分离自丁香假单胞菌的抗真菌剂的制作方法

专利名称：分离自丁香假单胞菌的抗真菌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及丁香假单胞菌(P.syringae)缩酚十肽类(depsidecapeptides)、产生这些肽类的方法、以及利用该肽类的抗真菌活性的方法。
背景真菌性感染是导致人类，特别是免疫损伤的病人生病、生活质量降低以及死亡率升高的一个显著原因。在过去20年里由于人类的真菌感染导致的发病率显著上升。这种现象部分是由于免疫系统被器官移植、癌症化疗、AIDS、衰老、或其它类似的障碍或条件所削弱或破坏的人群数量的增加而引起的。这些病人易于受到真菌病原体的攻击，这些病原体在人群中非常普遍但是受到功能正常的免疫系统的监视。这些病原体非常难于控制，因为目前的一些抗真菌制剂要么具有高毒性，要么仅仅抑制真菌活性。例如，多烯类物质是一种杀菌剂但是具有毒性；而吡咯类物质毒性小得多但是仅具有抑制真菌的作用。更为重要的，最近有关于假丝酵母属的部分菌株具有吡咯和多烯抗性的报道，这样就严重限制了对这些菌株的治疗的选择余地。
丁香假单胞菌能够产生几类具有抗真菌或抗生素活性剂，例如假单胞霉素(pseudomycin)、丁香霉素、丁香毒素(syringotoxin)和丁香因子(syringostatin)，这些物质都属于脂缩酚九肽(lipodepsinonapeptide)。丁香假单胞菌的天然菌株和转座子产生的突变体能够产生这些脂缩酚九肽。一些假单胞霉素和丁香霉素和其它的脂缩酚肽类抗真菌剂已经被分离、化学表征以及显示出很广的抗真菌活性谱，包括抗对人类和植物重要的真菌病原体的活性。假单胞霉素、丁香霉素、丁香毒素和丁香因子代表了具有显著结构特征的抗真菌化合物族系。
还没有任何一种丁香假单胞菌的脂缩酚九肽类物质被投入市场用于抗真菌治疗。不良副作用的发现、生产制剂、放大生产以及其它发展问题大大的妨碍了丁香假单胞菌脂缩酚九肽类物质在抗影响动物、人类和植物的全部范围的真菌方面的开发。目前存在对一种能够用于抗特定感染的抗真菌制剂的需求，这种感染不能被现存的其它抗真菌制剂所治疗，以及对抗动物、人类以及植物感染的应用的需求。
发明概述本发明提供了一种由丁香假单胞菌产生的缩酚十肽，它含有不常见的氨基酸高丝氨酸(Hse)、脱氢氨基丁酸(Dhb)和脱氢丙氨酸(Dha)，作为一个缩酚十肽环的组成部分。更为具体的，丁香假单胞菌缩酚十肽包含一个缩酚十肽环结构，该环含有精氨酸、苏氨酸、高丝氨酸、脱氢氨基丁酸和脱氢丙氨酸，以及一个由精氨酸的羧基基团和苏氨酸的氨基基团形成的内酯结构。从丁香假单胞菌中分离后，缩酚十肽成为脂缩酚十肽一个与亲脂性部分结合的环状多肽。典型的该亲脂性部分是通过酰胺键与苏氨酸的氨基基团偶联的脂肪酸。优选的，该脂肪酸部分是一个n-十二烷酸。该脂缩酚十肽可以用式I表示 其中R是亲脂性部分。亲脂性部分包括C9-C15烷基、C9-C15羟烷基、C9-C15二羟烷基、C9-C15烯基或C9-C15二羟烯基。优选的，亲脂性部分是C11烷基。烷基、羟烷基、二羟烷基、烯基、羟烯基、二羟烯基基团可以具有分枝或没有。优选的，缩酚十肽环的氨基酸序列是苏氨酸-丙氨酸-苏氨酸-谷氨酸胺-高丝氨酸-脱氢氨基丁酸-丙氨酸-脱氢丙氨酸-苏氨酸-精氨酸，在此称之为“25-B1十肽”或“Thr-Ala-Thr-Gln-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Thr-Arg(SEQ ID NO1)”。如此所用的术语“25-B1十肽抗真菌因子A”指的是特定的具有优选氨基酸序列SEQ ID NO1和R＝不分支C11烷基(即R＝-(CH2)10CH3)的缩酚十肽分子。
本发明也涉及利用丁香假单胞菌缩酚十肽的方法，以在需要它的病人体内抑制真菌活性或降低真菌感染症状。这样的方法能够杀死真菌、降低真菌感染的痛苦、降低过高的体温以及改善病人的整体健康水平。因此，丁香假单胞菌缩酚十肽可以被用于制造一种治疗如上所描述的病人的药物。本发明的方法和药物对诸如近平滑假丝酵母、白色假丝酵母、新生隐球酵母或荚膜组织胞浆菌的真菌效果显著。
本发明介绍了在一种方法中应用微生物以制取诸如丁香假单胞菌缩酚十肽，以及包括25-B1十肽等抗真菌剂。该方法包括在包含有3种或更少的氨基酸的培养基中培养丁香假单胞菌以及从该培养物中回收一种或几种丁香假单胞菌缩酚十肽的方法。在一个实施方案中，丁香假单胞菌的培养是在含有甘氨酸和一种脂类、一种马铃薯产品或它们的组合的培养基中于pH值约为4到6.5的环境下进行的，直到产生的一种或更多的丁香假单胞菌缩酚十肽的浓度至少达到10g/mL。另外，本发明提供了通过上述方法制备的丁香假单胞菌缩酚十肽。
本发明也提供了一种处理或防止真菌在植物中生长的方法，在该方法中一种真菌和上述的一种或更多丁香假单胞菌缩酚十肽相接触。
详细描述脂缩酚十肽抗真菌制剂如此处所用的“脂缩酚十肽抗真菌制剂”指的是一种抗真菌制剂，该制剂具有以内酯结构封闭的十肽环，以及一个附加的憎水基团，如脂肪酸部分。脂缩酚十肽抗真菌制剂是被丁香假单胞菌产生的。这一类化合物的一个代表，25-B1十肽抗真菌制剂A，已经被分离纯化而且其结构已经被确定。如此处所用的术语“丁香假单胞菌脂缩酚十肽”指的是一种由丁香假单胞菌产生的脂缩酚十肽抗真菌制剂，并且包括25-B1十肽抗真菌制剂A以及相关的类似物。
各种丁香假单胞菌脂缩酚十肽共同具有某些结构特征。例如，这些抗真菌制剂中的每一个都包含有不常见氨基酸高丝氨酸(Hse)、脱氢氨基丁酸(Dhb)和脱氢丙氨酸(Dha)作为一个缩酚十肽环的组成部分。在每一种丁香假单胞菌脂缩酚十肽中，精氨酸的羧基基团连接到N-末端苏氨酸的羟基基团上，形成一个封闭该缩酚十肽环的内酯。丁香假单胞菌脂缩酚十肽的缩酚十肽环的序列可以表示如下Thr-Xaa-Xbb-Xcc-Hse-Dhb-Xdd-Dha-Xee-Arg其中，每一个Xaa、Xbb、Xcc、Xdd和Xee分别是天然存在的氨基酸。不像假单孢菌素天然产物，本发明的脂缩酚十肽不含氯苏氨酸，它被怀疑为是药剂成分中含有假单孢菌素化合物药物在注射位点产生刺激的原因。
缩酚十肽环通过与N-末端苏氨酸的氨基形成酰胺键连接到一个亲脂性部分上，如脂肪酸。该脂肪酸一般含有10、12、14或16个碳原子，典型的含有0、1或2个羟基基团。该脂肪酸可以是分支的或不分支的，而且也可以含有至少一个不饱和部份。优选的脂肪酸部分包括n-癸酸部分、用一个或两个羟基基团取代的n-癸酸部分、n-十二烷酸部分或用一个或两个羟基基团取代的十二烷酸部分，n-十四烷酸部分或用一个或两个羟基基团取代的n-十四烷酸部分。25-B1十肽抗真菌制剂如此处所用的，“25-B1十肽抗真菌制剂”指的是从细菌丁香假单胞菌中分离得到的抗真菌制剂家族中的一个或更多的成员。一种25-B1十肽抗真菌制剂是丁香假单胞菌脂缩酚十肽。特别的，一种25-B1十肽抗真菌制剂是具有缩酚十肽环的脂缩酚十肽，该环具有如下序列Thr-Ala-Thr-Gln-Hse-Dhb-Ala-Dha-Thr-Arg(SEQ ID NO1)每一种25-B1十肽抗真菌制剂具有同样的环状肽核心，但它们在相连的憎水侧链上有所不同。25-B1十肽抗真菌制剂包括25-B1十肽抗真菌制剂A。
