专利名称：高效表达肿瘤血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒及其构建方法
技术领域：
本发明涉及生命科学领域，具体涉及一种能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，及其构建和增殖的方法。
恶性肿瘤严重危及人类的生命健康。目前对恶性肿瘤的常规治疗仍为手术及放、化疗，这种常规治疗对极大多数肿瘤的疗效仍不十分理想，对于极大多数化疗药物而言，其治疗指数仍较低，即其治疗剂量与毒性剂量较为接近。故这种治疗方案通常伴有明显的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制等。因此，研究选择性杀灭肿瘤细胞而不影响正常细胞的方法对肿瘤治疗非常重要，这种选择性杀灭肿瘤细胞的方法主要依赖于肿瘤细胞的特异性标记，其疗效也决定于该肿瘤标记是否严格限制于肿瘤细胞内。
近几年来，关于肿瘤新生血管研究取得很大进展，Folkkman的研究小组提出了在肿瘤发生和发展过程中的“血管生成开关机制”，揭示了肿瘤微血管形成的分子机制。当肿瘤的半径＜2mm时，它主要依靠扩散在细胞周围的营养物质和氧气生存。随着瘤体的增大，肿瘤本身或宿主组织将建立起新生血管网以供给瘤体营养。肿瘤新生血管网的形成取决于肿瘤周围的微环境中诱导与抑制新生血管形成的因子相互作用结果，在肿瘤的发生及转移灶形成过程中，诱导及促进新生血管形成的因子如成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血小板来源的内皮生长因子(PDEGF)、白细胞介素-8(IL-8)、纤溶酶原激活因子(PA)及基质金属蛋白酶(MMP)等占主导地位，而抑制新生血管形成的因子如内皮抑素(endostatin)、血管生成抑制(angiostatin)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、血小板反应蛋白(thrombospondin)、血小板因子4基因、纤溶酶原激活因子抑制剂(PAI)基因及纤维结合素(fibronectin)基因等处于劣势。从而导致肿瘤新生血管的形成，新生血管输送肿瘤细胞快速增殖所需的营养，也使肿瘤细胞的远距离转移得已实现。抑制肿瘤新生血管的形成，可阻断肿瘤细胞的营养供应，从而导致肿瘤细胞因营养不足而死亡，肿瘤明显萎缩乃至完全消褪。同时抑制肿瘤新生血管的形成，也达到阻断肿瘤转移的通路的目的。目前已有多种阻断肿瘤新生血管生成抑制因子进入临床试验。但由于新生血管生成抑制因子需要半衰期均较短，需要每天给予治疗。同时通常需要量也较多，如内皮抑素(endostatin)及血管生成抑素(angiostatin)治疗剂量10-20mg/Kg/天。常规生物工程方法难以达到。
肿瘤特异性增殖的病毒的根据肿瘤细胞与正常细胞某些生物学特性的差异，经过改造的病毒只能特异性地在肿瘤细胞内增殖、裂解肿瘤细胞，然后释放出病毒颗粒，再次感染其它肿瘤细胞，再次增殖、裂解，如此产生放大效应，由于病毒能够弥散到全身各个组织及脏器，因而能感染所有肿瘤细胞，从而杀灭局部及转移的肿瘤，而不影响正常细胞。
但迄今为止，尚未见到应用肿瘤特异性增殖的病毒系统高效表达血管生成抑制因子的报告。
本发明的目的在于提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒及其构建方法。
本发明的目的在于提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒的复合物。
本发明的目的在于研究上述能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒的应用。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，将编码血管生成抑制因子的核苷酸序列插入肿瘤细胞内特异性增殖的病毒基因组中的非增殖必需区域，该病毒选择性地在肿瘤细胞内增殖，而在正常细胞内不增殖，通过病毒在肿瘤细胞内复制增殖，导致编码血管生成抑制因子的核苷酸序列拷贝数增加，从而血管生成抑制因子基因表达量增加，该肿瘤细胞内特异性增殖的病毒可以是以下任何一种(1)在肿瘤细胞内特异性增殖的野生型病毒；(2)病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间插入肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件；(3)蛋白功能缺失重组后能在肿瘤细胞内特异性增殖的病毒。
上述重组病毒可以是腺病毒、单纯疱疹病毒等，编码血管生成抑制因子的核苷酸序列可以是编码内皮抑素的核苷酸序列、编码血管生成抑素的核苷酸序列等。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒的构建方法，(1)将编码血管生成抑制因子的核苷酸序列直接插入肿瘤细胞内特异性增殖的病毒基因组中的非增殖必需区域；(2)病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间插入肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件；顺式作用元件可以是下述任何一种(a).甲胎蛋白(AFP)增强子及启动子；(b).癌胚抗原(CEA)增强子及启动子；(c).酪氨酸酶增强子及启动子；(d).ErbB2增强子及启动子；(e).ErbB3增强子及启动子；(f).ErbB4增强子及启动子；(g).DF3乳腺癌相关抗原(MUCl)增强子；(h).前列腺素特异性抗原增强子及启动子；(i).腺血管舒缓素增强子及启动子；(j).EB病毒爱泼斯坦氏-巴尔氏病毒(Epstein-Barr virus，按常规简称为EB病毒)中的Orip；(k).EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(按常规简称为FR)；(1)EB病毒BamHⅠC-启动子；(m).EB病毒中的Orip联合EB病毒BamHⅠC-启动子；(n).EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子或SV40基本启动子；(3)蛋白功能缺失重组后能在肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，蛋白功能缺失可以是下述任何一种腺病毒E1B 55Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1B19Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1A蛋白功能缺失，单纯疱疹病ICP6蛋白功能缺失，单纯疱疹病ICP34.5蛋白功能缺失。
病毒在肿瘤细胞内特异性增殖及复制，而在正常细胞不增殖及复制，主要通过以下方法实现(1)选择性对病毒增殖必需基因的控制基因转录激活的调节受反式作用因子(如转录因子)与顺式作用元件相互作用的影响。当缺乏或出现某些转录因子会影响基因的转录水平。本发明应用肿瘤组织特异性激活顺式作用元件(包括启动子或增强子)控制目的基因，使该目的基因特异性在肿瘤细胞内表达，而在正常的细胞内不表达或低水平表达。应用控制肿瘤组织特异性启动子或增强子病毒增殖及复制的必需基因，从而使病毒增殖必需基因只能在肿瘤的细胞中表达，导致病毒只能在肿瘤的细胞内增殖，而在正常细胞内不增殖。
本发明采用细胞专一的反应元件是由肿瘤细胞特异性激活顺式作用元件组成，其顺式作用元件可以是下述任何一种甲胎蛋白(AFP)增强子及启动子为肝癌细胞特异性激活增强子及启动子。
癌胚抗原(CBA)增强子及启动子为胃癌及结肠癌细胞特异性激活增强子及启动子。
酪氨酸酶增强子及启动子为黑色素瘤细胞特异性激活增强子及启动子。
ErbB2增强子及启动子为乳腺癌细胞特异性激活增强子及启动子。
ErbB3增强子及启动子为乳腺癌细胞特异性激活增强子及启动子。
ErbB4增强子及启动子为乳腺癌及胃癌细胞特异性激活增强子及启动子。
DF3乳腺癌相关抗原(MUCl)增强子为乳腺癌细胞特异性激活增强子及启动子。
前列腺素特异性抗原增强子及启动子，该前列腺素特异性抗原增强子位于前列腺素特异性抗原起始转录位点的nt-5322～nt-3739，启动子位于前列腺素特异性抗原起始转录位点的nt-540～nt+12，该增强子与启动子特异性激活于前列腺细胞及前列腺癌细胞。
腺血管舒缓素增强子及启动子特异性激活于前列腺细胞及前列腺癌细胞。
爱泼斯坦氏-巴尔氏病毒(Epstein-Barr virus，按常规简称为EB病毒)中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒BamHⅠC-启动子、EB病毒中的Orip联合EB病毒BamHⅠC-启动子、EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子或SV40基本启动子、在EB病毒感染或潜伏感染细胞中特异性激活的顺式作用元件。
本发明提出的在于提供一类能特异性杀灭肿瘤细胞的增殖型重组病毒，它至少有一个病毒增殖所必需的基因的肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件制。它由在病毒增殖必需基因的转录起始位点与编码起始位点之间区域插入某种顺式作用元件而构成。该顺式作用元件特异性在肿瘤细胞内激活，产生转录活性，而在正常细胞内不激活，不能产生转录活性。该顺式作元件可以是下述顺序之一甲胎蛋白(AFP)增强子及启动子，癌胚抗原(CEA)增强子及启动子，酪氨酸酶增强子及启动子，ErbB2增强子及启动子，ErbB3增强子及启动子，ErbB4增强子及启动子，DF3乳腺癌相关抗原(MUCl)增强子，前列腺素特异性抗原增强子及启动子，腺血管舒缓素增强子及启动子，EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒BamHⅠC-启动子、EB病毒中的Orip联合EB病毒BamHⅠC-启动子、EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子或SV40基本启动子、在EB病毒感染或潜伏感染细胞中特异性激活的顺式作用元件。上述病毒增殖所必需的为病毒早期表达基因，如单纯疱疹病毒早早期表达基因ICP4。
本发明中，上述病毒可以采用腺病毒。其病毒增殖必需基因至少含有以下一个腺病毒的早期表达基因E1A、E1B、E2、E4。
(2).病毒在正常细胞复制必需而在肿瘤细胞中非必需的基因编码的蛋白功能选择性地缺失正常细胞与肿瘤存在着某些基因表达上的差异，某些病毒在正常细胞内复制所必需的基因，在肿瘤细胞内并不需要，因此，去除这些基因编码的蛋白功能有望使在肿瘤细胞内特异性复制，而不能在正常细胞中复制。
