表达唾液蛋白的转基因动物的制作方法

专利名称：表达唾液蛋白的转基因动物的制作方法
技术领域：
本发明涉及转基因动物，更具体的说就是，涉及经遗传修饰表达期望蛋白质的动物。
背景技术：
磷对于所有有机体的生长而言都是必需的元素。在家畜生产中，磷缺乏已经成为全世界最普遍的矿物质缺乏，饲料中必须经常添加无机磷，由此获得期望的单胃动物(如猪、家禽、等等)生长性能。
植酸或植酸盐(肌醇1，2，3，4，5，6-六磷酸二氢盐)是磷在谷类和豆类中的主要贮藏形式，占总磷含量的18％-88％(Reddy等人，1992)。植酸酶(肌醇六磷酸盐磷酸水解酶)属于磷酸单酯水解酶类它催化植酸盐(肌醇六磷酸盐)水解成无机单磷酸盐和肌醇的较低磷酸酯，或者在有些情况中是游离的肌醇。植酸酶根据酶攻击的第一个磷酸基团分为3-植酸酶或6-植酸酶。微生物中通常是3-植酸酶，而植物中通常是6-植酸酶(Cosgrove，1980)。
在单胃动物中不存在植酸酶，或者以很低水平存在(Bitar和Reinhold，1972；Iqbal等人，1994)。因此，饮食中的植酸盐不被小肠消化或吸收，而是浓缩在粪便中，由此促成家畜生产密集地区的磷污染。来自畜牧场的排放物导致对江河的污染。这种排放物已经导致了江河中氧浓度的快速下降，这是由于水中过度的藻类生长所致，继而导致鱼和现存植物区系和动物区系的死亡率上升。由于猪和家禽生产的增加，这正成为全球化问题(Miner，1999；Mallin，2000)。此外，植酸被认为是抗营养因子，因为它与饮食中的必需矿物质和蛋白质发生相互作用，限制了谷类和豆类在人和动物中的营养价值(Harland和Morris，1995)。
由于上述原因，已经进行了各种尝试，试图使动物能够利用饲料中可获得的植酸盐。这些尝试包括生产低植酸盐植物(Abelson，1999)、向动物饲料中添加植酸酶(Simons等人，1990)(Stahl等人，1999)、或转化饲料植物以产生需要的植酸酶(Pen等人，1993；Verwoerd等人，1995)。还测试了这些选项的组合，对接受低植酸盐玉米的家禽给予植酸酶(Huff等人，1998)。然而，这些解决方案增加了动物生产的成本。还因为植酸酶是一种酶，所以它易于因热度和湿气而失活，且在饲料粒化的高温下通常不稳定。
用于补充动物饲料的植酸酶主要来自曲霉种；然而，大量的植物和微生物都产生植酸酶(Wodzinski和Ullah，1996)(Dvorakova，1998)。已经有报导说，由大肠杆菌产生的植酸酶展示所有报导中的最高活性(Wodzinski和Ullah，1996)。来自大肠杆菌的这种植酸酶最初以称为APPA的酸性磷酸酶基因而克隆(Dassa等人，1990)。Greiner等人(1991；1993)纯化了来自大肠杆菌的植酸酶，并报导说来自大肠杆菌的天然植酸酶的酸性磷酸酶活性的一些动力学特性与APPA编码的酸性磷酸酶相似。然而，作者并没有克隆植酸酶基因来证明它与APPA基因是相同的。我们随后克隆、过度表达、并分析了APPA基因，而且显示了大肠杆菌基因APPA编码双功能酶，其展示植酸酶和酸性磷酸酶活性(Golovan等人，2000)。植酸酶展示磷酸酶活性，然而酶之间的相对活性差异很大(Wodzinski和Ullah，1996)。
因此，对能够使动物获得植酸酶从而能够有效进行植酸盐代谢由此降低磷污染的改进方法存在。
在使用重组方法的蛋白质生产领域，相关问题之一涉及所需糖基化的缺乏。因此，还需要用于生产这些糖蛋白的方法。
发明概述在一个实施方案中，本发明提供了体细胞和/或生殖细胞基因组中携带包含异源转基因构建物的核酸序列的转基因非人动物，该构建物包含编码蛋白质的转基因，所述转基因可操作连接用于在唾液腺中特异性表达蛋白质的第一种调控序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了体细胞和/或生殖细胞基因组中携带包含异源转基因构建物的核酸序列的转基因非人动物，该构建物包含编码植酸酶或其同源物的转基因。
在还有一个实施方案中，本发明提供了用于表达蛋白质的方法，该方法包括下列步骤a)将转基因构建物导入非人动物胚胎，使得由胚胎发育而成的非人转基因动物具有包含转基因构建物的基因组，其中所述转基因构建物包含i)编码蛋白质的转基因，和ii)至少一种用于在胃肠道中特异性表达该蛋白质的调控序列，b)将胚胎转移至代孕雌性动物；并c)将胚胎发育成所述转基因动物，其中转基因在动物的胃肠道中产生的。
在另外的实施方案中，本发明提供了经上文方法改造后表达蛋白质的转基因动物。本发明还提供了这种动物的后代。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于生产蛋白质的方法，包括下列步骤a)由非人转基因动物获得含蛋白质的唾液，该动物在其基因组中包含转基因构建物，其中所述转基因构建物包含i)编码该蛋白质的转基因，和ii)至少一种用于在唾液腺中特异性表达该蛋白质的调控序列，并b)由唾液提取蛋白质。
在另外的实施方案中，本发明提供了用于在非人动物中表达植酸酶或其同源物的方法，所述方法包括a)构建包含转基因构建物的核酸序列，其中转基因构建物包含i)编码植酸酶或其同源物的转基因，和ii)至少一种用于在胃肠道中特异性表达蛋白质的调控序列，并b)用该核酸序列转染动物，由此，动物在其体细胞和/或生殖细胞基因组中携带转基因构建物，且动物在其胃肠道中表达植酸酶或其同源物。
在另一个实施方案中，本发明提供了核酸分子，其所含核酸序列包含编码蛋白质的基因，该基因可操作连接至少一种用于在胃肠道中特异性表达该蛋白质的调控序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了对由上文的核酸序列表达的蛋白质具有特异性的抗体和用于免疫学检测这种蛋白质的测试试剂盒。本发明还提供了用于分泌这些抗体的杂交瘤。
在另一个实施方案中，本发明提供了用上文的核酸序列转染的细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于生产包含在唾液中分泌的、展示新的生理学活性的糖基化蛋白质的蛋白质分子的方法。这种活性的一个范例是植酸酶。
图的简述在详细描述了下列附图之后，本发明优选实施方案的这些和其它特色将变得更加清晰


图1是表示用于产生含可诱导的脯氨酸富含蛋白(PRP)启动子/增强子的本发明基因构建物的方法的示意图。更具体的说就是，
图1是例示用于产生转基因小鼠的转基因R15/APPA+内含子和R15/APPA的构建步骤的示意图。
图2是表示用于产生含SV40启动子的本发明基因构建物的方法的示意图。更具体的说就是，图2是例示含通过转染导入哺乳动物细胞系的转基因SV40/APPA+内含子的质粒的构建步骤的示意图。
图3是表示用于产生含组成性的腮腺分泌蛋白(PSP)启动子/增强子的本发明基因构建物的方法的示意图。更具体的说就是，图3是例示编码天然AppA植酸酶的转基因Lama2/PSP/APPA和编码含PSP信号肽序列的AppA植酸酶的Lama2/PSP/APPA的构建步骤的示意图。
图4是含APPA转基因的Lama2-APPA质粒的示意图。
图5例示含大肠杆菌APPA基因的Lama2/APPA质粒的核酸序列(SEQID NO1)。
图6例示经转化小鼠的PCR结果。更具体的说就是，图6是例示来自使用Lama2/APPA构建物的XhoI和NotI片段产生的转基因雌性建立者小鼠3-1的第3代后代的尾部基因组DNA的APPA PCR产物的琼脂糖凝胶照片。第2代植酸酶基因阳性雄性与两只植酸酶阳性转基因雌性9f和11f都进行杂交(表3)。对于18m×9f窝，后代3、4、5、和6是PCR阳性的；对于18m×11f窝，后代2和3是PCR阳性的。Std是寡核苷酸标准物，左边的数目是标准物的bp大小。C道是缺少DNA模板的阴性对照反应混和物，而appA是含植酸酶基因扩增片段的阳性对照。所用引物是APPA-UP2和APPA-KPN。
图7例示经转化建立者猪的PCR结果。更具体的说就是，图7是例示来自167号窝的5头建立者小猪的基因组尾部DNA的植酸酶基因PCR产物和β-珠蛋白PCR产物的琼脂糖凝胶照片。Std是1kb梯形标准物。使用植酸酶引物组的2道关于植酸酶基因是阳性的，而所有样品关于β-珠蛋白基因是阳性的。C道是不含模板DNA的阴性对照。植酸酶转基因引物组包括APPA-UP2和APPA-KPN，给出了期望的片段大小750bp。用于β-珠蛋白基因的引物组包括PIG-BGF和PIG-BRG，给出了期望的片段大小207bp。
图8例示转基因重排检验的PCR结果。更具体的说就是，图8是显示用于扩增导入猪167-02的转基因不同片段的4种不同引物组的PCR产物的琼脂糖凝胶照片。Std包含1kb DNA梯形标准物。所用引物组包括1道，APPA-UP2和APPA-KPN(750bp)；2道，APPA-MATURE和APPA-KPN(1235bp)；3道，APPA-MATURE和APPA-DOWN2(608bp)；4道，PIG-BGF和PIG-BGR(207bp)。5道，未加入DNA模板的阴性对照；6道，appA基因和引物APPA-UP2和APPA-KPN。左边的数目指示标准物中条带的大小。当不存在DNA模板或引物时，没有检测到PCR产物。
图9例示生长过程中距离一定时间，转基因公猪167-02的体重和唾液植酸酶活性，以及同栏的平均体重。符号167-02的体重，●；4头同栏的平均体重±SD，▲；167-02的植酸酶活性，■；植酸酶比活，□。箭头指示粪便磷浓度取样。
图10例示生长过程中距离一定时间，转基因公猪282-02的体重和唾液植酸酶活性，以及同栏的平均体重。符号282-02的体重，●；5头同栏的平均体重±SD，▲；282-02的植酸酶活性，■；植酸酶比活，□。箭头指示粪便磷浓度取样。
图11例示生长过程中距离一定时间，转基因公猪282-04的体重和唾液植酸酶活性，以及同栏的平均体重。符号282-04的体重，●；5头同栏的平均体重±SD，▲；282-04的植酸酶活性，■；植酸酶比活，□。箭头指示粪便磷浓度取样。
图12例示生长过程中距离一定时间，转基因公猪405-02的体重和唾液植酸酶活性，以及同栏的平均体重。符号405-02的体重，●；4头同栏的平均体重±SD，▲；405-02的植酸酶活性，■；植酸酶比活，□。箭头指示粪便磷浓度取样。
图13例示生长过程中距离一定时间，转基因公猪421-06的体重和唾液植酸酶活性，以及同栏的平均体重。符号421-06的体重，●；4头同栏的平均体重±SD，▲；421-06的植酸酶活性，■；植酸酶比活，□。箭头指示粪便磷浓度取样。
图14例示第一代猪的PCR结果。更具体的说就是，
图14是显示8窝154只小猪的PCR分析的琼脂糖凝胶照片。植酸酶转基因公猪167-02被用于与非转基因雌性进行繁殖。Std，100bp梯形标准物，左边的数目是每一条带中片段的bp大小；167-02道，来自公猪167-02的DNA；1，来自167-02的DNA；C道，是未加入DNA的道；1-8道，来自该窝每一头后代小猪的扩增DNA插入片段。植酸酶引物是Lama-UP和APPA-DOWN4。β-珠蛋白引物是PIG-BGF和PIG-BGR。
图15例示银染的十二烷基硫酸钠凝胶，演示大肠杆菌产生的APPA植酸酶和猪产生的APPA植酸酶的大小，并证实猪植酸酶是糖基化的。更具体的说就是，
图15是纯化的大肠杆菌产生的AppA植酸酶和纯化的猪唾液植酸酶的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)照片，(A)是直接银染的，(B)是由相似SDS-PAGE凝胶转移到硝酸纤维素膜上并对糖蛋白进行染色。肌酸酶不是糖基化的，而转移是糖基化的。左边的数目是以kDa表述的分子量标准物(Std)的大小。
