专利名称：：葡萄糖脱氢酶的制作方法
技术领域：
：本发明涉及可利用于葡萄糖测定试剂及葡萄糖传感器的新型葡萄糖脱氢酶(以下，有时也简写为"GDH")。本发明涉及编码来自米曲霉(Aspergillusoiyzae)的葡萄糖脱氢酶的基因以及通过基因重组制造该葡萄糖脱氢酶的方法。本发明涉及用重组体使来自丝状菌的葡萄糖脱氢酶高表达的方法。本发明涉及提高包含需要辅酶的可溶性葡萄糖脱氢酶的组合物稳定性的方法及使用该方法的组合物。更加详细地说，本发明涉及提高包含以黄素化合物等为辅酶的可溶性葡萄糖脱氢酶的组合物的稳定性的方法及使用该方法的组合物。背景絲自己测定血糖对于糖尿病患者日常掌握自身血糖值而应用到治疗中非常重要。用于检测自己血糖的传感器利用以葡萄糖为底物的酶。这类酶例如可为葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4)。葡萄糖氧化酶因具有对葡萄糖的特异性高、稳定性好的优点，所以一直用作血糖传感器用酶，其最初的发表实际上可以追溯到大约40年前。采用葡萄糖氧化酶的血糖传感器，是通过在氧化葡萄糖转换为D—葡糖酸-S-内酯(D-glucono-S-lactone)的过程中产生的电子通过介体转移到电极上来测定，然而问题是葡萄糖氧化酶反应产生的质子容易转移给氧，因此溶解氧会影响测定值。为解决这个问题，例如采用NAD(P)依赖型葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.47)或吡咯喹啉醌(本说明书中有时也将吡咯喹啉醌记为PQQ)依赖型葡萄糖脱氢酶(EC.U.5.2;(旧EC1丄99.17)作为血糖传感器用酶。这些酶有不受溶解氧干扰的优点，但前者的NAD(P)依赖型葡萄糖脱氢酶[本说明书中也将NAD(P)依赖型葡萄糖脱氢酶记为NADGDH]欠稳定，需补加辅酶，比较烦杂；8后者PQQ型依赖葡萄糖脱氢酶(本说明书中也将PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶记为PQQGDH)缺点是底物特异性较差，因对麦芽糖或乳糖等葡萄糖以外的糖类起作用，所以影响测定值的准确性。非专利文献14中，报道了来自米曲霉的葡萄糖脱氢酶，但未报道葡萄糖脱氢酶基因。此外，非专利文献14中，没有关于通过基因重组制造来自米曲霉的葡萄糖脱氢酶的记载。且在专利文献l中，公开了来自曲霉属的与黄素结合的葡萄糖脱氢酶。该酶有底物特异性好，不受溶解氧影响的优点。在热稳定性方面，5(TC处理15分钟后的活性残存率为约89%，稳定性(以下也用耐热性表述)也良好。在专利文献2中，报道了其基因序列及氨基酸序列。但是考虑到在制作传感器芯片的工序中需要加热处理，因而还决不能说会十分稳定。且黄素结合型葡萄糖脱氢酶(也称作FAD依赖性葡萄糖脱氢酶)的制造，即使使用重组体DNA技术也极为困难。实际上，专利文献2中公开了FAD依赖性葡萄糖脱氢酶在重组大肠杆菌K12株中为0.09U/mL，为极低的水平。大肠杆菌K12株在重组生产中最为常用，从重组操作简便、容易培养及安全性等方面考虑，为工业上多用的宿主。因此，希望有通过以大肠杆菌K12株为宿主的重组体，高效生产FAD依赖性葡萄糖脱氢酶的方法。最近，米曲霉的全基因组序列已被确定。但还没有关于该序列的哪个部分编码葡萄糖脱氢酶的信息。专利文献1:WO2004/058958专利文献2:WO2006/101239非专利文献1:BiochimBiophysActa.1967，7月，ll;139(2):265-76非专利文献2:BiochimBiophysActa.1967,7月，11;139(2):277-93非专利文献3:BiochimBiophysActa.146(2):317-27非专利文献4:BiochimBiophysActa.l46(2):328-3