25-B1十肽抗真菌制剂包含一个通过与N-末端苏氨酸的氨基基团形成的酰胺键相连的脂肪酸。25-B1十肽抗真菌制剂A的该脂肪酸部分是一种n-癸酸部分。丁香假单胞菌脂缩酚十肽的生物学活性一种丁香假单胞菌脂缩酚十肽，例如25-B1十肽抗真菌制剂A，具有一些生物学活性，包括杀死和抑制不同真菌，如植物和动物的真菌病原体，的活性，特别的，一种25-B1十肽抗真菌制剂是有效的抗引起免疫损伤病人机会性感染的真菌的抗真菌制剂。这些真菌包括新生隐球菌、荚膜组织胞浆菌和包括近平滑念珠菌和白色念珠菌在内的各种不同种类的念珠菌。丁香假单胞菌丁香假单胞菌包括一般与植物相关的范围很广的细菌。一些丁香假单胞菌是植物病原体，而其它的仅仅是轻微致病或是腐生菌。很多不同的丁香假单胞菌的分离菌种产生一种或更多细胞毒性因子，这些制剂可以帮助该细菌在必须与真菌和其他细菌竞争的野外环境中生存。丁香假单胞菌产生的细胞毒性剂包括抗真菌剂，例如丁香假单胞菌脂缩酚十肽类，包括25B-1十肽抗真菌制剂A的、假单孢菌素、丁香霉素、丁香毒素和丁香因子。
经过分离的，可以产生一种或更多假单孢菌素、丁香霉素、丁香毒素和丁香因子的假单胞菌菌株为本领域的技术人员所熟知。野生型菌株MSU 174和通过转座子作用产生的该菌株的一个突变体，MSU 16H(ATCC 67028)已经在1996年11月9日授予G.Strobel等的美国专利号5.576.298的专利中、Harrison等人发表于《遗传微生物杂志》1991年137期2857-2865页的“Pseudomycins，a family of novelpeptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrumantifungal activity”一文中和Lamb等发表于Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1987年84期6447-6451页的“Transposon mutagenesis andtagging of fluorescent pseudomonasAntimycotic production isnecessary for control of Dutch elm disease”一文中进行了描述。培养各种不同的丁香假单胞菌菌株的方法以及其在生产诸如假单孢菌素的抗真菌剂中的作用也在Matthew D.Hilton等人的美国专利申请序号PCT/US00/08728的申请中进行了公开，该申请被命名为“Pseudomycin Production By Pseudomonas Syringae”，该申请与本专利申请同期提交，并在下文中进行了描述。本段引用的参考文献的公开在此引入作为参考。
适于用作一种或更多诸如25-B1十肽抗真菌剂A的丁香假单胞菌脂缩酚十肽生产的丁香假单胞菌菌株能够从包括植物，例如大麦植物、柑橘类植物和丁香类植物，在内的环境资源中和森林地面落叶层、土壤、水、空气和灰尘中分离得到。本发明包括一种菌株、一种分离物和一种以超过10μg/ml的数量，优选的从最少约10μg/ml到约50μg/ml的数量，产生一种或更多诸如25-B1十肽抗真菌剂A的丁香假单胞菌脂缩酚十肽的生物学纯化的丁香假单胞菌培养物。优选的，该微生物生物学纯化培养物是丁香假单胞菌菌株MSU 16H、25-B1、67H1、7H9-1或一种产生假单孢菌素的突变体，变种，分离菌或这些菌株的重组体。MSU 16H培养物保存在Montana StateUniversity(Bozeman，Montana，USA)，而且也可以从美国典型培养物保藏中心(Parklawn Drive，Rockville，MD，USA)保藏编号ATCC67028得到。
一株适于用作一种或更多诸如25-B1十肽抗真菌剂A的丁香假单胞菌脂缩酚十肽生产的丁香假单胞菌菌株能够从包括植物，例如大麦植物、柑橘类植物和丁香类植物，在内的环境资源中和森林地面落叶层、土壤、水、空气和灰尘中分离得到。一株优选的菌株是从植物中分离得到的。这些丁香假单胞菌的环境分离菌可以认为是野生型。如此处所用的，“野生型”指的是一种在普通丁香假单胞菌群体中自然发生的具有优势的基因型(即在自然界发现而不是通过实验室操作产生的菌株或分离菌)。在与其它生物体作用的条件下，本发明采用的产生脂缩酚十肽的培养物，丁香假单胞菌株如MSU 174、MSU 16H、MSU206、25-B1和7H9的特征易于变异。因此，这些菌株的后代，例如，重组体、突变体和变种，可以通过为本领域技术人员熟知的方法获得。
丁香假单胞菌的突变体植株同样也适于生产一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A。如此处所用的，“突变”指的是一个菌株表型发生的突然的可遗传的改变，该改变可以是自发产生的也可以是被已知的诱变剂，包括辐射和各种化学物质，所诱导的。本发明的丁香假单胞菌突变体能够通过使用多种诱变剂包括诸如紫外线和X-射线在内的辐射、化学诱变剂、位点专一性诱变和转座子介导的诱变得到。化学诱变剂的例子有乙基甲烷磺酸(EMS)、二环氧辛烷、N-甲基-N-硝基-N’-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸。
根据本发明的适于生产一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A的丁香假单胞菌能够通过用一定数量的，可以有效地产生突变体，该突变体过量产生一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A或在有利的生长条件下产生一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A，的一种诱变剂处理细菌。尽管所用诱变剂的种类和数量可以发生变化，一个优选的方法是将NTG在约1到约100μg/mL的范围内进行系列稀释。本发明优选的突变体是那些过量产生25-B1十肽抗真菌剂A并且在基本培养基中生长的突变体。这些突变体过量表达丁香假单胞菌脂缩酚十肽，例如25-B1十肽抗真菌剂A，优选的从至少10μg/mL到约50μg/mL。
环境分离菌、突变菌株和其它期望的丁香假单胞菌菌株能够被用于选择期望的生长习惯、生长介质、营养来源以及氨基酸需求特性。优选的，产生丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A的丁香假单胞菌菌株被选择在基本限定性培养基上生长。优选的菌株在一种含有甘氨酸，可选的添加一种脂类、一种马铃薯产物或两者的培养基中显示出产生一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A的特征。