图15B是未处理猪AppA植酸酶和用3种脱糖基化酶联合处理后相同植酸酶的Western印渍照片。1道，纯化的大肠杆菌产生的AppA植酸酶(未处理)；2道，纯化的猪植酸酶(未处理)；3道，用脱糖基化酶(包括N-糖苷酶F、O-糖苷酶、和神经氨酸酶)联合处理的纯化的猪植酸酶。
图16例示猪植酸酶和大肠杆菌产生的APPA植酸酶的Western印渍，使用针对APPA植酸酶的单克隆抗体，证明它们具有同源表位。更具体的说就是，
图16是来自猪唾液、经各种纯化步骤的APPA植酸酶和纯化的大肠杆菌产生的植酸酶的Western印渍。针对大肠杆菌植酸酶制备的单克隆抗体被作为用于检测的第一抗体使用。1道，来自非转基因猪164-04的唾液；2道，来自转基因猪167-02的唾液；3道，不结合DEAE-Sepharose的唾液部分；4道，结合DEAE-Sepharose并由NaCl梯度释放的唾液植酸酶；5道，通过pH梯度4-7的层析聚焦进一步纯化的唾液植酸酶；6道，来自大肠杆菌的纯化的植酸酶。左边的数目是以kDa表述的分子量标准物(未显示)的大小。
图17例示大肠杆菌APPA植酸酶、来自植酸酶阴性和阳性猪和小鼠的唾液样品的SDS-PAGE以及相应的Western印迹，证明来自3种来源的植酸酶具有同源抗原表位，但是动物植酸酶比大肠杆菌产生的更大。更具体的说就是，图6是纯化的大肠杆菌产生的AppA植酸酶以及猪和小鼠产生的AppA植酸酶的SDS-PAGE照片，(A)是银染的，(B)是相同组的蛋白质样品的Western印渍。针对大肠杆菌植酸酶制备的单克隆抗体被作为用于检测的第一抗体使用。1道，纯化的大肠杆菌产生的AppA植酸酶；2道，来自非转基因猪164-01的唾液；3道，来自产生AppA的转基因猪167-02的唾液；4道，来自猪167-02的纯化的植酸酶；5道，来自非转基因小鼠的唾液；6道，来自含R15/APPA转基因的转基因小鼠、用异丙肾上腺素诱导的唾液；7道，来自含Lama/APPA转基因的转基因小鼠的唾液；Std，分子量标准物。左边的数目是以kDa表述的分子量标准物(未显示)的大小。
图18例示含pBLCAT3载体序列的R15/APPA+内含子质粒的已知片段的核酸序列(SEQ ID NO4)。
图19例示用于产生转基因小鼠的R15/APPA+内含子转基因构建物的已知片段的核酸序列(SEQ ID NO3)。
图20例示含pBLCAT3载体序列的R15/APPA质粒的已知片段的核酸序列(SEQ ID NO4)。
图21例示用于产生转基因小鼠的R15/APPA转基因构建物的已知片段的核酸序列(SEQ ID NO5)。
图22例示SV40/APPA+内含子质粒的核酸序列(SEQ ID NO6)。
图23例示用于产生转基因小鼠和转基因猪的Lama2/APPA转基因构建物的核酸序列(SEQ ID NO7)。
优选实施方案的描述在下面的描述中，使用了大量的重组DNA技术术语。提供下列定义使能够更清晰的理解本说明书和所附权利要求书“启动子”-通常作为基因5’区描述并接近起始密码子的DNA序列。邻近基因的转录由启动子区起始。如果启动子是可诱导的启动子，那么转录速率应答诱导剂而增加。而组成性的启动子在没有额外调控的情况中起始邻近基因的转录。
“可操作连接”一当置于与另一种核酸序列的功能性相互关系中时，核酸序列是“可操作连接”的。例如，如果启动子引起序列的转录，那么启动子或增强子与编码序列“可操作连接”。通常，“可操作连接”指连接的核酸序列是相邻的，在将两个蛋白质编码区连接时，则它们在相同读码框中相邻连接。
“植酸酶”-由肌醇六磷酸或其它肌醇磷酸释放磷酸的任何蛋白质。它的催化能力可能局限于植酸或其一种盐，或者它可能显示较低特异性并水解多种磷酸化化合物。
“基因”-包含RNA聚合酶的模板并包含表达多肽或蛋白质所需的信息的DNA序列。
“多核苷酸分子”-多聚脱氧核糖核酸(DNA)分子或多聚核糖核酸(RNA)分子。
表达”-由结构基因产生多肽的过程。
“克隆载体”-指能够携带遗传信息进入宿主细胞的质粒或噬菌体DNA或其它DNA序列。克隆载体的特征通常为一个或多个核酸内切酶识别位点，在此可以以可决定的方式切割这些DNA序列而不损失载体必要的生物学功能。克隆载体是可以剪接期望DNA由此将其克隆到宿主细胞中的DNA序列。
载体”-也用于指称克隆载体的术语。
“质粒”-是通常包含环状DNA分子、在至少一种宿主细胞中维持并自主复制的克隆载体。
“表达载体”-与克隆载体相似、但是转化宿主后支持克隆其中的基因表达的载体。克隆基因通常置于某些控制序列(诸如启动子序列)的控制之下(即可操作连接)。
“宿主”-作为重组材料的接受者和携带者来利用的细胞。
“同源”-指由与宿主相同的属或种起源的核酸分子。
“异源”-指由与宿主不同的属或种起源的核酸分子。
“糖蛋白”-指经历了糖基化的肽分子。
“糖基化”-指向肽分子的氨基酸残基添加碳水化合物基团。
最近几年，为了许多目的而开发转基因动物(Pinkert等人，1990)(Wall等人，1997)。因此，本发明的一个前提是，通过提供能够表达植酸酶的转基因动物将避免上文讨论的问题。用于动物中的异源植酸酶表达的几种方案包括(i)唾液腺分泌植酸酶，(ii)胰脏分泌酶并与消化酶一起进入小肠，或(iii)由肠上皮细胞分泌，很象本身的碱性磷酸酶和糖苷酶的分泌(Low，1989)。大肠杆菌植酸酶似乎最适合于单胃的水解活性，因为该酶的最佳pH范围是2.5-4.5，而且它对胃中有活性的优势蛋白酶胃蛋白酶有抗性。植酸酶在大肠杆菌中定位于周质，具有N端信号肽序列(Golovan等人，1999)，似乎用于由腮腺分泌是最佳的。植酸酶可以由胰脏分泌进入小肠的方式表达，或在肠上皮组织中表达并分泌进入肠环境。然而，如果选定了表达位置，将有必要选择在小肠更中性pH有活性且对胰酶(包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、和弹性蛋白酶)更有抗性的酶。
选择植酸酶用于胃肠道表达的重要因素包括，对于活性最佳的pH、高催化活性、广泛的底物特异性、和蛋白酶抗性。如果不具备这些特性，那么现在有久经考验的用于修饰酶特性的分子方法。这些方法包括定点诱变、随机诱变、和DNA改组的各种修改(Harayama，1998；Crameri等人，1998)。
因此，植酸酶在唾液腺中的合成和在唾液中的分泌，将提供酶与食物中存在的植酸的早期接触，并为水解提供足够时间。
猪的唾液腺系统由3对腺体组成，通过两颊导管分泌的腮腺、和具有接合导管在舌前下方分泌的下颌和颌下腺。在猪中经这些导管的唾液分泌是不连续的，在食用固体食物时产生；而且当进食过程中限制饮水时，能够与进食的重量相等(Corring，1980；Arkhipovets，1956)。例如，由45kg猪产生的唾液量在接近零(当猪接受的食物主要是流体时)和500g(当食用干的食物而未饮水时)之间变化。猪的唾液腺分泌淀粉酶(Rozhkov和Galimov，1990)和多种其它唾液蛋白和粘多糖。
据我们所了解，尚未由猪克隆编码唾液蛋白的基因。然而，已经克隆并分析了由大鼠和小鼠分泌的主要蛋白质的编码基因。当小鼠或大鼠食用单宁或注射异丙肾上腺素时，产生所谓的脯氨酸富含蛋白(PRP)，即编码一组富含脯氨酸的独特蛋白质的多基因家族。
开发经转化表达植酸酶(优选在唾液腺中)的动物将是有利的。在这种情况中，动物可以利用动物饲料中天然存在的植酸盐而无需使用任何添加剂。这将降低动物生产的成本，进而将避免磷对环境的污染。因此，本发明致力于克服涉及增加植酸盐利用的现有技术的不足，具体的说就是，提供表达植酸酶的转基因动物。
在借助重组方法的异源蛋白质生产中，需要面对几个障碍。常常面对的这样一种障碍是，表达的蛋白质缺乏所需的翻译后修饰，从而导致蛋白质在结构上和/或功能上与期望分子不同。糖基化就是这样一种期望的翻译后修饰。然而，通常发现这种修饰在更复杂的哺乳动物系统中发生。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了用于生产重组糖蛋白的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了能够在唾液中可诱导或组成性表达异源蛋白质的动物。为了例示，选择小鼠作为动物模型，并使用大鼠脯氨酸富含蛋白(PRP)启动子/增强子(可诱导启动子)和小鼠腮腺分泌蛋白(PSP)启动子/增强子(组成性启动子)产生用于转化的基因构建物。在该例示中，将植酸酶用于在唾液中表达。
在发现了可诱导植酸酶能够在小鼠腮腺中表达之后，检验了植酸酶转基因在组成性PSP启动子的控制下的表达。根据与阿拉巴马大学的合同，生产了两只PSP构建物的转基因小鼠。
在检验了上文所述的小鼠之后，通过将包含驱动高活性植酸酶合成的组成型启动子的植酸酶转基因导入基因组而产生了转基因猪。发现如此产生的猪在粪便中排泄的磷比非转基因猪少。在唾液腺中的表达唾液是由主要唾液腺(腮腺、颌下腺、舌下腺、和次要唾液腺)分泌的清澈的无色流体，其润滑并清洁口腔，以及起始消化过程。腮腺是与唾液生成有关的6个主要腺体中的两个。腮腺主要包括两种细胞类型腺泡和小球间导管细胞。腺泡细胞，占组织的75-85％，是分泌蛋白的合成位点(Frandson和Spurgeon，1992)。这些细胞产生两种很丰富的蛋白质α-淀粉酶(AMY-1)(polyA RNA的2％)(Madsen和Hjorth，1985)和腮腺分泌蛋白(PSP)(polyA RNA的10％)(Shaw和Schibler，1986)。现在可以获得能够在小鼠唾液腺中组织特异性表达转基因的几种构建物。
猪的唾液分泌尚未受到如小鼠和人一般的关注。有人提出猪的唾液分泌是不连续的(在就餐之间分泌较少)。45kg的猪在食用500g干的食物时可以分泌多达500g的唾液(Corring，1980)。在不同动物的唾液中检测的流速和电解质变化大，甚至相同动物不同日子采集的样品之间也是如此(Tryon和Bibby，1966)。关于猪唾液或唾液酶的组成知道得很少。已检测到唾液淀粉酶，但是量比胰淀粉酶少250 000倍，比人唾液少100倍(Low，1989)。尚没有能够在猪唾液腺中特异性表达转基因的已知构建物。1)在可诱导启动子控制之下的APPA基因a)R15/APPA构建物的构建(可诱导启动子)在此过程中，通过连接唾液蛋白的启动子/增强子与编码双功能植酸酶、酸性磷酸酶的APPA基因构建了质粒。用于构建的APPA基因由大肠杆菌ATCC 33965克隆到pBR322中。这在上文中有所描述(Golovan等人，2000)。
通常富含脯氨酸的蛋白质，即所谓的脯氨酸富含蛋白(PRP)，占人唾液中总蛋白质的大约70％(Bennick，1982)。与PRP在人的组成性表达不同，小鼠、大鼠、和仓鼠的唾液腺通常不表达PRP或低水平表达。在大鼠和小鼠中，PRP基因表达可以通过富含单宁的食谱或通过注射β-激动剂异丙肾上腺素而显著诱导(Carlson，1993)。每天注射异丙肾上腺素6-10天后，PRP占腮腺提取物中总可溶性蛋白质的大约70％。已经由大鼠(Clements等人，1985)、小鼠(Ann和Carlson，1985)、仓鼠(Mehansho等人，1987)、和人(Kim和Maeda，1986)克隆并分析了PRP cDNA和PRP基因。