发明内容本发明的第一目的在于，克服上述公知的血糖传感器用酶所具有的缺点，提供从实用方面更有效的血糖传感器用酶。本发明的第二目的在于，提供高效制造从实用方面更有效的血糖传感器用酶的方法。更具体地说，在于确定、获得、利用来自米曲霉的葡萄糖脱氢酶的基因，确立大量、稳定地生产该葡萄糖脱氢酶的方法。本发明的第三目的在于，提供从实用方面更有效的血糖传感器用酶。更具体地说，大量获得、利用不仅底物特异性优异，生产成本也低的来自丝状菌的葡萄糖脱氢酶(GDH)。本发明的第四目的在于，克服上述公知的血糖传感器用酶的热稳定性的缺点，提供可使用于从实用方面更有效的血糖值湖啶用试剂的组合物。本发明者为达至U上述目的进行了多方面的探讨，结果从青霉属丝状菌中得到葡萄糖脱氢酶，发现该葡萄糖脱氢酶的特性具有优于公知血糖测定用酶的特性。本发明者为实现上述目的，发现利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的数据库，推定、获得来自米曲霉的葡萄糖脱氢酶基因，使用该基因，可从大肠杆菌中得到来自米曲霉的葡萄糖脱氢酶。此外，还发现由基因组信息推测氨基酸序列，该氨基酸序列的N末端区上存在被认为是信号肽的氨基酸序列。根据本发明，通过利用从米曲霉中分离的葡萄糖脱氢酶基因，可高效生产葡萄糖脱氢酶，且可得到更实用的葡萄糖脱氢酶。信号肽成为向间质空间(periplasmaspace)的转移信号，因该空间的间隙上有可能出现限制表达量的危险，所以，在探讨缺失该信号肽的功能时，GDH的生产率可提高约10倍，生产成本被控制在1/10。如上所述，在专利文献l中所述的FADGDH的热稳定性在5(TC、处理15分钟后的活性残存率为约89%。然而，这恐怕是从野生株中培养、纯化所得到的酶标准品，而我们讨论的结果，可知在该酶的大肠杆菌的重组体中，在酶表面不附加多糖，热稳定性会显著降低。比较从米曲霉株中得到的FADGDH和使米曲霉的FADGDH基因在大肠杆菌中表达得到的FADGDH重组体(AOGDH)的热稳定性时，同样50°C、处理15分钟，前者维持约77%的活性，但后者rFADGDH只能维持约13%的活性。比较从土曲霉株(NBRC33026)中得到的FADGDH和使土曲霉的FADGDH基因在大肠杆菌中表达得到的FADGDH重组俠ATGDH)的热稳定性时，同样50。C、处理15分钟，前者维持约90%的活性，但后者rFADGDH只能维持约2%的活性。血糖传感器用芯片的制备过程中，有时需进行加热干燥处理，利用重组体时，有弓跑大幅度热失活的危险性，因而有必要提高热稳定性。至此为止，有关提高PQQGDH的稳定性的对策在专利文献中3有所报道，其中，虽报道了对基因水平上使用PQQGDH改变方法进行的探讨，但对于不使用酶的改变而使稳定性增大的方法，贝链其可能性都未曾触及。专利文献3:W002/072839可加热干燥的水平，是指5(TC处理15分钟后残存活性存在20%以上的状态，优选存在40%以上的残存活性的状态，更优选存在60%以上的残存活性的状态。本发明主要包括以下第1实施方式到第4实施方式。第1实施方式项1A一种葡萄糖脱氢酶，其特征在于，来自真核生物，液状下在55°C、加热处理15分钟后也可保持与加热处理前相比90。/。以上的活性。项2A一种葡萄糖脱氢酶，其特征在于，来自真核生物，液状下在60°C、加热处理15分钟后也可保持活性。项3A项2A中所述的葡萄糖脱氢酶，其特征在于，来自真核生物，液状下在60°C、加热处理15分钟后也可保持与加热处理前相比40%以上的活性。项4A项1A3A中任一项所述的葡萄糖脱氢酶，其特征在于，真核生物为丝状菌。项5A项4A中所述的葡萄糖脱氢酶，其特征在于，丝状菌为青霉属(青霉属)丝状菌。项6A项5A中所述的葡萄糖脱氢酶，其特征在于，青霉属丝状菌为薄刺青霉(Penicilliumlilacinoechinulatum)或意大禾晴霉(Penicilliumitalicum)。项7A项1A6A中任一项所述的葡萄糖脱氢酶，其特征在于，对麦芽糖的作用性不到对葡萄糖的作用性的1%。项8A项7A中所述的葡萄糖脱氢酶，其特征在于，对半乳糖的作用性为不到对葡萄糖的作用性的2%。项9A一种葡萄糖脱氢酶，其特征在于，来自真核生物，具有以下(a)(f)中所示的理化性质。