氨基酸残基组成)，以及一个编码成熟蛋白的DNA序列(其中成熟蛋白由从+1位的丝氨酸残基到+222位的谷氨酰胺残基之间的222个氨基酸残基组成)。正常情况下，ATG编码蛋氨酸，但在这种情况下TTG(fMet)似乎是转译起始密码子。在从SalⅠ切割位点开始的5’未转译区域的332bp片段中，有一个含有-35序列的启动子区域，一个Pribnow盒，和一个Shine-Dal-garno序列(该序列存在于从上述推测的转译起始密码子TTG上游的9个碱基)。在3’-未转译区中，由13个碱基对组成的反向互补重复区位于终止密码子TAA下游8个碱基处。Ⅵ．构建表达载体如图2所示，通过将编码SEQ ID NO:1显示的本发明的Blase的一个DNA片段(即含有一个启动子，一个编码信号肽的DNA序列，一个编码Blase成熟肽的DNA序列，和一个终止因子的DNA片段)插入所说载体pHY300pLKtt，而从往复性载体pHY300PLKtt(该载体含有来源于枯草芽孢杆菌ATCC NO.6051的一个碱性蛋白酶终止因子)获得本发明的一个典型的表达载体pHY300BLtt。如图3中所示，通过将一个来源于枯草杆菌ATCC NO.6051的碱性蛋白酶终止因子插入载体pHY300PLK中而从载体pHY300pLK(它是大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的往复性载体)获得前面所说的载体pHY300pLKtt。
下面按所涉及方法的顺序对上述方法作进一步的解释。首先，如图3所示，按照M.Stahl等人(见上文)的方法从枯草芽孢杆菌ATCC NO.6051中分离基因组DNA，并将其用作模板DNA。然后，用化学方法合成一个由相应于来源于枯草芽孢杆菌Ⅰ-168的碱性蛋白酶基因终止因子部分的5’-末端附近序列的DNA序列组成的片段，该片段带有一个附加的×baⅠ切割位点，以及合成一个与相应于终止因子部分的3’末端附近序列的一个DNA序列互补的片段，该片段附带一个HindⅢ切割位点，并且用这些片段作为引物进行PCR反应。然后，用XbaⅠ和HindⅢ切割得到的DNA片段，从而获得由图3所显示的片段(1)。接着，由XbaⅠ和HindⅢ切割pHY300PlK，从而获得显示于图3的较大片段(2)。然后通过连接片段(1)和(2)而构建往复性载体pHY300PLKtt，该载体含有来源于枯草芽孢杆菌ATCC NO.6051的碱性蛋白酶终止因子。
接着，从地衣形芽孢杆菌ATCC NO.14580的培养细胞中分离基因组DNA，将其用作为模板DNA。然后，合成一个由相应于该模板DNA5’末端附近并附带一个EcoRⅠ切割位点的DNA序列组成的片段以及一个与相对应于该模板DNA3’-末端的DNA序列互补并附带一个XbaⅠ切割位点的片段，并分别用作为有意义和反意义引物。利用前面所说的模板DNA，有意义引物，和反意义引物进行PCR反应。然后，用EcoRⅠ和XbaⅠ切割所得到的片段，从而获得编码Blase的DNA片段(3)(见图2)。该片段(3)含有一个启动子，一个编码信号肽的DNA序列，一个编码成熟Blase的DNA序列和一个终止因子。接着，用EcoRⅠ和XbaⅠ切割前面所说的载体pHY300PLKtt，从而获得较大的片段(4)。然后通过连接前面所说的片段(3)和(4)而获得本发明的表达载体pHY300BLtt(见图2)。
该表达载体pHY300Bltt受BlaSe启动子的控制，含有编码从第-94位的N-甲酰甲硫氨酸残基到第-1位的赖氨酸残基的信号肽的DNA序列，编码从Blase第+1位的丝氨酸残基延伸到第+222位的谷氨酰胺残基的成熟肽的DNA序列；以及包括一个终止子的3’末转译区域。往更远的下游处，存在来源于枯草杆菌ATCC NO.6051的碱性蛋白酶终止因子。Ⅶ．转化体的制备以及Blase的生产利用常规的方法将上述第Ⅵ节中获得的表达载体引入合适的宿主中。例如，利用J.Spiezen等人的方法(proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.44,1072,1958)可将上面所说载体PHY300Bltt引入枯草杆菌ISW1214(Takara Shuzo)。在任何适合于该宿主的培养基中培养该转化体(枯草杆菌pHY300BLtt/ISW1214)，从而产生本发明的Blase。最后，从转化体已培养成熟的肉汤培养基中分离出Blase，并用上述第Ⅱ部分中描述的方法进行纯化。
