专利名称：生物分子在导电基底上的原位电化学定位方法
技术领域：
本发明涉及一种生物分子在导电基底上的原位电化学定位方法。
生物分子例如DNA、蛋白、抗体、抗原、生长因子等在固体基底上的固定是构建生物芯片、研制传感器等的先决条件，但是，由于不能形成有效的结合力，这些分子的直接固定比较困难。一般需要对基底材料和/或需要固定的分子进行预处理，常用的方法有1，在基底表面上进行化学活性基团预修饰。比如，通过偶联剂等化学试剂处理使表面形成憎水性的但带有胺基(NH2)、醛基(HCO)等活性基团的修饰层。2，通过巯基自组装形成表面共价键。基于金(Au)等金属能与巯基形成强结合力的共价键，生物分子在金表面的固定一般是在生物分子端位结合带巯基的分子。如在DNA的5′端位结合R-SH，其中R一般是六个碳链左右的烷基。3，通过亲合结合将生物分子直接连接到基底表面。其方法是先在基底表面修饰链亲合素，然后通过施加电场将经过生物素预修饰的核酸结合在基底表面(如nanogen公司基因芯片制作方法)。
以上所述的几种结合方式目前已在实际应用，但是，不足之处抑或是基底材料表面处理比较复杂，费时费力；抑或是不同的生物分子对基底或修饰层有专门的或特殊的要求。而且，基底表面上经过化学活性基团预修饰后，其价格大大提高(可高达几十倍)，从而限制其大量应用。
生物分子转移到固体基底上形成有序排列或高密度组合(每平方厘米成千上万点)的方法通常有1)，以类似微电子制作技术包括光刻等方法原位合成。2)，通过喷墨打印、微阵列点样等方式直接将生物分子转移到基底表面。方法1)可以在基底上制备很高密度的微阵列，但是，工艺复杂，设备投资较大，成本高，只能由专业化公司生产。此外，该方法需要较长的制作时间，对于长链大分子的合成比较困难。方法2)的操作比较简单，但是基底或生物分子需要如前所述的预处理。
本发明的目的是提供一种利用电化学方法一步将生物分子有选择地定向转移并固定在指定的基底上的生物分子在导电基底上的原位电化学定位方法。
为了达到上述目的本发明采取下列措施生物分子在导电基底上的原位电化学定位方法的定位步骤如下1)采用导电的基底材料作为阳极，另一由化学稳定的可三维移动控制的导电材料作为阴极；2)在阳极表面或阴极端面构建多孔或离子导电的隔离层；3)蘸取含生物分子的电解液，并使两电极通过电解液层构成电化学回路；4)由电化学工作站在两电极之间施加电位或电流，在阳极表面构建呈三维多孔状的立体结构，从而使生物分子一步转移并固定在阳极基底表面。
本发明的优点1).方法简单，可利用现有的芯片点样仪，仅需对点样针进行改造，使用时施加适当的电场即可；2).在无须特殊处理的情况下，生物分子的转移-固定一步完成。操作程序简化，省时省费用；3).由于电场加速生物分子定向运动，此方法具有富集生物分子的功能；4).由于电化学聚合过程能构建立体结构，生物分子在基底表面可形成三维结构，从而增加生物分子的固定量。其中，3)、4)两点的结果都将大大提高检测灵敏度。
下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。
图1是电化学体系构成方式示意图；图2是隔离型电化学点样固定法示意图；图3是电位极化波形示意图；图4是电化学定位工作原理图；图5是苯丙酮酸尿症诊断DNA专用芯片模式图；图6是检测Arg243Gln突变的苯丙酮酸尿症患者的杂交结构图。
本发明首先是制作系统要形成一个电化学单元，即由两个电极和带有生物分子的电解质层组成。电化学单元是这样组成的被使用的基底材料整体或表面层应该是电子导体，基底在有良好的电导情况下，最表面层亦可以是离子电导层。在生物分子的转移和固定的系统中，该基底材料一般被控制成阳极1，这是因为生物分子如DNA一般带负电。在电场的作用下，这些带负电分子以电泳方式向阳极移动，最终固定在基底材料表面。另一电极设计成针型，针头的大小根据所要固定的生物分子在基底材料上形成的面积大小而定，此电极一般被控制成阴极2。含生物分子的电解质层的形成可以有几种方法，一是将液体电解液层3分布于两电极之间(