(a)最适反应温度5(TC;(b)最适反应pH值约6.5;(c)温度稳定性55°C加热处理15分钟后GDH活性残存率为90%以上，60°C加热处理15分钟后GDH活性残存率为40%以上；(d)pH稳定性5.08.0(25°〇处理16小时后活性残存率为90%以上)；(e)底物特异性对葡萄糖的作用性为100%时，对木糖为约10%，对2-脱氧-D-葡萄糖具有约14%的作用性，对麦芽糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、松三糖、山梨糖、核糖、麦芽三糖、麦芽四糖及海藻糖反应性不到2%;(f)化学影响受到铜、银及镉的强抑制，受到碘乙酸、N-乙基马来酰亚胺、羟胺及叠氮钠的抑制。项10A一种葡萄糖脱氢酶，其特征在于，来自真核生物，具有以下(a)(f)中所示的理化性质。(a)最适反应温度60°C;(b)最适反应pH值约6.5;(c)温度稳定性55°C加热处理15分钟后GDH活性残存率为95%以上，60°C加热处理15分钟后GDH活性残存率为70%以上；(d)pH稳定性5.08.5(25。C处理16小时后活性残存率为80%以上)；(e)底物特异性对葡萄糖的作用性为100%时，对木糖为约10%，对2-脱氧-D-葡萄糖具有约17%的作用性，对麦芽糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、松三糖、山梨糖、核糖、麦芽三糖、麦芽四糖及海藻糖反应性不到2%;(f)化学影响受到铜、银及镉的强抑制，受到铁、锌、碘乙酸、N-乙基马来酰亚胺及羟胺的抑制。项11A一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)(e)中任一项所述的蛋白质(a)—种蛋白质，含有序列号2所示的氨基酸序列，且具有葡萄糖脱氢酶活性；(b)—种蛋白质，其在序列号2所示的氨基酸序列中，在不失去葡萄糖脱氢酶活性的范围内，缺失N末端的连续多个的氨基酸残基；(c)一种蛋白质，其在序列号2所示的氨基酸序列中，缺失N末端15个以上22个以下的连续的氨基酸，；Cd)—种蛋白质，其含有上述(a)(c)中任一项所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入或附加后的氨基酸序列，且具有葡萄糖脱氢酶活性；及问一种蛋白质，其与序列号2所示的氨基酸序列有80%以上同源性，且具有葡萄糖脱氢酶活性。项12A一种蛋白质，其特征在于，其为以下(a)(e)中任一项所述的蛋白质。(a)—种蛋白质，其含有序列号4所示的氨基酸序列，且具有葡萄糖脱氢酶活性；(b)—种蛋白质，其在序列号4所示的氨基酸序列中，在不失去葡萄糖脱氢酶活性的范围内，缺失N末端的连续多个的氨基酸残基；(c)一种蛋白质，其在序列号4所示的氨基酸序列中，缺失N末端15个以上19个以下的连续氨基酸；(d)—种蛋白质，其含有上述(a)(c)中任一项所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入或附加后的氨基酸序列，且具有葡萄糖脱氢酶活性；及(e)—种蛋白质，其与序列号4所示的氨基酸序列有80%以上同源性，且具有葡萄糖脱氢酶活性。项13A一种葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于，培养真核生物，提取及纯化项1A12A中任一项所述的葡萄糖脱氢酶。项14A一种核酸，其特征在于，具有编码1A12A中任一项所述的蛋白质的碱基序列。项15A一种重组质粒，其特征在于，其是使具有编码项1A12A中任一项所述的蛋白质的碱基序列的核酸在宿主生物中在功能性启动子下连接而成的重组质粒。项16A一种重组微生物，其特征在于，其是将具有包含项14A中所述核酸的序列的核酸分子转化到宿主微生物的重组微生物。项17A项16A中所述的重组微生物，其特征在于，核酸分子是项15A中所述的重组质粒。项18A项16A或项17A中所述的重组微生物，其特征在于，宿主微生物是真核微生物。项19A项16A或项17A中所述的重组微生物，其特征在于，宿主微生物是原核微生物。