实施例现在参考特定的例子对本发明作进一步的解释。
实施例1在pH7.0含有2.0％葡萄糖，2.0％大豆粗粉，0.25％玉米浸渍液，0.5％硫酸铵，0.05％磷酸氢二钾，0.05％硫酸镁七水合物，0.01％硫酸铁七水合物，以及0.3％碳酸钙的培养基中于28℃培养地衣形芽孢杆菌ATCC NO.14580 36小时。将95升肉汤培养基挤压过滤，并借助于超过滤模型(Nitto UltrafiltrationModule NTU 2020T P18B(HF)；截止分子量为20,000)浓缩至约14升，并且离心(4200rpm,30分钟)。用2mM氯化钙将该经过浓缩的不合细胞的肉汤培养基稀释到大约28升(1.9ms/cm)。然后加入盐酸将经过稀释的无细胞肉汤培养基的pH值调至6.0。向该溶液中加入大约4升Amberlite CG-50，该Amberlite CG-50已用含有2mM氯化钙的10mM醋酸缓冲液(pH6.0)进行平衡，在室温下将该混和物搅拌4小时。在确证其上清液没有Blase活性后，去掉上清液。然后用Amberlite CG-50装填14×32cm玻璃柱子。用含有2mM氯化钙的10mM乙酸缓冲液(pH6.0)约10升洗涤柱子后，用也含有2mM氯化钙的0.5M醋酸钠缓冲液进行洗脱。
将从AmberHte CG-50洗脱得到的具有Blase活性的分馏物合并(各馏分的总体积为2.7升)并且在水中透析48小时。将透析物用2mM氯化钙稀释至8升(2.23ms/cm)，在将pH调节6.0后，使该液体吸附到装填于5×40cm柱子中的约800ml S-Sepharose上，该装填有S-Sepharrose的柱子预先已用含有2mM氯化钙的5mM醋酸缓冲液(pH6.0)平衡过。在用约5升与用于上面所述平衡过程的缓冲液具有相同组分的缓冲液进行洗涤后，用7升该缓冲液在0-0.2M氯化钠线性梯度下洗脱该柱子。将具有Blase活性的分馏物合并(各馏分总体积是900ml)，在2mM氯化钙水溶液中透析过夜，从而获得约950ml的透析物(0.86ms/cm)。将该透析物pH调节到7.5，然后快速地进行亲和层析。该亲和层析方法中使用的载体是装填于3×48cm柱子中的约340ml的CH Sepharose4B(phe Leu-D-GluOMe)，并已用含有2mM氯化钙的5mM Tris-HCl(pH7.5)进行平衡。在该柱子吸附前面所说的透析物后，用与平衡柱子所用缓冲液具相同组分的缓冲液约5升洗涤该柱子，然后在0-0.7M氯化钠线性梯度下用3.5升同样组份的缓冲液洗脱该柱子。
利用第Ⅲ部分描述的优选实施例显示的测定酶活性的方法测量上述获得的每一馏分的Blase活性，结果显示于图4中。测量每一馏分在280nm处的吸收值作为蛋白质浓度的参数，如此得到的结果也显示于图4中。该图表明在大约0.5M的氯化钠浓度时可以洗脱出Blase。如此获得的Blase在SDS-PAGE中表现为一条单一谱带。用这种方法，可以从95升肉汤培养液中获得833.1mg的所说酶样品(用一种BioRad蛋白测定试剂盒定量)，该样品具有1.9×103-2×103U/mg的比活性。酶活性的产量为27.5％。
实施例2测定编码Blase的DNA碱基序列(1)基因组DNA内部碱基序列的PCR分析将100微克由实施例(1)中得到的已用DFP处理过的纯化酶加入含有1M脲的150μl0.05MTris-HCl(pH9.0)中，并用1μg赖氨酰肽链内切酶(Wako Pure Chemical Industries,Ltd)在37℃消化5小时。然后利用一个用TSKgelODS-120T装填的柱子(4.6×250mm,Tosoh Co.Ltd)进行高效液相色谱分析而分离和纯化所得到的酶消化产物。用477A型蛋白质序列分析仪(AppliedBiosystems)测定如此获得的消化片段的氨基酸序列，从而测定出5种类型片段的氨基酸序列。其中三种序列如下所示。并表示于SEQ ID NOS:8,9和10。
Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Lys (Ⅰ)Ala-Ile-Val-His-Ile (Ⅱ)Ser-Thr-Arg-Tyr-Phe-Ile-Pro-Ser (Ⅲ)接着，利用M.Stahl等人的方法(见上文)从地衣形芽孢杆菌ATCC NO.14580中分离基因组DNA，将该DNA用作为PCR分析的模板。根据由地衣形芽孢杆菌ATCC NO.14580产生的Blase的氨基酸序列的已知部分可以制备用于PCR的寡聚核苷酸引物。首先，化学合成编码从Blase分子的氨基末端的第12位开始到第19位终止的氨基酸序列(见表3)的寡聚核苷酸。该氨基酸序列是Thr Asn Thr Thr Ala Tyr Pro Tyr(除所说寡聚核苷酸仅延伸到为该寡聚肽羧基末端酪氨酸残基编码的三联体的第二碱基即所说寡聚核苷酸是一个三嵌合聚体(tricosamer)的情况外)。用这个合成的寡聚核苷酸作为有意义引物BL8(显示于SEQ ID NO:2)。
T TT ABL8:5′-AC AACAC AC GCTTACCC TAC CC G接着，用化学方法合成一个十八聚体，它与编码某一特定氨基酸片段的DNA序列互补，该氨基酸片段是前面所说的赖氨酰肽链内切酶消化产物并具有最大可靠程度的氨基酸序列[即GlyTyr Pro Gly Asp Lys(由SEQ ID NO:8所示)]。该十八聚体用作反意义引物BL83(如SEQ ID NO:3所示)。
T A T C TBL83:5′-TT TC CC GGATA CCC G G A G用上述模板DNA和寡聚核苷酸引物，通过PCR法(Saiki etal.,Science 239,487-491,1989)扩增DNA。通过1％琼脂糖凝胶电泳对一部分扩增产物进行分析，从而确证了存在有大约370bpDNA片段。分离该片段，用Klenow片段使末端平齐后，将该片段克隆于已用SmaⅠ消化的M13mp11中，通过Sanger方法(Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463-5467,1977)测定该片段的DNA序列。通过这种方法，测定375bp片段的碱基序列，并发现与BL83相对应的氨基酸序列定位于第131到第136位。再者，还发现前面所说的氨基酸序列(Ⅱ)和(Ⅲ)分别定位于第21-25位以及第79-86位。(2)基因组DNA的Southern印迹分析用限制性酶SalⅠ消化由上述第(1)项中描述的步骤得到的来源于地衣形芽孢杆菌ATCC NO.14580的基因组DNA，在用1％琼脂糖凝胶电泳使产物分离后，将该DNA片段吸印到尼龙滤膜上并用Southern方法进行分析。用于杂交的探针是上述第(1)项中获得的BL8-BL83PCR产物，并已通过常规方法用32p-dcTp进行标记。与这种BL8-BL83产物显示阳性杂交反应的DNA片段被认为是一条对应于约3.1kb长度的谱带。(3)通过PCR法测定基因组DNA的序列用SalⅠ消化上述第(1)项中获得的地衣形芽孢杆菌ATCCNO.14580的基因组DNA，然后用T4DNA聚合酶使该片段形成平齐末端。将该具平齐末端的片段连接到一个脱磷酸化的SmaⅠ消化的pUC119载体上。用一种商品试剂盒(Takara Shuzo)来完成这一连接反应。
接着，用化学方法合成有意义引物RV(如SEQ ID NO:4所示)和反意义引物B125(由SEQ ID NO:5所示)，其碱基序列也可见下文所示，将其加入等份的上述连接反应的反应混和物中，以便进行PCR反应。
有意义引物RV是PUC119的DNA序列的一部分，并定位于前面所说基因组DNA的上游，而反意义引物B125是与在前面第(2)项中分析的375bpDNA片段的3’末端附近的一个序列互补的一个DNA序列。
RV: 5′ -CAGGAAACAGCTATGACB125: 5′-TGTCCCAACAAGTGATGA通过前面所说的PCR法获得约为1050bp的一个DNA片段。利用直接DNA序列分析法(Gibbs et al.,pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86,1919-1923,1989)可测定该片段的碱基序列。通过这种方法，确定了编码本发明酶的DNA序列是从5’末端到该序列的中间部分。