图1A)；二是在基底材料表面先覆盖多孔或离子导电隔离层4，然后针型阴极蘸取含生物分子的电解液，在外加电位的情况下，将生物分子固定在基底表面(
图1B)。三是首先在针型阴极上固定有机或无机的多孔或离子导电隔离层4，防止两电极在工作时直接接触，而造成短路。使用时由这一薄层吸取带生物分子的电解液进行表面固定(
图1C)。这三种结构表示在图一中。对于第一种情况，由于生物分子在电场作用下能从各个方向由溶液相电泳到基底表面，但是，由于电场分布不均匀，在固定点上的生物分子的浓度分布也不均匀。而且，点的大小不易控制。第二种情况，生物分子固定在离子导电隔离层的表面，离子导电隔离层可以是Nafion、聚苯胺、聚吡咯等。由于离子导电隔离层可以做得空隙率比较大，因此可以固定比较多的生物分子。但是，此种方法需要预先制备导电层。第三种情况可能会最多被应用，因为仅仅需要在针头修饰离子导电隔离层。生物分子固定在基底上的大小和总量较易被控制。而且，由于隔离层呈多孔状态，可以吸纳较多的溶液，因而可以一次点样很多点。第三种结构的工作原理如图2所示。导电基底在电化学回路中形成阳极1，阴极2的顶部修饰多孔离子隔离层4。在电场的作用下，荷负电的生物分子5吸附在阳极表面。
此方法的工作原理叙述如下在已构成的电化学体系中，加入或蘸取配好的电解液。电解液中至少含有电介质、所需固定的生物分子、能在控制电位范围内聚合或凝聚在基底表面的有机或无机物等三类物质。在合适的电位或电流控制方式下，可聚合或凝聚的单体在阳极表面形成三维生长的呈多孔状的立体基架，这一立体结构能容纳更多的生物分子，而不是普通方法形成的单分子层，从而大大提高检测灵敏度。在这一过程中，中性的或带负电的生物分子加速向阳极扩散、迁移、电泳，一部分生物分子嵌入或被包裹在聚合层中，从而提高固定效果；亦有可能一部分生物分子与基底，特别是与表面已有聚合层的基底形成共价键。生物分子在表面固定的量与所施加的电位(电流)、极化时间、溶液中生物分子的浓度、溶液的电导等因素有关。在达到所需的固定量后，撤除外加电场，已有生物分子的基底可以进行进一步处理。比如，在制造生物芯片时，可进行清洗、PCR扩增、杂交等程序。
本发明所指的基底材料是指具有高电导的材料，其中包括1)，高稳定性的金属，如铂、金；2)，无机导体，如ITO玻璃(一种表面镀有铟掺杂的氧化锡导电层的玻璃)、石墨、玻碳等；3)，导电高聚物，如聚苯胺、聚吡咯、Nafion(全氟磺酸离子交换导电聚合物)等。这些基底材料可以是整体导电，亦可以仅限于表面层导电，即在导电体或绝缘体表面以不同方法覆盖导电层。
本发明所指的阴极是具有一定刚性的金属或表面覆盖有电子电导层的刚性材料。这些材料可以是在阴阳极极化情况下都稳定的Au、Pt、玻碳、石墨等材料，也可以是在阴极保护下稳定的不锈钢、镍，甚至铜等导电体。生物分子在基底上固定的形状、大小取决于阴极顶端的形状。因此，阴极可以呈圆柱形、针形、条形、方形等等形状。针形阴极的直径为1～0.01厘米。针形阴极可以制作成实心的、空心的、顶部开叉的等等形状。
所说的离子导电隔离层为Nafion离子电导聚合物；聚乙烯、聚胺脂、聚氯乙烯多孔状的塑料薄膜；聚四氟乙烯、四氟乙烯-四氟丙烯共聚物、四氟乙烯-全氟烷基乙烯基醚共聚物熔融形成的大小孔分布的高聚物或沸石、氧化铝无机材料；通过电化学或化学方法形成的聚乙炔、聚苯胺、聚吡咯导电聚合物。