项20A项19A中所述的重组微生物，其特征在于，原核微生物是革兰氏阴性菌。项21A项20A中所述的重组微生物，其特征在于，革兰氏阴性菌是大肠杆菌。项22A一种葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于，培养项16A21A中任一项所述的生物，提取及纯化葡萄糖脱氢酶。项23A一种葡萄糖浓度的测定方法，其特征在于，使用项1A12A中任一项所述的葡萄糖脱氢酶。项24A一种葡萄糖检测试剂盒，其特征在于，包含项1A12A中任一项所述的葡萄糖脱氢酶。项25A一种葡萄糖传感器，其特征在于，包含项1A12A中任一项所述的葡萄糖脱氢酶。第2实施方式项1B一种基因，其特征在于，含有以下(a)，(b)，(c)或(d)的DNA组成(a)DNA，其含有序列号11中记载的碱基序列；(b)DNA，其包含序列号ll中记载的碱基序列及内含子，含有序列号14中记载的碱基序列，(c)DNA，其和含有与(a)DNA相互补碱基序列的DNA在严谨条件下杂交，且编码具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质；(d)DNA，其包含以下区域，该区域与含有与(b)的DNA的互补碱基序列的DNA在严谨条件下杂交，且编码具有葡萄糖脱氢酶活性蛋白质。项2B一种基因，其特征在于，编码以下(a)或(b)的蛋白质(a)—种蛋白质，其含有序列号10中记载的氨基酸序列；(b)—种蛋白质.其含有序列号10中记载的氨基酸序列中1个或多个氨15基酸发生缺失、取代或附加(插入)后的氨基酸序列，且具有葡萄糖脱氢酶活性。项3B一种重组载体，其特征在于，包含项1B或2B中任一项所述的基因。项4B一种转化体，其特征在于，其由项3B中所述的重组载体转化。项5B根据项4B中所述的转化体，其特征在于，宿主为大肠杆菌。项6B一种制造具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的方法，其特征在于，在营养培养基中培养项4B或项5B中所述的转化体，提取具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。第3实施方式项1CGDH的生产方法，其特征在于，在重组生产来自丝状菌的葡萄糖脱氢酶的方法中，通过将突变导入到其N末端区中存在的信号肽序列中，从而与导入突变前相比增加该靶酶的表达量。项2C项1C中所述的GDH的生产方法，其特征在于，在重组生产来自丝状菌的GDH的方法中，通过使其N末端区中存在的信号肽的氨基酸序列的一部分发生缺失或取代，从而与导入突变前相比增加该靶酶的表达量。项3C项1C中所述的GDH的生产方法，其特征在于，通过去除序列号9、10的任一个记载的氨基酸序列中其N末端区存在的MLFSLAFLSALSLATASPAGRA的氨基酸序列的一部分或全部且而使其表达，从而与这些氨基酸序列存在时相比提高表达量。项4C项1C中所述的GDH的生产方法，其特征在于，通过序列号9、10的任一个记载的氨基酸序列中在其N末端区存在的MLFSLAFLSALSLATASPAGRA的氨基酸序列中进行122个氨基酸取代或/及氨基酸插入，从而与原氨基酸序列存在时相比提高表达活性。项5C项1C中所述的GDH的生产方法，其特征在于，通过去除来自丝状菌的葡萄糖脱氢酶的其N末端区存在的MLGKLSFLSALSLAVAATLSNSTSA的氨基酸序列的一部分或全部且而使其表达，从而与这些氨基酸序列存在时相比提高表达量，或通过进行125个氨基酸取代或/及氨基酸插入，从而与原氨基酸序列存在时相比提高表达活性。项6C项1C5C中任一项所述的生产方法中使用的DNA序列，其特征在于，编码来自丝状菌的葡萄糖脱氢酶(GDH)中，使编码其N末端区存在的葡萄糖脱氢酶的DNA序列一部分或全部发生取代或/及缺失后的GDH基因。项7C一种重组载体，其特征在于，包含项6C的DNA。项8C一种转化体，其特征在于，将项7C中所述的重组载体导入宿主。项9C一种GDH蛋白质，其特征在于，使用项8C中所述的转化体生产。