重组体菌株能够通过使用本领域技术人员所熟知的方法转化丁香假单胞菌菌株来进行改良。通过使用重组技术，丁香假单胞菌菌株可以被转化以表达除了这些菌株所表达的抗生素之外的多种基因产物。例如，可以用能够使菌株获得对原本敏感的抗生素抗性的重组载体转化菌株。从而所获得的转化体将不仅产生丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A，而且产生获得性抗性的酶从而允许从野生细胞中选择转化体。更进一步的，利用类似技术，可以修饰目前的菌株以导入外源脂缩酚十肽生物合成基因的多个拷贝，从而达到更高的脂缩酚十肽产量。保持了产生脂缩酚十肽特征的丁香假单胞菌菌株25-B1、67H1、和7H9-1的后代，即天然和诱导的变种、突变体和重组体是本发明的部分。丁香假单胞菌的生长如此处所述的，“水性营养介质”指的是包含本发明所用的细菌生长必需的无机盐和有机化合物及其盐类的以水为基础的组合物。优选的营养介质含有有效数量的3种或更少的氨基酸，优选的是谷氨酸、甘氨酸、组氨酸或它们的一种组合。在一个实施方案中，介质含有有效数量的甘氨酸和可选的一种或更多马铃薯产物和一种脂类。甘氨酸可以以一种单独的氨基酸形式提供也可以作为一种氨基酸混合物如水解蛋白质的组分的形式被提供。合适的脂类包括大豆油、脂肪酸或脂肪酸酯类。合适的马铃薯产物包括马铃薯葡萄糖肉汤、马铃薯糊精或商品化马铃薯泥混合食物制品。营养介质中优选的无机盐包括在细胞培养和发酵中通常使用的盐类混合物，如包含KCl、MgSO4和FeSO4的恰佩克无机盐类。在营养介质中的有机化合物优选的包括葡萄糖以及可选的包括可溶性淀粉，其它类似的有机化合物也可以被包含在内。介质的pH值优选的介于约4到约6.5之间，更为优选的介于约4.5到约5.7之间，最优选的是约5.2。
尽管营养肉汤中每一种组分的数量对细菌生长或丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A的生产不是非常关键性的，但特定水平的营养物还是有利的。甘氨酸的优选含量介于约0.1g/L到约10g/L，更为优选的介于约0.3g/L到约3g/L，最优选的是约1g/L。脂类的优选含量对于诸如豆油的油类产品介于约1g/L到约10g/L，优选的介于约0.5g/L到约2g/L。脂肪酸或脂肪酸酯类的优选含量是介于约0.5g/L到约5g/L。马铃薯产品的优选含量介于约12g/L到约36g/L。更为优选的约24g/L马铃薯葡萄糖肉汤；约5g/L到约50g/L，优选的约30g/L商品化粉碎的马铃薯混合物；约1g/L到约30g/L，优选的约20g/L马铃薯糊精；和/或约1g/L到约10g/L，优选的约4g/L马铃薯蛋白质。一种优选的营养介质包含无机盐，优选的，KCl约0.02到约2g/L，更为优选的约0.2g/L；MgSO4，优选的为MgSO4·7H2O约0.02到约2g/L，更为优选的约0.2g/L；FeSO4，优选的为FeSO4·7H2O约0.4到约40mg/L，更为优选的为约4mg/L。在加入的情况下可溶性淀粉优选的介于约0.5到50g/L，更为优选的为5g/L。葡萄糖优选的介于约2到80g/L，更为优选的为20g/L。
丁香假单胞菌在控制的或调控的pH和温度条件下典型的生长于所述的介质中。丁香假单胞菌在介于约15℃到约35℃，优选的介于约20℃到约30℃，最优选的为25℃的温度下生长并且产生一种或更多细胞毒素。丁香假单胞菌在介于约4到约9，优选的介于约4到约6，最优选的介于4.5到5.5的pH条件下生长并且产生一种或更多细胞毒素。丁香假单胞菌的典型生长在温度高于约37℃或低于约10℃或在pH高于约9或低于约4的条件下不发生。生产丁香假单胞菌脂缩酚十肽的方法为了从丁香假单胞菌的野生型或突变体菌株中生产一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A，将培养物以振荡的方式在包含有有效数量的三种或更少的氨基酸的水性营养物介质中进行培养。这三种或更少的氨基酸优选的是谷氨酸、甘氨酸、组氨酸或它们的一种组合。在一个优选的实施方案中，氨基酸包括甘氨酸和可选的，一种或更多的某种马铃薯产品和一种脂类。培养过程是在对丁香假单胞菌的生长和所需的丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A的生产有效的条件下进行的。有效的条件包括介于约22℃到约27℃的温度条件和介于约36小时到约96小时的持续培养时间。当在如此处所述的培养基中培养时，丁香假单胞菌生长得到的细胞密度可以达到约10-15g/L细胞干重以及产生一种丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A达到总量至少约10μg/mL，优选的达到至少约50μg/mL。
在丁香假单胞菌的培养中控制介质中氧的浓度对丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A的生产是有利的。优选的，氧的水平被维持在约5％到约50％饱和度，更为优选的在约30％饱和度。用空气、纯氧或包含氧气的气体混合物进行鼓泡通气可以调节介质中氧的浓度。进一步，振荡速率的调整可以被用来调节氧气传递速率。
在丁香假单胞菌的培养中控制介质的pH值对丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A的生产是有利的。培养介质的pH值可以维持在低于约6并且高于约4。
丁香假单胞菌在批式培养中生长能够产生丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A。不过，葡萄糖和可选的，用于控制pH的一种酸或碱，如氢氧化铵的分批进料或半连续进料提高丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A的产量。丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A的产量可以通过使用连续培养方法得到进一步加强，在该方法中葡萄糖和可选的，用于控制pH的一种酸或碱如氢氧化铵是自动进料的。pH值优选的维持在约5到5.4，更为优选的介于5.0到5.2。
丁香假单胞菌菌株的选择会影响到在此书所述的条件下培养时产生的丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A的产量和分布。例如，菌株25-B1能够占优势的产生25-B1十肽抗真菌剂A。
丁香假单胞菌脂缩酚十肽类的环状十肽核心能够通过切割掉亲脂性部分，如通过脱酰基作用而制备得到。切割和脱酰基的方法为本领域的技术人员所熟知，例如通过使用脱酰基酶。丁香假单胞菌脂缩酚十肽类的制剂和抗真菌作用丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A，显示出在体外和体内的活性，并且在对抗全身性真菌感染或皮肤真菌感染中是有用的。相应的，本发明提供了一种抑制真菌活性的方法，包括将一种丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A，或它的一种药剂学上可以接受的盐类和真菌相接触。一个优选的方法包括抑制不同的真菌，例如新生隐球菌、荚膜组织胞浆菌和包括近平滑念珠菌和白色念珠菌在内的各种念珠菌的生长和活性。如此处所用的使一种本发明的化合物“接触”一种寄生物或真菌指的是本发明的一种化合物和一种寄生物或真菌形成的一个联合体或结合体，或者明显的接触，或相互相接。但是，术语接触并不意味着任何抑制性机制。