所说的生物分子为寡核苷酸、蛋白质、cDNA、生物酶、抗体、抗原及维生素、氨基酸、嘌呤碱、嘧啶碱生长因子。
所说的电解液由生物分子、支持电解质、易电聚合的有机单体、具有pH缓冲能力的物体组成的液体或糊状体。
本发明所指的外加电场可以是如下几种方法中的一种或几种(见图3所示)1，恒电位法。即在两电极之间施加一恒定的直流电位，一般情况下，需要固定生物分子的基底材料被控制成阳极。2，方波电位法。方波电位法是指在一定频率下对基底电极进行交替正负电位极化。对于带负电的生物分子容易在基底表面形成静电吸附，特别对于bp长的DNA分子会平坦躺在基底表面而影响正常的分子固定。使用对称方波电位法可以在阳极负极化时使非特异性吸附的分子重新脱附，让出空位使分子正常固定。方波电位法可以是其正负电位或正负电位极化时间是不对称的。此方法的优点是可以方便调节生物分子吸脱附的时间，3，极化-驰豫法。是指阳极在施加一定时间电位后，电路断开一定的时间。在施加电位的时间内，生物分子固定到基底表面；在断路时，让生物分子自由扩散接近阳极，靠静电吸附的分子产生脱附，同时，在多孔隔离层孔洞中的液体借重力作用向阳极方向流动，减少极化时的浓差极化。这样既减少了电位极化的时间，节省用电，降低生物分子在电场作用下被破坏的可能性，又不影响固定速度。
按本发明的方法进行操作的工作原理在图4中简要表示。首先按图4连接好工作体系，阳极1固定不动，阴极2在计算机7控制下可三维运动，自动一步完成取样、点样、清洗等程序。在电化学工作站6施加电场的条件下，阴极通过上下运动与阳极构成电回路或断开，阴极与阳极导通的时间可任意调节，以改变生物分子固定在基底上的量。
实施例DNA探针的固定1)，实验条件仪器美国CHI660A电化学工作站；英国BioRobotics的TAS点样仪；溶液pH＝7的电导缓冲溶液，其中含10-6moldm-3的以Cy5荧光物修饰的含15bp寡核苷酸样品(5’NH2-oligo-3’Cy5)、10-4mol dm-3的苯胺；电极表面经过清洗的ITO导电玻璃；顶部直径为0.5mm的铂电极。
2)，操作步骤将ITO导电玻璃连接电化学工作站的阳极，铂电极连接阴极，铂电极顶端在使用前先在含0.5％Nafion的醇稀释液中浸渍两次，待完全干燥后待用。本实例采用恒电位法，两电极之间的电位差控制在1.2伏。正式点样时，铂电极先在样品溶液中浸渍取样，在带电状态下接触阴极，电路导通后苯胺在阳极发生聚合成聚苯胺，同时荷负电的DNA分子向阳极电泳、扩散，经一段时间后，撤除电场，在GSI Scanarrayer 5000激光扫描仪上进行扫描。波长为633nm的Cy5荧光物在激光激发下显示桔红色，说明Cy5修饰的DNA探针已转移到导电玻璃上。
对检验确定已含DNA探针的玻片在缓冲溶液中清洗，最后以纯净水清洗，干燥后如上法再次扫描检测，仍有明显的荧光产生，但是，较未洗前弱，说明DNA探针能较牢固地固定在基底上。荧光的减弱是由于表面一部分游离的分子经清洗后被除去。
通过以上两步骤已确信DNA探针能用本发明的方法固定在基底上。为了进一步试验DNA探针的稳定性，用不经荧光物修饰的DNA探针如前法固定到导电玻璃上，经清洗后用带Cy3荧光物的寡核苷酸杂交。杂交后进行激光扫描，发现波长为543nm的Cy3荧光物显示绿色。以上结果说明利用本方法将DNA固定后经杂交过程仍牢固地结合在基底上。
生物芯片的制作，本实施例说明以本发明提出的方法制备生物芯片用于疾病相关基因突变检测。
具体以典型的病例来说明。苯丙酮酸尿症(PKU)是一种单基因突变引起的智力迟缓的遗传性疾病，是由于苯丙氨酸羟化酶基因活性缺失，苯丙氨酸羟化酶催化苯丙氨酸降解反应的第一步，即苯丙氨酸转化为酪氨酸。所以缺失苯丙氨酸羟化酶，苯丙氨酸在血液中积累并转化为苯丙酮酸，损害神经系统的发育。因为PKU病症可以利用低苯丙氨酸饮食进行治疗，所以PKU的早期诊断非常重要。