项10C一种组合物，其特征在于，包含项9C中所述的GDH蛋白质。项11C一种葡萄糖浓度的测定方法，其特征在于，使用项10C中所述的组合物。项12C一种葡萄糖传感器，其特征在于，包含项IIC中所述的组合物。第4实施方式项1D一种提高GDH的稳定性的方法，其特征在于，包括以下工序，该工序为在含有需辅酶的可溶性葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物中，使该酶与选自不作为该酶底物的糖类或氨基酸类中的任一种以上的化合物共存的工序,和不使该化合物共存时比较，提高了GDH的稳定性。项2D项ID中所述提高稳定性的方法，其特征在于，溶液中共存的各化合物的最终浓度为0.01重量％以上，且各化合物的合计浓度为30重量％以下。项3D项1D或2D中所述的提高热稳定性的方法，其特征在于，添加的化合物选自海藻糖、甘露糖、松三糖、葡萄糖酸钠、葡糖醛酸钠、半乳糖、甲基-a-D-葡萄糖苷、环糊精、a-D-蜜二糖、蔗糖、纤维二糖、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、BSA、氯化钠、硫酸钠、拧檬酸三钠、硫酸铵、琥珀酸、丙二酸、戊二酸、阿拉伯糖、脱水山梨糖醇、2-脱氧-D-葡萄糖、木糖、果糖、天冬氨酸钠、谷氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸及牛磺酸中任一种以上。项4D项1D3D中任一项所述的提高热稳定性的方法，其特征在于，以黄素化合物为辅酶的GDH来自丝状菌。项5D--种含有可溶性GDH的组合物，其特征在于，通过项1D4D中任一项所述的方法提高热稳定性。项6D项5D中所述的含有GDH的组合物，其特征在于，在含有黄素化合物结合型的葡萄糖脱氢酶(GDH)重组体的组合物中，与4t:下保存的该组合物相比，即使在50。C、处理15分钟时，也可残存20。/。以上的GDH活性。项7D项5D中所述的含有GDH的组合物，其特征在于，在含有黄素化合物结合型GDH的组合物中，与4。C下保存的该组合物相比，即使在5(TC、处理30分钟时，也可残存10。/。以上的GDH活性。项8D一种测定葡萄糖浓度的方法，其特征在于，使用项5D7D中所述的组合物。项9D一种葡萄糖传感器，其特征在于，包含项5D7D中任一项所述的组合物项10D一种组合物的制造方法，其特征在于，包括以下工序，该工序为在含有可溶性辅酶结合型的葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物中，使该酶与选自不作为该酶底物的糖类或氨基酸类中的任一种以上的化合物共存的工序，和不使该化合物共存时比较，GDH的稳定性有所提高。通过本发明，可提供耐热性及底物特异性优异，且不受溶解氧的影响的葡萄糖脱氢酶。通过本发明，可高效生产葡萄糖脱氢酶。且因获得更加实用的葡萄糖脱氢酶，所以可容易地进行分子生物学改良。通过本发明，在可高效生产葡萄糖脱氢酶的同时，还可获得更加实用的葡萄糖脱氢酶。根据本发明，可从曲霉属或青霉属中分离的葡萄糖脱氢酶基因中的推定氨基酸序列，预测信号肽区域，通过使编码信号肽的一部分或全部的DNA序列缺失，或通过在编码信号肽的氨基酸序列上施加氨基酸取代或氨基酸插入，从而可用重组体高效生产葡萄糖脱氢酶，且从产业利用的观点来看，可获得更加实用的葡萄糖脱氢酶。本发明的GDH组合物稳定性的提高，可降低葡萄糖观啶试剂、葡萄糖检测试剂盒及葡萄糖传感器制作时的酶的热失活，实现该酶的使用量降低、测定精度的提高。此外，还可提供使用保存稳定性优异的GDH组合物的血糖值测定试齐u。图1表示本发明的GDH反应速度的温度依赖性。用活性最大时的温度条件作为100时的相对活性(％)表示。图2表示本发明的GDH反应速度的pH依赖性。用活性最大时的温度条件作为100时的相对活性(％)表示。19图3表示本发明的GDH的温度稳定性。用各温度下加温处理后的活性值、加温处理前的活性作为100时的相对活性(％)表示。图4表示来自保藏编号NBRC6092的GDH的pH稳定性。