用SalⅠ消化上述第(1)项中获得的地衣形芽孢杆菌ATCCNO.14580的基因组DNA，并将催化产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，从而分离出约3.1kb的一个片段。用Klenow片段使该片段变成平齐末端，并且与脱磷酸化的已用SmaⅠ消化的M13mp11的片段连接。用它作为模板，进行PCR反应。用于这种PCR的引物是有意义引物的B40(如SEQ ID NO:6所示)，它是前面第(2)项中分析的375bpDNA片段的一部分(位于前面所述的B125引物的上游)，以及反意义引物M4(如SEQ ID NO:7所示)，它是与定位于该基因组DNA下游的M13mp11的DNA序列的一部分互补的一个DNA序列。
M4: 5′-GTTTTCCCAGTCACGACB40: 5′-AAAACCGTCGCAACAGCC上述PCR产生一个约2.2kb的DNA片段。该DNA片段的碱基序列可由直接DNA序列分析法测定。用这种方法，可以测定该基因组DNA的3’末端到中间部分的碱基序列。
由这种方法测得的Blase的全部DNA序列以及从该DNA序列推测的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:1和
图1-1到1-3。
可以利用Blase的DNA序列以及与所说DNA序列发生杂交的DNA序列生产具有Blase活性的蛋白酶，该酶也属于本发明的范围。例如，利用下面的方法可以获得与Blase DNA序列发生杂交的DNA序列。
利用Blase的全部或一部分DNA序列如从SEQ ID NO:1的第248位的A到第1371位的T之间的一个1124bpDNA片段作为探针，对各种DHA片段，例如，来源于各种生物体的DNA片段进行筛选。例如通过利用32p标记的探针，以及具有下面组份的杂交缓冲液，用Southern杂交反应技术进行(Southern,E.M.,J.Mol.Biol.98,503-517,1975)。
O.5MNaH2PO4(pH7.2)1mM EDTA1％ BSA7％ SDS在65℃下使杂交反应进行过夜后，在室温下用2×SSC,0.1％SDS洗涤已经与探针杂交的滤膜，四次中每次洗涤在室温下进行10分钟，从而获得了与BlaseDNA序列具有约65％同源性的一个DNA片段。在50℃将滤膜再次洗涤20分钟，可以获得与BlaseDNA序列具有约80％同源性的一个DNA片段。(4)表达载体的构建(4)-1构建往复性载体pHY300PLKtt利用M.Stshl等人的方法(同上文)从地衣形芽孢杆菌ATCC NO.6051中分离基因组DNA，并将其用作模板DNA。接着，用化学方法合成由与枯草芽孢杆菌Ⅰ-168的碱性蛋白酶基因的终止因子部分的5’末端附近相对应的DNA序列组成的一个片段(Journal of Bacteriology158,4111-418,1984)，该片段附带一个XbaⅠ切割位点(有意义引物A，用SEQ ID NO:11表示)，以及合成与对应于终止因子部分3’末端附近的一个DNA序列互补的一个片段，该片段附带一个HindⅢ切割位点(反意义引物B，用SEQ ID NO:12表示)。以这两种片段作为引物。
有意义引物A5’-GAGTCTAGAGCAGCTGCACAATAATAG-3’反意义引物B5’-GAGAAGCTTGACAGAGAACAGAGAAG-3’然后，利用前面所说模板DNA和这两种引物进行PCR反应。用XbaⅠ和HindⅢ切割如此获得的DNA片段，从而获得图3中显示的片段(1)。接着，用XbaⅠ和HindⅢ切割往复性载体pHY300PLK(Takara Shuzo)，获得较大的片段(2)(见图3)。然后通过将这些片段(1)和(2)连接而构建含有枯草杆菌ATCC NO.6051的碱性蛋白酶终止因子的往复载体pHY300PLKtt。