苯丙酮酸尿症的Tyr326Term，Trp356Term，Tyr204Cys，Arg243Gln，Arg111Term，Phe161Ser，Gly247Val，INS4nt-1(G-A)，Leu255Val，Arg413Pro，Thr418Pro，INS7nt2(T-A)等12种突变，苯丙氨酸羟化酶基因突变DNA相关探针表示如下W1CGA ACC GTG AGT ACTM1CGA ACC GAG AGT ACTW2ATT TAC TGG TTT ACTM2ATT TAC TAG TTT ACTW3TAC AGT ACT GCT TATM3TAC AGT AAT GCT TATW4GCT TGC TAT GAG TACM4GCT TGC TGT GAG TACW5CGC CTC CGA CCT GTGM5CGC CTC CAA CCT GTGW6GCT TTC ACG AGA TAAM6GCT TTC ATG AGA TAAW7AAG CAG TTT GCT GACM7AAG CAG TCT GCT GACW8GTG GCT GGC CTG CTTM8GTG GCT GTC CTG CTTW9GGA TTT CTT GGG TGGM9GGA TTT CGT GGG TGGW10 TCA GTT CGC TAC GACM10 TCA GTT CCC TAC GACW11 CCC ATA CAC CCA AAGM11 CCC ATA CCC CCA AAGW12 TCT CCT AGG GTT TTAM12 TCT CCT AAG GTT TTA探针固定采用由电聚合苯胺覆盖的硅片作为基底，此基底被控制为阳极。阴极是不锈钢针，使用前针头在约含30％PTFE(聚四氟乙烯)的水溶液中浸渍，干燥后放在电炉中350℃烧结半小时，使针头表面形成多孔的PTFE隔离层。每种氨基修饰的DNA探针配制成10-6mol dm-3的磷酸盐缓冲溶液。
在-0.5～+1.2V方波电位下以10Hz频率固定DNA探针，每个探针点四点以作比较，用于平行分析。样品处理取待测者血液1毫升，利用商业化的基因组DNA抽提试剂盒或标准的苯酚抽提/乙醇沉淀方法提取待测者的基因组DNA，用设计的几组PCR(聚合酶链式反应)引物对苯丙氨酸羟化酶基因的外显子3，4，6，7，10，11，12进行扩增。扩增的体积为50μl，0.5μg基因组DNA，200×10-6mol dm-3的dNTPs，0.5×10-6mol dm-3的PCR引物1和0.5×10-6mol dm-3的荧光修饰引物2，5μl的10×缓冲液，5U的DNA聚合酶。每一循环为94℃变性30秒，退火温度62℃，30秒；72℃延伸30秒，30个循环，最后延伸10分钟。混合PCR产物，加入1/10体积的3 moldm-3pH5.2醋酸缓冲液，加入2.5倍体积的-20℃冷藏的100％乙醇，混匀后，-20℃放置30分钟。13000rpm离心10分钟，用70％乙醇洗涤沉淀，干燥。DNA芯片表面杂交过程5μl杂交缓冲液(5 X SSC，0.2％SDS)溶解上述DNA，95℃变性5分钟，冷却至室温，滴加于DNA阵列表面，再盖上载玻片，42℃杂交4～8小时。杂交信号检测用共聚焦荧光显微镜或荧光扫描仪检测DNA芯片杂交信号。
检测结果与用常规点样法在胺基修饰玻片上固定的芯片比较，用本发明提出的技术制备的芯片显示较强的信号。芯片制作和检测结果表示在图5、6中。图5中8导电处理硅片，912×4突变序列探针，从左到右是Tyr326Term，Trp356Term，Arg243Gln，Tyr204Cys，Arg111Term，Phe161Ser，Gly247Val，INS4nt-1(G-A)，Leu255Val，Arg413Pro，Thr418Pro，INS7nt2(T-A)；1012×4与2相对应的正常序列探针。图6中11正常序列信号；12Arg243Gln突变位点信号。
