专利名称：葡萄糖脱氢酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及以吡咯并-喹啉醌作为辅酶的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)的制备及其在葡萄糖检测方面的用途。
因此，本发明的一个目的是提供一种对葡萄糖的亲合力增强了的修饰水溶性PQQGDH。本发明的另一个目的是提供一种对葡萄糖具有高度选择性的修饰水溶性PQQGDH以便提高检测血糖浓度的灵敏度。
本发明的公开我们发现对葡萄糖具有高度亲合力的PQQGDHs有利于作为以往葡萄糖酶促测定中使用的酶的新型酶替代物。
PQQGDHs是以吡咯并-喹啉醌作为辅酶的葡萄糖脱氢酶，其催化葡萄糖被氧化生成葡糖酸内酯的反应。
已知PQQGDHs包括膜-结合酶和水溶性酶。膜-结合PQQGDHs是分子量大约为87kDa的单肽蛋白并且被发现普遍存在于革兰氏阴性菌中。例如，参见AM.Cleton-Jansen等，J.Bacteriol.(1990)172，6308-6315。另一方面，已鉴定出乙酸钙不动杆菌的几个菌株中含有水溶性PQQGDHs(Biosci.Biotech.Biochem.(1995)，59(8)，1548-1555)，并且克隆了表达这些水溶性G6PDHs的氨基酸序列的结构基因(Mol.Gen.Genet.(1989)，217430-436)。源于乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDHs是一种分子量大约为50kDa的同型二聚体。它与其它PQQ酶在蛋白质的初级结构上几乎不具有同源性。
近来，据报导该酶的X-射线晶体结构分析结果表明该酶的高级结构含有活性中心(J.Mol.Biol.，289，319-333(1999)，源于乙酸钙不动杆菌的脱辅基形式的可溶性醌蛋白葡萄糖脱氢酶的晶体结构显示了一个新型的内保守序列重复；A.Oubrie等，EMBO Journal，18(19)5187-5194(1999)，可溶性醌蛋白葡萄糖脱氢酶的结构和机理；A.Oubrie等，PNAS，96(21)，11787-11791(1999)，与甲肼络合的可溶性醌蛋白葡萄糖脱氢酶的活性-位点结构；一种共价辅因子-抑制剂络合物，A.Oubrie等)。这些论文表明水溶性-PQQGDH是一种由6个W-基元组成的β-螺旋蛋白。
为了通过改善传统水溶性PQQGDH以增强其对葡萄糖的亲合力来研制一种能够用于临床检测或食品分析的修饰的PQQGDH，我们进行了认真研究，结果成功地获得了一种由于将一个氨基酸的变化引进水溶性PQQGDH的特定区域而对葡萄糖具有高度亲和力的酶。
因此，本发明提供了一种以吡咯并-喹啉醌作为辅酶的修饰水溶性葡萄糖脱氢酶，其特征在于天然水溶性葡萄糖脱氢酶中的至少一个氨基酸残基被另外一个氨基酸残基所取代并且所述修饰的水溶性葡萄糖脱氢酶对葡萄糖的亲合力比天然水溶性葡萄糖脱氢酶对葡萄糖的亲合力高。本发明的修饰PQQGDH对葡萄糖的Km值低于天然PQQGDH的Km值，优选地低于20mM，更优选地低于10mM。
尽管本发明的修饰葡萄糖脱氢酶对其它糖的亲和力未得到改变或降低，但优选地，对葡萄糖的亲和力增强了，因而它对葡萄糖的选择性比天然水溶性葡萄糖脱氢酶对葡萄糖的选择性要高。尤其是，与对葡萄糖的反应性相反，对乳糖或麦芽糖的反应性比野生型对乳糖或麦芽糖的反应性低。假设对葡萄糖的反应性是100％，那么对乳糖或麦芽糖的反应活性优选地是60％或更低，更优选地是50％或更低，进一步更优选地是40％或更低。
在本发明的PQQ葡萄糖脱氢酶的实施方案中，与乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH中的残基268-289或448-468对应的区域中的至少一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代，即被一个不同于天然PQQ葡萄糖脱氢酶中的相关氨基酸残基的氨基酸残基所取代。本文氨基酸编号是从起始甲硫氨酸开始作为+1位置。
本文使用的与氨基酸残基或区域有关的术语“对应于”指的是某些氨基酸残基或区域在两个或多个结构相似的不同蛋白质中具有同等功能。例如，如果源于其它生物而非乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDHs中的任何区域与源于乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH中由残基268-289限定的区域具有高度的氨基酸序列相似性并且根据该蛋白质的二级结构合理地推定该区域在该蛋白质中具有同样的功能，那么认为该区域“对应于乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH中由残基268-289限定的区域”。另外，认为该区域中的第10个氨基酸残基“对应于乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH中的第277个残基”。
在本发明优选的修饰PQQGDHs中，对应于SEQ ID NO1所示氨基酸序列中的谷氨酸277、异亮氨酸278、天冬酰胺462、天冬酰胺452、赖氨酸455、天冬氨酸456、天冬氨酸457或天冬氨酸448的至少一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代。