本发明进一步提供了一种治疗真菌感染的方法，包括对一个需要治疗的主体给与有效剂量的一种丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A，或其药剂学上可以接受的盐类。一个优选的方法包括治疗由不同的真菌，例如新生隐球菌、荚膜组织胞浆菌和包括近平滑念珠菌和白色念珠菌在内的各种念珠菌菌株引起的感染。以有效剂量方式使用一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽的一种制剂，如25-B1十肽抗真菌剂A，减轻了真菌感染的痛苦，减轻了与真菌感染有关的症状，并且导致了真菌感染的消除。
一些需要用一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽的一种制剂，如25-B1十肽抗真菌剂A进行抗真菌治疗的病人，存在严重的感染症状，如高烧，并且可能处于加强或重症护理状态。各种不同的真菌能够引起如此严重的感染。例如，念珠菌引起粘膜和严重的全身感染，而且可能以吡咯和多烯类抗性菌株的形式存在。曲霉菌引起威胁生命的全身感染。隐球酵母是脑膜炎的成因。如此严重的真菌感染可以在免疫受损的病人体内发生，例如那些接受器官或骨髓移植、接受癌症化疗、从大手术中恢复、或受HIV感染的病人。对这样的病人，抗真菌治疗典型的包括静脉注射几天一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽的一种制剂(例如-B1十肽抗真菌剂A)，以阻止或消除感染。
考虑到抗真菌活性，术语“有效剂量”指的是能够抑制真菌生长或活性、或减轻真菌感染症状的本发明的化合物的一定剂量。对大多数真菌感染，感染症状的减轻包括退烧、苏醒和本人整体状况的改善。优选的，通过杀死真菌以消除感染或使感染恢复到病人可以忍受的水平或被病人的免疫系统所控制以达到症状的减轻。如此处所用的“抑制”指的是抑制真菌活性，包括停止、阻止或预防性的阻碍或阻止真菌生长，或任何真菌存在特征和由真菌存在导致的结果。
典型的，组合物被以有效剂量使用到需要的病人身上(人类或其它动物，包括诸如猫、马和牛的哺乳动物以及鸟类)以抑制真菌感染。用药的剂量将根据诸如感染真菌种类和感染的严重性、年龄和宿主的一般健康状态和宿主对抗真菌剂的耐受性等因素发生变化。特殊的剂量方案同样可以根据这样的因素发生变化而且可以每天服药一次或多次服药进行给药。治疗方案可以持续从约2-3天到约2-3周或更长。一个典型的每日剂量(以一次服药或多次服药方式给药)含有的剂量水平从约0.01mg/kg到约100mg/kg体重的本发明的一种活性化合物。优选的每日剂量一般从约0.1mg/kg到约60mg/kg，而理想的剂量从约2.5mg/kg到约40mg/kg体重。对严重感染，该化合物可以通过静脉输液方式，采用例如0.01到10mg/kg/hr的活性成分。
本发明也提供了本发明的抗真菌化合物用药的药剂学制剂。相应的，本发明也提供了一种包括一种或更多药剂学上可接受的载体、稀释剂、媒介物、赋形剂、或其它添加剂和一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A的药剂学制剂。该制剂中的活性成分包含了从0.1％到99.9％的制剂重量，更为一般的从10％到30％的制剂重量。通过“药剂学可接受的”代表了载体、稀释剂或赋刑剂可与制剂中的其它成分相容，并且对接受者无害。
制剂中可以包括例如各种油类的添加剂，包括那些石油、动物、植物或人造来源的油类，例如，花生油、大豆油、矿物油和芝麻油。合适的药物赋形剂包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸、氯化钠、干粉脱脂牛奶、甘油、丙二醇、水和乙醇。该组合物可以被用于传统药剂学措施，如灭菌而且可以含有传统的药剂学添加剂，如防腐剂、稳定剂、潮湿或乳化剂、用于调节渗透压的盐类和缓冲剂。适当的药剂学载体和其制剂在Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”15th Ed.；Mack Publishing Co.Easton(1975)一书中的例如1405-1412和1461-1487页中进行了描述。
如此处所用的，术语“药剂学可接受的盐类”指的是基本上对活体无毒性的上述制剂复合物中的盐类。典型的药剂学可接受盐类包括那些通过将本发明的化合物与一种无机或有机酸或一种无机碱反应而制备的盐类。这样的盐类称为酸加成或碱加成盐类。
通常用于形成酸加成盐类的酸类是诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸和磷酸的无机酸，以及诸如p-甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸和乙酸的有机酸。这样的药剂学可以接受的盐类的例子有硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、盐酸盐、溴化盐、碘化盐、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、延胡索酸盐、顺丁烯二酸盐、丁炔-1，4-dioate、己炔-1，6-dioate、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、napththalene-2-磺酸盐和扁桃酸盐。优选的药剂学可接受酸加成盐是那些用无机酸如盐酸和氢溴酸处理形成的盐类和那些用有机酸如顺丁烯二酸和甲磺酸处理形成的盐类。
碱加成盐类包括那些来源于无机碱，如铵或强碱或碱性的金属氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐。这样的在制备本发明的盐类中有用的碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钙和碳酸钙。钾盐和钠盐形式是特别优先选用的。
应该认识到的是形成本发明的任何一种盐的组成部分的特定平衡离子不具有关键性的本质，只要该盐作为一个整体在药剂学上是可以接受的而且只要该平衡离子对盐作为整体不起非所希望的作用。
丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A，可以通过肠道外给药，例如，使用肌肉内、皮下或腹膜内注射，经鼻或口途径。除了这些给药方法之外，丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A可以被局部应用于表面皮肤感染或抑制粘液中真菌的生长。
对于非肠道给药方式，制剂包含一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A和一种生理学可接受的稀释剂，如去离子水、生理盐水、5％葡萄糖和其他常用稀释剂。该制剂可以含有一种环糊精和/或一种增溶剂，如聚乙烯乙二醇或聚丙烯乙二醇或其它已知的增溶剂。这样的制剂可以在含有干粉或冻干粉末形式的抗真菌剂和赋形剂的无菌小瓶中配置。在使用之前，要加入一种生理学上可接受的稀释液并且将溶液用注射器抽出用于对病人注射。
本发明的药剂学制剂是通过已知的步骤，使用已知而且常见的成分进行制备的。在制造本发明的组合物时，活性成分通常和一种载体进行混合，或者用一种载体进行稀释，或者包装在一种载体内，其形状可以是胶囊、小袋、纸或其它容器。当载体用作稀释剂时，它可以是固体、半固体或液体材料，以作为活性成分的媒介物、赋形物或介质。因此，该组合物的形状可以是片剂、丸剂、粉末、锭剂、小袋、胶囊剂、配剂、悬浮液、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂(作为固态或在液态介质中)，例如，含有重量超过10％的活性化合物的软膏、软或硬的明胶胶囊、栓剂、无菌的注射用溶液或无菌包装的粉末。