病毒蛋白功能功失可以是以下任何一种腺病毒E1B 55kDa的基因点突变、缺失突变、插入突变导致E1B 55kDa蛋白质功能异常。腺病毒E1B 19kDa的基因点突变、缺失突变、插入突变导致E1B 19kDa蛋白质功能异常。腺病毒E1A的基因点突变、缺失突变、插入突变导致E1A蛋白质功能异常。单纯疱疹病毒ICP6基因点突变、缺失突变、插入突变导致ICP6的蛋白质功能异常。单纯疱疹病毒ICP34.5基因点突变、缺失突变、插入突变导致ICP34.5的蛋白质功能异常。
(3).依赖于肿瘤细胞某个信号转导途径异常而产生的病毒复制，呼吸道肠道过滤性病毒(Reovirus)感染后其早期病毒基因转录可激活双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)，而该激酶可抑制该病毒的其它基因的转录，从而使病毒不能有效复制，而当细胞中Ras处于激活状态则可抑制该激酶，从而使该病毒活跃复制。Ras基因是一个癌基因，当它被不正常激活时，即可能发生癌变。呼吸道肠道过滤性病毒复制及增殖依赖于Ras异常激活的信号途径，即在Ras高表达的肿瘤细胞内复制及增殖。
(4).选择性进入肿瘤细胞改变它们表面的结合蛋白可使其与某些特定的肿瘤组织结合，从而使病毒只能感染特定的肿瘤组织。目前这方面改造主要集中于腺病毒外壳蛋白-纤维蛋白(Fiber)、五邻体(penton)及六邻体蛋白(hexon)，尤其在纤维蛋白中头部HI环中或C末端最常见，包括插入肿瘤膜表面具有高亲和力的某种配体、短肽及抗体Fab区域。
本发明提供一类的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码含有分泌型信号肽的内皮抑素(endostatin)的核苷酸序列。内皮抑素是一个胶原蛋白ⅩⅧ的20KDa的C-末端片段，它能特异性地抑制血管内皮细胞增殖作用，而不影响其它细胞。Folkman等的实验结果表明内皮抑素对肿瘤诱导的血管生成具有强烈的抑制活性，从而抑制肿瘤的形成与转移，而且反复应用内皮抑素无抗性产生，即使数百倍治疗剂量也无明显毒性。由于内皮抑素为胶原蛋白ⅩⅧ的C-末端片段，故无分泌性信号肽。在基因治疗时需要加入分泌型信号肽，M-成瘤蛋白信号肽及免疫球蛋白K链信号肽均为强分泌型信号肽，在内皮抑素加入M-成瘤蛋白信号肽或免疫球蛋白K链信号肽可将内皮抑素分泌至细胞外。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血管生成抑素(angiostatin)的核苷酸序列。血管生成抑素是血浆纤维蛋白溶酶原(plasminogen)的内部片段。血浆纤维蛋白溶酶原包含Kringle1-5结构，Kringle位点是3个环状相连的二硫键结构，每个Kringle结构包含约80个氨基酸，各个Kringle结构有50％左右的序列相同。血管生成抑素具有强烈抑制血管生存和肿瘤生长。通常的血管生成抑素是指血浆纤维蛋白溶酶原中含有Kringle1-4结构的38kDa蛋白片段。最近有研究对人血浆纤维蛋白溶酶原水解片段Kringle1-4和Kringle1-3作抗血管内皮细胞作用比较，Kringle1-3比Kringle1-4抗血管内皮细胞作用更强，重组的人Kringlel、Kringle2、Kringle3及Kringle4抗血管内皮细胞作用的研究表明抗血管内皮细胞作用依次Kringle1＞Kringle3＞Kringle2，而Kringle4几乎无活性。Keingle5抗血管内皮细胞作用活性与Kringle1-4相似或更强。
本发明中该编码血管生成抑制因子(angiostatin)的核苷酸序列，其为编码血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-4结构的核苷酸序列。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-5结构的核苷酸序列。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-3结构的核苷酸序列。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-3加上Kringle5结构的核苷酸序列。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1结构的核苷酸序列。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle2结构的核苷酸序列。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle3结构的核苷酸序列。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle5结构的核苷酸序列。
干扰素广泛应用于抗病毒治疗，有研究表明干扰素在体内有明显抑制肿瘤的作用。实验表明干扰素是通过抑制肿瘤新生血管形成而抑制肿瘤生长与转移。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码干扰素-α的核苷酸序列。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码干扰素-β的核苷酸序列。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码干扰素-γ的核苷酸序列。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血小板反应蛋白Ⅰ(thrombospondinⅠ)的核苷酸序列。血小板反应蛋白Ⅰ是一个由三个相同的180kDa亚单位组成的糖蛋白，它只少有两个不同的作用区域抑制新生微血管的形成。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血小板因子4的核苷酸序列。血小板因子4是血小板α颗粒蛋白，其抑制新生微血管形成区位于C-末端、肝素结合区。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码纤溶酶原激活因子抑制剂(PAI)的核苷酸序列。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码白细胞介素-12的核苷酸序列。白细胞介素-12是一个具有多种功能的细胞因子，包括促进淋巴细胞增殖、增强抗肿瘤的细胞免疫、诱导大量干扰素γ的产生、增强NK细胞及LAK细胞活性。最近发现它具有抗新生血管形成作用。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码纤维结合素(fibronectin)的核苷酸序列。纤维结合素是很多正常细胞的表面的主要组成成分及潜在的细胞猕散因子。纤维结合素在体内抑制新生血管生成。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列受启动子控制。该启动子可以为以下启动子之一猴病毒40(Simian virus40，按常规简称为SV40)启动子、劳斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，按常规简称为RSV)LTR启动子及人巨细胞病毒(按常规简称为HCMV)IE启动子等。
本发明在上述这种修饰病毒基因组中非增殖必需区域插入编码血管生成抑制因子的核苷酸序列，本发明所述的编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为含有分泌型信号肽的内皮抑素基因(endostatin)，该分泌信号肽为M-成瘤蛋白信号肽、免疫球蛋白K链信号肽，血管生成抑素基因(angiostatin)(血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-4结构)、血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-5结构、血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-3结构、血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-3加上Kringle5结构、血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1结构、血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle2、结构血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle3、结构血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle5结构、干扰素-α基因、干扰素-β基因、干扰素-γ基因、血小板反应蛋白(thrombospondin)基因、血小板因子4基因、纤溶酶原激活因子抑制剂(PAI)基因、白细胞介素-12及纤维结合素(fibronectin)基因。随着病毒在肿瘤细胞内复制，使编码血管生成抑制因子的核苷酸序列拷贝数增加，使肿瘤细胞高效表达血管生成抑制因子，从而抑制肿瘤血管形成，抑制肿瘤形成、生长及转移。同时，这种修饰后的病毒载体可被用于在某些细胞混合物中杀灭被某种殊靶细胞，通过给予修饰后的病毒能选择性地在该种靶细胞中增殖，从而使这种靶细胞被增殖的病毒选择性的杀灭；在体外培养或在动物体内通过将修饰后的病毒与细胞复合物混合，病毒只能在靶细胞增殖，也就是说除了靶细胞，其它细胞不能被这种病毒杀死。由于病毒在靶细胞内增殖及扩增，从而使混合细胞中的该靶细胞被杀灭，一旦靶细胞被破坏，病毒不再能够再增殖。
本发明提出的高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒与化学治疗药物(如顺铂、5-氟脲嘧啶丝裂霉素C等)、生物毒素(如蛇毒素)、单克隆抗体一起可以组成复合物，其作为抗肿瘤药物效果更好。与X-线联合应用可产生更为有效的抗肿瘤效应。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，用于抑制肿瘤细胞的生长。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，用于体外感染肿瘤细胞，病毒在肿瘤细胞内复制及增殖，导致编码血管生成抑制因子的核苷酸序列拷贝数增加及血管生成抑制因子表达量增加。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，可用于体内选择性地在肿瘤细胞内复制及增殖，导致编码血管生成抑制因子的核苷酸序列拷贝数增加及其表达量增加，抑制肿瘤血管形成，抑制肿瘤形成、生长及转移。同时该病毒能在而且仅限于肿瘤细胞内增殖，也能特异性直接杀灭肿瘤细胞。