(4)-2构建表达载体pHY300BLtt利用M.Stshl等人的方法(同上文)从地衣形芽孢杆菌ATCC NO.14580的培养细胞中分离基因组DNA，并用作为模板DNA。然后，合成与该模板DNA5’末端附近相对应的带有一个附加的EcoRⅠ切割位点的一条单链DNA片段，以及合成与相应于模板DNA的3’末端的DNA序列相互补并附带一个XbaⅠ切割位点的一条单链DNA片段，分别作为有意义引物C(用SEQID NO:13表示)和反意义引物D(用SEQ ID NO:14表示)。
有意义引物C5’-CAAGAATTCGGCTTCCCGTGCGCCTCC-3’反意义引物D
5’-TTGTCTAGAATTTGCCGATCAGCGGTC-3’利用前面所说的模板DNA，有意义引物C，和反意义引物D进行PCR反应。然后，用EcoRⅠ和XbaⅠ切割如此获得的片段，从而获得编码Blase的DNA片段(3)(见图2)。接着，用EcoRⅠ和XbaⅠ切割前面所说载体pHHY300PLKtt，从而获得较大片段(4)。然后用T4DNA连接酶连接前面所述片段(3)和(4)。将连接混合物用于转化E.Coli K-12C600。在含有氨苄青霉素的琼脂平板培养基上培养转化体，选择具氨苄青霉素抗性的菌落。然后，从筛选出的菌落细胞中分离质粒DNA，从限制性酶切割方式可以确证上述的片段(3)以正确的方位插入。(5)制备转化体和生产Blase用J.Spizien等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.44,1072(1958))将上述第(4)项中获得的表达载体pHY300BLtt引入枯草杆菌ISW1214(Takara Shuzo)中。然后在含有四环素的琼脂平板培养基中培养该细菌，并筛选四环素抗性菌落，从而获得所需要的转化体(枯草杆菌pHY300BLtt/ISW1214)。
将该转化体移植到5mlLB培养基中(10g胰蛋白胨，5g酵母抽提物，5g氯化钠，加水至总体积为1升；pH7.2)，并于37℃振荡培养18小时。然后，把1ml这种肉汤培养基加入到10mlSc+培养基，该培养基已在高压灭菌器中于120℃灭菌20分钟，于28℃下进行振荡培养。
Sc+培养基配方可溶性淀粉10g甘油 5gBacto soytone 5gCSL 2.5g酵母抽提物1g碳酸钙3g加水至总体积为1升(pH7.0)将前面所说的肉汤培养液在2500×g离心5分钟得到上清液。利用本说明书优选实施例中所述的酶活性测定方法测定该上清液中的Blase活性。这种测定结果如表4所示。根据估计的Blase比活性为2500U/mg计算出每升肉汤培养液中蛋白质的量。
表4
如上所述，本发明提供一种新的蛋白酶，该蛋白酶特异性地切割多肽氨基酸的谷氨酸残基羧基端的肽键，一种从芽孢杆菌属细菌中制备蛋白酶的方法，编码该蛋白酶的一个DNA序列，含有该DNA序列的一个表达载体，将该表达载体引入宿主中获得的转化体，以及利用该转化体制备蛋白酶的方法。这种类型的蛋白酶可用于各种目的，如蛋白质分析以及在融合蛋白的所需位点上切割肽链等。
SEQ ID NO:1序列类型有相应蛋白质的核苷酸序列长度1448个碱基对股数双股局部解剖结构线性分子类型基因组来源生物体地衣形芽孢杆菌菌株ATCC NO.14580特征从323至1270bpCDS(E)从323至604bp信号肽(E)从605至1270bp成熟肽(E)其他信息氨基酸序列第-94位的Xaa甲酰基甲硫氨酸TCGACGGCTT CCCGTGCGCC TCCGGGATCG CTGTGATAAT TGACAACCAC ATTCATCTTT 60TCTTTTCCAA ACCGTTCTGC AACCGCCTTG CCTATACCTT TTGAAGAGCC GGTCACAATT 120GCTGTTTTTC CTTTTAAATC ACTATACAAC CTAAACACCC CTCAATTTCT TTTCTCCATG 180TACATTACCC GGTATCAATA TATGATCAAA CAAAATGTTA ATACACACCT TTAGTATGAT 240CTTTTTTAAA CATATGGAAA ATTCAGAATT ATTTTGTTAA TATCTAACTT GTACTTACAA 300CAAAATAAGG AAGTGATATG AT TTG GTT AGT AAA AAG AGT GTT AAA CGA GGT 352Xaa Val Ser Lys Lys Ser Val Lys