在本发明更优选的修饰PQQGDHs中，SEQ ID NO1所示氨基酸序列中的谷氨酸277被选自丙氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和甘氨酸的一个氨基酸残基所取代，或者异亮氨酸278被苯丙氨酸所取代。
另一方面，本发明的修饰PQQGDHs包含以下序列Xaa8 Thr Ala Gly Xaa1 Val Gln Xaa2 Xaa3 Xaa4 Gly Ser ValThr Xaa5 Thr Leu Glu Asn Pro Gly其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5和Xaa8代表任何天然氨基酸残基，条件是当Xaa1代表Asn，Xaa2代表Lys，Xaa3代表Asp，Xaa4代表Asp和Xaa5代表Asn时，Xaa8不代表Asp。
另一方面，本发明的修饰PQQGDHs包含以下序列Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Xaa6 Xaa7 Asn Leu IleVal Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp其中Xaa6和Xaa7代表任何天然氨基酸残基，条件是当Xaa6代表Glu时，Xaa7不代表Ile。
本发明还提供了一种编码上述任何修饰葡萄糖脱氢酶的基因，含有所述基因的载体和含有所述基因的转化体，以及葡萄糖检测试剂盒和含有本发明的修饰葡萄糖脱氢酶的葡萄糖传感器。
由于本发明的修饰的PQQGDHs的酶蛋白对葡萄糖具有很高的亲合力和氧化活性，所以它们能被用于高灵敏度和高选择性的葡萄糖检测。
图2表示制备编码本发明的修饰酶的突变基因的图解。
图3表示利用本发明的修饰PQQGDH进行的葡萄糖检测。
本发明最优选的实施方案修饰的PQQGDHs的结构为了构建一个携带氨基酸改变的水溶性PQQGDHs的文库，我们通过易错聚合酶链反应将随机突变引进编码水溶性PQQGDH的基因的编码区。这些基因被转化到大肠杆菌中并且筛选对葡萄糖的PQQGDHs活性以便得到几个表达PQQGDHs的克隆，该PQQGDHs对20mM的葡萄糖和对100mM的葡萄糖的活性相当以及对低浓度葡萄糖的反应性高于野生型酶。
对这些克隆中的一个克隆的核苷酸序列分析的结果表明Glu 277被换成Gly。当这个氨基酸残基被其它不同的氨基酸残基所取代时，在每一种情况下都获得了对葡萄糖的亲合力高于野生型水溶性PQQGDH的最佳突变酶。
然后，将位点特异性突变引入第277个残基附近的其它残基中并测定对葡萄糖的亲合力。制备在残基268-289所限定的区域中带有Ile278Phe和Asn279His的修饰酶并检测其活性，结果表明这些修饰酶对葡萄糖具有很高的亲合力。
进一步筛选上述获得的几个克隆以便得到表达PQQGDHs的克隆，该PQQGDHs对20mM葡萄糖的活性相当于野生型PQQGDH的活性而对20mM乳糖的活性则低于野生型PQQGDH的活性。
对这些克隆中的一个克隆的核苷酸序列分析的结果表明Asn 452被换成Asp。当这个氨基酸残基被苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、组氨酸或天冬氨酸所取代时，在每一种情况下都获得了对葡萄糖的选择性高于野生型水溶性PQQGDH的最佳突变酶。也以同样的方式将突变引入第452个残基附近的其它残基中。构建带有Lys455Ile、Asp456Asn、Asp457Asn、Asn462Asp、Asp448Asn的突变酶。结果如表4所示，发现所有的突变酶对葡萄糖的选择性都提高了。
在本发明的优选PQQ葡萄糖脱氢酶中，至少有一个位于与乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH中的残基448-468对应的区域中的氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代。在本发明优选的修饰PQQGDHs中，至少有一个对应于SEQ ID NO1所示氨基酸序列中的天冬酰胺462、赖氨酸452、天冬氨酸456、天冬氨酸457或天冬氨酸448的氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代。
另一方面，本发明修饰的PQQGDHs包含序列Xaa8 Thr Ala Gly Xaa1 Val Gln Xaa2 Xaa3 Xaa4 Gly Ser ValThr Xaa5 Thr Leu Glu Asn Pro Gly其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5和Xaa8代表任何天然氨基酸残基，条件是当Xaa1代表Asn，Xaa2代表Lys，Xaa3代表Asp，Xaa4代表Asp和Xaa5代表Asn时，Xaa8不代表Asp。