本发明具有如下有益效果1．本发明提供一类治疗肿瘤的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，动物实验证明，这种重组病毒可用于治疗肿瘤。
2．本发明提供一类高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒的构建方法。该方法通常易行可用于构建高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒。
3．本发明提供一种在体内及体外杀灭肿瘤细胞、而不影响正常细胞，并在体内及体外肿瘤细胞内高效表达血管生成抑制因子，与化学抗肿瘤药物结合，更有效地杀灭肿瘤细胞，达到高效低毒应用于治疗肿瘤的目的。
人类腺病毒有6个不同亚属，分为A、B、C、D、E及F。它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病史并不相同。本发明以腺病毒C亚属中的5型(Ad5)作为例证对本发明加以进一步具体说明，本发明构建手段均是现有技术人员能够实现。
例一、携带人内皮抑素(endostatin)基因的E1区缺失的腺载体的构建pCA13载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pCA13含有5型腺病毒序列bp22-5790并缺失E1区342至3523bp片段，在E1缺失区插入了人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)及SV40 poly A加尾信号。应用多聚酶链反应(PCR)技术应用多聚酶链反应(PCR)技术人内皮抑素(endostatin)基因，自新鲜的正常人肝组织中抽提总RNA，以随机引物作逆转录反应，在扩增人内皮抑素(endostatin)基因，并用两次多聚酶链反应(PCR)技术(方法参见PCRProtools Current Methods and Applications,White BA主编，HumanaPress Inc.1993年出版一文献1)在基因前加入M-成瘤蛋白(Oncostatin-M)信号肽及信号肽前、基因结尾引入EcoRⅠ和XbaⅠ两个酶切位点。
Primer1:GGG GAA TTC ACC ATG GGG GTA CTG CTC ACA CAG AGG ACGCTG CTC AGT CTG GTC CTT GCA CTCPrimer2:CTG CTC AGT CTG GTC CTT GCA CTC CTG TTT CCA AGC ATGGCG AGC CAC AGC CAC CGC GAC TTC CAGPrimer3:GCT CTA GAC TAT TAC TTG GAG GCA GTC ATG AAG CTG TTCTCA ATG CAT AGC ACG ATG TAG GCG TGPrimer2与primer3进行第一次PCR扩增，回收615bp片段，再用primer1与primer3对615bp片段进行第二次PCR扩增，回收647bp片段，应用EcoRⅠ+XbaⅠ对酶切，将该基因插入pbluescriptⅡKS(+)载体(购于美国ATCC公司)中进行测序，其测序结果见下GAATTCACCATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTAACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTATGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAGTAATAGTCTAG将其EcoRⅠ+XbaⅠ切下，定向插入pCA13载体EcoRⅠ+XbaⅠ中，命名pCA13-human endostatin。
例二、携带血管生成抑素(angiostatin)基因的E1区缺失的腺载体的构建应用多聚酶链反应(PCR)技术血管生成抑素(angiostatin)基因，自新鲜的正常人肝组织中抽提总RNA，以随机引物作逆转录反应后进行第一轮PCR，并用两次多聚酶链反应(PCR)技术(方法参见PCR Protools Current Methods and Applications，White BA主编，Humana Press Inc.1993年出版一文献1)在基因结尾引入EcoRⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，primer4:AGC GAA TTC CAA AAT GGA ACA TAA GGEcoRⅠ血浆纤维蛋白溶酶原49-67primer5:ACA CTT TTC CTT GAC CTG ATT TCA G血浆纤维蛋白溶酶原348-343+111-94primer6:CTG AAA TCA GGT CAA GGA AAA GTG TAT CTC TCAGAG TGC血浆纤维蛋白溶酶原94-111+343-363primer7:5’-AGCCTCGAGCTATTACGCTTCTGTTCCTGAG-3’XhoⅠ(2 Stop)血浆纤维蛋白溶酶原1431-1416Primer4与primer5、primer6与primer7分别进行第一次PCR反应，将其反应产物混合，用primer4与primer7进行再次PCR反应，回收1168bp片段。应用EcoRⅠ+XhoⅠ对酶切，将该基因插入pbluescript ⅡKS(+)载体(购于美国ATCC公司)中进行测序，其测序结果见下GAATTCCAAAATGGAACATAAGGAAGTGGTTCTTCTACTTCTTTTATTTCTGAAATCAGGTCAAGGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGTAATAGCTCGAG将其EcoRⅠ+XhoⅠ切下，定向插入pCA13载体EcoRⅠ+XhoⅠ中，命名pCA13-human angiostatin。例三、腺病毒E1b 55Kda蛋白基因部分缺失及在缺失区插入终止密码子载体的构建pXC.1载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。应用内切酶BglⅡ将该载体在3329bp中切开，然后用内切酶Hind Ⅲ再作部分酶切，回收9372bp DNA片段，应用大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段对3’凹端补平，即为pXC.1载体中缺失2809bp-3329bp区域(具体方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)。
合成两个DNA寡核苷酸片段做一个连接头，其DNA寡核苷酸序列为primer8 TAATGAGTAACTAAprimer9 TTAGTTACTCATTA将两个DNA寡核苷酸片段各0.1μg混合，100℃变性5分钟，然后缓慢降温复性，复性后应用T4噬菌体多核苷酸激酸进行磷酸化。将该磷酸化后的连接头与缺失2809-3329bp区域的pXC.1载体片段进行连接，命名为pXC-del E1b(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)。在插入连接头两端附近位置中合成引物，分别为primer10 CTG GCC AAT ACC AAC CTT Aprimer11 ATA TGA GCT CAC AAT GCT TC对pXC-del E1b进行聚合酶链式反应(PCR)进行体外扩增(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)，其PCR产物进行测序。结果显示 CTGGCCAATACCAACCTTATCCTACACGGTGTAAGCTTAATGAGTAACTAAGATCTGGAAGGTGCTGAGGTACGATGAGACCCGCACCAGGTGCAGACCCTGCGAGTGTGGCGGTAAACTATTAGGAACCAGCCTGTGATGCTGGATGTGACCGAGGAGCTGAGGCCCGATCACTTGGTGCTGGCCTGCACCCGCGCTGAGTTTGGCTCTAGCGATGAAGATACAGATTGAGGTACTGAAATGTGTGGGCGTGGCTTAAGGGTGGGAAAGAATATATAAGGTGGGGGTCTTATGTAGTTTTGTATCTGTTTTGCAGCAGCCGCCGCCGCCATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATAT， 这表明pXC-del E1b为pXC.1载体中缺失了2809-3329区域并在该区域中插入TAATGAGTAACTAA，并在两个终止密码子后保留了BglⅡ酶切位点。例四、携带人内皮抑素或血管生成抑素的E1b 55Kda蛋白基因部分缺失的腺病毒载体的构建应用BglⅡ分别酶切pCA13-human endostatin和pCA13-humanangiostatin，分别回收1237bp(含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40poly A加尾信号)及1758bp(人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人血管生成抑制及SV40 poly A加尾信号)，将其插入pXC-delE1b BglⅡ酶切位点，应用PCR技术分别验证其插入的正反方向其BglⅡ上游引物primer10:CTG GCC AAT ACC AAC CTT A分别与人内皮抑素5’及3’-primer进行扩增primer12人内皮抑素5’-primer(位于M-成瘤蛋白信号肽及人内皮抑素基因中110-131bp)TCC ACC TGG TTG CGC TCA ACA Gprimer13人内皮抑素3’-primer(位于M-成瘤蛋白信号肽及人内皮抑素基因中577-600bp)AGC ACG ATG TAG GCG TGA TGG C分别与人血管生成抑素5’及3’-primer进行扩增primer14人血管生成抑素5’-primer(位于人血管生成抑素11-32bp)ATG GAA CAT AAG GAA GTG GTT Cprimer15人血管生成抑素3’-primer(位于人血管生成抑素823-842bp) AGG AGT CAC AGG ACG GTA TC其primer10与primer13能扩增到1056bp，表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40 poly A加尾信号正向插入pXC-del E1b Bgl Ⅱ酶切位点，命名为pXC-del E1b-endostatinl。其primer10与primer12能扩增到752bp，表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40 poly A加尾信号反向插入pXC-del E1b BglⅡ酶切位点。