将转基因小鼠用于定位大鼠脯氨酸富含蛋白基因R15的唾液特异性和可诱导表达必要的顺式作用DNA元件。发现R15启动子上游的腮腺控制区(-6至-1.7kb)能够指导异源启动子构建物的腮腺特异性和异丙肾上腺素可诱导表达(Tu等人，1993)。远端-10至-6kb区显示发挥增强子的功能，它能够将表达水平增加超过30倍。-6至-1.7kb区还似乎发挥基因座控制区(LCR)的功能，因为它赋予所有15只独立转基因小鼠中的报导基因以依赖拷贝数而不依赖染色体位置的方式表达(Tu、Lazowski、Ehlenfeldt、Wu、Lin、Kousvelari、和Ann，1993)。
我们由Dr.D.K.Ann以质粒-10R15/CAT获得R15-PRP启动子，该质粒将氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)置于可诱导R15-PRP启动子的控制之下。我们决定使用该质粒作为转基因构建的基础(
图1)。由于没有关于R15-PRP启动子的完整序列信息(只对10kb中的2kb进行了测序)，我们通过XhoI消化除去了R15-PRP启动子(
图1，第1步)。将重新连接的质粒作为模板与CAT-ATG和CAT-TAA合成引物一起用于PCR。用最佳的真核起始序列替代4.3kb CATPCR片段的CAT基因起始位点(Kozak，1987)。通过琼脂糖凝胶电泳纯化片段，进行自身重新连接，并用于转化大肠杆菌(
图1，第2步)。用NcoI消化CATPCR质粒，并使用T4 DNA聚合酶进行填补产生平端。此后，用Eco47III消化CATPCR片段，并通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化(
图1，第3步)。在导致转基因构建的亚克隆步骤过程中，修饰APPA基因中的3个稀有密码子。具体的说就是，将Ala3编码序列由GCG换成GCC，将Pro428序列由CCG换成CCC，将Ala429序列由GCG换成GCT。进行这种修饰是为了增加真核细胞中基因转录的可能性。使用pBR322/APPA质粒先前克隆的APPA基因，与合成引物APPA-DRA和APPA-SMA一起，通过PCR扩增APPA基因。用DraI和SmaI消化通过PCR产生的1.3kb APPAPCR片段，并进行凝胶纯化(
图1，第4步)。将APPAPCR和CATPCR片段平端连接而产生CAT/APPA+内含子载体(
图1，第5步)，并导入大肠杆菌DH5α菌株。通过SalI和EcoRI限制性消化检查插入片段的取向。通过双链测序检查CAT/APPA+内含子中的转基因。为了除去SV40小t内含子，通过XhoI和EcoRI消化由质粒切下2.3kb APPA/内含子/polyA片段(
图1，第6a步)，凝胶纯化，并用DraI消化(
图1，第6b步)。对1.5kb(APPA)和0.2kb(polyA)片段进行凝胶纯化，并与经XhoI和EcoRI消化的CATPCR在三片段连接反应中连接在一起(
图1，第6c步)。将产生的质粒CAT/APPA和CAT/APPA+内含子用XhoI进行消化，凝胶纯化，并与经XhoI消化的R15-PRP启动子重新连接(
图1，第7步)。由于连接的低效率，将整个连接混和物用于转化大肠杆菌，制备总质粒DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳。将比最初的CAT/APPA(5.6kb)大的质粒洗脱并重新转化大肠杆菌。通过对来自单菌落的DNA进行琼脂糖凝胶电泳来鉴定含R15-PRP插入片段的质粒(15kb)。通过使用R15-UP1和APPA-DOWN2合成引物的PCR来鉴定正确取向。用HindIII和KpnI消化质粒R15/APPA和R15/APPA+内含子；将转基因进行凝胶纯化，并使用Qiagen柱进行进一步纯化(
图1，第8步)。
图18例示包含R15/APPA+内含子序列(含pBLCAT3载体序列)的已知片段的质粒的核酸序列。该质粒的序列称为SEQ ID NO2。
图19例示包含R15/APPA+内含子序列(用于产生转基因小鼠)的已知片段的转基因构建物的核酸序列。该转基因的序列称为SEQ ID NO3。
图20例示包含R15/APPA序列(含pBLCAT3载体序列)的已知片段的质粒的核酸序列。该质粒的序列称为SEQ ID NO4。
上文指出的pBLCAT3序列示于
图1的CAT/APPA和图2的CAT/APPA+内含子中。该序列是最初的-10R15/CAT的一部分，其一部分在整个构建过程中都存在。
图21例示包含R15/APPA序列(用于产生转基因小鼠)的已知片段的转基因构建物的核酸序列。该转基因的序列称为SEQ ID NO5。
2)SV40/APPA+内含子在细胞培养物中的表达为了产生用于在细胞培养物中表达APPA的SV40/APPA质粒，使用合成引物SV-HIND与SV-XHO，通过PCR由pSV-β-半乳糖苷酶质粒(Promega)扩增SV40启动子/增强子。将SV40启动子/增强子片段进行XhoI和HindIII消化，凝胶纯化，并连接到经XhoI和HindIII消化的CAT/APPA中(图2)。
图22例示SV40/APPA+内含子的核酸序列。该质粒的序列称为SEQID NO6。
我们获得了大鼠腮腺腺泡细胞系PARC 5.8(Quissel等人，1998)，意欲用于植酸酶转基因的瞬时表达。目的是，在导入动物前，检验用于转基因表达的不同构建物的效率，还检测植酸酶表达的任何有害影响。我们使用R15/APPA和R15/APPA+内含子构建物尝试了APPA基因的瞬时表达，但是由于低转染效率和/或低表达水平，我们没有能够检测到植酸酶和作为转染对照的β-半乳糖苷酶。
我们用SV40组成性启动子-增强子替换R15/APPA构建物的R15-PRP可诱导启动子，使得能够在不同的细胞培养物中高水平瞬时表达。我们使用SV40启动子/增强子对CHO、COS7、和HELA细胞系进行了APPA植酸酶瞬时表达的筛选。在含10％(w/v)热灭活的胎牛血清的DMEM/F12(Sigma)细胞培养基上，于37℃，在5％CO2和95％空气中，维持所有细胞系。在转染前培养细胞至70％汇合。转染前2小时，换成新鲜培养基。使用DNA-磷酸钙转染法(Gorman等人，1983)，用5μg DNA/60mm培养板转化细胞(1∶1 SV40/APPA与SV40/β-半乳糖苷酶)。温育6小时后，除去培养基，并对细胞进行甘油休克3分钟(Ausbel等人，1992)。用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞，并在标准生长条件下在新鲜培养基中进行温育。温育48小时后，收集无细胞培养液，用PBS清洗细胞2次，并用1ml含1％(v/v)NP-40、1mM EDTA二钠的Hanks平衡盐水(HBSS)于4℃裂解1小时。在总体积100μl的0.1M醋酸钠/醋酸缓冲液(pH4.5)中以植酸钠(4mM)为底物于37℃进行植酸酶测定。温育6小时后，用67μl钼酸铵/钒酸铵/硝酸混和物终止反应，并于405nm测定释放的无机磷酸浓度(Engelen等人，1994)。1个单位(U)的酶活性指每分钟释放1μmol无机磷酸的酶量。测定进行3次。使用未转染细胞系作为内源植酸酶活性的对照。
我们在未转染细胞系中没有检测到内源植酸酶活性。在所有经转染细胞系中检测到植酸酶活性，其中COS7细胞在无细胞培养液(4ml)中表达0.35U植酸酶，在由相同平板获得的细胞部分(1.1ml)中表达0.0034U。由COS7细胞产生的植酸酶活性比CHO高7倍，比HELA细胞系高35倍。超过99％的活性位于无细胞培养液中，这说明表达的酶使用细菌信号序列外运至细胞外。我们没有能够检测到胞质β-半乳糖苷酶的表达，我们意欲以此作为转染效率的对照。
c)R15-PRP/APPA在转基因小鼠中的表达由阿拉巴马大学(伯明翰，阿拉巴马)NICHD转基因小鼠开发机构(NTMDF)的Dr.C.A.Pinkert使用构建物R15/APPA和R15/APPA+内含子产生转基因小鼠。产生小鼠的程序已经由NTMDF进行标准化，而且可以由http//transgenics.bhs.uab.edu/pagel.htm获得进一步的信息，此处收入其内容作为参考。该过程包括用期望核酸序列转染小鼠的微注射技术。总之，将序列微注射到小鼠受精卵中，并将幸存卵子移植到假孕接受者小鼠中。然后接受者小鼠产生获得的建立者转基因小鼠。值得赞赏的是，在本发明中可以使用产生转基因小鼠的多种其它方法。
通过PCR检测小鼠中的R15/APPA转基因使用引物CAT-UP1与APPA-DOWN2，其产生700bp片段，PCR中使用标准PCR条件，不同之处只是杂交步骤设置为51℃40sec，聚合步骤设置为72℃60sec。
对于R15/APPA构建物，获得8只PCR阳性建立者小鼠，4雄4雌。3只建立者没有将转基因传给后代，可能是嵌合体。对于R15/APPA+内含子，获得5只PCR阳性建立者小鼠，3雄2雌，发现其中1只是嵌合体。在10-12周龄，通过每天腹膜内(ip)注射溶于100μl无菌生理盐水的1mg异丙肾上腺素，对不同种系PCR阳性后代的PRP生成诱导10天。还对几个PCR阴性后代进行诱导作为对照。在PCR阳性与PCR阴性后代之间，在诱导期开始或结束时，没有觉察到体重的显著差异。在诱导前和10天诱导期结束时收集唾液。
为了收集唾液，用氯胺酮/甲苯噻嗪混和物轻微麻醉小鼠(ip注射在水中稀释的50mg氯胺酮和5mg甲苯噻嗪/kg体重)，并通过注射匹鲁卡品/异丙肾上腺素来诱导唾液流(ip注射溶于生理盐水的0.5mg匹鲁卡品和2mg异丙肾上腺素/kg体重)(Hu等人，1992)。在注射匹鲁卡品/异丙肾上腺素5分钟后开始的30分钟时间内，由每只小鼠收集了100-250μl唾液。
将小鼠握在一只手中，并用20μl移液枪由嘴角吸取唾液，由此由每只小鼠收集唾液。将收集的唾液转移至装有2μl 0.5M EDTA(pH8.0)和4μl 10mg/ml蛋白酶抑制剂Pefabloc(Boehringer Mannheim)水溶液的冷的Eppendorf微量离心管。将装有唾液的离心管置于冰上直至进行测定。如关于在细胞培养物中表达的SV40/APPA所述，测定唾液中的植酸酶活性。
在未诱导或经诱导的PCR阴性小鼠中没有检测到植酸酶表达。对于PCR阳性小鼠，在未诱导小鼠中没有检测到植酸酶表达。然而，在经诱导的PCR阳性小鼠中观察到植酸酶表达。该研究的结果概述于表1。
尽管有可能在植酸酶测定中通过特征性黄色区分经诱导的PCR阳性与PCR阴性小鼠的唾液，当进行测定时，有些阴性小鼠的唾液产生混浊，这种混浊不能通过离心除去并影响分光光度计读数。我们没有在表达中觉察到任何性别差异，发现雄性与雌性都在唾液中产生植酸酶。在3个家系中(都是R15/APPA+内含子)，没有检测到植酸酶表达或仅检测到很低水平的表达(0.03-0.95U/ml)；在4个家系中，表达范围为7-87U/ml；2个家系(都是R15/APPA)在唾液中产生很高水平的植酸酶，为252和547U/ml。
这些实验证明，植酸酶能够在小鼠唾液腺中以很高水平表达而对动物没有有害影响。我们还能够由表达可诱导植酸酶的动物产生具有可诱导唾液植酸酶的后代，由此证明该性状可以遗传并显示动物的生殖能力未受影响。经检查小鼠F2代的唾液植酸酶发现，其植酸酶产生水平仍旧保持。
包含转基因(不含内含子)的建立者的后代产生的植酸酶水平显著较高。R15/APPA+内含子构建物中的SV40内含子似乎引起较低水平的表达，在3个家系(A1f、A20f、和B0m)中几乎检测不到植酸酶水平。A2m家系(R15/APPA+内含子)的植酸酶表达水平比B0m-内含子家系(R15/APPA)低6.2倍。