在本发明的其它优选的PQQ葡萄糖脱氢酶中，至少有一个位于与SEQ ID NO1所示氨基酸序列中的残基268-289对应的区域中的氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代。在本发明特别优选的修饰PQQGDHs中，SEQ ID NO1所示氨基酸序列中的谷氨酸277被选自丙氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和甘氨酸的氨基酸残基所取代，或者异亮氨酸278被苯丙氨酸所取代。
另一方面，本发明修饰的PQQGDHs包含序列Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Xaa6 Xaa7 Asn Leu IleVal Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp其中Xaa6和Xaa7代表任何天然氨基酸残基，条件是当Xaa6代表Glu时，Xaa7不代表Ile。
在本发明的修饰葡萄糖脱氢酶中，其它的氨基酸残基可以部分缺失或被部分取代或者可以插入其它的氨基酸残基而仍保持葡萄糖脱氢酶的活性。
根据本文的教导，本领域的技术人员还能通过取代源于其它细菌的水溶性PQQGDHs中的一个氨基酸残基来获得对葡萄糖的亲合力增强的修饰葡萄糖脱氢酶。尤其是，源于乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH中的对应于谷氨酸277、异亮氨酸278、天冬酰胺462、赖氨酸452、天冬氨酸455、天冬氨酸456、天冬氨酸457和天冬氨酸448的氨基酸残基可通过比较序列对比中的蛋白质的一级结构或比较由该酶的一级结构推导出的二级结构而被轻易地识别。根据本发明，能够通过取代这类氨基酸残基来获得对底物亲合力增强的修饰的葡萄糖脱氢酶。这些修饰的葡萄糖脱氢酶也包括在本发明的范围内。制备修饰PQQGDHs的方法SEQ ID NO2定义了编码源于乙酸钙不动杆菌的野生型水溶性PQQGDH的基因序列。
编码本发明的修饰PQQGDHs的基因可通过用编码一个待取代的氨基酸残基的核苷酸序列取代编码野生型水溶性PQQGDH的基因中的编码一个特定氨基酸残基的核苷酸序列来构建。用于这种位点特异性核苷酸序列取代的各种技术在本技术领域中是已知的，例如如Sambrook等，“Molecular CloningA Laboratory Manual”，第二版，1989，冷泉港实验室出版社，纽约所描述的。
如此获得的突变基因被插入基因表达载体(例如，质粒)中并被转化到合适的宿主(例如，大肠杆菌)中。几种表达外源蛋白的载体/宿主系统是已知的并且各种不同的宿主如细菌、酵母或培养细胞是适合的。
通过易错聚合酶链反应将随机突变引进靶区域来构建一个在靶区域中携带突变的修饰水溶性PQQGDH的基因文库。将这些基因转化到大肠杆菌中来筛选其中的PQQGDH对葡萄糖具有亲合力的各克隆。当水溶性PQQGDHs在大肠杆菌中得到表达时，它们被分泌到壁膜间隙中，因此利用大肠杆菌细胞能够方便地检测水溶性PQQGDHs的酶活性。在有20mM的葡萄糖存在的条件下，将这个文库与一种PMS-DCIP染料结合以便目测PQQGDH活性，由此选择出所示活性相当于对100mM葡萄糖的活性的克隆并且通过分析核苷酸序列来确认突变。
为了获得对葡萄糖的选择性增强的修饰PQQGDHs，将这个文库与一种PMS-DCIP染料结合以便目测PQQGDH活性，由此选择出所示对20mM葡萄糖的活性相当于野生型PQQGDH对20mM葡萄糖的活性而所示对20mM乳糖的活性低于野生型PQQGDH对20mM乳糖的活性的克隆并且通过分析核苷酸序列来确认突变。
培养并采用离心或其它方法从培养基中收集如此获得的表达修饰PQQGDHs的转化细胞，然后采用弗氏压碎器或渗压震扰破碎该转化细胞以便将壁膜酶释放到培养基中。可对该酶进行超离心以便得到含有水溶性PQQGDH的组分。或者，可利用适当的宿主/载体系统将表达的PQQGDH分泌到培养基中。采用离子交换层析、亲和层析、HPLC等方法纯化得到的水溶性组分来制备一种本发明的修饰PQQGDH。测定酶活性的方法本发明的PQQGDHs与在催化葡萄糖氧化制备葡糖酸内酯的反应中作为辅酶的PQQ有关。
所述酶活性的测定可以通过利用氧化还原染料的颜色产生反应测定PQQGDH催化的葡萄糖氧化所还原的PQQ的量来进行。合适的颜色产生试剂包括例如PMS(吩嗪硫酸甲酯)-DCIP(2，6-二氯酚靛酚)、高铁氰化钾和二茂铁。对葡萄糖的亲合力本发明的修饰PQQGDHs与野生型的PQQGDHs相比，对葡萄糖的亲合力有了很大的提高。因此，修饰的PQQGDHs对葡萄糖的Km值大大低于野生型PQQGDH对葡萄糖的Km值。在修饰的PQQGDHs中间，Glu277Lys变异体对葡萄糖的Km值为8.8mM并具有相当于野生型酶的最大活性，因此该变异体对低浓度葡萄糖的反应性增强了。