pH3.36时使用醋酸缓冲液，pH67时使用PIPES缓冲液、pH78.5时使用Tris盐酸缓冲液。图5表示来自保藏编号NBRC32032的GDH的pH稳定性。pH3.36时使用醋酸缓冲液，pH67时使用PIPES缓冲液、pH78.5时使用Tris盐酸缓冲液。图6表示使用本发明的GDH制备的葡萄糖电极中葡萄糖电极和应答电压值的关系。通过检测器输出的应答电压值1V相当于葡萄糖电极中IO^iA的电流。图7表示使用本发明的GDH(重组蛋白质)制备的葡萄糖电极中葡萄糖电极和应答电压值的关系。通过检领U器输出的应答电压值1V相当于葡萄糖电极中lO(iA的电流。图8表示来自米曲霉的FAD-GDH的信号肽切割位点的预测。图9表示米曲霉野生型GDH(有信号肽)的培养期与菌体浊度(OD)、pH、GDH活性值的关系。图10表示米曲霉突变型GDH-S2的培养期与菌体浊度(OD)、pH、GDH活性值的关系。图ll表示米曲霉突变型GDH-S3的培养期与菌体浊度(OD)、pH、GDH活性值的关系。图12表示土曲霉野生型GDH(切除预测信号肽序列)的培养温度28。C、Kd.P0.5时的培养期与菌体浊度(OD)、pH、GDH活性值的关系。图13表示土曲霉野生型GDH(切除预测信号肽序列)的培l^显度28°C、Kd.P0.75时的培养期与菌体浊度(OD)、pH、GDH活性值的关系。图14表示土曲霉野生型GDH(切除预测信号，太序列)的培养纟显度28。C、Kd.Pl.O时的培养期与菌体浊度(OD)、pH、GDH活性值的关系。图15表示土曲霉野生型GDH(切除预测信号肽序列)的培养温度28。C、Kd.P1.5时的培养期与菌体浊度(OD)、pH、GDH活性值的关系。图16表示土曲霉野生型GDH(切除预观瞻号肽序列)的培辭显度20。C、Kd.P0.5时的培养期与菌体浊度(OD)、pH、GDH活性值的关系。图17表示土曲霉野生型GDH(切除预观ij信号肽序列)的培賴显度23。C、Kd.P0.5时的培养期与菌体浊度(OD)、pH、GDH活性值的关系。图18表示土曲霉野生型GDH(切除预测信号肽序列)的培萧益度26。C、Kd.P0.5时的培养期与菌体浊度(OD)、pH、GDH活性值的关系。图19表示土曲霉野生型GDH(切除预领i腊号肽序列)的培辭显度29。C、Kd.P0.5时的培养期与菌体浊度(OD)、pH、GDH活性值的关系。具体实施例方式本发明具有从第1实施方式到第4实施方式的4个主要实施方式。以下分别对第1实施方式到第4实施方式进行说明，但各实施方式中的记载可根据需要与其他实施方式适应。第1实施方式在第l实施方式中，本发明是来自真核生物的葡萄糖脱氢酶，催化以下的反应。0-葡萄糖+电子传递物质(氧化型)—D-葡糖酸-S-内酯+电子传递物质(还原型)本发明的特征在于耐热性强，此点与公知的来自真核生物的GDH有区别。相对于公知的来自真核生物的葡萄糖脱氢酶中稳定性优异的来自土曲霉的GDH在55°C、加温处理15分钟后的残存活性(加温处理前的活性为100%时的活性残存率)为60%,与此相对，本发明的GDH在55°C、加温处理15分钟后的残存活性为90%以上。且本发明的GDH优选在60。C处理15分钟后也可保持GDH活性，更优选60。C处理15分钟后残存活性为40%以上。在判别是否具有以上所述的耐热性时，本发明中所示的加温处理的条件，是在浓度为20mMK-磷酸缓冲液(pH6.5)中溶解GDH以成为1U/mL的活性的状态加温15分钟。且活性是根据后述试验例中所示的方法测定的值。本发明的GDH的来源生物不仅是真核生物，还包含在真核生物的范畴内、在细胞中具有覆盖了核膜的细胞核的生物全部，更优选丝状菌。其中优选的丝状菌可例举属于青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)的种类，但其中更优选青霉属丝状菌作为来源生物。并且青霉属中的薄刺青霉(Penicilliumlilacinoechinulatum)或意大禾U青霉(Penicilliumitalicum)更j尤选来自本发明的GDH的菌株。