初步实验显示，当通过PAGE分析酶时，它的大小由42kDa增加至60kDa。它可能通过糖基化进行了修饰，但是保持稳定和有活性。2)在组成性启动子控制之下的APPA基因a)Lama2/APPA转基因的构建(组成性启动子)鼠腮腺分泌蛋白(PSP)在小鼠腮腺中是表达最丰富的蛋白质(Madsen和Hjorth，1985)。脉冲标记1小时后，小鼠腮腺将65-85％的14C-亮氨酸掺入这一种蛋白质(Owerbach和Hjorth，1980)。估计PSP mRNA积累达到50,000分子/细胞，且对于每个分子的淀粉酶，产生3-5个分子的PSP(Madsen和Hjorth，1985)。尽管PSP在唾液中占优势，但是还没有很好的分析它的功能。
已经克隆并分析了编码PSP的单拷贝基因。它具有两个等位基因PSPa(Shaw和Schibler，1986)和PSPb(Owerbach和Hjorth，1980)。PSPb等位基因也在舌下腺中表达，但是是在腮腺中发现的水平的1/10。已经显示，PSPb的4.6kb 5’侧翼序列足以进行唾液腺特异性表达。舌下腺表达水平接近PSP mRNA水平的100％，而腮腺表达不超过1％(Mikkelsen等人，1992)，这证明舌下腺和腮腺表达的调控序列是不同的。表达水平还依赖整合位点。将相同构建物用于表达人血液凝结因子VIII(FVIII)的C端链。在舌下腺中检测到高水平的FVIII mRNA，而在腮腺中是低水平。转基因家系还在唾液中以10U/唾液分泌(大约0.05ml唾液)的水平分泌FVIII轻链(Mikkelsen等人，1992)。后来，通过使用11.4kb 5’侧翼序列和2.5kb 3’侧翼序列，相同组达到了高水平的腮腺特异性表达，与内源基因相似甚至更高(Larsen等人，1994)。表达似乎与位置无关而依赖于拷贝数，这可能指示在这些序列中存在LCR。
Lama2是PSP基因的一部分，包含在转基因小鼠中以高达内源PSP基因的56％表达的18kb构建物。
因为Lama2的较大部分尚未测序，所以首先将构建物拆分并亚克隆到pBluescript KS(+)中，而且在掺入APPA基因后，重新装配Lama2(图3)。我们使用唯一的RsrII和SmaI位点由Lama2切下3.4kb片段，使用KpnI-RsrII衔接头，亚克隆到经KpnI和SmaI消化的pBluescript IIKS(+)的多克隆位点(MCS)中(图3，第1步)。
KpnI*RsrIITGGGAGGTCGCATGACCCTCCAGCCAG那使得我们能够保留RsrII位点(CG/GWCCG)并破坏KpnI位点(GGTAC/C＞GGTAC/T)，因为KpnI位点的存在将有可能干扰将来的克隆。将pKS/Lama构建物进行ApaI和KpnI消化，并与经修饰APPA一起用于三片段连接反应(图3，第2步)。我们设计了2种PSP/APPA构建物。一种构建物APPA-signal/APPA(图3，第3a-7a步)具有来自APPA蛋白质的原始细菌信号序列，其氨基酸序列如下Met-Lys-Ala-Ile-Leu-Ile-Pro-Phe-Leu-Ser-Leu-Leu-Ile-Pro-Leu-Thr-Pro-Gln-Ser-Ala-Phe-Ala我们还修饰了ATG密码子附近的序列，使之类似最佳的哺乳动物Kozak序列(GCC GCC A/GCC ATG G)(Kozak，1987)，但是我们没有诱变第+4位，因为这将会使信号序列中的Lys变成Glu，可能给蛋白质外运带来有害后果。将此优化序列用于我们的先前构建物R15/APPA，并导致高水平产生植酸酶。我们使用PSORT电脑神经网络检查了APPA细菌信号序列，所述PSORT针对真核信号序列，进一步描述见http//psort.nibb.ac.ip8800/(Nakai和Kanehisa，1992)。已认识到APPA细菌信号序列是有效的前导肽，而且正确预测了切割位点。PSORT还预测到植酸酶将正确外运到细胞外的高概率。还有出版物显示，有些细菌信号序列可能在哺乳动物细胞中有效发挥功能(Williamson等人，1984)(Hall等人，1990)。我们使用细胞培养物的实验证明，APPA信号得到正确加工，并将植酸酶外运到细胞外。
使用细胞培养物的实验不能预测外运方向，而且，如果植酸酶外运进入血管而非唾液导管，这可能导致有害影响。这是我们还设计了第二种构建物PSP-signal/APPA(图3，第3b-7b步)的原因，这将保留原始的PSP信号氨基酸序列Met-Phe-Gln-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Val-Leu-Cys-Gly-Leu-Leu-Ile-Gly-Asn-Ser-Glu-Ser该前导肽也由PSORT有效识别正确切割位点(Nakai和Kanehisa，1992)。在该构建物中，我们也保留了ATG起始密码子附近的原始PSP序列，这可能不是最佳的，但是在基因表达的调控中可能是重要的。以我们先前的转基因构建物R15/APPA(如上文所述，具有最佳Kozak序列和残基Ala3、Pro428、和Ala429的经修饰密码子)为模板，通过PCR扩增两种构建物的APPA基因。对于APPA-signal/APPA构建物，使用两种合成引物，它们在ATG密码子附近导入ClaI位点(APPA-CLA)，在TAA终止密码子附近导入KpnI位点(APPA-KPN)。用ClaI和KpnI消化APPAPCR1产物。使用pKS/Lama2作为PCR的模板，将ClaI位点也导入Lama2。LAMA-UP引物定位于ApaI位点上游，LAMA-CLA引物在ATG密码子附近导入ClaI位点(图3，第3a步)。用ClaI和ApaI消化LamaPCR1产物(图3，第4a步)。在三片段连接反应中，将pKS/Lama(Apal-KpnI)、LamaPCR1(ApaI-ClaI)、和APPAPCR1(ClaI-KpnI)联合在一起(图3，第5a步)。用RsrII和SmaI消化回收的pKS/Lama/APPA质粒，并插入回Lama2(图3，第6a步)。
对于PSP-signal/APPA构建物，将合成引物APPA-KPN与合成引物APPA-MATURE一起使用，产生不含信号序列的植酸酶。使用T4 DNA聚合酶对APPAPCR2产物进行末端补平，并用KpnI进行消化。使用LAMA-UP和LAMA-SIGNAL引物产生PSP信号序列(图3，第3b步)。使用T4 DNA聚合酶对LamaPCR2产物进行末端补平，并用ApaI进行消化(图3，第4b步)。在三片段连接反应中，将pKS/Lama(Apal-KpnI)、LamaPCR2(ApaI-平端)、和APPAPCR2(平端-KpnI)联合在一起(图3，第5b步)。用RsrII和SmaI消化回收的pKS/Lama/APPA质粒，并插入回Lama2(图3，第6b步)。
即使成功产生了两种构建物，我们仍然决定将Lama2/APPAsignal/APPA用于产生转基因小鼠，因为我们已经用过先前的转基因构建物R15/APPA和R15/APPA+内含子，证明具有优化Kozak序列和APPA信号肽的植酸酶在诱导后在唾液腺中以高水平合成并有效外运至唾液导管中。用XhoI和NotI消化Lama2/APPA载体，对转基因进行凝胶纯化，并使用Qiagen柱进行进一步纯化(图3，第7a步)。
b)Lama2/APPA构建物的序列在我们的研究之前，GenBank中尚没有报导用于构建Lama2-APPA转基因的Lama2构建物(Laursen和Hjorth，1992)大片段。为了确保我们能够更清晰的描述该转基因构建物，并在产生转基因猪的过程中避免将来自小鼠的有害DNA序列导入猪，我们在Lama2-APPA质粒的两条链上进行测序。图4例示Lama2-APPA质粒的结构。图5例示该质粒的核酸序列(SEQ ID NO1)。使用由Huang(1996；1999)开发的毗邻序列群装配程序(Contig Assembly Program，CAP)(http//hercules.tigem.it/ASSEMBLY/assemble.html)，由交叠DNA序列重建完整转基因序列，然后人工检查测序错误。使用电脑程序RepeatMasker(Smith和Green，http//ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker)，对转基因序列检查散布的重复元件的存在。发现26％的转基因序列包含重复元件(表2)。然而，这些重复元件广泛存在于所有哺乳动物基因组中。例如，多达50％的人类基因组是由重复元件衍生的(Smit，1996；Kazazian，1998)。
图23例示Lama2/APPA转基因构建物的核酸序列(SEQ ID NO7)。
Lama2高水平表达盒(Laursen和Hjorth，1997)包含腮腺中Psp基因的增强子区和启动子。高表达显示依赖-11.5kb与-6.5kb之间和/或+8.3kb与+10.9kb之间的调控元件。Svendsen等人(1998a)显示，-3.1kb与-4.6kb之间的1.5kb序列具有腮腺和舌下腺特异性增强子的特性，称为PSP近端增强子。此外，他们显示，包含PSP启动子和位于-3.6kb与-4.3kb之间的5’侧翼区的转基因包含指导唾液腺特异性表达必需的序列信息。
用RepeatMasker筛选转基因没有揭示任何全长有活性自主元件的存在。存在的重复片段通过插入和删除得到广泛修饰。还利用blastx程序对所有读码框中翻译的转基因序列与国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)蛋白质序列数据库(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)(Altschul等人，1990；Gish和States，1993；Terada和Nakanuma，1993)进行比较。发现了可能编码与几种人和小鼠逆转录酶C端具有有限同源性(38-58％同一性)的部分蛋白质的DNA区(861-2180)。然而，该区域通过多种读码框转换和翻转的突变得到广泛修饰，可能是LINE元件逆转录酶基因的遗迹。它不大可能有活性，因为氨基酸序列中有广泛修饰，只存在完整逆转录酶序列的18％，而且不存在高度保守的氨基酸基序(Y/FXDD)(Xiong和Eickbush，1990)。使用程序GENSCAN(http//CCR-081.mit.edu/GENSCAN.html)(Burge和Karlin，1997)，还对完整序列扫描编码蛋白质的开放读码框(ORF)的存在。只发现了一种基因，它对应于APPA植酸酶基因。GENSCAN出乎意料的预测了与由序列预测的不同的植酸酶N端。然而，那可能是因为GENSCAN检测起始位点的较低精确度所致(Burge和Karlin，1998)。
c)表达组成性唾液植酸酶的转基因小鼠的产生在下面的描述中，根据与阿拉巴马大学的合同，制备了掺入植酸酶基因和组成性启动子的一对建立者小鼠。正如将讨论的，将这些建立者用于产生后代，然后通过PCR分析植酸酶基因的存在，并且对含该基因的动物检验组成性唾液植酸酶生成。
由阿拉巴马大学的NICHD转基因小鼠开发机构(Transgenic MouseDevelopment Facility)收到含植酸酶转基因的2只转基因建立者小鼠(1只黑色雄性和1只白色雌性，3-1)。黑色雄鼠是唾液植酸酶阴性的，而雌鼠3-1展示30U/ml的唾液植酸酶活性。通过黑色雄鼠与4只CD-1雌鼠杂交产生后代，其中25只雌鼠中的9只和26只雄鼠中的13只是PCR阳性的。所有后代都是唾液植酸酶阴性的。将雌鼠建立者3-1与CD-1雄鼠异型杂交产生3窝共35只后代。由这些杂交的后代中获得1只植酸酶阳性G1雄鼠。将G1雄鼠与6只CD-1雌鼠进行异型杂交时，产生6窝后代，其中20/34只雄鼠是PCR阳性且唾液植酸酶阳性的，21/28只雌鼠是PCR阳性和唾液植酸酶阳性的(表3)。相同第一代(G1)雄鼠的不同后代的唾液植酸酶活性范围为1.3-71.2U/ml。雄性和雌性小鼠的植酸酶活性之间没有显著差异。