因此，用本发明的修饰酶制备的检测试剂盒或酶传感器由于对葡萄糖检测的灵敏度高而具有能检测低浓度葡萄糖的明显优点。选择性的评估方法本发明的PQQGDHs对葡萄糖的选择性可以通过上述以不同的糖如2-脱氧-D-葡萄糖、甘露糖、阿洛糖、3-邻-甲基-D-葡萄糖、半乳糖、木糖、乳糖和麦芽糖作为底物检测酶活性和确定对葡萄糖活性的相对活性来进行评估。葡萄糖检测试剂盒本发明还涉及一种含有本发明的修饰PQQGDH的葡萄糖检测试剂盒。本发明的葡萄糖检测试剂盒含有本发明修饰的PQQGDH的量足以用于至少一个循环的检测。除了本发明的修饰PQQGDH外，该试剂盒还含有一种用于检测的必需缓冲液、一种介体、用于制作校正曲线的标准葡萄糖溶液和说明书。本发明的修饰PQQGDHs能够以诸如冻干试剂或含有适当保存液的溶液的多种形式来提供。尽管本发明的修饰PQQGDHs也能以脱辅酶的形式来提供并在使用前被转化为全酶，但是优选地是它们以全酶的形式来提供。葡萄糖传感器本发明还涉及利用本发明的修饰PQQGDH的葡萄糖传感器。合适的电极包括碳、金、铂等电极，通过利用交联剂；包封在一种聚合物基质中；用透析膜包裹；利用一种光交联性聚合物，一种电传导性聚合物或一种氧化还原聚合物；将酶固定在一种聚合物中或用包括二茂铁或其衍生物在内的电子介体将其吸附在电极上；或其任意的组合将本发明的酶固定在这些电极上。尽管本发明的修饰PQQGDHs可以以脱辅酶的形式被固定化并且PQQ可以以分离层的形式或在溶液中来提供，但是它们优选地是以全酶的形式被固定在电极上。典型地，本发明的修饰PQQGDHs通过戊二醛被固定在炭精电极上，然后用一种含胺试剂处理以封闭戊二醛。
葡萄糖的浓度按照以下方法进行测定。将PQQ、CaCl2和一种介体加到含有缓冲液的恒温器小池中并保持在恒定的温度下。合适的介体包括，例如高铁氰化钾和吩嗪硫酸甲酯。其上固定了本发明的修饰PQQGDH的电极与计数电极(例如铂电极)和参比电极(例如Ag/AgCl电极)一起被用作工作电极。为了达到一个稳定的电流将一恒定电压加到炭精电极上后，加入含有葡萄糖的样品来测定电流的增加量。可由采用标准浓度的葡萄糖溶液制作的校正曲线来计算样品中的葡萄糖浓度。
本文引用的所有专利和文献的公开内容全部被引入本文作为参考。本申请要求了基于申请号为1999-124285和2000-9137的日本专利申请的优先权，其公开内容全部被引入本文作为参考。
下面的实施例进一步阐述了本发明，然而，并不只限于此。
从这些克隆中随机选择一个克隆并对其进行核苷酸序列分析，结果表明谷氨酸277被改变为甘氨酸。实施例2由实施例1获得的各菌落被转移到微量滴定板上。将所述菌落在第一块含有20mM葡萄糖和PMS-DCIP的复制平板以及第二块含有20mM乳糖和PMS-DCIP的复制平板上进行影印培养，对两块平板进行PQQGDH活性的目测评估。由此获得了两块平板中的几个对乳糖的活性明显低于对葡萄糖的活性的克隆。
从这些克隆中随机选择一个克隆并对其进行核苷酸序列分析，结果表明天冬酰胺452被改变为天冬氨酸。
将含有编码源于乙酸钙不动杆菌的PQQGDH的部分基因的KpnI-HindIII片段整合到载体质粒pKF18k(Takara Shuzo Co.，Ltd.)中并被用作模板。将50fmol的这种模板、5pmol的MutanTM-ExpresssKm试剂盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.)中附带的选择引物和50pmol的磷酸化靶引物与相当于1/10总体积量(20μl)的试剂盒中附带的退火缓冲液相混合，并将混合物在100℃下加热3分钟以便使质粒变性成单链。所述选择引物用于回复pKF18k的卡那霉素抗性基因上的双重琥珀突变。将所述混合物放置在冰上保持5分钟以便使引物退火。向该混合物中加入3μl的所述试剂盒中附带的延伸缓冲液、1μl的T4DNA连接酶、1μl的T4DNA聚合酶和5μl的无菌水以便合成一条互补链。
该合成的互补链被转化到错配修复-缺陷菌株大肠杆菌BMH71-18mutS中并过夜振荡培养来扩增所述质粒。
然后，将质粒拷贝从培养物中提取出来并转化到大肠杆菌MV1184中，然后从菌落中提取出来。对这些质粒进行测序以便证实引入了预定的突变。将这些片段替换成质粒pGB2A上的编码野生型PQQGDH的基因片段来构建编码修饰PQQGDHs的基因。
为了将组氨酸替换为天冬酰胺452，以同样的方式合成一种序列为5’-C ATC TTT TTG GAC ATG TCC GGC AGT AT-3’的寡核苷酸靶引物。利用质粒pGB2按照图2所示的方法进行定点诱变。还构建了编码携带突变Asp448Asn、Asn452Asp、Asn452His、Asn452Lys、Asn452Thr、Asn452Ile、Lys455Ile、Asp456Asn、Asp457Asn和Asn462Asp的修饰PQQGDHs的基因。
用10mM的pH7.0的磷酸盐缓冲液对如此获得的水溶性组分进行过夜透析。将透析的样品吸附到预先经10mM的pH7.0的磷酸盐缓冲液平衡的阳离子色谱柱TSKgelCM-TOYOPEARL 650M(Tosoh Corp.)上。用750ml 10mM的pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤该柱，然后用含有0-0.2M NaCl的10mM的pH7.0的磷酸盐缓冲液以5ml/分钟的流速将酶洗脱下来。收集具有GDH活性的组分，然后用10mM的pH7.0的MOPS-NaOH缓冲液进行过夜透析。由此获得电泳均匀的修饰PQQGDH蛋白。该修饰PQQGDH蛋白在下面的实施例中被用作纯酶样品。
将野生型和实施例4中所获得的修饰PQQGDHs的各粗酶样品在有1μM PQQ和1mM CaCl2存在的条件下经过1小时或更长的时间转化为全酶。将一个187μl的等分试样与3μl的活化剂(由48μl的6mM DCIP、8μl的600mM PMS和16μl的pH7.0的10mM磷酸盐缓冲液制备而成)和不同浓度的10μL的D-葡萄糖溶液混合，然后在室温下采用实施例5所示的方法测定酶的活性。通过底物浓度相对酶活性作曲线来测定Km。结果如表3所示。