这些菌株通过依赖从各菌株保藏机关分售，可容易地获得。且薄刺青霉更优选在产品评价技术基础机构，生物资源部门注册的保藏编号NBRC6231的菌株，意大利青霉更优选保藏编号NBRC32032的菌株。且本发明的特征还在于底物特异性高，对麦芽糖的作用小于对葡萄糖的作用性的1%，且对半孚L糖的作用性小于对葡萄糖的作用性的2%。此处所述的作用性是指底物浓度为4mM时的GDH活性，其测定方法根据后述试验例，但使用的反应液浓度组成中底物浓度调节为最终浓度4mM。且从其他观点来看，本发明来自真核生物，是具有以下特性的葡萄糖脱氢酶。(a)通过凝胶过滤发现的分子量约270kDa;(b)最适反应温度50°C;(c)最适反应pH值约6.5;(d)温度稳定性55°C加热处理15分钟后GDH活性残存率为至90%以上，60°C加热处理15分钟后GDH活性残存率为40%以上。(e)pH稳定性5.08.0(25。C处理16小时后活性残存率为90%以上)；(f)底物特异性对葡萄糖的作用性为100%时，对木糖为约10%,对2-脱氧-D-葡萄糖具有约14%的作用性，对麦芽糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、松三糖、山梨糖、核糖、麦芽三糖、麦芽四糖及海藻糖反应性不足2%;(g)化学影响受到铜、银及镉的强抑制，受到碘乙酸、N-乙基马来酰亚胺、羟胺及叠氮钠的抑制。来源真核生物如可生产具有上述特性的GDH，无特别限定，优选丝状菌，进一步优选青霉属丝状菌，更优选薄刺青霉。进一步优选作为保藏编号NBRC6231的在产品评价技术基础机构生物资源部门注册的菌株。且本发明是来自真核生物的具有以下特性的葡萄糖脱氢酶。(a)通过凝胶过滤发现的分子量7993kDa;(b)最适反应温度60°C;(c)最适反应pH值约6.5;(d)温度稳定性55°C加热处理15分钟后GDH活性残存率为95%以上，60°C加热处理15分钟后GDH活性残存率为70%以上；(e)pH稳定性5.08.0(25。C处理16小时后活性残存率为80%以上);(f)底物特异性对葡萄糖的作用性为100%时，对木糖为约10%,对2-脱氧-D-葡萄糖具有约17%的作用性，对麦芽糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、松三糖、山梨糖、核糖、麦芽三糖、麦芽四糖及海藻糖反应性低于2%;(g)化学影响受到铜、银及镉的强抑制，受到铁、锌、碘乙酸、N-乙基马来酰亚胺及羟胺的抑制。来源真核生物如可生产具有上述特性的GDH，无特别限定，优选丝状菌，进一歩优选青霉属丝状菌，更优选意大利青霉。进一步优选保藏编号NBRC32032的在产品评价技术基础机构生物资源部门注册的菌株。在判别是否具有上述记载的pH稳定性时，作为本发明所示的加温处理条件，以使GDH在浓度20mM醋酸缓冲液(pH4.56.0)、PIPES缓冲液(pH6.07.5)或Tris盐酸缓冲液(pH7.08.5)中分别为1U/mL的活性而溶解的状态加温15分钟。且根据一下试验例中所示方法测定的值。上述所示的凝J交过滤的处理条件如下所示。使用的色谱柱为东曹(TOSOH)株式会社制TSK-GELG3000SW(7.5mmx300mm)，使用的缓冲液为50mMTris-HCl150mMNaCl(pH7.5)，装入的样品量为25^L、以流速0.5mL/分钟来分离。根据预先用标准蛋白质制作的标准曲线，由资料的峰值出现位置计算分子量。峰出现位置的特定方法，可通过紫外光测定进行监测，且将透过色谱柱的液体进行组分提取，也可通过特定GDH活性的峰值组分进行。如上所述化学的影响的测定条件，在后述试验例中所示的反应试剂中使各化学物质溶解到最终浓度为2mM，使用0.15U/mL的GDH溶液根据试验23例的方法进行活性测定，将通过不加入该化学物质的反应试剂测定的活性进行比较。本发明中"受到阻碍"，是指本方法中添加该化学物质时与无添加条件相比可看出有10%以上的活性降低，且"受到强阻碍"，是指本方法中添加该化学物质时与无添加条件相比可看出有50%以上的活性降低。