对于经口给药方式，抗真菌复合物被填充到明胶胶囊中或形成片剂。这样的片剂也可以含有一种结合剂，一种分散剂或其它合适的赋形剂，该赋形剂适合用于制备一种对于剂量和丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A大小适当的片剂。对于儿科或老年人使用，该抗真菌复合物可以设计成有甜味的液体悬浮液、溶液或乳剂。一种优选的口服制剂是亚油酸、cremophor RH-60和水，优选的比例(体积比)为8％亚油酸、5％cremophor RH-60、87％无菌水和一种丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A，其数量从约2.5到约40mg/ml。
对于局部使用，该抗真菌复合物可以以干粉末进行设计以用于皮肤表面或者它可以被设计成包含一种增溶性水性液体或非水性液体，例如，醇或二元醇(glycol)的制剂。丁香假单胞菌脂缩酚十肽制剂的应用本发明也包括一套含有本发明的药剂学制剂而且和本发明的方法一起使用的试剂盒。该试剂盒可以含有一个小玻璃瓶，该瓶中有干粉或液体状的本发明的一种制剂和合适的载体。该试剂盒还可以包括贴于瓶壁上的标签形式和/或包含于小瓶包装盒内的插入条形式的说明书，用于说明该复合物的用途和给药。该说明书也可以印刷在小瓶的包装盒上。该说明书包含了诸如足够的剂量和用药信息在内的信息，使得该领域的工作人员使用该药。我们预期该领域的工作人员包括可能使用该药的任何医生、护士或技术人员。
本发明也涉及一种药剂学组合物，其包含一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A的一种制剂，且该组合物适于用作注射给药。根据本发明，一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A的一种制剂可以被用于制造一种适合于注射用药的组合物或药剂。本发明也涉及制造适合于口服或局部用药方式的组合物的方法，该组合物包括一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A的一种制剂。例如，一种液体或固体制剂可以使用传统工艺按几种方法制造。一种液体制剂可以通过将一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A在合适的pH条件下溶解于合适的溶剂，例如水中，该溶剂包含了缓冲剂和其它赋形剂。
农业上的用途由丁香假单胞菌NRRL B-12050产生的抗生素已经被证实可以有效地治疗荷兰榆树病(见，例如，U.S.专利号4,342,746和4,277,462)。特别的，丁香假单胞菌MSU 16H已经被显示出相比野生型菌株能够使被Ceratocystis ulmi，引起荷兰榆树病的病因感染的榆树获得更大的保护(见，例如，Lam等，Proc.Natl.Sci.USA，84，6447-6451(1987))。对野外生长的榆树进行得更为广泛的实验证实了在预防水平上的生物控制现象。因此，本发明的脂缩酚十肽可以用于作为荷兰榆树病的防治性处理手段。假单孢菌素已经被显示出对包括Rynchosporium secalis、Ceratocystis ulmi、Rizoctonia solani、Sclerotinia scleraotiorum、Verticillium alboatrum、Verticillium dahliae、Thielaviopis basicola、Fusariumoxysporum和Fusarium culmorum在内的广谱植物病原体真菌具有毒性(见HarrisonL.等，“Pseudomycins，a family of novel peptidesfrom Pseudomonas syringae possessing broad-spectrumantifungal activity.”普通微生物学杂志，7，2857-2865(1991)。因此，一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A(包括其氢氧化物、溶剂化物和酯类)在治疗植物真菌(特别是V.albo-atrum Rhizoctonia solani和F.oxysporum)感染中可能是有用的，要么直接治疗或者作为预防性处理。一般的，被感染的植物是通过注射或喷洒一种脂缩酚十肽化合物水相悬浮液到植物中或在植物表面而进行治疗的。注射的方法为本领域的技术人员所熟知(例如，凿孔枪)。任何一种喷洒悬浮液的方法都可以被用来散布有效数量的活性物质到植物表面。该悬浮液也可以包括其它通常被本领域技术人员所用的添加剂，例如，增溶剂、稳定剂、增湿剂和它们的组合。
对植物的治疗也可以通过使用含有一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1十肽抗真菌剂A的一种干粉组分来完成。该干粉制剂可以通过任何一种为本领域技术人员所熟知的方法被应用到植物表面，例如从容器中喷洒或摇落。
通过参考下面的实例可以更好的理解本发明。这些例子意图被用来代表本发明的特定实施方案，而不是被作为本发明范围的限制。
实例保存的生物材料丁香假单胞菌MSU 16H可以从美国典型培养物保藏中心(ParklawnDrive，Rockville，MD，USA)公开得到，其编号是ATCC 67028。丁香假单胞菌菌株25-B1、7H9-1和67 H1于2000年3月23日保存在美国典型培养物保存中心，它们被指定为如下的编号25-B1 保藏编号PTA-16227H9-1 保藏编号PTA-162367 H1 保藏编号PTA-1621例1-25-B1抗真菌剂A的生产用于在一种丁香假单胞菌菌株的发酵肉汤中生产脂缩酚十肽抗真菌剂，25-B1缩酚十肽抗真菌剂A的发酵方法被进行了改进。材料和方法接种物制备将一份保存在液氮气相中的丁香假单胞菌菌株25-B1的等份试样复苏并接种到两个900毫升CSM肉汤中。CSM肉汤由以下成分组成(g/L)葡萄糖(5)、麦芽糖(4)、Difco胰蛋白酶大豆汤(30)、Difco酵母提取物(3)和MgSO4·7H2O(2)。约0.5毫升细胞分别被用于接种保存在两个2升烧瓶里的各900毫升培养基。烧瓶在25℃条件下摇动培养24小时。两个烧瓶的内含物被混合在一起，然后接种一个含有115升生物菌发酵肉汤的150升发酵罐。
发酵阶段发酵肉汤由以下部分溶于自来水中组成(g/L)葡萄糖(20)、可溶性淀粉(5)、Basic American Foods Country StylePotato Pearls即食马铃薯泥(30)、丙二醇(1)、MgSO4·7H2O(0.2)、KCl(0.2)和FeSO4·7H2O(0.004)。灭菌前将pH值调节到5.2。发酵过程在25℃条件下进行68小时。通过空气流量和搅拌转速的连续调节将溶氧保持在30％空气饱和度或以上。通过加入H2SO4或NaOH将pH值维持在介于4.0到5.4。