命名为pXC-delE1b-endostatin2其primer10与primer15能扩增到1298bp，表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人血管生成抑素基因及SV40poly A加尾信号正向插入pXC-del E1b BglⅡ酶切位点，命名为pXC-del E1b-angiostatin1。其primer10与primer14能扩增到1374bp，表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人血管生成抑素基因及SV40 poly A加尾信号反向插入pXC-del E1b BglⅡ酶切位点，命名为pXC-del E1b-angiostatin2。例五、携带人内皮抑素或血管生成抑素的E1b 55Kda蛋白基因部分缺失的腺病毒的重组将本发明的缺陷型病毒转染至E1转化人胚胎肾细胞株293或E1转化的人胚胎视网膜细胞株911细胞，本发明例将其转染293细胞，293细胞株购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞而成，它含有及表达5型腺病毒E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率。将含有5型腺病毒左臂的质粒联合含有5型腺病毒右臂的质粒共转染293细胞，通过同源重组可产生具有感染力的腺病毒。我们将pXC-del E1b-endostatin1 pXC-del E1b-endostatin2、pXC-de1 E1b-angiostatin1或pXC-del E1b-angiostatin2分别与含有5型腺病毒右臂的质粒pBHG10或pBHGE3通过Lipofectamine共转染至293细株，其具体方法参见GIBCO BRL公司的操作说明。pBHG10及pBHGE3购于加拿大Microbix Biosystems Inc.(0ntario)，pBHG10含有5型腺病毒右臂，但缺失E3区；pBHGE3含有5型腺病毒右臂，含有E3区。共转染后9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，该腺病毒命名为CNHK-endostatin1-1、CNHK-endostatin1-2、CNHK-endostatin2-1CNHK-endostatin2-2及CNHK-angiostatin1-1、CNHK-angiostatinl-2、CNHK-angiostatin2-1、CNHK-angiostatin2-2，具体方法参见GeneTransfer and Expression Protocols，Murray EJ主编，Humana Press1991出版。
病毒的产生及基因组结构重组腺病毒方法参见例一内容。其名称见下
腺病毒在293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒(具体方法参见Gene Transfer and ExpressionProtocols,Murray EJ主编，Humana Press 1991出版)。Ad5-del E1b-endostatin1(CNHK-endostatin-1-1)为5型腺病毒，在2809-3329bp区域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突变，并在缺失突变区域中插入含有两个终止密码子的序列TAATGAGTAACTAA，并在终止密码子后BglⅡ酶切位点中正向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40 polyA加尾信号基因序列，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。Ad5-delE1b-endostatin2(CNHK-endostatin-1-2)为5型腺病毒，在2809-3329bp区域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突变，并在缺失突变区域中插入含有两个终止密码子的序列TAATGAGTAACTAA，并在终止密码子后BglⅡ酶切位点中反向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299-+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40 poly A加尾信号基因序列，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。Ad5-del E1b E3-endostatin1(CNHK-endostatin-2-1)为5型腺病毒，在2809-3329bp区域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突变，并在缺失突变区域中插入含有两个终止密码子的序列TAATGAGTAACTAA，并在终止密码子后BglⅡ酶切位点中正向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40 poly A加尾信号基因序列，同时伴有28133-30818bp(E3区部分序列)缺失，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。Ad5-del E1b E3-endostatin2(CNHK-endostatin-2-2)为5型腺病毒，在2809-3329bp区域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突变，并在缺失突变区域中插入含有两个终止密码子的序列TAATGAGTAACTAA，并在终止密码子后BglⅡ酶切位点中反向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40 poly A加尾信号基因序列，同时伴有28133-30818bp(E3区部分序列)缺失，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。
Ad5-del E1b-angiostatin1(CNHK-angiostatin-1-1)为5型腺病毒，在2809-3329bp区域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突变，并在缺失突变区域中插入含有两个终止密码子的序列TAATGAGTAACTAA，并在终止密码子后BglⅡ酶切位点中正向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人angiostatin及SV40 poly A加尾信号基因序列，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。Ad5-del E1b-angiostatin 2(CNHK-angiostatin-1-2)为5型腺病毒，在2809-3329bp区域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突变，并在缺失突变区域中插入含有两个终止密码子的序列TAATGAGTAACTAA，并在终止密码子后BglⅡ酶切位点中反向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人angiostatin及SV40 poly A加尾信号基因序列，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。Ad5-del E1b E3-angiostatin1(CNHK-angiostatin-2-1)为5型腺病毒，在2809-3329bp区域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突变，并在缺失突变区域中正向插入含有两个终止密码子的序列TAATGAGTAACTAA，并在终止密码子后BglⅡ酶切位点中正向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人angiostatin及SV40 poly A加尾信号基因序列，同时伴有281 33-30818bp(E3区部分序列)缺失，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。Ad5-del E1bE3-angiostatin2(CNHK-angiostatin-2-2)为5型腺病毒，在2809-3329bp区域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突变，并在缺失突变区域中插入含有两个终止密码子的序列TAATGAGTAACTAA，并在终止密码子后BglⅡ酶切位点中反向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人angiostatin及SV40 poly A加尾信号基因序列，同时伴有28133-30818bp(E3区部分序列)缺失，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。例六、携带人内皮抑素或血管生成抑素的E1b 55Kda蛋白基因部分缺失的重组腺病毒体外肿瘤细胞复制、增殖并高效表达人内皮抑素或人血管生成抑素，并在体外特异性杀灭肿瘤细胞将CNHK-endostatin1-1、CNHK-endostatin1-2、CNHK-angiostatin1-1及CNHK-angiostatin1-2分别感染肝癌细胞株Hep3B、293及正常人成纤维细胞，细胞按2×105/孔接种6孔板，分别感染重组腺病毒CNHKEBV-endostatin1-1、CNHKEBV-endostatin1-2、CNHKEBV-angiostatin1-1、CNHKEBV-angiostatin1-2及野生型5型腺病毒4×105pfu，48小时后应用293细胞株测定其病毒滴度，具体方法参见前述文献2，结果为