表3
迄今为止，所报道的野生型PQQGDH对葡萄糖的Km值大约为25mM。相反，本申请所构建的携带有谷氨酸277和Ile278Phe突变的所有酶对葡萄糖的Km值低于10mM。这些结果表明本发明的修饰PQQGDHs对葡萄糖具有很高的亲合力。
表4葡萄糖 乳糖 麦芽糖野生型 100％ 61％61％Asp448Asn100％ 48％36％Asn452Asp100％ 56％50％Asn452His100％ 39％39％Asn452Lys100％ 55％42％Asn452Thr100％ 42％30％Asn452Ile100％ 36％28％Lys455Ile100％ 49％37％Asp456Asn100％ 59％41％Asp457Asn100％ 43％32％Asn462Asp100％ 52％41％
如此制备的酶传感器被用来测量葡萄糖浓度。其上固定有本发明的修饰PQQGDH的酶传感器能被用于测定0.1mM-5mM范围内的葡萄糖。
工业实用性本发明的修饰PQQGDHs对葡萄糖具有高亲合力，因此它们有望提供这样一种优势，即利用这种酶制成的检测试剂盒或酶传感器能够以明显高于传统的天然PQQGDHs的灵敏度测量较低浓度的葡萄糖。
序列表<110>Sode，Koji<120>葡萄糖脱氢酶<130>YCT493<150>JP 11-1 24285<151>1999-4-30<150>JP 2000-9137<151>2000-1-18<160>15<210>1<211>454<212>PRT<213>乙酸钙葡萄杆菌<400>1Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn1 5 10 15Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu20 25 30Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly35 40 45Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe50 55 60Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu65 70 75 80Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile85 90 95Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn100105 110Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu115 120 125Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His130 135 140Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr145 150 155 160Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn
165 170 175Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr180 185 190His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile195 200 205Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr210 215 220Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys225 230 235240Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu245 250 255Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys260 265 270Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys275 280 285Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val290 295 300Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro305 310 315 320Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro325 330 335Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser340 345 350Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu355 360 365Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile370 375 380Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met385 390 395 400Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly405 410 415Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp420 425 430Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys435 440 445Phe Thr Tyr Lys Ala Lys