以APPA-UP2与APPA-KPN为引物，进行PCR测定来鉴定转基因小鼠起始加热步骤，95℃3min；随后是40个循环，95℃30sec，54℃30sec，72℃60sec(图6)。
如上文关于在细胞培养物中表达的R15-PRP/APPA植酸酶所述，进行植酸酶测定。
4)含植酸酶转基因Lama2/APPA的转基因猪的产生使用约克夏猪和约克夏猪/兰德瑞斯猪杂交小母猪作为胚胎供给体、使用约克夏猪大母猪作为接受者，产生转基因猪。所用实验程序与Wall等人(1985)所述相似。下文描述了详细程序。将含APPA信号肽的Lama2/APPA构建物作为转基因用于微注射。用于产生转基因猪的方法学下面是关于用于产生本发明转基因猪的优选方法的描述。然而，对于本领域技术人员是显而易见的，也可以采用多种其它方法。
i)青春期前的小母猪和大母猪的超数排卵通过肌肉内注射2000IU怀孕母马的血清促性腺激素(PMSG，AyerstVeterinary Laboratories)，60-72小时后以相同方式施用700IU人绒毛膜促性腺激素，使选择的70-80kg的约克夏猪或约克夏猪/兰德瑞斯猪杂交小母猪超数排卵。使用来自高育种值约克夏猪公猪的精液对小母猪进行3次人工受精，各间隔16小时。最后一次受精后24小时，宰杀小母猪并回收生殖道。
ii)接受者动情期的同步化如关于供给者大母猪所述，对有经验的接受者大母猪进行动情期同步化。由于目的是同步化而非超数排卵，将激素水平降至500IU PSMG和500IU HCG。PMSG在大母猪断奶那天给予，72小时内给予HCG，并在此后54小时进行胚胎转移手术。
iii)胚胎收集在屠宰场收集生殖道，装入袋中，封口，并浸泡在39℃水中运输至实验室。在维持在32-33℃的实验室中进行胚胎回收和转基因微注射。解剖输卵管，并用装有15ml预热的HBECM-3培养基的注射器和喂食管进行冲洗(Dobrinsky等人，1996)。将培养基收集在100mm培养皿中，并于38.5℃、在含5％(v/v)CO2、5％(v/v)O2、和平衡N2的空气中温育。冲洗所有生殖道后，使用擦净的移液枪由冲洗培养基单个收集胚胎。将胚胎在3ml预热的HBECM-3中漂洗2次，并置于3ml过滤除菌的矿物油封盖下的100μl预热的HBECM-3中直至注射。
iv)原核注射由1头小母猪收集胚胎，置于装在1.5ml离心管中的1ml预热的HBECM-3中，并以14,000xg离心6分钟(Wall等人，1985)。然后收集胚胎，并置于装有40μl预热的HBECM-3、以2.5ml过滤除菌的矿物油封盖的注射盘中。使用以5ng/μl浓度溶于10mM Tris(pH7.5)、0.1mMEDTA的DNA溶液，给每个胚胎中的原核注射3pl Lama2/APPA DNA。注射后，将胚胎置于装有100μl预热的HBECM-3、以3ml过滤除菌的矿物油封盖的盘中。所有胚胎都注射后(由收集生殖道开始不超过4小时)，将胚胎转移至装有1ml预热的HBECM-3的1.8ml冷冻管(Nunc)中，并在38.5℃的保温箱中运输至猪手术室。
v)胚胎转移通过静脉内注射500mg Brietol来麻醉接受者大母猪，并通过吸入3％氟烷及4L/min NO和4L/min氧气来维持麻醉。通过剖腹手术暴露输卵管，就在背中线旁，将装有20-35个经注射胚胎和3-6个未处理胚胎的导管插入漏斗，沿输卵管向下至峡部，排空。将输卵管放回腹腔并缝合切口。
vi)猪的生长一起饲养新生小猪直至断奶。此时，将雄性和雌性分开，并与6头来自其它窝的相似年龄、相同性别的非转基因猪一起关栏。给猪无限制喂以开始食谱至25kg体重，25-60kg体重喂以生长食谱，60kg-上市体重喂以结束食谱。无限制供应水。转基因猪167-02、282-02、和282-04依次维持低植酸盐食谱至85、50、和50日龄，然后换成生长食谱。所有其它转基因猪给予标准高磷食谱。
在断奶期间食物以颗粒状配方提供，生长和结束期显示于表4和表5。食谱中包含的维生素和矿物质混和物显示于表6和表7。PCR分析由新生小猪收集尾部，并将每份的切片置于600μl 50mM NaOH中于95℃加热15分钟。用50μl 1M Tris(pH8.0)中和悬浮液，并通过在微量离心机中离心5分钟来除去不溶性物质。每份取2μl样品用于以APPA-UP2和APPA-KPN为引物的PCR。
如果存在转基因，则引物将产生750bp片段。作为阳性对照，将PIG-BGF和PIG-BGR引物对用于检测来自相同DNA制剂的猪β-珠蛋白基因(Heneine和Switzer，1996)。使用与检测植酸酶转基因的相同条件进行PCR反应。作为阴性对照，将来自非转基因猪的基因组DNA用于PCR反应；对于阳性对照，用已知量的转基因对该DNA进行示踪(1基因拷贝/基因组)。
当通过PCR鉴定到猪167-02的阳性信号后(图3)，生成另一种DNA制剂，并将额外的2对PCR引物(APPA-MATURE与APPA-KPN，APPA-MATURE与APPA-DOWN2)用于检验基因完整性(图4)。
PCR条件与先前所述相似。由血液提取DNA用于PCR分析用于由血液提取DNA的方法基于Higuchi(1989)所述方法，加以一些修改。将100μl全血与200μl裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，0.32M蔗糖，5mM MgCl2，1％(v/v)屈立通X-100，pH7.5)混和，简单混匀，并在冰上保温5分钟。然后将样品以14,000xg离心3分钟，并丢弃上清液。将沉淀悬浮于裂解缓冲液，混匀，保温，并离心。将此程序再重复2次，或直至没有血红蛋白残留。将沉淀在100μl 50mM NaOH中解离，混匀，并于100℃加热10分钟。将内容物冷却，加入10μl 1M Tris-HCl(pH8.5)，并简单混匀。然后将样品以14,000xg离心2分钟，并将2μl上清液用于PCR分析。
总体积40μl的PCR反应混和物组成如下23.8μl蒸馏水，4μl10X Gibco BRL PCR缓冲液，1.2μl 50mM MgCl2，0.8μl 10mM dNTP，8μl中含正向和反向引物各40pmol，2μl模板DNA，和0.2μl Taq DNA聚合酶(Gibco BRL，5U/μl)。如下进行扩增程序起始加热步骤，95℃3min；随后是40个循环，95℃30sec，54℃30sec，72℃60sec。
用APPA基因的引物对(APPA-KPN与APPA-UP2)检测转基因猪；作为对照，将PIG-BGF与PIG-BGR引物对用于检测猪β-珠蛋白基因。由猪收集唾液用于植酸酶测定和猪的称重通过用棉签在舌下擦拭，对断奶的猪进行唾液取样，折去棍，将棉团置于管底有孔的0.4ml微量离心管中，再套上1.5ml微量离心管，并进行离心。使用系了牙线的1.5英寸长的2号牙科棉吸收卷(AshTemple Sundries有限公司，Don Mills，ON)对生长和结束期的猪进行取样。将它们置于管底有孔的1.5ml微量离心管中，再套上更大的管，并进行离心。由大管收集唾液，并保存于-20℃，直至分析。
收集唾液并以一周为间隔对猪称重。植酸酶活性分析直接或用0.1M醋酸盐缓冲液(pH4.5)稀释后测定唾液样品。在200μl 0.1M醋酸钠缓冲液(pH4.5)中以植酸钠(4mM)作为底物于37℃测定植酸酶。温育10分钟后，加入133μl钼酸铵/钒酸铵/硝酸混和物终止反应，并于405nm测定释放的无机磷酸盐浓度(Engelen、van derHeeft、Randsdorp、和Smit，1994)。这个和所有其它测定进行3次。1个单位(U)的酶活性指每分钟释放1μmol无机磷酸盐的酶量。
如先前关于唾液样品所述，进行唾液植酸酶和血液样品中的植酸酶的测定。由样品读数减去加入与所测样品相同浓度的血液的试剂空白。粪便材料的收集和总磷分析在生长和结束期间由每头猪收集新鲜粪便。将样品置于铝盘中并用蜡纸覆盖，立即冻存直至冻干用于分析。冻干后，将样品转移至室内条件过夜，以达到湿度平衡。用臼和杵分开研磨样品直至同质，并封存于塑料容器中直至进一步分析。按照AOAC(官方分析化学家协会(AOAC)，1984)，取1g样品于110℃加热4小时并在称重前在干燥器中冷却，分析样品的干物质含量。为了分析总磷含量，将样品在马弗炉中于550℃进行加热，加入10ml 10M HCl并加热至沸腾。将每份样品的内容物用水定量稀释至250ml，并通过Heinoen和Lahti(1981)的方法测量无机磷含量。由大肠杆菌产生的植酸酶和猪唾液植酸酶的纯化如Jia等人(1998)所述，在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中过度表达APPA植酸酶，并在DEAE-Sepharose和Sephadex-G75上纯化EDTA溶菌酶提取物部分。在DEAE-Sepharose上通过层析法纯化猪植酸酶，并通过pH梯度4.0-7.0的层析聚焦进一步纯化用NaCl梯度洗脱的酶条带。SDS-PAGE分析和银染如Laemmli(1970)所述使用10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶进行凝胶电泳，不同之处是将样品缓冲液中的蛋白质于70℃加热10分钟。如Nesterenko等人(1994)所述对样品进行银染。对APPA编码的大肠杆菌植酸酶具有特异性的单克隆抗体的制备按照Galfrè和Milstein(1981)的方法，制备对大肠杆菌APPA编码的植酸酶具有特异性的单克隆抗体。简而言之，用纯化的APPA酶制剂对2只雌性Balb/c小鼠在59天内进行7次免疫。收获小鼠脾脏，并将其中的细胞与NS-1骨髓瘤细胞系进行融合(Kohler和Milstein，1976)。在含次黄嘌呤、氨基蝶呤、和胸苷的培养基(HAT)中选择融合细胞的生长能力。使用Western印渍和酶联免疫吸收测定(ELISA)鉴定能够向培养基中分泌抗体的那些克隆，该抗体识别大肠杆菌和猪APPA酶上的表位。将分泌期望抗体的克隆亚克隆2次以确保获得分泌抗体的杂交瘤的纯培养物。针对纯化的大肠杆菌来源APPA植酸酶的多克隆抗体的产生在2只新西兰白兔中通过大腿不同位点两次肌肉内注射溶于0.5ml1∶1磷酸盐缓冲液(PBS)与弗氏完全佐剂的混和物中的50μg纯化的大肠杆菌衍生APPA植酸酶来制备抗体。随后在第4、19、25、和39天重复注射溶于1∶1 PBS与弗氏不完全佐剂的混和物中的20μg每种植酸酶。在第42天经心脏穿刺收集血液。将血清与细胞部分分开，并作为抗体来源使用。用于抗体生产的基本程序描述于Harlow和Lane(1988)。Western印渍如Towbin等人(1979)所述进行Western印渍。
按照Roche Molecular Biochemicals的方案，以下列修改，进行猪植酸酶的脱糖基化。通过在50mM Tris(pH8.0)、1mM EDTA、1％SDS、1％2-巯基乙醇中于95℃加热3分钟进行蛋白质变性。然后用氯仿-甲醇法(Wessel和Flugge，1984)沉淀蛋白质，并以100μg/mL重悬于含1％屈立通X-100的20mM磷酸钠(pH7.2)中。使用1U N-糖苷酶F、1.2mU O-糖苷酶、和1mU神经氨酸酶(Boehringer Mannheim GmbH)，将溶于50μL的5μg植酸酶的完全脱糖基化于37℃进行过夜。温育后，取0.5μg蛋白质在SDS凝胶上进行电泳。糖蛋白染色使用DIG聚糖检测试剂盒(Boehringer Mannheim)，按照制造商的指示(O’Shannessy等人，1987)进行染色。关于转基因猪产生的统计关于回收、微注射、并转移到接受者大母猪中的胚胎的统计显示于表8。合计，将4147个经转基因注射的胚胎和675个未处理的胚胎导入了140头接受者大母猪，平均每头接受30个经注射胚胎和5个未注射胚胎。对所有后代，通过PCR分析检验转基因在活组织切片中、在血液中的存在情况，并进行唾液中植酸酶活性的测定。
表9列出了产生的转基因猪、它们的出生日期、性别、和唾液植酸酶水平。在来自微注射胚胎的203头存活小猪中，有31头转入了植酸酶基因。这是使用标准引物组APPA-UP2与APPA-KPN检测到基因在血液样品中的存在，但是使用标准引物组进行尾部DNA制剂分析只检测到14头。当使用引物组LAMA-UP1与APPA-DOWN4(图8)重新分析阴性样品时，又发现8份尾部DNA样品是阳性的。尾部活组织切片DNA的纯化可能将导致所有样品对于植酸酶转基因都是PCR阳性的。转基因猪167-02中的植酸酶转基因的特征通过对167号窝的分析例示了PCR检测转基因猪的应用。其中检验了7头小猪，包括1头死产的和1头出生后被大母猪压死的，称为167-02的1头存活小猪经鉴定是APPA基因阳性的，由它的尾部染色体DNA产生了大约750bp的PCR产物(2道)(图7)。根据使用指向APPA基因3’区(2道)、完整基因(3道)和5’区(4道)的引物的PCR，均得到阳性结果，而没有检测到APP基因重排(图8)。转基因和非转基因同栏猪生长过程中的唾液植酸酶和增重关于5头转基因猪的唾液植酸酶活性和增重及其非转基因同栏猪的增重的数据显示于图9、10、11、12、和13。唾液中的植酸酶活性随取样时间有本质上的变化。这种易变性要归咎于环境因素的组合，包括动物是否刚刚进食或饮水、以及与进食或饮水有关的腮腺调控和唾液分泌。5头转基因猪在生长过程中的增重在正常的非转基因猪的增重范围内。
除167-02外，转基因猪的生长速率与非转基因同窝相似。来自转基因和非转基因猪的粪便材料中的磷含量来自接受断奶、生长、或结束食谱的3头转基因建立者猪、167-02、282-02、282-04、405-02、和421-06的新鲜粪便样品的磷含量显示于表9。转基因猪的粪便磷含量的范围为1.59-2.26％，而非转基因同栏猪的范围为1.61-2.76％。粪便磷含量的降低范围由最大的26％至最小的8％。在大多数情况中，差异达到99％的显著性水平。粪便取样时猪的年龄和相应的植酸酶活性显示于图9、10、11、12、和13。喂给的食谱包含易获得的、适用于使非转基因猪的生长最大化的磷补充。由于在接受高矿物磷食谱的转基因猪中测量到粪便磷的降低，所以如果食谱缺乏矿物磷，那么很有可能粪便磷将有实质性的降低。在这些条件下，由植酸盐释放的磷将占饮食磷的大部分，而很小部分会到达大肠并在粪便中排泄。植酸酶转基因的遗传(待续)当将来自转基因公猪167-02的精液用于使约克夏猪小母猪受精时，在所有4头大母猪产下的几窝小猪中，8只中的4只、9只中的2只、8只中的7只、和5只中的2只转入了植酸酶基因(表11)。证明转基因存在的154号窝的PCR数据显示于
图14。所有包含该基因的猪都在唾液中展示植酸酶活性，范围为341-10,077U/ml。一半转基因小猪的唾液植酸酶活性超过2000U/ml。唾液中植酸酶的比活范围由39U/mg蛋白质至高达706U/mg蛋白质。
该数据证明基因发生了转移而且在建立者中观察到的植酸酶表达水平在第一代猪中得到保留。11日龄的雄性和雌性猪都展示高植酸酶活性。在猪唾液腺中合成的植酸酶的特征将来自大肠杆菌和来自由转基因猪167-02收集的唾液的植酸酶纯化至同质。纯化的酶在SDS-PAGE后的银染显示于
图15。由大肠杆菌衍生的酶的分子量为大约45kDa，而由猪产生的为大约55kDa。还象以前对酶进行电泳，转移至硝酸纤维素，并对糖蛋白进行染色。
图15的第二部分显示猪APPA蛋白质是糖基化的。
图15B显示用脱糖基化酶对猪植酸酶进行处理可将植酸酶由60kDa变成45kDa，这一结果证实了猪唾液中产生的重组植酸酶为糖基化形式。
图16的数据显示猪植酸酶与大肠杆菌酶是同源的，尽管它们的大小不同。
纯化的猪植酸酶的Km和Vmax值依次为0.33mM和624U/mg蛋白质。Golovan等人(2000)先前报导了大肠杆菌酶的Km和Vmax为0.63mM和2325U/mg蛋白质。由此唾液植酸酶展示大肠杆菌酶的大约25％的活性。该活性降低可能是因会修饰酶催化位点或导致低催化活性酶形成的糖基化所致。
关于糖基化蛋白质生成的后一种发现提出了使用转基因动物生成这些蛋白质的方法。目前，虽然重组方法可以用于在宿主细胞中生成蛋白质，但是常常发现成熟肽缺乏通常与更高生命形式产生的蛋白质有关的糖基化。胰岛素是这种蛋白质的范例。这项研究的发现提出，生成期望糖蛋白的一种方法是通过已知方法或上文所述方法用编码期望蛋白质的基因产生经转化的转基因动物(诸如猪)。当由这种动物表达时，将产生目标蛋白质，并将在细胞中经历翻译后加工，包括糖基化步骤。由此，本发明涵盖经在动物唾液中表达并分离来生成糖基化蛋白质的常用方法，其中所述动物用编码这种蛋白质的基因进行了转化，且该基因可操作连接唾液蛋白启动子或增强子。
用于由猪腮腺收集糖蛋白用于各种应用的各种方法在本领域是已知的。例如，Denny等人(1972)发表了用于由腮腺和下颌下唾液导管收集分泌物的手术技术。用于检测猪中APPA植酸酶蛋白质的检验试剂盒针对大肠杆菌表达的APPA植酸酶产生的单克隆抗体与转基因小鼠和猪唾液中产生的APPA植酸酶可以发生反应(
图17)。唾液中植酸酶的免疫学检测提供了在转基因猪唾液中分泌的植酸酶是在猪唾液腺中表达的APPA基因的产物的权威性证据。这是证明转基因猪中植酸酶生成的可靠方法。
使用上文讨论的多克隆抗体也可以获得进一步的检验。
可以由多种来源获得编码植酸酶的DNA序列，诸如细菌、植物、或动物来源。优选由微生物来源获得DNA序列，诸如细菌。最优选的DNA序列是由大肠杆菌获得的。
可以使用各种方法实现编码植酸酶蛋白质的基因或cDNA的克隆。一种方法是纯化植酸酶蛋白质，随后测定N端和几个内部氨基酸序列，并使用基于氨基酸序列的寡核苷酸探针筛选产生植酸酶的生物体的基因组或cDNA文库。如果已知至少部分基因序列，该信息可以用于通过例如聚合酶链式反应(PCR)来克隆相应cDNA(《PCR技术DNA扩增的原理和应用》(PCR TechnologyPrinciples and Applications forDNA Amplification)，1989，H.A.Ehrlich编，Stockton出版社，纽约；此处收入该书内容作为参考)。对于本领域技术人员而言是显然的，上文所述克隆的植酸酶基因可用于致力于由其它微生物分离植酸酶编码基因的异源杂交实验。
如下文详细讨论的，可以在正确的读码框中，融合编码植酸酶或其个别片段或经修饰蛋白质的DNA与适当的调控信号，而产生遗传构建物，然后按照传统方法，通过例如在细菌(如大肠杆菌)质粒载体中的制备来进行扩增。这些方法描述于例如Sambrook等人，《分子克隆实验室手册》(Molecular CloningA Laboratory Manual)(冷泉港出版社，1989)，此处收入该书内容作为参考。此后由载体切下经扩增的构建物，并纯化用于产生转基因动物。
也可以以包含另一种蛋白质的融合蛋白来生成期望蛋白质。例如，可以以较大重组蛋白的一部分来生成本发明期望的重组蛋白使得期望蛋白质稳定。在本文中有用的修饰包括(但不限于)改变翻译后修饰、大小、或活性位点的修饰，或者将该蛋白质或其部分与另一种蛋白质融合的修饰。可以通过本领域众所周知的技术将这些修饰导入蛋白质，诸如通过连接交叠的寡核苷酸，或通过例如寡核苷酸介导的诱变将突变导入克隆的基因，来合成经修饰基因。
克隆的植酸酶基因可以作为起始材料用于构建改进的植酸酶。改进的植酸酶是通过诱变技术(如定点诱变或定向进化)发生改变使得其特性与野生型植酸酶不同的植酸酶(Kuchner和Arnold，1997)。例如，可以改变最佳温度或pH、比活、温度或蛋白酶耐受性，使得更适用于特定应用。
可以根据植酸酶的生物物理学和生物化学特性，在本发明中选择进行细胞区室内表达(诸如细胞溶质、内质网)或细胞外表达。这些特性包括(但不限于)对pH的敏感性、对蛋白酶的敏感性、和对优选区室离子强度的敏感性。对编码感兴趣酶的DNA序列的修饰应当使得酶能够在细胞内的期望定位发挥其作用。为了实现植酸酶的细胞外表达，本发明的表达构建物利用了细菌信号序列。虽然优选与动物宿主物种同源的(天然的)信号序列，但是也可以使用异源信号序列，即由其它动物物种或微生物来源起源的信号序列。这些信号序列对于本领域技术人员而言是已知的。
如果想要，可以使用本领域技术人员已知的方法对本发明有关DNA构建物的所有部分(启动子、调控、分泌、稳定、靶向、或终止序列)进行修饰，来影响其控制特征。在本发明中有用的顺式作用调控区包括驱动植酸酶基因表达的启动子。高度优选在唾液腺细胞中特异性有活性的启动子。在这些启动子中，高度优选小鼠腮腺分泌蛋白(PSP)启动子、大鼠脯氨酸富含蛋白(PRP)启动子、人唾液淀粉酶启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子(Samuelson，1996)。在调控转录的有用序列中，除了上文讨论的启动子，还有增强子、剪接信号、转录终止信号、和多聚腺苷酸化位点。在这方面特别有用的是增加植酸酶基因在下文所列转基因动物唾液腺或其它细胞中的转录效率的序列。优选用于在唾液腺细胞中高度表达的蛋白质的转录调控序列。可以导入内含子来增加表达水平。这些内含子包括合成内含子SIS、SV40小t抗原内含子、及其它(Whitelaw等人，1991；Petitclerc等人，1995)。
本发明的表达系统或构建物还优选在编码用于调控的期望重组蛋白或唾液蛋白基因的DNA序列下游包括3’非翻译区。该区显然稳定了表达系统的RNA转录物，并由此增加期望蛋白质的产量。在这方面有用的3’非翻译区是提供polyA信号的序列。这些序列可以由如SV40小t抗原晚期多聚腺苷酸化信号、合成多聚腺苷酸化信号、或本领域众所周知的其它3’非翻译序列衍生(Carswell和Alwine，1989；Levitt等人，1989)。3’非翻译区优选由唾液特异性蛋白质衍生。对该区polyA转录本的稳定效果在稳定表达序列的mRNA中是重要的。而且，加入基因座控制区(LCR)、基质吸附区(MAR)、和骨架吸附区(SAR)将能够使包含同源或异源启动子的转基因进行不依赖位置而依赖拷贝数的表达(Taboit-Dameron等人，1999；Geyer，1997)。活泼表达基因与转基因的共整合也显示可增加低表达转基因的表达水平(CLark等人，1993)。在增加植酸酶表达效率中同样重要的是强翻译起始位点(Kozak，1987)。同样的，调控植酸酶翻译后修饰的序列可以用于本发明。
如此处所用，术语“动物”指除了人之外的所有动物。它还包括处于所有发育阶段的动物个体，包括胚胎和胎儿。