将肝癌细胞株Hep3B及正常人成纤维细胞分别感染重组腺病毒CNHK-endostatin1-1、CNHK-endostatin1-2、CNHK-angiostatin1-1及CNHK-angiostatin1-2，MOI为1，37℃孵育1小时，感染后7天收集细胞，应用QIAamp DNA Blood mini kit(德国QIAGEN公司)提取病毒DNA，方法参见QIAGEN公司操作说明。应用NheⅠ和XhoⅠ双酶切，用0.8％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用32P标记人5型腺病毒1178bp BstXⅠ加XhoⅠ片段(位于腺病毒nt4611-5789)，进行souther blot杂交，以pXC.1作为病毒拷贝数对照(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)，CNHK-endostatin1-1、CNHK-endostatin1-2、CNHK-angiostatin1-1及CNHK-angiostatin1-2在肝癌细胞株Hep3B及正常人成纤维细胞的每个细胞病毒拷贝数分别为2×104、3×104、1×104、1×104及＜10、＜10、＜10、＜10。
将上述CNHK-endostatin1-1及CNHK-endostatin1-2提取的DNA分别应用BglⅡ酶切，用1％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用32P分别标记人内皮抑素cDNA片段(EcoRⅠ与XbaⅠ双酶切pCA13-humanendostatin，回收637bp)作为探针，进行souther blot杂交，以pCA13-human endostatin作为病毒拷贝数对照(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)，CNHK-endostatin1-1及CNHK-endostatin1-2在肝癌细胞株Hep3B及正常人成纤维细胞的每个细胞病毒拷贝数分别为2×104、3×104及＜10、＜10。将上述CNHK-angiostatin1-1及CNHK-angiostatin1-2提取的DNA分别应用BglⅡ酶切，用1％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用32P分别标记人血管生成抑素cDNA片段(EcoRⅠ与XbaⅠ双酶切pCA13-human angiostatin，回收1168bp)作为探针，进行souther blot杂交，以pCA13-human angiostatin作为病毒拷贝数对照(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)，CNHK-angiostatin1-1及CNHK-angiostatin1-2在肝癌细胞株Hep3B及正常人成纤维细胞的每个细胞病毒拷贝数分别为1×104、1×104及10、10。例七、携带人内皮抑素或血管生成抑素的E1b 55Kda蛋白基因部分缺失的重组腺病毒在裸鼠体内治疗移植肿瘤并高效表达人内皮抑素或人血管生成抑素，抑制肿瘤新生血管形成，抑制肿瘤形成、生长及转移。同时该病毒能在而且仅限于肿瘤细胞内增殖，也能特异性直接杀灭肿瘤细胞。将4-5周龄的SCID小鼠皮下接种肝癌细胞株Hep 3B细胞1×107，两周后给予1×109pfu增殖型重组腺病毒CNHK101治疗或用相同剂量的对照腺病毒Ad5-LacZ，其未治疗组及对照腺病毒治疗组4周后肿瘤体增加4倍以上，而治疗组则肿瘤明显缩小，部分肿瘤完全消失。例八含有EB病毒顺式作用元件的载体的构建以pCAT-Basic为基础载体，在其多克隆位点中插入EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(FR，位于EB病毒7337-8190bp)联合SV40基本启动子(mini-SV40)，pCAT-Basic购自Promega公司。应用PCR技术扩增EB病毒Orip中的family of 30bp repeats及mini-SV40启动子。前者的模板EB病毒DNA从淋巴瘤细胞株B95-8中提取，其提取病毒DNA方法参见QIAGEN公司QIAamp Blood试剂盒的操作说明。后者的模板为pCAT-Control(购于Promega公司)。EB病毒Orip中的FR的引物为primer16:5’-引物(含有Hind Ⅲ及AgeⅠ酶切位点)GGG AAG CTTACC GGT GCA TGC AGG AAA AGG ACA AGCprimer17:3’-引物(含有部分mini-SV40启动子序列)GAG ATGCAG ATC AAT GGC ACC CCG GGG AAT ACCmini-SV40启动子的引物为primer18:5’-引物(含有部分Orip中的FR序列)GTG CCA TTG ATCTGC ATC TCA ATT AGT CAGprimer19:3’-引物(含有SalⅠ及AgeⅠ酶切位点)GCT AAA GTCGAC ACC GGT AAG CTT TTT GCA AAA GCC TAG应用两次叠加PCR技术(方法同前)将EB病毒Orip中的FR序列和mini-SV40启动子产生融合启动子，将其融合启动子PCR片段应用Hind Ⅲ及SalⅠ双酶切插入pCAT-Basic载体Hind Ⅲ及SalⅠ位点中(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)。将该片段进行DNA测序，其融合启动子序列完全正确，记为CHEB-FRSV40。
以pbluescriptⅡKS(+)为基础载体(购于美国ATCC公司)，在其多克隆位点中插入EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(FR，位于EB病毒7337-8190bp)联合HSV-TK基本启动子(mini-TK)，pbluescriptⅡ购自Promega公司。应用PCR技术扩增EB病毒Orip中的family of 30bp repeats及mini-SV40启动子。前者的模板EB病毒DNA从淋巴瘤细胞株B95-8中提取，其提取病毒DNA方法参见QIAGEN公司QIAamp Blood试剂盒的操作说明。后者的模板为(购于Invitrogen公司)。
EB病毒Orip中的FR的引物为Primer 20:5’-引物(含有XhoⅠ酶切位点)GGG CAT CTC GAG GCATGC AGG AAA AGG ACA AGCPrimer 21:3’-引物(含有部分mini-HSV-TK启动子序列)AGT CGGGGC GGC AAT GGC ACC CCG GGG AAT ACCmini-HSV-TK启动子的引物为
Primer22:5’-引物(含有部分Orip中的FR序列)GGT GCC ATT GCCGCC CCG ACT GCA TCT GCPrimer23:3’-引物(含有XbaⅠ酶切位点)TTT TCT AGA CTT CTGCTT CAT CCC CGT G应用两次叠加PCR技术(方法同前)将EB病毒Orip中的FR序列和mini-TK启动子产生融合启动子，将其融合启动子PCR片段应用XhoⅠ及XbaⅠ双酶切插入pbluescriptⅡKS(+)载体(购于美国ATCC公司)XhoⅠ及XbaⅠ位点中(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)。将该片段进行DNA测序，其融合启动子序列完全正确，记为CHEB-FRTK。例九携带内皮抑素或血管生成抑素的EB病毒顺式作用元件控制E1A及E1B表达的减毒增殖腺病毒载体的构建。pXC.1载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(oronto),pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。在该载体中552bp处创立一个新的、唯一的AgeⅠ酶切位点，该位点位于E1A起始密码前12bp，其方法采用定位突变双次PCR技术(方法参见前述文献1)。其引物分别为primer24:5’-引物(含有EcoRⅠ酶切位点)TTC AAG AAT TCT CATGTT TGprimer25:3’-引物(插入一个A，从而产生一个AgeⅠ酶切位点)CAG TCA CCG GTG TCG GAG Cprimer26:5’-引物(插入一个T，从而产生一个AgeⅠ酶切位点)GCT CCG ACA CCG GTG ACT GA
primer27:3’-引物(含有XbaⅠ酶切位点)TTC TCT AGA CAC AGG TGATG采用定位突变双次PCR技术，PCR产物片段插入pGEM-T-easy载体中(方法参见Promega公司操作说明书)，命名为pGEM-T-Ela。将该片段进行DNA测序，其测序结果显示在pXC.1质粒bp552位点中插入T，从而产生一个新的AgeⅠ酶切位点，其它序列与pXC.1相同。应用EcoRⅠ与XbaⅠ双酶切pGEM-T-E1A及pXC.1质粒，将pGEM-T-E1A中切出片段插入pXC.1质粒中EcoRⅠ及BamHⅠ位点中，从而使pXC.1中552插入一个T，从而产生一个AgeⅠ酶切位点，该位点位于E1A起始密码前12bp，将该质粒命名为pXC.1-AgeⅠ。
CHEB分别用AgeⅠ酶切，其酶切片段分别插入pXC-AgeⅠ质粒中AgeⅠ酶切位点中，分别应用引物24及19进行PCR扩增，扩出2050bp，这表明EB病毒Orip中的family of 30bp repeats联合mini-SV40启动子已正向插入pXC-AgeⅠ质粒AgeⅠ位点，即腺病毒5型E1A起始密码子上游区12bp处，命名为pXC-FRSVE1A。