450<210>2<211>1612<212> DNA<213> Acinetobacter calcoaceticus<400>2agctactttt atgcaacaga gcctttcaga aatttagatt ttaatagatt cgttattcat 60cataatacaa atcatataga gaactcgtac aaacccttta ttagaggttt aaaaattctc 120ggaaaatttt gacaatttat aaggtggaca catgaataaa catttattgg ctaaaattgc 180tttattaagc gctgttcagc tagttacact ctcagcattt gctgatgttc ctctaactcc 240atctcaattt gctaaagcga aatcagagaa ctttgacaag aaagttattc tatctaatct 300aaataagccg catgctttgt tatggggacc agataatcaa atttggttaa ctgagcgagc 360aacaggtaag attctaagag ttaatccaga gtcgggtagt gtaaaaacag tttttcaggt 420accagagatt gtcaatgatg ctgatgggca gaatggttta ttaggttttg ccttccatcc 480tgattttaaa aataatcctt atatctatat ttcaggtaca tttaaaaatc cgaaatctac 540agataaagaa ttaccgaacc aaacgattat tcgtcgttat acctataata aatcaacaga 600tacgctcgag aagccagtcg atttattagc aggattacct tcatcaaaag accatcagtc 660aggtcgtctt gtcattgggc cagatcaaaa gatttattat acgattggtg accaagggcg 720taaccagctt gcttatttgt tcttgccaaa tcaagcacaa catacgccaa ctcaacaaga 780actgaatggt aaagactatc acacctatat gggtaaagta ctacgcttaa atcttgatgg 840aagtattcca aaggataatc caagttttaa cggggtggtt agccatattt atacacttgg 900acatcgtaat ccgcagggct tagcattcac tccaaatggt aaattattgc agtctgaaca 960aggcccaaac tctgacgatg aaattaacct cattgtcaaa ggtggcaatt atggttggcc 1020gaatgtagca ggttataaag atgatagtgg ctatgcttat gcaaattatt cagcagcagc 1080caataagtca attaaggatt tagctcaaaa tggagtaaaa gtagccgcag gggtccctgt 1140gacgaaagaa tctgaatgga ctggtaaaaa ctttgtccca ccattaaaaa ctttatatac 1200cgttcaagat acctacaact ataacgatcc aacttgtgga gagatgacct acatttgctg 1260gccaacagtt gcaccgtcat ctgcctatgt ctataagggc ggtaaaaaag caattactgg 1320ttgggaaaat acattattgg ttccatcttt aaaacgtggt gtcattttcc gtattaagtt 1380agatccaact tatagcacta cttatgatga cgctgtaccg atgtttaaga gcaacaaccg 1440ttatcgtgat gtgattgcaa gtccagatgg gaatgtctta tatgtattaa ctgatactgc 1500cggaaatgtc caaaaagatg atggctcagt aacaaataca ttagaaaacc caggatctct 1560cattaagttc acctataagg ctaagtaata cagtcgcatt aaaaaaccga tc1612<210>3<211>22<212>PRT<213>乙酸不动杆菌