简单批式培养的一些变化也被发现以产生该新的环状肽产物。葡萄糖在接种后的头24小时内可以以每小时60毫升的速率加入到发酵罐中。在整个发酵过程中加料可以是连续的。可选的，一种程序，在接种后的头24小时，溶氧保持在5％的空气饱和度并一直持续到发酵结束曾经被采用。溶氧维持在5％是通过在通入发酵罐的空气中加入惰性的氮气而实现的。在所有情况下，气体是通过开口位于发酵罐的底部搅拌器涡轮下的单一浸没式分布器管供应的。结果和结论一些发酵方法可从丁香假单胞菌产生25-B1缩酚十肽抗真菌剂A。
例2-25-B1抗真菌剂A的分离和纯化从丁香假单胞菌的一个菌株的发酵肉汤中分离和纯化一种丁香假单胞菌脂缩酚十肽，25-B1十肽抗真菌剂A的方法被进行了改进。材料和方法根据例1得到的全部发酵肉汤，收获后通常为100升，被通过MembraloxTM陶瓷滤器(0.45μm)进行过滤。得到的固体浆用等体积含有0.1％TFA的丙酮进行提取90分钟。丙酮提取物通过过滤分离并在真空中蒸发得到水相溶液。
该溶剂和从陶瓷滤器得到的全肉汤的滤出液混合并加到一根填充在水里的AmberchromTMCG 300sd树脂柱上(4升)。该柱最初用0.2％的乙酸(pH4.8)洗涤直到流出物显示pH4.5，接着用10L含有0.2％乙酸(pH4.8)的22％的乙腈洗涤。然后，将该柱用含有0.2％乙酸的22-35％线性梯度乙腈(32升)和含有0.2％乙酸的35％乙腈(8升)以400毫升/分钟的速度进行洗脱。组分11-16被合并(4.8升)，在真空中浓缩到100毫升并离心。
将上清液分离并在一根Amberchrom CG 300sd柱(1升)上用含有0.2％乙酸(pH 4.8)，线性梯度为25-35％的乙腈以50毫升/分钟的速度进行色谱分离。组分20到25(1.2升)被混合并在一根反相柱(NovaPak C18，6μm，40×300mm，流速40毫升/分钟，含有0.2％乙酸的线性梯度为30-60％的乙腈)再次进行色谱分离以得到21mg的一种化合物(紫外检测纯度为89％)。
ESIMS数据显示在m/z 1165.7有一个可能的[M+H]-峰，这个特征与到目前为止已经从丁香假单胞菌发现的已知的抗真菌剂不同。1H NMR谱显示出的信号使人联想起假单孢菌素类似的脂肽，但是也显示出存在超过一种的化合物。为了获得高纯度的25-B1缩酚十肽抗真菌剂A用于结构确定和抗真菌活性，另外一种来自4×100升发酵的肉汤按照上述方法进行处理，另外，最后的纯化步骤在一根反相柱[Rainin C18，6μm，24×250mm，0.1％TFA-乙腈-MeOH(8∶1∶1到4∶3∶3)梯度洗脱60分钟；(4∶3∶3到10∶45∶45)梯度洗脱30分钟]以产生42mg25-B1缩酚十肽抗真菌剂A(紫外检测纯度为93％)。结果和结论类似于用于纯化其他缩酚十肽抗真菌剂方法的HPLC方法导致了25-B1缩酚十肽抗真菌剂A从发酵肉汤中的纯化。
例3-25-B1抗真菌剂A的结构确定质谱和NMR确定了脂缩酚十肽抗真菌剂，25-B1缩酚十肽抗真菌剂A的结构。材料和方法25-B1缩酚十肽抗真菌剂A的分子式通过高分辨率FABMS确定为C52H88N14O16[m/z 1165.6581对C52H89N14O16(M+H)，Δ+0.9ppm]。
与该分子式相一致，13C和DEPT NMR谱显示了50个独立的共振峰，包括了12个羰基碳、5个烯基碳和6个甲基碳4个氧化SP3碳，8个典型的氨基酸2-碳原子，15个亚甲基碳和6个甲基碳。其中，甲基碳原子之一在16.7产生信号，亚甲基碳之一在28.9产生信号，它们各构成一系列兼并碳原子，从而导致在分子式中观察到的52个碳原子。
1H、13C和2D NMR(DQCOSY、TOCSY、HMQC、HMBC和ROESY)数据的详细分析使我们能够确定25-B1缩酚十肽抗真菌剂A(IA)的结构和明确的指定所有的质子和碳原子(表1)。 表1.25-B1缩酚十肽抗真菌剂A在DMSO-d6中的1H和13C NMR化学位移
在35℃条件下于DMSO-d6中测量得到的1H、DQCOSY和TOCSY数据揭示了7个天然存在的氨基酸残基-2个丙氨酸、1个精氨酸、1个谷氨酰胺和3个苏氨酸以及3个天然存在较少的氨基酸-1个脱氢丙氨酸(Dha)、1个脱氢氨基丁酸(Dhb)和1个高丝氨酸的自旋系统的存在。天然存在较少的氨基酸残基，即Dha、Dhb和高丝氨酸，是通过分别观察到的在TCCSY谱中从9.01(brs)、9.07(brs)和8.22共振的酰胺质子到5.86、5.61(C106.4)、6.40(δC128.5)、1.61(δC12.9)和4.22(δC51.4)、1.82、1.76(δC34.0)、3.47(δC57.3)共振的酰胺质子的交叉峰进行鉴定的。与此相一致，13C NMR谱显示了对饱和氨基酸残基的8个质子结合-碳原子信号以及对非饱和氨基酸Dha和Dhb的两个四元-碳原子信号。在12个酰胺或酯羰基中，9个被确定为8个饱和氨基酸残基(2个为谷氨酰胺)、两个(δ164.0和163.7ppm)为Dha和Dhb。余下的一个羰基基团被确定到十二烷酰侧链，其存在是从末端甲基信号(δH0.83和δC13.9)和13C NMR谱中的10个亚甲基信号(表1)而鉴别出来的。
该分子式需要16级的不饱和度。占15个非饱和度位点的10个氨基酸和12烷酰侧链显示出25-B1缩酚十肽抗真菌剂A是一个单环十肽。比较苏氨酸的β-质子的化学位移(δH4.94、4.11和4.00)显示出在δ4.94处共振的质子是连在一个被修饰为酯或内酯的甲醇上。如此结果和25-B1缩酚十肽抗真菌剂A是缩酚酞被HMBC和ROESY数据所证实。这些数据也确定了25-B1缩酚十肽抗真菌剂A的氨基酸序列和该十二烷酰侧链的位置。
以精氨酸作为起始点，在HMBC谱中观察到在酰胺质子和相邻的氨基酸羰基和或α-碳原子(见下面


图1)的长程1H-13C相关性明确的确定了氨基酸序列精氨酸-NH/苏氨酸-CO、苏氨酸-NH/脱氢丙氨酸-CO、脱氢丙氨酸-NH/丙氨酸-CO、丙氨酸-NH/脱氢氨基丁酸-CO、脱氢氨基丁酸-NH/高丝氨酸-CO、高丝氨酸-NH/谷氨酸-CO、谷氨酸-NH/苏氨酸-CO、苏氨酸-NH/丙氨酸-CO和丙氨酸-NH/苏氨酸-CO。
图1HMBC(H-C)相关性与丙氨酸相邻的苏氨酸NH没有显示出与精氨酸残基的羰基之间具有长程1H-13C相关性，而是显示出对确定为十二烷酰侧链的羰基之间的相关性。该苏氨酸-NH/精氨酸-CO相关性的缺乏以及苏氨酸-β-H(δH4.94、δC70.5)/精氨酸-CO相关性的存在明确的确定了在苏氨酸-β-H和精氨酸-COOH之间存在酯连接。与这些确定结果一致的是在酰胺质子和相邻氨基酸α-质子R之间观察的OESY相关性(见下图II)。 图II选择的ROESY相关性结论化合物25-B1缩酚十肽抗真菌剂A代表了一类新的脂缩酚十肽，其具有一些在其它任何一种由丁香假单胞菌的不同分离株产生的假单孢菌素、丁香菌素、丁香毒素和丁香因子中都不存在的氨基酸残基。该新的缩酚酞有10个氨基酸组成，这也与仅具有9个氨基酸残基的假单孢菌素和丁香菌素不同。不像假单孢菌素天然产物，该新的缩酚酞不含有氯苏氨酸，它被怀疑为是药剂制剂中含有假单孢菌素化合物的药物在注射位点产生刺激的原因。