为进一步证实EB病毒Orip中的family of 30bp repeats联合mini-SV40启动子已正向插入pXC-AgeⅠ质粒AgeⅠ位点，本研究将pXC-FRSVE1A载体应用EcoRⅠ加XbaⅠ作双酶切，回收2823bp片段，插入pBluescriptⅡSK载体EcoRⅠ及XbaⅠ酶切位点进行测序，结果证实EB病毒Orip中的family of 30bp repeats联合mini-SV40启动子已正向插入pXC-AgeⅠ质粒AgeⅠ位点，序列如下GAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCGGGCCCCCATTTCCCCTCCCTTCCAGCTCTCTGCCCCTTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGGAGTTTGTGACGTGGCGCGGGGCGTGGGAACGGGGCGGGTGACGTAGTAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGCAAGTGTGGCGGAACACATGTAAGCGACGGATGTGGCAAAAGTGACGTTTTTGGTGTGCGCCGGTGTACACAGGAAGTGACAATTTTCGCGCGGTTTTAGGCGGATGTTGTAGTAAATTTGGGCGTAACCGAGTAAGATTTGGCCATTTTCGCGGGAAAACTGAATAAGAGGAAGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTTACTCATAGCGCGTAATATTTGTCTAGGGCCGCGGGGACTTTGACCGTTTACGTGGAGACTCGCCCAGGTGTTTTTCTCAGGTGTTTTCCGCGTTCCGGGTCAAAGTTGGCGTTTTATTATTATAGTCAGCTGACGTGTAGTGTATTTATACCCGGTGAGTTCCTCAAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCGAGTAGAGTTTTCTCCTCCGAGCCGCTCCGACACCGGTGCATGCAGGAAAAGGACAAGCAGCGAAAATTCACGCCCCCTTGGGAGGTGGCGGCATATGCAAAGGATAGCACTCCCACTCTACTACTGGGTATCATATGCTGACTGTATATGCATGAGGATAGCATATGCTACCCGGATACAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGTAGTATATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCTAATCTCTATTAGGATAGCATATGCTACCCGGATACAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGTAGTATATGCTACCCATGGCAACATTAGCCCACCGTGCTCTCAGCGACCTCGTGAATATGAGGACCAACAACCCTGTGCTTGGCGCTCAGGCGCAAGTGTGTGTAATTTGTCCTCCAGATCGCAGCAATCGCGCCCCTATCTTGGCCCGCCCACCTACTTATGCAGGTATTCCCCGGGGTGCCATTGATCTGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTACCGGTGACTGAAAATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTpXC.1载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Tronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。在该载体中1686bp处创立多个酶切位点，包括BglⅡ、BamHⅠ、XhoⅠ及XbaⅠ，该酶切位点位于E1B转录位点与起始密码之间，其方法采用定位突变双次PCR技术(方法参见上述文献1)。其引物分别为primer28:5’-引物(含有Hind Ⅲ及HpaⅠ酶切位点)TTT TGCAAG CTT GTT AAC GCC TTT GTT TGC TGAprimer29:3’-引物(产生四个酶切位点)CTC GAG GGA TCC AGA TCTGCG CAT TAT ATA CCC TTT AAGprimer30:5’-引物(产生四个酶切位点)AGA TCT GGA TCC CTC GAGTGA TCT AGA GGG CTA ATC TTG GTT ACA TCprimer31:3’-引物(含有KpaⅠ酶切位点)CCA GAA AAT CCA GCAGGT AAC采用定位突变双次PCR技术，PCR产物片段经HindⅢ和KpnⅠ酶切，插入pUC19载体中HindⅢ和KpnⅠ酶切点，pUC19购于美国ATCC公司，命名为pUC-E1B。将该片段进行DNA测序，其测序结果显示在E1b转录起始位点与编码起始位点中插入BglⅡ、BamHⅠ、XhoⅠ及XbaⅠ酶切位点，其它序列与pXC.1相同。
将CHEB-FRTK用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切，其片段插入pUC-E1B中XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点，即在E1B转录起始位点与编码起始位点中正向插入EB病毒Orip中的family of 30bp repeats联合mini-TK启动子，命名pUC-E1B-FRTK，应用引物28及23进行PCR扩增，扩出1159bp，这表明EB病毒Orip中的FR联合mini-TK启动子已正向插入pUC质粒XhoⅠ和XbaⅠ位点。其测序结果如下GTTAACGCCTTTGTTTGCTGAATGAGTTGATGTAAGTTTAATAAAGGGTGAGATAATGTTTAACTTGCATGGCGTGTTAAATGGGGCGGGGCTTAAAGGGTATATAATGCGCAGATCTGGATCCCTCGAGGCATGCAGGAAAAGGACAAGCAGCGAAAATTCACGCCCCCTTGGGAGGTGGCGGCATATGCAAAGGATAGCACTCCCACTCTACTACTGGGTATCATATGCTGACTGTATATGCATGAGGATAGCATATGCTACCCGGATACAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGTAGTATATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCTAATCTCTATTAGGATAGCATATGCTACCCGGATACAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGTAGTATATGCTACCCATGGCAACATTAGCCCACCGTGCTCTCAGCGACCTCGTGAATATGAGGACCAACAACCCTGTGCTTGGCGCTCAGGCGCAAGTGTGTGTAATTTGTCCTCCAGATCGCAGCAATCGCGCCCCTATCTTGGCCCGCCCACCTACTTATGCAGGTATTCCCCGGGGTGCCATTGCCGCCCCGACTGCATCTGCGTGTTCGAATTCGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGTCATCATAGAACTAAAGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGGACACCGCCAGCAAACGCGAGCAACGGGCCACGGGGATGAAGCAGAAGTCTAGAGGGCTAATCTTGGTTACATCTGACCTCATGGAGGCTTGGGAGTGTTTGGAAGATTTTTCTGCTGTGCGTAACTTGCTGGAACAGAGCTCTAACAGTACCTCTTGGTTTTGGAGGTTTCTGTGGGGCTCATCCCAGGCAAAGTTAGTCTGCAGAATTAAGGAGGATTACAAGTGGGAATTTGAAGAGCTTTTGAAATCCTGTGGTGAGCTGTTTGATTCTTTGAATCTGGGTCACCAGGCGCTTTTCCAAGAGAAGGTCATCAAGACTTTGGATTTTTCCACACCGGGGCGCGCTGCGGCTGCTGTTGCTTTTTTGAGTTTTATAAAGGATAAATGGAGCGAAGAAACCCATCTGAGCGGGGGGTACCTG应用BglⅡ分别酶切pCA13-human endostatin和pCA13-humanangiostatin，分别回收1237bp(含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40poly A加尾信号)及1758bp(人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人血管生成抑制及SV40 poly A加尾信号)，将其插入pUC-E1B-FRTK中BglⅡ酶切位点，应用PCR技术分别验证其插入的正反方向其BglⅡ上游引物primer32:GTT AAC GCC TTT GTT TGC TGA分别与人内皮抑素5’及3’-primer进行扩增primer12人内皮抑素5’-primer(位于M-成瘤蛋白信号肽及人内皮抑素基因中110-131bp)TCC ACC TGG TTG CGC TCA ACA Gprimer13人内皮抑素3’-primer(位于M-成瘤蛋白信号肽及人内皮抑素基因中577-600bp)AGC ACG ATG TAG GCG TGA TGG C
分别与人血管生成抑素5’及3’-primer进行扩增primer14人血管生成抑素5’-primer(位于人血管生成抑素11-32bp)ATG GAA CAT AAG GAA GTG GTT Cprimer15人血管生成抑素3’-primer(位于人血管生成抑素823-842bp)AGG AGT CAC AGG ACG GTA TC其primer32与primer13能扩增到1122bp，表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40 poly A加尾信号正向插入pUC-E1B-FRTK BglⅡ酶切位点，命名为pUC-E1B-FRTK-endostatin1。其primer32与primer12能扩增到818bp，表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40 polyA加尾信号反向插入pUC-E1B-FRTK BglⅡ酶切位点。命名为pUC-E1B-FRTK-endostatin2。
其primer32与primer15能扩增到1364bp，表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人血管生成抑素基因及SV40poly A加尾信号正向插入pUC-E1B-FRTK BglⅡ酶切位点，命名为pUC-E1B-FRTK-angiostatin1。其primer32与primer14能扩增到1440bp，表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人血管生成抑素基因及SV40 poly A加尾信号反向插入pUC-E1B-FRTKBglⅡ酶切位点，命名为pUC-E1B-FRTK-angiostatin2。
应用HpaⅠ和KpnⅠ双酶切pUC-E1B-FRTK-endostatin1、pUC-E1B-FRTK-endostatin2、pUC-E1B-FRTK-angiostatin1及pUC-E1B-FRTK-angiostatin2，回收片段，分别插入pXC-FRSVE1A中HpaⅠ和KpnⅠ酶切位点，分别命名为pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin1、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin2、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-angiostatin1及pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-angiostatin2。例十携带内皮抑素或血管生成抑素的EB病毒顺式作用元件控制E1A及E1B表达的减毒增殖腺病毒的重组。