Arg Gly-94 -90 -95TTG ATC ACA GGT CTC ATT GGT ATT TCT ATT TAT TCT TTA GGT ATG CAC 400Leu Ile Thr Gly Leu Ile Gly Ile Ser Ile Tyr Ser Leu Gly Mer His-90 -85 -80CCG GCC CAA GCC GCG CCA TCG CCT CAT ACT CCT GTT TCA AGC GAT CCT 448Pro Ala Gln Ala Ala Pro Ser Pro His Thr Pro Val Ser Ser Asp Pro-75 -70 -65TCA TAC AAA GCG GAA ACA TCG GTT ACT TAT GAC CCA AAC ATT AAG AGC 496Ser Tyr Lys Ala Glu Thr Ser Val Thr Tyr Asp Pro Asn Ile Lys Ser-60 -55 -50GAT CAA TAC GGC TTG TAT TCA AAA GCG TTT ACA GGC ACC GGC AAA GTG 544Asp Gln Tyr Gly Leu Tyr Ser Lys Ala Phe Thr Gly Thr Gly Lys Val-45 -40 -35AAT GAA ACA AAG GAA AAA GCG GAA AAA AAG TCA CCC GCC AAA GCT CCT 592Asn Glu Thr Lys Glu Lys Ala Glu Lys Lys Ser Pro Ala Lys Ala Pro-30 -25 -20 -15TAC AGC ATT AAA TCG GTG ATT GGT TCT GAT GAT CGG ACA AGG GTC ACC 640Tyr Ser Ile Lys Ser Val Ile Gly Ser Asp Asp Arg Thr Arg Val Thr-11 5 10AAC ACA ACC GCA TAT CCG TAC AGA GCG ATC GTT CAT ATT TCA AGC AGC 688Asn Thr Thr Ala Tyr Pro Tyr Arg Ala Ile Val His Ile Ser Ser Ser15 20 25ATC GGT TCA TGC ACC GGA TGG ATG ATC GGT CCG AAA ACC GTC GCA ACA 736Ile Gly Ser Cys Thr Gly Trp Met Ile Gly Pro Lys Thr Val Ala Thr30 35 40GCC GGA CAC TGC ATC TAT GAC ACA TCA AGC GGT TCA TTT GCC GGT ACA 784Ala Gly His Cys Ile Tyr Asp Thr Ser Ser Gly Ser Phe Ala Gly Thr45 50 55 60GCC ACT GTT TCG CCG GGA CGG AAC GGG ACA AGC TAT CCT TAC GGC TCA 832Ala Thr Val Ser Pro Gly Arg Asn Gly Thr Ser Tyr Pro Tyr Gly Ser65 70 75GTT AAA TCG ACG CGC TAC TTT ATT CCG TCA GGA TGG AGA AGC GGA AAC 880Val Lys Ser Thr Arg Tyr Phe Ile Pro Ser Gly Trp Arg Ser Gly Asn80 85 90ACC AAT TAC GAT TAC GGC GCA ATC GAA CTA AGC GAA CCG ATC GGC AAT 928Thr Asn Tyr Asp Tyr Gly Ala Ile Glu Leu Ser Glu Pro Ile Gly Asn95 100 105ACT GTC GGA TAC TTC GGA TAC TCG TAC ACT ACT TCA TCA CTT GTT GGG 976Thr Val Gly Tyr Phe Gly Tyr Ser Tyr Thr