权利要求
1.一种生物分子在导电基底上的原位电化学定位方法，其特征在于它的定位步骤如下1)采用导电的基底材料作为阳极[1]，另一由化学稳定的可三维移动控制的导电材料作为阴极[2]；2)在阳极表面或阴极端面构建多孔或离子导电的隔离层[4]；3)蘸取含生物分子的电解液[3]，并使两电极通过电解液层构成电化学回路；4)由电化学工作站在两电极之间施加电位或电流，在阳极表面构建呈三维多孔状的立体结构，从而使生物分子一步转移并固定在阳极基底表面。
2.根据权利要求1所述的一种生物分子在导电基底上的原位电化学定位方法，其特征在于所说阳极基底材料为金、银、铂系金属；ITO导电玻璃、石墨、玻碳无机导体；聚苯胺、聚吡咯、Nafion导电聚合物。
3.根据权利要求1所述的一种生物分子在导电基底上的原位电化学定位方法，其特征在于所说阳极基底材料为在固定生物分子前已形成立体结构的含胺基、醛基活性基团的导电聚合物。
4.根据权利要求1所述的一种生物分子在导电基底上的原位电化学定位方法，其特征在于所说阴极为稳定的裸露导体，或顶部已结合多孔或离子导电隔离层的铂系金属、金、银、不锈钢、石墨、玻碳导电材料。
5.根据权利要求1或4所述的一种生物分子在导电基底上的原位电化学定位方法，其特征在于所说的阴极呈圆柱形、针形、条形、方形，针形电极的直径为1～0.01厘米。
6.根据权利要求1或5所述的一种生物分子在导电基底上的原位电化学定位方法，其特征在于所说的针形电极，是指由金属或无机良导体制作的实心的、空心的、顶部开一条或多条叉的电极。
7.根据权利要求1所述的一种生物分子在导电基底上的原位电化学定位方法，其特征在于所说的离子导电隔离层为Nafion离子电导聚合物；聚乙烯、聚胺脂、聚氯乙烯多孔状的塑料薄膜；聚四氟乙烯、四氟乙烯-四氟丙烯共聚物、四氟乙烯-全氟烷基乙烯基醚共聚物熔融形成的大小孔分布的高聚物或沸石、氧化铝无机材料；通过电化学或化学方法形成的聚乙炔、聚苯胺、聚吡咯导电聚合物。
8.根据权利要求1所述的一种生物分子在导电基底上的原位电化学定位方法，其特征在于所说的生物分子为寡核苷酸、蛋白质、cDNA、生物酶、抗体、抗原及维生素、氨基酸、嘌呤碱、嘧啶碱生长因子。
9.根据权利要求1所述的一种生物分子在导电基底上的原位电化学定位方法，其特征在于所说的电解液由生物分子、支持电解质、易电聚合的有机单体、具有pH缓冲能力的物体组成的液体或糊状体。
10.根据权利要求1所述的一种生物分子在导电基底上的原位电化学定位方法，其特征在于所说的电化学工作站施加的电位或电流的方式为恒电位、恒电流、低频对称或不对称方波脉冲、多次极化—驰豫。
全文摘要
本发明公开了一种生物分子在导电基底上的原位电化学定位方法。其定位步骤如下:1)采用导电的基底材料作为阳极,化学稳定的导电材料作为阴极;2)在阳极表面或阴极端面构建多孔或离子导电的隔离层;3)蘸取含生物分子的电解液;4)由电化学工作站在两电极之间施加电位或电流,使生物分子一步转移并固定在阳极基底表面。本发明的优点:1)方法简单;2)生物分子的转移－固定一步完成,操作程序简化,省时省费用;3).由于电场加速生物分子定向运动,此方法具有富集生物分子的功能;4)大大提高检测灵敏度。
文档编号C12Q1/68GK1338521SQ0012611
公开日2002年3月6日 申请日期2000年8月21日 优先权日2000年8月21日
发明者沈培康, 叶邦策, 缪金明 申请人:浙江江南生物科技有限公司