293细胞株购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞而成，它含有及表达5型腺病毒E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率。将含有5型腺病毒左臂的质粒联合含有5型腺病毒右臂的质粒共转染293细胞，通过同源重组可产生具有感染力的腺病毒。我们将pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin1、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin2、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-angiostatin1及pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-angiostatin2与含有5型腺病毒右臂的质粒pBHG10通过Lipofectamine共转染至293细株，其具体方法参见GIBCO BRL公司的操作说明。PBHG10购于加拿大Microbix BiosystemsInc.(Ontario)，含有5型腺病毒右臂，但缺失E3区。共转染后9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，即得E1A及E1B受EB病毒顺式作用元件Orip FR联合mini-SV40启动子及Orip FR联合mini-HSV-TK启动子控制的腺病毒，并携带人内皮抑素或血管生成抑素，分别命名为EBV FRSVEIA-FRTKE1B-endostatin1、EBV FRSVEIA-FRTKE1B-endostatin2、EBV FRSVEIA-FRTKE1B-angiostatin1及FRSVEIA-FRTKE1B-angiostatin2，分别记为CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin2、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2。
由上述方法构建的重组病毒的列表如下
腺病毒在293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒(具体方法参见前述文献2出版)。EBV FRSVEIA-FRTKE1B-endostatin1(CNHKEBV-endostatin1)为5型腺病毒，在E1A及E1B转录起始位点与编码起始位点之间分别插入EB病毒顺式作用元件0rip FR联合mini-SV40启动子及Orip FR联合mini-HSV-TK启动子，并在E1A终止密码子后与Orip FR联合mini-HSV-TK启动子上游区之间新建一个BglⅡ酶切位点，在该酶切位点中正向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40 poly A加尾信号基因序列，同时伴有28133-30818bp(E3区部分序列)缺失，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。EBV FRSVEIA-FRTK E1B-endostatin2(CNHKEBV-endostatin2)为5型腺病毒，在E1A及E1B转录起始位点与编码起始位点之间分别插入EB病毒顺式作用元件Orip FR联合mini-SV40启动子及Orip FR联合mini-HSV-TK启动子，并在E1A终止密码子后与Orip FR联合mini-HSV-TK启动子上游区之间新建一个BglⅡ酶切位点，在该酶切位点中反向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40polyA加尾信号基因序列，同时伴有28133-30818bp(E3区部分序列)缺失，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。
EBV FRSVEIA-FRTK E1B-angiostatin1(CNHKEBV-angiostatin1)为5型腺病毒，在E1A及E1B转录起始位点与编码起始位点之间分别插入EB病毒顺式作用元件0rip FR联合mini-SV40启动子及OripFR联合mini-HSV-TK启动子，并在E1A终止密码子后与OripFR联合mini-HSV-TK启动子上游区之间新建一个BglⅡ酶切位点，在该酶切位点中正向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含人血管生成抑素基因及SV40 poly A加尾信号基因序列，同时伴有28133-30818bp(E3区部分序列)缺失，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。EBV FRSVEIA-FRTK E1B-angiostatin2(CNHKEBV-angiostatin2)为5型腺病毒，在E1A及E1B转录起始位点与编码起始位点之间分别插入EB病毒顺式作用元件Orip FR联合mini-SV40启动子及Orip FR联合mini-HSV-TK启动子，并在E1A终止密码子后与Orip FR联合mini-HSV-TK启动子上游区之间新建一个BglⅡ酶切位点，在该酶切位点中反向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有人血管生成抑素基因及SV40poly A加尾信号基因序列，同时伴有28133-30818bp(E3区部分序列)缺失，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。例十一携带人内皮抑素或人血管生成抑素的EB病毒顺式作用元件控制E1A及E1B表达的减毒增殖腺病毒的体外在EB感染或潜伏感染的肿瘤细胞增殖、复制及高效表达人内皮抑素或人血管生成抑素因子并特异性杀灭肿瘤细胞。
将CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2分别感染EB病毒感染的淋巴瘤细胞株Jijoye、293及正常人成纤维细胞，细胞按2×105/孔接种6孔板，分别感染重组腺病毒CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-angiostatin1、CNHKEBV-angiostatin2及野生型5型腺病毒4×105pfu，48小时后应用293细胞株测定其病毒滴度，具体方法参见前述文献2，结果为
将感染EB病毒感染的淋巴瘤细胞株Jijoye及正常人成纤维细胞分别感染重组腺病毒CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin2、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2，MOI为1，37℃孵育1小时，感染后7天收集细胞，应用QIAamp DNA Bloodmini kit(德国QIAGEN公司)提取病毒DNA，方法参见QIAGEN公司操作说明。应用NheⅠ和XhoⅠ双酶切，用0.8％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用32P标记人5型腺病毒1178bp BstⅪ加XhoⅠ片段(位于腺病毒nt4611-5789)，进行souther blot杂交，以pXC.1作为病毒拷贝数对照(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)，CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin2、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2在Jijoye及正常人成纤维细胞的每个细胞病毒拷贝数分别为5×104、5×104、4×104、4×104及＜10、＜10、＜10、＜10。将上述CNHKEBV-endostatin1及CNHKEBV-endostatin2提取的DNA分别应用BglⅡ酶切，用1％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用32P分别标记人内皮抑素cDNA片段(EcoRⅠ与XbaⅠ双酶切pCA13-human endostatin，回收637bp)作为探针，进行souther blot杂交，以pCA13-human endostatin作为病毒拷贝数对照(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)，CNHKEBV-endostatin1及CNHKEBV-endostatin2在Jijoye及正常人成纤维细胞的每个细胞病毒拷贝数分别为5×104、5×104及＜10、＜10。
将上述CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2提取的DNA分别应用BglⅡ酶切，用1％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用32P分别标记人血管生成抑素eDNA片段(EcoRⅠ与XbaⅠ双酶切pCA13-human angiostatin，回收1168bp)作为探针，进行southerblot杂交，以pCA13-human angiostatin作为病毒拷贝数对照(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)，CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2在Jijoye及正常人成纤维细胞的每个细胞病毒拷贝数分别为4×104、4×104及＜10、＜10。例十一携带人内皮抑素或人血管生成抑素的EB病毒顺式作用元件控制E1A及E1B表达的减毒增殖腺病毒的在SCID小鼠体内治疗EB病毒感染或潜伏感染的肿瘤细胞移植瘤将4-5周龄的SCID小鼠皮下接种EB病毒感染的淋巴瘤细胞株Jijoye细胞5×107，两周后给予5×108pfu增殖型重组腺病毒CNHK101治疗或用相同剂量的对照腺病毒Ad5-LacZ，其未治疗组及对照腺病毒治疗组4周后肿瘤体增加3倍以上，而治疗组则肿瘤明显缩小，部分肿瘤完全消失。