例4-25-B1缩酚十肽抗真菌剂A的抗真菌活性抗真菌研究是通过使用根据临床实验室标准国家委员会的指导方针的微量滴定肉汤稀释技术方法在96孔微量滴定板中进行的。萨布罗和葡萄糖肉汤被调整到含有2.5×104孢子/毫升。试验化合物被溶解于水中并以两倍稀释浓度进行试验，起始最高浓度为20□g/ml。平板在35℃条件下培养48小时。表2中的结果显示了该化合物的最低抑制浓度(MIC)，与未处理对照组相比完全抑制生长。
表2抗真菌活性生物体 MIC(μg/ml)白色念珠菌 10近平滑念珠菌 10新生隐球菌 1.25烟曲霉 ＞20荚膜组织胞浆菌 20一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1缩酚十肽抗真菌剂A的存在或数量可以通过测量一种制剂的抗真菌活性来确定。体外抗真菌活性可以通过使用标准琼脂稀释试验或圆盘扩散试验获得制剂的最低抑制浓度(MIC)来确定。一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1缩酚十肽抗真菌剂A的一种制剂可以是细胞培养物的提取物、或一种更为纯化的混合物。测定抗真菌活性中一种常用的真菌是白色念珠菌。如果该测试制剂引起白色念珠菌x657接种的琼脂平板产生10-12mm直径的抑制区，则抗真菌活性被认为是显著的。
例5-丁香假单胞菌分离、表征和诱变丁香假单胞菌的环境分离菌和突变体被产生和用来生产抗真菌剂。材料和方法菌株MSU 174和MSU 16-H是按照1996年11月9日授予G.Strobel等的美国专利号5.576.298的专利、Harrison等人发表于《遗传微生物杂志》1991年137期2857-2865页的“Pseudomycins，a family ofnovel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity”一文和Lamb等发表于Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1987年84期6447-6451页的“Transposonmutagenesis and tagging of fluorescent pseudomonasAntimycotic production is necessary for control of Dutch elmdisease”一文进行分离和表征的。本段引用的参考文献的公开在此引入作为参考。
其它附加的菌株是来自如野生型菌株和通过化学诱变作用产生的转座子突变体。受到诱变的菌株包括MSU 174、MSU 16H和25-B1。要受诱变的菌株在含有马铃薯产品的培养基上生长，然后分到含有0、1、2、4、16或32μM化学诱变剂1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG或MNNG)的培养基中。这些细胞随后被冻存以进行进一步的筛选和选择。
诱变的细胞被选择能够适应期望的生长条件和/或产生一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1缩酚十肽抗真菌剂A。化学诱变的丁香假单胞菌细胞，如诱变的菌株25-B1，复苏后在N21SM培养基中稀释到6细胞/毫升(表3)。该培养基有时含有一种或多种用于选择的组分，例如不同浓度的磷酸盐。每50μl体积的诱变细胞被分配到96孔圆底微滴定板的一个孔中，以运送平均0.3细胞/孔。典型的，每孔中要加入硅油以减少蒸发。该平板在25℃条件下摇动培养6到12天。
表3-N21SM培养基的组成
经过培养后，从每一孔中取出一般为5μL的等份试样进行系列稀释，(例如，1∶56、1∶196、1∶320、1∶686、和/或1∶1715)并且评估在液体微滴定板生物技术中对白色念珠菌的活性。该平板在37℃条件下培养过夜，并对各孔进行白色念珠菌生长一致的评估。合适的菌株被挑选出来，在CSM培养基(表4)中培养，在25℃条件下生长1到3天。
表4.链霉菌完全培养基(CSM)组分 浓度(g/l)葡萄糖5麦芽糖4Difco胰蛋白酶大豆汤 30Difco酵母提取物 -MgSO4·7H2O2不进行pH调整 -所选择的菌株被保存并接种到含有13ml N21SM培养基的发酵瓶中，在25℃条件下生长约66个小时。从该发酵物中取出一份试样，加入等体积的乙腈提取1个小时，离心，轻轻倒出用于对一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1缩酚十肽抗真菌剂A进行HPLC分析，如例1-3所描述的步骤。产生一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1缩酚十肽抗真菌剂A的菌株被再次分离、再次发酵并准备用于在更大规模生长。结果显示出产生一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1缩酚十肽抗真菌剂A特性的菌株用上述方法被生产出来。结论此处所公开的选择方法和准则对生长于基本培养基上并且产生一种或更多丁香假单胞菌脂缩酚十肽，如25-B1缩酚十肽抗真菌剂A的丁香假单胞菌菌株的生产是有效的。
例6-包含丁香假单胞菌脂缩酚十肽的制剂下面的制剂实例仅仅起到说明作用，并不准备用于限制本发明在任何一方面的范围。术语“活性成分”指的是一种丁香假单胞菌脂缩酚十肽或它的一种药剂学上可接受的盐类。制剂1硬明胶胶囊使用如下成分制备
制剂2片剂是用以下制剂制备的。所有成分进行混合然后压缩形成每片重665mg的片剂。
制剂3一种含有如下成分的气溶胶溶液被制备。活性成分与乙醇混合，混合物添加到压缩气体22的一部分，在-30℃冷却并转移到装填装置中。所需要的量被输送到不锈钢容器中并用压缩气体的剩余部分稀释。然后将阀门单元安装到容器上。
制剂4每一片含有60mg活性成分的片剂按如下制造
活性成分、淀粉和纤维素通过No.45目的美制筛子并进行充分混合。含有聚乙烯吡咯烷酮的水相溶液和得到的粉末混合，然后将混合物通过No.14目的美制筛子。得到的微粒在50℃下干燥，并通过No.18目的美制筛子。羧甲基钠淀粉、硬脂酸镁和滑石粉事先通过No.60目的美制筛子，然后加到微粒中，混合后，一起在制片机中压缩产生重量为150mg片剂。制剂5每颗含有80mg活性成分的胶囊，按以下步骤制造
有效成份、纤维素、淀粉、硬脂酸镁混合，通过No.45目的美制筛子，然后按200mg的质量填充到硬明胶胶囊中。制剂6每剂含有225mg有效成份的栓剂，按以下步骤制造
活性成份通过No.60目的美制筛子，然后悬浮在饱和脂肪酸甘油酯中，该甘油酯事先用尽可能少的热量融化，然后将混合物倒入标称为2g容量的栓剂模子中，并冷却。制剂7每5ml剂量含有50mg活性成分的悬浮液，按以下步骤制造
活性成份通过No.45目的美制筛子，并与羧甲基钠纤维素和糖浆混合形成细腻的糊状物。苯甲酸溶液、香料和颜料用一部分水稀释，在搅拌状态下加入到糊状物中。加入足够的水以达到所需体积。制剂8静脉内制剂可以按如下步骤制备。这些成分的溶液一般是以每分钟1ml的速度静脉内注射到患者体内。
本发明是参考不同的特效药和优选实施方案和技术而进行表述的。不过，应该理解的是在保持在本发明的精神和范围内，可能进行很多的变化和修改。