Thr Ser Ser Leu Val Gly110 115 120ACA ACT GTT ACC ATC AGC GGC TAC CCA GGC GAT AAA ACA GCA GGC ACA 1024Thr Thr Val Thr Ile Ser Gly Tyr Pro Gly Asp Lys Thr Ala Gly Thr125 130 135 140CAA TGG CAG CAT TCA GGA CCG ATT GCC ATC TCC GAA ACG TAT AAA TTG 1072Gln Trp Gln His Ser Gly Pro Ile Ala Ile Ser Glu Thr Tyr Lys Leu145 150 155CAG TAC GCA ATG GAC ACG TAC GGA GGA CAA AGC GGT TCA CCG GTA TTC 1120Gln Tyr Ala Met Asp Thr Tyr Gly Gly Gln Ser Gly Ser Pro Val Phe160 165170GAA CAA AGC AGC TCC AGA ACG AAC TGC AGC GGT CCG TGC TCG CTT GCC 1168Glu Gln Ser Ser Ser Arg Thr Asn Cys Ser Gly Pro Cys Ser Leu Ala175 180 185GTA CAC ACA AAT GGA GTA TAC GGC GGC TCC TCG TAC AAC AGA GGC ACC 1216Val His Thr Asn Gly Val Tyr Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Arg Gly Thr190 195 200CGG ATT ACA AAA GAG GTG TTC GAC AAT TTG ACC AAC TGG AAA AAC AGC 1264Arg Ile Thr Lys Glu Val Phe Asp Asn Leu Thr Asn Trp Lys Asn Ser205 210 215 220GCA CAA TAATACACGA AGACAGCCCG CTTCCTTTTG GAACGGGCTG TCACATCTAA 1320Ala GlnCGGCCGTATA CTTAATTTCC TTTAAGCCTG TACTTTTTGC CATCTATTGA TATCGTGAAA1380TTTGAAGGAC CGCTGATCGG CAAATAATAG ACAAGCTGAA ACTCCGCTTC CTCACCAGGT1440TTGAATGG 1448SEQ ID NO:2序列类型核苷酸序列长度23碱基对股数单股局部解剖结构线性分子类型其他核酸，合成DNAACYAACACYA CYGCTTACCC RTA 23SEQ ID NO:3序列类型核苷酸序列长度18个碱基对股数单股局部解剖结构线性分子类型其他核酸，合成DNA
YTTRTCKCCM GGATAKCC 18SEQ ID NO:4序列类型核酸序列长度17个碱基对股数单股局部解剖结构线性分子类型其他核酸，合成DNACAGGAAACAG CTATGAC17SEQ ID NO:5序列类型核酸序列长度18个碱基对股数单股局部解剖结构线性分子类型其他核酸，合成DNATGTCCCAACA AGTGATGA 18SEQ ID No:6序列类型核酸序列长度18个碱基对股数单股局部解剖结构线性分子类型其他核酸，合成DNAAAAACCGTCG CAACAGCC 18
SEQ ID No:7序列类型核酸序列长度17个碱基对股数单股局部解剖结构线性分子类型其他核酸，合成DNAGTTTTCCCAG TCACGAC17SEQ ID NO:8序列类型氨基酸序列长度6个氨基酸局部解剖结构线性分子类型肽片段类型内部片段来源生物体地衣形芽孢杆菌菌株ATCC NO.14580Gly Tyr Pro Gly Asp Lys1 5SEQ ID NO:9序列类型氨基酸序列长度5个氨基酸局部解剖结构线性分子类型肽片段类型内部片段来源生物体地衣形芽孢杆菌菌株ATCC NO.14580Ala Ile Val His Ile1 5SEQ ID NO:10序列类型氨基酸序列长度8个氨基酸局部解剖结构线性分子类型肽片段类型内部片段来源生物体地衣形芽孢杆菌菌株ATCC NO.14580Ser Thr Arg Tyr Phe Ile Pro Ser1 5SEQ ID NO:11序列类型核酸序列长度27个碱基对股数单股局部解剖结构线性分子类型其他核酸，合成DNAGAGTCTAGAG CAGCTGCACA ATAATAG 27SEQ ID NO:12序列类型核酸序列长度26个碱基对股数单股局部解剖结构线性分子类型其他核酸，合成DNAGAGAAGCTTG ACAGAGAACA GAGAAG 26SEQ ID NO:13序列类型核酸序列长度27个碱基对股数单股局部解剖结构线性分子类型其他核酸，合成DNACAAGAATTCG GCTTCCCGTG CGCCTCC 27SEQ ID NO:14序列类型核酸序列长度27个碱基对股数单股局部解剖结构线性分子类型其他核酸，合成DNA
TTGTCTAGAA TTTGCCGATC AGCGGTC2权利要求
1．一种生产蛋白酶的方法，其包括下列步骤在培养基中培养通过构建表达载体并将该表达载体导入宿主而得到的转化体，其中表达载体含有编码蛋白酶的DNA序列，所述蛋白酶切割多肽的谷氨酸残基的羧基端肽键，并且来源于地衣形芽孢杆菌；从培养基中回收所产生的蛋白酶。
2．权利要求1的方法，其中蛋白酶来源于地衣形芽孢杆菌ATCCNo.14580。
3．权利要求1的方法，其中蛋白酶具有下列特性(1)最适pH约为8.0，以及(2)稳定的pH范围pH为6.5-8.5,25℃。
4．一种生产蛋白酶的方法，其包括下列步骤在培养基中培养通过构建表达载体并将该表达载体导入宿主而得到的转化体，其中表达载体含有编码蛋白酶的DNA序列，所述蛋白酶切割多肽的谷氨酸残基的羧基端肽键，并且含有SEQ ID No:1的+1位丝氨酸到+222位谷氨酰胺的氨基酸序列；从培养基中回收所产生的蛋白酶。
5．权利要求4的方法，其中DNA序列含有SEQ ID No:1的605位胸腺嘧啶残基到1270位的腺嘌呤残基的碱基序列。
6．权利要求4的方法，其中蛋白酶含有SEQ ID No:1的-94位N-甲酰甲硫氨酸到+222位的谷氨酰胺的氨基酸序列。
7．权利要求6的方法，其中DNA序列含有SEQ ID No:1的323位胸腺嘧啶残基到1270位的腺嘌呤残基的碱基序列。
8．权利要求1-7的方法，其中所述宿主是芽孢杆菌菌株。
9．一种生产转化体的方法，其包括下列步骤构建含有编码蛋白酶的DNA序列的表达载体，所述蛋白酶切割多肽的谷氨酸残基的羧基端肽键，并且来源于地衣形芽孢杆菌；并将该表达载体导入宿主。
10．权利要求9的方法，其中蛋白酶来源于地衣形芽孢杆菌ATCCNo.14580。
11．权利要求9的方法，其中蛋白酶具有下列特性(1)最适pH约为8.0，以及(2)稳定的pH范围pH为6.5-8.5,25℃。
12．一种生产转化体的方法，其包括下列步骤构建含有编码蛋白酶的DNA序列的表达载体，所述蛋白酶切割多肽的谷氨酸残基的羧基端肽键，并且含有SEQ ID No:1的+1位丝氨酸到+222位谷氨酰胺的氨基酸序列；将该表达载体导入宿主。
13．权利要求12的方法，其中DNA序列含有SEQ ID No:1的605位胸腺嘧啶残基到1270位的腺嘌呤残基的碱基序列。
14．权利要求12的方法，其中蛋白酶含有SEQ ID No:1的-94位N-甲酰甲硫氨酸到第+222位的谷氨酰胺的氨基酸序列。
15．权利要求14的方法，其中DNA序列含有SEQ ID No:1的323位胸腺嘧啶残基到1270位的腺嘌呤残基的碱基序列。
16．权利要求9-15的方法，其中所述宿主是芽孢杆菌菌株。
全文摘要
提供了一种来源于地衣形芽孢杆菌的新型蛋白酶。该蛋白酶切割多肽的谷氨酸残基羧基端的肽键。该蛋白酶含有从SEQID NO:1的第+1位丝氨酸到第+222位谷氨酰胺之间的氨基酸序列。
文档编号C12R1/10GK1310232SQ00126248
公开日2001年8月29日 申请日期2000年8月19日 优先权日1990年10月24日
发明者寺冈宏, 玉木干男, 中村悦男, 新优, 吉田信男, 续木博茂, 藤原孝司, 松本浩一 申请人:盐野义制药株式会社