权利要求
1．一种能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于将编码血管生成抑制因子的核苷酸序列插入肿瘤细胞内特异性增殖的病毒基因组中的非增殖必需区域，该病毒选择性地在肿瘤细胞内增殖，而在正常细胞内不增殖，通过病毒在肿瘤细胞内复制增殖，导致编码血管生成抑制因子的核苷酸序列拷贝数增加，从而血管生成抑制因子基因表达量增加，该肿瘤细胞内特异性增殖的病毒可以是以下任何一种(1)在肿瘤细胞内特异性增殖的野生型病毒；(2)病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间插入肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件；(3)蛋白功能缺失重组后能在肿瘤细胞内特异性增殖的病毒。
2．根据权利要求1所述能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒的构建方法，其特征在于(1)将编码血管生成抑制因子的核苷酸序列直接插入肿瘤细胞内特异性增殖的病毒基因组中的非增殖必需区域；(2)病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间插入肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件；顺式作用元件可以是下述任何一种(a).甲胎蛋白增强子及启动子；(b).癌胚抗原增强子及启动子；(c).酪氨酸酶增强子及启动子；(d).ErbB2增强子及启动子；(e).ErbB3增强子及启动子；(f).ErbB4增强子及启动子；(g).DF3乳腺癌相关抗原增强子；(h).前列腺素特异性抗原增强子及启动子；(i).腺血管舒缓素增强子及启动子；(j).EB病毒中的Orip；(k).EB病毒Orip中的FR增强子；(l).EB病毒BamHⅠC-启动子；(m).EB病毒中的Orip联合EB病毒BamHⅠC-启动子；(n).EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子或SV40基本启动子；(3)蛋白功能缺失重组后能在肿瘤细胞内特异性增殖的病毒；蛋白功能缺失可以是下述任何一种腺病毒E1B 55Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1B 19Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1A蛋白功能缺失，单纯疱疹病毒ICP6蛋白功能缺失，单纯疱疹病毒ICP34.5蛋白功能缺失。
3． 根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于它由要病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间区域插入某种肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件构成，该种顺式作用元件可以是下述任何一种甲胎蛋白增强子及启动子，癌胚抗原增强子及启动子，酪氨酸酶增强子及启动子，ErbB2增强子及启动子，ErbB3增强子及启动子，ErbB4增强子及启动子，DF3乳腺癌相关抗原增强子，前列腺素特异性抗原增强子及启动子，腺血管舒缓素增强子及启动子，EB病毒中的Orip，EB病毒Orip中的FR增强子，EB病毒BamHⅠC-启动子，EB病毒中的Orip联合EB病毒BamHⅠC-启动子，EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子或SV40基本启动子，在EB病毒感染或潜伏感染细胞中特异性激活的顺式作用元件，病毒增殖必需基因为病毒早期基因。
4．根据权利要求3所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述病毒为腺病毒，该腺病毒增殖必需基因至少含有以下一个腺病毒的早期表达基因E1A、E1B、E2、E4。
5．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述病毒是腺病毒时，该腺病毒E1B55Kda通过基因点突变、缺失突变及插入突变导致E1B 55Kda蛋白功能缺失。
6．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述病毒是腺病毒时，该腺病毒E1B19Kda通过基因点突变、缺失突变及插入突变导致E1B 19Kda蛋白功能缺失。
7．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述病毒是腺病毒时，该腺病毒E1A通过基因点突变、缺失突变及插入突变导致E1A蛋白功能缺失。
8．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述病毒是单纯疱疹病毒时，该单纯疱疹病中ICP6基因点突变、缺失突变及插入突变导致ICP6蛋白功能缺失。
9． 根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述病毒是单纯疱疹病毒时，该单纯疱疹病毒中双拷贝ICP34.5基因点突变、缺失突变及插入突变导致ICP34.5蛋白功能缺失。
10．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码含有分泌型信号肽的内皮抑素的核苷酸序列。
11．根据权利要求10所述分泌型信号肽，其特征在于该分泌型信号肽为M-成瘤蛋白信号肽。
12．根据权利要求10所述分泌型信号肽，其特征在于该分泌型信号肽为免疫球蛋白K链信号肽。
13．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血管生成抑素的核苷酸序列。
14．根据权利要求13所述的编码血管生成抑制因子的核苷酸序列，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-4结构的核苷酸序列。
15．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-5结构的核苷酸序列。
16．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-3结构的核苷酸序列。
17．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-3加上Kringle5结构的核苷酸序列。
18．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1结构的核苷酸序列。
19．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle2结构的核苷酸序列。
20．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle3结构的核苷酸序列。
21．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle5结构的核苷酸序列。
22．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码干扰素-α的核苷酸序列。
23．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码干扰素-β的核苷酸序列。
24．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码干扰素-γ的核苷酸序列。
25．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血小板反应蛋白Ⅰ的核苷酸序列。
26．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血小板因子4的核苷酸序列。
27．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码纤溶酶原激活因子抑制剂的核苷酸序列。
28．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码白细胞介素-12的核苷酸序列。
29．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码纤维结合素的核苷酸序列。
30．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列受启动子控制。
31．根据权利要求30所述的启动子，其特征在于所述启动子为SV40启动子。
32．根据权利要求30所述的启动子，其特征在于所述启动子为RSVLTR启动子。
33．根据权利要求30所述的启动子，其特征在于所述启动子为人巨细胞病毒IE启动子。
34．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于该病毒与化学抗肿瘤药物组成复合物。
35．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于将该重组病毒用于抑制肿瘤细胞的生长
36．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒的应用，其特征在于将该重组病毒用于体外感染肿瘤细胞，病毒在肿瘤细胞内复制及增殖，导致编码血管生成抑制因子的核苷酸序列拷贝数增加及血管生成抑制因子表达量增加。
37．根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于将该重组病毒用于体内选择性地在肿瘤细胞内复制及增殖，导致编码血管生成抑制因子的核苷酸序列拷贝数增加及其表达量增加，抑制肿瘤血管的抑制肿瘤血管形成，抑制肿瘤形成、生长及转移，同时该病毒能在而且仅限于肿瘤细胞内增殖，也能特异性直接杀灭肿瘤细胞。
全文摘要
本发明提供一类高效表达肿瘤血管生成抑制因子的肿瘤细胞特异性增殖的病毒及其构建方法。该病毒选择性地在肿瘤细胞内增殖,而在正常细胞内不增殖,通过将编码血管生成抑制因子的核苷酸序列插入肿瘤细胞内增殖的病毒基因组中的非增殖必需区域,随着病毒在肿瘤细胞内复制,使编码血管生成抑制因子的核苷酸序列拷贝数增加,从而在肿瘤细胞高效表达血管生成抑制因子。抑制肿瘤血管形成,抑制肿瘤形成、生长及转移。同时该病毒能在而且仅限于肿瘤细胞内增殖,也能特异性直接杀灭肿瘤细胞。
文档编号C12N9/68GK1298947SQ00127680
公开日2001年6月13日 申请日期2000年12月1日 优先权日2000年12月1日
发明者钱其军, 车小燕, 岑信棠, 吴孟超 申请人:钱其军