序列表<110>Eli Lilly and Company<120>分离自丁香假单胞菌的抗真菌剂<130>X-11015 序列表<140><141><150>60/129,446<151>1999-04-15<160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>10<212>PRT<213>Pseudomonas syringae<214>丁香假单胞菌<220><223>位置5的Xaa是高丝氨酸<220><223>位置6的Xaa是脱氢氨基丁酸<220><223>位置8的Xaa是脱氢丙氨酸<400>1Thr Ala Thr Gln Xaa Xaa Ala Xaa Thr Arg15 10
权利要求
1.一种分离的丁香假单胞菌缩酚十肽，或一种其药剂学上可接受的盐、酯或水合物，其含有一个缩酚十肽环，其中缩酚十肽环含有精氨酸、苏氨酸、高丝氨酸、脱氢氨基丁酸和脱氢丙氨酸，和一个由精氨酸的羧基与苏氨酸的羟基形成的内酯。
2.根据权利要求1的丁香假单胞菌缩酚十肽，其缩酚十肽环具有如下序列Thr-Ala-Thr-Gln-Hse-Dhb-Ala-Dha-Thr-Arg(SEQ ID NO1)
3.根据权利要求1的丁香假单胞菌缩酚十肽，其中的丁香假单胞菌缩酚十肽是一种丁香假单胞菌脂缩酚十肽。
4.根据权利要求3的丁香假单胞菌缩酚十肽，其中的丁香假单胞菌脂缩酚十肽包含一个与苏氨酸的氨基通过酰胺键结合的脂肪酸部分。
5.根据权利要求4的丁香假单胞菌缩酚十肽，其中的脂肪酸部分是一种癸酸部分、一种用一个或两个羟基基团取代的癸酸部分、一种十二烷酸部分、一种用一个或两个羟基基团取代的十二烷酸部分、一种十四烷酸部分或一种用一个或两个羟基基团取代的十四烷酸部分。
6.根据权利要求5的丁香假单胞菌缩酚十肽，其中的脂肪酸部分是一种n-十二烷酸部分。
7.根据权利要求3的丁香假单胞菌缩酚十肽，其中的丁香假单胞菌脂缩酚十肽由如下分子式表示 其中R是一种亲脂部分，或它的一种药剂学上可接受的盐、酯或水合物。
8.根据权利要求7的丁香假单胞菌缩酚十肽，其中的亲脂部分是选自C9-C15烷基、C9-C15羟烷基、C9-C15二羟烷基、C9-C15烯基、C9-C15羟烯基和C9-C15二羟烯基。
9.根据权利要求8的丁香假单胞菌缩酚十肽，其中的亲脂性部分是C9-C15烷基。
10.一种分离的丁香假单胞菌缩酚十肽具有如下分子式 或一种其药剂学上可接受的盐、酯或水合物。
11.一种通过将真菌和一种根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的分离的丁香假单胞菌缩酚十肽相接触而抑制真菌活性的方法。
12.根据权利要求11的方法，其中的真菌包括近平滑念珠菌、白色念珠菌、新生隐球菌或荚膜组织胞浆菌。
13.一种减轻需要其的病人体内真菌感染症状的方法，该方法包括给与病人有效剂量的一种包含根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的分离的丁香假单胞菌缩酚十肽的组合物。
14.根据权利要求13的方法，其中减轻症状包括降低真菌感染的痛苦。
15.根据权利要求13的方法，其中的真菌感染包括被近平滑念珠菌、白色念珠菌、新生隐球菌或荚膜组织胞浆菌感染。
16.根据权利要求13的方法，进一步包括如下步骤确定对给与分离的丁香假单胞菌缩酚十肽的需要；监控病人真菌感染症状的减轻。
17.根据权利要求13的方法，其中的给药包括每天肠道外给药约0.1到约5mg/kg分离的丁香假单胞菌缩酚十肽约1到3次/天。
18.根据权利要求13的方法，其中的减轻真菌感染的症状包括降低体温和提高病人的整体状态。
19.一种根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的分离的丁香假单胞菌缩酚十肽的在一种用于治疗真菌感染的药物的制备中的应用。
20.根据权利要求19的应用，其中的真菌感染包括被近平滑念珠菌、白色念珠菌、新生隐球菌或荚膜组织胞浆菌感染。
21.生产一种或更多丁香假单胞菌缩酚十肽的方法包括如下步骤在pH值约4到6.5条件下于含有三种或更少氨基酸的营养培养基中培养一种生物学纯的丁香假单胞菌培养物，直到一种或更多丁香假单胞菌缩酚十肽的浓度达到至少约10μg/ml；并且从培养物中收回一种或更多丁香假单胞菌缩酚十肽，或一种其在药剂学上可以接受的盐、酯或水合物。
22.根据权利要求21的方法，其中的氨基酸包括谷氨酸、甘氨酸、组氨酸或它们的一个组合。
23.根据权利要求22的方法，其中的氨基酸包括甘氨酸。
24.根据权利要求22的方法，其中的营养培养基进一步包含可溶性淀粉、酵母提取物或它们的组合和一种脂类。
25.根据权利要求24的方法，其中的营养培养基包含一种马铃薯制品和一种选自大豆油、脂肪酸和脂肪酸酯的脂类。
26.根据权利要求25的方法，其中的马铃薯制品包括马铃薯葡萄糖肉汤、马铃薯泥混合物、马铃薯糊精、马铃薯蛋白或它们的一个组合。
27.根据权利要求21的方法，其中在发酵步骤中溶氧浓度保持在约5％到30％。
28.根据权利要求21的方法，其中的发酵过程进一步包括葡萄糖、氢氧化铵或其组合的进料。
29.根据权利要求21的方法，其中产生的丁香假单胞菌缩酚十肽是一种根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的丁香假单胞菌缩酚十肽。
30.根据权利要求21的方法，其中的丁香假单胞菌包括来自菌株MSU 16H、MSU 174或MSU 206的一个菌株。
31.根据权利要求21的方法，其中的丁香假单胞菌包括菌株MSU16H、菌株25-B1、菌株67H1或菌株7H9-1。
32.根据权利要求31的方法，其中的丁香假单胞菌包括菌株25-B1。
33.一种根据权利要求7的、通过权利要求21、22、23、24、25、26、27、28、30、31或32制备的丁香假单胞菌缩酚十肽。
34.一种治疗或阻止真菌在植物中生长的方法，该方法包括将真菌和一种根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的丁香假单胞菌缩酚十肽相接触。
35.根据权利要求33的方法，其中的真菌是Rynchosporiumsecalis.Ceratocystis ulmi、Rizoctonia solani、Sclerotiniascleraotiorum、Verticillium albo-atrum、Verticillium dahliae、Thielaviopis basicola、Fusarium oxysporum或Fusariumculmorum。
36.根据权利要求34的方法，其中的真菌是Verticilliumalbo-atrum、Rizoctonia solani或Fusarium oxysporum。
全文摘要
本发明涉及丁香假单胞菌缩酚十肽类、产生这些肽类的方法、以及利用该肽类的抗真菌活性的方法。丁香假单胞菌缩酚十肽包括一种具有特定分子式(a)的化合物,其中的R是一个亲脂性部分,或它的一种药剂学上可接受的盐、酯类或水合物。
文档编号C12P21/04GK1347421SQ00806260
公开日2002年5月1日 申请日期2000年4月14日 优先权日1999年4月15日
发明者P·古兰塔伊夫尔, M·D·贝尔洛, J·W·马丁, D·J·泽克内尔 申请人:伊莱利利公司