<220>
<222>10<223>Xaa是除Glu之外的任何氨基酸残基<220>
<222>11<223>Xaa是除Ile之外的任何氨基酸残基<400>3Ser Glu Gln GIy Pro Asn Ser Asp Asp Xaa Xaa Asn Leu Ile Val Lys1 5 10 15Gly Gly Asn Tyr Gly Trp20<210>4<211>22<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>用于点突变的引物<400>4gaggttaatt gcatcgtcag ag22<210>5<211>30<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>用于点突变的引物<400>5caatgaggtt aatgttatcg tcagagtttg30<210>6<211>22<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>用于点突变的引物
<400>6gaggttaata tcatcgtcag ag 22<210>7<211>22<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>用于点突变的引物<400>7gaggttaatt ttatcgtcag ag 22<210>8<211>30<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>用于点突变的引物<400>8caatgaggtt aatgtgatcg tcagagtttg30<210>9<211>22<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>用于点突变的引物<400>9gaggttaatt tgatcgtcag ag 22<210>10<211>30<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>用于点突变的引物
<400>10caatgaggtt aattacatcg tcagagtttg30<210>11<211>22<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>用于点突变的引物<400>11gaggttaatt ccatcgtcag ag22<210>12<211>26<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>用于点突变的引物<400>12caatgaggtt gaattcatcg tcagag26<210>13<211>30<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>用于点突变的引物<400>13gacaatgagg tgaatttcat cgtcagagtt30<210>14<211>21<212>PRT<213>乙酸钙不动杆菌<220>
<222>1
<223>Xaa是任何氨基酸残基<222>5<223>Xaa是任何氨基酸残基<222>8<223>Xaa是任何氨基酸残基<222>9<223>Xaa是任何氨基酸残基<222>10<223>Xaa是任何氨基酸残基<222>15<223>Xaa是任何氨基酸残基<400>14Xaa Thr Ala Gly Xaa Val Gln Xaa Xaa Xaa Gly Ser Val Thr Xaa Thr1 5 10 15Leu Glu Asn Pro Gly20<210>15<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于点突变的引物<400>15catctttttg gacatgtccg gcagtat1权利要求
1.一种以吡咯并-喹啉醌作为辅酶的修饰水溶性葡萄糖脱氢酶，其特征在于天然水溶性葡萄糖脱氢酶中的至少一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代并且所述修饰水溶性葡萄糖脱氢酶对葡萄糖的亲和力比天然水溶性葡萄糖脱氢酶对葡萄糖的亲和力高。
2.如权利要求1所述的修饰水溶性葡萄糖脱氢酶，其特征在于其对葡萄糖的选择性比野生型PQQGDH对葡萄糖的选择性高。
3.一种以吡咯并-喹啉醌作为辅酶的修饰葡萄糖脱氢酶，其特征在于源于乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH中的天冬酰胺462或与所述残基对应的一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代。
4.一种以吡咯并-喹啉醌作为辅酶的修饰葡萄糖脱氢酶，其特征在于源于乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH中的天冬酰胺452或与所述残基对应的一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代。