“转基因”动物指含有携带某种遗传信息的细胞的任何动物，所述遗传信息直接或间接的通过在亚细胞水平进行遗传操作而接受，诸如通过微注射或感染重组病毒。在本文的内容中，“转基因”不包括传统的杂交育种或体外授精，但是包含其中一个或多个细胞接受了重组DNA分子的动物。虽然高度优选这种分子整合到动物染色体中，本发明仍然涵盖染色体外复制DNA序列的使用，诸如可以通过基因工程进入酵母人工染色体。将要导入动物的信息对于接受者所属的动物物种而言可以是外来的(即“外源”)，或者这种信息可以只对于特定的个别接受者而言是外来的，或者接受者早就具有这种遗传信息。在最后一种情况中，导入的基因可以以与天然基因不同的方式表达。
正如上文指出的，本发明的转基因动物是除了人之外的动物。本发明的范围包括农畜(猪、山羊、绵羊、牛、马、兔、等等)、啮齿类动物(诸如小鼠和大鼠)、家庭宠物(如猫和狗)、鱼、和家禽(如鸡)。高度优选如此产生本发明的转基因动物将编码植酸酶或其片段或经修饰产物的适当多核苷酸导入单细胞胚胎，使得这些多核苷酸稳定整合到成熟动物种系细胞DNA中，并以常规的孟德尔方式遗传。胚胎显微操作技术的进展使得现在能够将异源DNA导入哺乳动物受精卵中。例如，可以通过微注射、磷酸钙介导的沉淀、脂质体融合、逆转录病毒感染、或其它方法来转化全能性或多能性干细胞，然后将经转化细胞导入胚胎，并将胚胎发育成转基因动物。在一种优选方法中，用包含期望DNA的逆转录病毒感染发育中的胚胎，并由受感染胚胎产生转基因动物。然而，在最优选的方法中，将适当DNA共转染进入胚胎(优选单细胞阶段)的原核或胞质，并使得胚胎发育成成熟的转基因动物。这些技术是众所周知的，参阅用于将异源DNA微注射进入哺乳动物受精卵的标准实验室程序的综述，包括Hogan等人，《小鼠胚胎操作》(Manipulating The Mouse Embryo)，冷泉港出版社，1986；Krimpenfort等人，生物/技术(Bio/Technology)9844，1991；Palmiter等人，细胞(Cell)41343，1985；Kraemer等人，《哺乳动物早期胚胎的遗传操作》(Genetic Manipulation On The EarlyMammalian Embryo)，冷泉港实验室出版社，1985；Hammer等人，自然(Nature)315680，1985；Wagner等人，美国专利号5,175,385；Krimpenfort等人，美国专利号5,175,384，此处收入各自内容作为参考。
对于本领域技术人员，也是显而易见的，本发明可以用于其它蛋白质在猪唾液腺中表达。这些蛋白质可以分泌到唾液中以改进消化并降低污染可能性(例如葡聚糖内切酶)，或者特异性靶向分泌到血液中并影响动物的生长和健康(诸如生长激素)。
可以通过大量的测定法来测量植酸酶活性，其选择对于本发明而言不是决定性的。例如，可以通过ELISA测定、Western印渍、或使用量热技术或凝胶测定系统的直接酶测定来检验转基因动物组织的植酸酶活性。
提供了此处包括的范例是为了给本领域普通技术人员提供关于如何生成并使用本发明的完整公开书和描述，而非意欲限制发明人对其发明看法的范围。已经进行了努力来确保所用数目(如数量、温度、pH、等等)的精确性，但是应当考虑到有些实验误差和偏差。除非特别指明，温度以摄氏温度表示，压力处于或近乎大气压。
虽然通过某些特定实施方案已经描述了本发明，其各种修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的，且不偏离此处所附描述的本发明的精神和范围。表1.含R15-PRP/APPA转基因的转基因小鼠和非转基因小鼠唾液中用异丙肾上腺素和匹鲁卡品诱导的植酸酶分泌。建立者 小鼠PCR 性别 世代 转基因 植酸酶活性μmol/min/mlA0m 4bfr(+) 阳性 F 1APPA+内含子39.73A0m 2brm(+) 阳性 M 1APPA+内含子24.29A0m 2brm(+) 阳性 M 2APPA+内含子14.42A0m 5brf(+) 阳性 F 2APPA+内含子 7.36A0m 1brm(-) 阴性 M 1APPA+内含子 0.00A1f 9brf(+) 阳性 F 1APPA+内含子 0.08A1f 11wf(+) 阳性 F 1APPA+内含子 0.07A1f 5brm(+) 阳性 M 1APPA+内含子 0.03A1f 10wf(-) 阴性 F 1APPA+内含子 0.02A20f1brm(+) 阳性 M 1APPA+内含子 0.53A20f5brf(+) 阳性 F 1APPA+内含子 0.12A20f4brf(-) 阴性 F 1APPA+内含子 0.03A2m 13wf(+) 阳性 F 1APPA+内含子87.70B0m 5brf(+) 阳性 F 1APPA+内含子 0.95B0m 3brm(+) 阳性 M 1APPA+内含子 0.73B0m 6wf(-) 阴性 F 1APPA+内含子 0.00B0f 3wf(+) 阳性 F 2APPA 252.43B0m-intr9wf(+) 阳性 F 1APPA 546.74W0m 8wf(+) 阳性 F 1APPA 60.42W30m1wm(+) 阳性 M 2APPA 41.91W30m11wf(+) 阳性 F 1APPA 43.44W30m4wm(-) 阴性 M 1APPA0.02W30m10wf(-) 阴性 F 1APPA0.02表2.在Lama2-APPA构建物中发现的重复序列。
表3.来自使用构建物Lama2-APPA产生的雌性建立者3-1的G2小鼠的唾液植酸酶活性。小鼠介于21-30日龄之间。
表4.给予5-10kg刚断奶的猪的II期开始食谱和低植酸盐开始食谱的组成和营养水平。
1矿物质和维生素达到或超过NRC推荐的水平(1998)。
表5.生长和结束食谱的组成和营养水平。
1矿物质和维生素达到或超过NRC推荐的水平(1998)。
表6.维生素预混物的组成1营养 每5kg预混物中的含量小麦中间产品 3.867kg维生素A 10×106IU维生素D 1×106IU维生素E 40×103IU甲萘醌(维生素K3) 2.5g泛酸 15g核黄素 5g叶酸 2g烟酸 25g硫胺(维生素B1) 1.5g吡哆醇(维生素B6) 1.5g维生素B1225mg生物素 200mg胆碱 500mg1来自Hoffman-LaRoche有限公司，邮政信箱877，剑桥，0N.N1R5X9.表7.矿物质预混物的组成1.2矿物质成分 量(％)石灰石 43.3硫酸铜(25％) 6.0硫酸亚铁(30％) 33.4氧化锌(72％) 13.9氧化锰(56％) 3.41矿物质预混物在Arkell制备。2磷酸二钙含18.5％钙和20.5％磷酸，通常向猪生长食谱中加入1.2％，向结束食谱中加入1.0％，向哺乳大母猪食谱中加入1.5％。表8.关于胚胎回收和将含转基因胚胎导入接受者大母猪的统计。处理 数目用于胚胎回收的小母猪约克夏猪 279约克夏猪x兰德瑞斯猪杂交猪 168杜洛克猪 12合计 459接受者大母猪174转移至接受者的胚胎用转基因微注射的胚胎 4147未注射载体胚胎 675合计 4543胚胎转移的总数 1401所用大母猪产潜在的转基因猪多达三次。用来自高育种值公猪的精液对大母猪进行受精。表9.通过使用Lama2-APPA转基因微注射单细胞受精卵而产生的含唾液植酸酶基因的转基因猪。猪的ID#1出生日期转基因的存在2性别 唾液植酸酶 受精卵来源4尾/血液 (U/ml)3167-02 99年4月14日 +/+ 公猪6,000 约克夏猪282-02 99年6月14日 +/+ 公猪618 约克夏猪282-04 99年6月14日 +/+ 公猪1,349 约克夏猪405-02 99年8月14日 +/+ 小母猪 339 约克猪/兰德瑞斯猪421-02 99年8月24日 -/+ 小母猪 0.8 约克猪/兰德瑞斯猪421-04 99年8月24日 -/+ 小母猪 2.2 约克猪/兰德瑞斯猪421-06 99年8月24日 +/+ 公猪97约克猪/兰德瑞斯猪448-01 99年9月3日+/+ 小母猪 0 约克猪/兰德瑞斯猪491-01 99年9月25日 +/+ 小母猪 2.3 约克猪/兰德瑞斯猪491-02 99年9月25日 +/+ 小母猪 0 约克猪/兰德瑞斯猪491-03 99年9月25日 +/+ 小母猪 0.3 约克猪/兰德瑞斯猪491-05 99年9月25日 +/+ 公猪0 约克猪/兰德瑞斯猪496-05 99年9月26日 +/+ 公猪0 约克猪/兰德瑞斯猪500-03 99年9月28日 +/+ 公猪136 约克猪/兰德瑞斯猪510-01 99年9月28日 +/+ 公猪0.2 约克猪/559-05 99年11月1日 +*/+ 公猪＞418 约克猪/兰德瑞斯猪560-04 99年11月2日 +*/+ 公猪5 约克夏猪594-03 99年11月18日 +/+ 小母猪 2.3 约克夏猪613-02 99年11月27日 -/+ 小母猪 0.5 约克猪/兰德瑞斯猪613-03 99年11月27日 -/+ 小母猪 0.3 约克猪/兰德瑞斯猪647-01 99年12月13日 -/+ 小母猪 0.5 约克猪/兰德瑞斯猪647-03 99年12月13日 +*/+ 小母猪 16.3 约克猪/兰德瑞斯猪647-04 99年12月13日 -*/+ 小母猪 0.5 约克猪/兰德瑞斯猪647-08 99年12月13日 -*/+ 公猪0.4 约克猪/兰德瑞斯猪647-09 99年12月13日 +*/+ 公猪1.92 约克猪/兰德瑞斯猪668-01 99年12月17日 +*/+ 小母猪 489 约克夏猪671-02 99年12月19日 +*/+ 公猪6.9 约克猪/兰德瑞斯猪671-04 99年12月19日 +*/+ 公猪325 约克猪/兰德瑞斯猪675-03 99年12月21日 -*/+ 小母猪 2.1 约克猪/兰德瑞斯猪675-04 99年12月21日 +*/+ 公猪 42.6 约克猪/兰德瑞斯猪675-06 99年12月21日 -*/+ 公猪5.0 约克猪/兰德瑞斯猪1破折号前面的数目代表窝的编号，破折号后面的数目代表窝内猪的编号。2所有PCR测定使用引物APPA-up2-APPA-Kpn进行。用星号指示的测定使用引物对给出了阴性结果。然而，这些样品使用引物组APPA-d4-Lama-up1给出了阳性结果。样品613-02和613-03使用后一种引物组是阴性的。3在小猪出生后2-4天采集唾液样品并测定植酸酶。4由超数排卵的约克夏猪或约克夏猪-兰德瑞斯猪杂交小母猪收集用于微注射的受精卵。表10.由产生唾液植酸酶的猪和非转基因同栏猪1收集的粪便的磷含量。对数据进行T检验分析，下文记录了数据。
表11.通过杂交植酸酶阳性公猪167-02与非转基因约克夏猪小母猪获得的第一代(G1)转基因后代的植酸酶活性1。
表12.用于构建和检测转基因构建物的引物。
1为Lama2/APPA序列显示的引物定位。APPA的起始和终止密码子以粗体字母表示，翻译最佳起始序列以斜体表示，限制性酶的限制性位点标有下划线。
参考文献表本发明中提及了下列参考文献。此处收入这些参考文献的内容作为参考。