5.一种以吡咯并-喹啉醌作为辅酶的修饰葡萄糖脱氢酶，其特征在于源于乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH中的赖氨酸455或与所述残基对应的一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代。
6.一种以吡咯并-喹啉醌作为辅酶的修饰葡萄糖脱氢酶，其特征在于源于乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH中的天冬氨酸456或与所述残基对应的一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代。
7.一种以吡咯并-喹啉醌作为辅酶的修饰葡萄糖脱氢酶，其特征在于源于乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH中的天冬氨酸457或与所述残基对应的一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代。
8.一种以吡咯并-喹啉醌作为辅酶的修饰葡萄糖脱氢酶，其特征在于源于乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH中的天冬氨酸448或与所述残基对应的一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代。
9.一种以吡咯并-喹啉醌作为辅酶的修饰葡萄糖脱氢酶，其特征在于与源于乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH中的残基268-289或448-468对应的区域中的至少一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代。
10.一种以吡咯并-喹啉醌作为辅酶的修饰葡萄糖脱氢酶，其特征在于源于乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH中的谷氨酸277或与所述残基对应的一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代。
11.一种以吡咯并-喹啉醌作为辅酶的修饰葡萄糖脱氢酶，其特征在于源于乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH中的异亮氨酸278或与所述残基对应的一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代。
12.一种以吡咯并-喹啉醌作为辅酶的修饰葡萄糖脱氢酶，其特征在于由SEQ ID NO1所示氨基酸序列中的残基268-289或448-468所限定的区域中的至少一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代。
13.一种PQQ葡萄糖脱氢酶，其包含以下序列Xaa8 Thr Ala Gly Xaal Val Gln Xaa2 Xaa3 Xaa4 Gly Ser ValThr Xaa5 Thr Leu Glu Asn Pro Gly其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5和Xaa8代表任何天然氨基酸残基，条件是当Xaa1代表Asn，Xaa2代表Lys，Xaa3代表Asp，Xaa4代表Asp和Xaa5代表Asn时，Xaa8不代表Asp。
14.一种PQQ葡萄糖脱氢酶，其包含以下序列Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Xaa6 Xaa7 Asn Leu IleVal Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp其中Xaa6和Xaa7代表任何天然氨基酸残基，条件是当Xaa6代表Glu时，Xaa7不代表Lle。
15.如权利要求14所述的PQQ葡萄糖脱氢酶，其特征在于SEQ IDNO1所示氨基酸序列中的谷氨酸277被另一个氨基酸残基所取代。
16.如权利要求14所述的PQQ葡萄糖脱氢酶，其特征在于SEQ IDNO1所示氨基酸序列中的异亮氨酸278被另一个氨基酸残基所取代。
17.编码如权利要求1-16中的任意一项权利要求所述的修饰葡萄糖脱氢酶的基因。
18.含有如权利要求17所述基因的载体。
19.含有如权利要求17所述基因的转化体。
20.如权利要求19所述的转化体，其特征在于权利要求17所述的基因被整合到主染色体中。
21.一种葡萄糖检测试剂盒，其含有如权利要求1-16中的任意一项权利要求所述的修饰葡萄糖脱氢酶。
22.一种葡萄糖传感器，其含有如权利要求1-16中的任意一项权利要求所述的修饰葡萄糖脱氢酶。
全文摘要
提供了以吡咯并－喹啉醌作为辅酶的修饰水溶性葡萄糖脱氢酶(PQQGDHs),其中特异区域中的至少一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代。本发明的修饰水溶性PQQGDHs对葡萄糖的亲和力增大了。
文档编号C12N15/53GK1353759SQ00808352
公开日2002年6月12日 申请日期2000年5月1日 优先权日1999年4月30日
发明者早出广司 申请人:早出广司