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序列表<110>Guelph大学Cecil W.ForsbergSergeui GolovanJohn P.Phillips<120>表达唾液蛋白的转基因动物<130>U Guelph-03<140><141><150>60/130,508<151>1999-04-23<160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20623<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述Lama2/APPA质粒<400>1tcgagagtat ctttgtcagc tgtgcctcca acaaaggggt actgttgccc acatagaaag 60atctaaacta attaattaat ccctcacccg caaatctttc agtcactaag ttagcacgat 120tgttgaacaa gttctccaaa ggagagatac agatgagtgc gtatagggtg gacctggctg 180ctgaggagac acctgcatct gactaagaag agccacggtg ttagttgaat ggtgtggagt 240agggtggttc tgtgggacag tagaaaatcg agaggcatgt gccgtttagt gaactgatgg 300aagctacccc aaacgacaga gattgtcagt caggccaatc cgtttcgagt ttgatgggca 360gccggacagt gagacagaca cacctactca gttggaggaa ggatgagaac aatggccagc 420agggattgag agaccctgac aggcgcaagg ccctaacaca cacacctacc acctcacttg 480acaaagctgc caaagaccaa agacttgttc tccattagaa atgacagctg gcttgacccg 540acagcataat aagcagagtg tactctgatt ggagaacttt aatgtgtttc attcagtatt 600ataaaaggac agtattacag attttgttgt acactgctgt tacatgtggg gcagtgtgtc 660tttaagtagg 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1.体细胞和/或生殖细胞基因组中携带包含异源转基因构建物的核酸序列的转基因非人动物，所述构建物包含编码蛋白质的转基因，所述转基因可操作连接用于在唾液腺中特异性表达所述蛋白质的第一种调控序列。
2.权利要求1的动物，其中所述第一种调控序列包含唾液蛋白启动子/增强子序列，由此，所述动物在其唾液中表达所述蛋白质。
3.权利要求1的动物，其中所述动物是哺乳动物。
4.权利要求3的动物，其中所述动物选自猪、山羊、绵羊、牛、马、兔、啮齿类动物、猫、和狗，还有鱼和家禽。
5.权利要求1的动物，其中所述唾液蛋白启动子/增强子序列包含腮腺分泌蛋白(PSP)启动子/增强子、富含脯氨酸蛋白(PRP)启动子/增强子、或唾液淀粉酶启动子/增强子。
6.权利要求5的动物，其中所述启动子/增强子是腮腺分泌蛋白(PSP)启动子/增强子。
7.权利要求6的动物，其中所述腮腺分泌蛋白(PSP)启动子/增强子是由小鼠衍生的。
8.权利要求5的动物，其中所述启动子/增强子是脯氨酸富含蛋白(PRP)启动子/增强子。
9.权利要求8的动物，其中所述脯氨酸富含蛋白(PRP)启动子/增强子是由大鼠衍生的。
10.权利要求1的动物，其中所述转基因还可操作连接一种或多种第二种调控序列，包含增强子、转录调控序列、终止序列、和多聚腺苷酸化位点。
11.权利要求1的动物，其中所述转基因包含编码具有植酸酶活性蛋白质的基因。
12.权利要求1的动物，其中所述转基因编码植酸酶或其同源物。
13.权利要求1的动物，其中所述动物是猪，所述转基因包含编码具有植酸酶活性的蛋白质的基因，所述第一种调控序列包含腮腺分泌蛋白(PSP)启动子/增强子或脯氨酸富含蛋白(PRP)启动子/增强子。
14.权利要求1的动物，其中所述转基因构建物包含SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、或SEQ ID NO7的核酸序列。
15.体细胞和/或生殖细胞基因组携带包含异源转基因构建物的核酸序列的转基因非人动物，所述构建物包含编码植酸酶或其同源物的转基因。
16.权利要求15的动物，其中所述转基因可操作连接用于在唾液腺中特异性表达所述植酸酶的第一种调控序列。
17.权利要求16的动物，其中所述第一种调控序列包含腮腺分泌蛋白(PSP)启动子/增强子、脯氨酸富含蛋白(PRP)启动子/增强子、或唾液淀粉酶启动子/增强子。
18.权利要求17的动物，其中所述动物是哺乳动物。
19.权利要求18的动物，其中所述植酸酶或其同源物在所述动物的唾液或胃肠道中表达。
20.权利要求15的动物，其中所述转基因构建物包含SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、或SEQ ID NO7的核酸序列。
21.用于表达蛋白质的方法，该方法包括下列步骤a)将转基因构建物导入非人动物胚胎，使得由所述胚胎发育而成的非人转基因动物具有包含所述转基因构建物的基因组，其中所述转基因构建物包含i)编码所述蛋白质的转基因，和ii)至少一种用于在胃肠道中特异性表达所述蛋白质的调控序列，b)将所述胚胎转移至雌性代孕者；并c)将所述胚胎发育成所述转基因动物，其中所述转基因在所述动物的胃肠道中产生。
22.权利要求21的方法，其中所述调控序列提供所述蛋白质的唾液腺或胰腺特异性表达。
23.权利要求21的方法，其中所述调控序列提供所述蛋白质的唾液腺特异性表达。
24.权利要求23的方法，其中所述唾液腺是腮腺、颌下腺、或下颌下腺。
25.权利要求23的方法，其中所述转基因在所述动物的唾液中表达。
26.权利要求21的方法，其中所述转基因是异源的。
27.权利要求21的方法，其中所述至少一种调控序列包含唾液蛋白启动子/增强子序列。
28.权利要求21的方法，其中所述蛋白质是糖蛋白。
29.适于经权利要求21的方法表达蛋白质的转基因动物或其后代。
30.权利要求21的方法，其中所述蛋白质是植酸酶或其同源物。
31.权利要求21的方法，其中所述转基因构建物包含SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、或SEQ ID NO7的核酸序列。
32.用于生产蛋白质的方法，包括下列步骤a)由非人转基因动物获得含所述蛋白质的唾液，所述动物在其基因组中包含转基因构建物，所述转基因构建物包含i)编码所述蛋白质的转基因，和ii)至少一种用于在唾液腺中特异性表达所述蛋白质的调控序列，并b)由所述唾液提取该蛋白质。
33.权利要求32的方法，其中所述转基因是异源的。
34.权利要求32的方法，其中所述至少一种调控序列包含唾液蛋白启动子/增强子序列。
35.权利要求32的方法，其中所述蛋白质是糖蛋白。
36.权利要求32的方法，其中所述转基因构建物包含SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、或SEQ ID NO7的核酸序列。
37.权利要求32的方法，其中所述蛋白质是植酸酶或其同源物。
38.权利要求32的过程，其中所述唾液腺是腮腺、颌下腺、或下颌下腺。
39.用于在非人动物中表达植酸酶或其同源物的方法，所述方法包括a)构建包含转基因构建物的核酸序列，其中所述转基因构建物包含i)编码所述植酸酶或其同源物的转基因，和ii)至少一种用于在胃肠道中特异性表达所述蛋白质的调控序列，并b)用所述核酸序列转染动物，由此，所述动物在其体细胞和/或生殖细胞基因组中携带所述转基因构建物，所述动物在其胃肠道中表达所述植酸酶或其同源物。
40.权利要求39的方法，其中所述转基因构建物导致在唾液腺或胰腺中特异性表达所述植酸酶或其同源物。
41.权利要求40的方法，其中所述调控序列提供所述植酸酶或其同源物的唾液腺特异性表达。
42.权利要求41的方法，其中所述唾液腺是腮腺、颌下腺、或下颌下腺。
43.权利要求41的方法，其中所述植酸酶或其同源物在所述动物的唾液中表达。
44.权利要求41的方法，其中所述转基因构建物包含SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、或SEQ ID NO7的核酸序列。
45.权利要求39的方法，其中所述核酸序列以转基因构建物的形式导入所述动物。
46.权利要求45的方法，其中所述转基因构建物是核酸分子。
47.权利要求46的方法，其中所述质粒包含SEQ ID NO3、SEQ IDNO5、SEQ ID NO7、或SEQ ID NO6的核酸序列。
48.权利要求39的方法，其中所述动物选自猪、山羊、绵羊、牛、马、兔、啮齿类动物、猫、狗、鱼、和家禽。
49.权利要求48的方法，其中所述动物包括小鼠或猪。
50.一种核酸分子，其包含含有编码蛋白质的基因的核酸序列，所述基因可操作连接至少一种用于在胃肠道中特异性表达所述蛋白质的调控序列。
51.权利要求50的分子，其中所述至少一种调控序列包含唾液蛋白启动子/增强子序列，由此在唾液腺中特异性表达所述蛋白质。
52.权利要求51的分子，其中所述唾液蛋白启动子/增强子序列包含腮腺分泌蛋白(PSP)启动子/增强子、脯氨酸富含蛋白(PRP)启动子/增强子、唾液淀粉酶启动子/增强子、或SV40启动子/增强子。
53.权利要求51的分子，其中所述蛋白质包括植酸酶或其同源物。
54.权利要求53的分子，其中所述分子是转基因构建物。
55.权利要求54的分子，其中所述分子是核酸分子。
56.权利要求55的分子，其中所述分子包含SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO4、或SEQ ID NO6的核酸序列。
57.权利要求53的分子，其中所述分子包含SEQ ID NO3、SEQ IDNO5、或SEQ ID NO7的核酸序列。
58.对由SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、或SEQ ID NO7的核酸序列表达的蛋白质具有特异性的抗体。
59.权利要求58的抗体，其中所述抗体是单克隆的。
60.权利要求58的抗体，其中所述抗体是多克隆的。
61.分泌权利要求59的抗体的杂交瘤。
62.用权利要求50的分子转染的宿主细胞。
63.用权利要求56的分子转染的宿主细胞。
64.用权利要求57的分子转染的宿主细胞。
65.权利要求63的宿主细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
66.权利要求64的宿主细胞，其中所述细胞是动物细胞。
67.用于免疫学检测由SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、或SEQ IDNO7的核酸序列表达的蛋白质的诊断试剂盒，该试剂盒包含对所述蛋白质具有特异性的抗体。
68.权利要求67的试剂盒，其中所述抗体是单克隆的。
69.权利要求56的试剂盒，其中所述抗体是多克隆的。
全文摘要
本发明提供了基因组中包含用于蛋白质胃肠道特异性表达的转基因构建物的转基因动物。在优选的实施方案中,该蛋白质是植酸酶或其同源物。这些蛋白质可以是异源的,而且通过可操作连接编码该蛋白质的核酸序列与包括唾液腺蛋白质启动子/增强子的调控序列,可以在动物唾液腺中特异性表达。本发明还提供了使用这些核酸构建物来表达和生产蛋白质的方法。此外,本发明还提供了对这些蛋白质特异的抗体和免疫学诊断试剂盒。
文档编号C12N15/85GK1368843SQ00807871
公开日2002年9月11日 申请日期2000年4月20日 优先权日1999年4月23日
发明者C·W·福斯博格, S·格罗万, J·P·菲利浦 申请人:圭尔夫大学