且从其他观点来看，本发明是含有序列号2所示的氨基酸序列，且具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。其使序列号2所示的氨基酸序列中，l个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入或附加后的氨基酸序列，且具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质也包含在本发明中。且与序列号2所示的氨基酸序列有80%以上同源性，更优选具有85%以上，进一步优选90%以上同源性的蛋白质也属于本发明的范畴。且这些序列中的氨基酸残基，也可在表达过程中受到糖链附加或甲基化等种种的修饰。本发明是含有序列号4所示的氨基酸序列，且具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。其使序列号4所示的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入或附加后的氨基酸序列，且具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质也包含在本发明中。且与序列号4所示的氨基酸序列有80%以上同源性，更优选具有85%以上，进一步优选90%以上同源性的蛋白质也属于本发明的范畴。且这些序列中的氨基酸残基，也可在表达过程中受到糖链附加或甲基化等种种的修饰。本发明的GDH，对于序列号2及序列号4中所示的氨基酸序列，是不失去葡萄糖脱氢酶活性的范围内缺失N末端侧的多个连续的氨基酸残基后的蛋白质。缺失的残基数如在不失去该GDH活性的范围内，无特别限定，但作为标准，例如，缺失相当于信号序列的N末端序列或预领,当于信号序列的N末端序列后的蛋白质。在不依赖基因重组的该GDH的生产、使用与该GDH的来源生物具有同样的分泌表达机构的宿主的重组GDH生产中，所得到的GDH是去除了分泌信号的成熟型GDH，其氨基酸序列可认为是缺失了序列号2及序列号4中所示的氨基酸序列中相当于N末端侧的信号序列的部分。且如原核微生物使用与该GDH的来源生物性质不同的宿主进行重组GDH生产时，可表达去除了编码相当于或相当于预测信号序列的N末端序列信号序列的基因。此时，去除了缺失序列的末端的氨基酸残基为蛋氨酸以外时，优选附加起始密码子(ATG)。或可在缺失N末端序列通过衔接子(adapter)连接标签基因，表达后用位点特异性肽酶等消化连接部分来制备N末端缺失GDH。这种N末端区域的预测方法，可使用预领,号肽的各种工具，这种工具的例子有SignalPvar.3.0。可在此程序的服务器(http:〃www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)上输入在线预测。通过此方法预测的信号序列部分，对于序列号2为起始密码子15位Ala、或起始密码子22位Ser的任一个，另一方面对于序列号4，为起始密码子15位Ala、或起始密码子19位Ala的任一个。特别是在原核微生物为宿主进行重组GDH表达时，除去上述N末端区，与不除去时相比具有培养液中的GDH活性提高的优点。本发明中所述的"同源性"，是指使用该
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中公知的数学计算方法比对2个氨基酸序列时，最佳比对(优选的是，该算法用于最佳比对时向序列的一方或双方导入空位)中，对于重叠的全氨基酸，指同一氨基酸残基的比例(％)。本发明中所述同源性，为非专利文献5中记载的算法整合了BLAST程序而算出的值。非专利文献5:Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)Vol.90p5873-5877。含有序列号2中所示序列的GDH与含有序列号4中所示序列的GDH对热的稳定性均高，此特征是一致的，此2种GDH间的氨基酸序列上同源性极高，为80%，且根据NCBI-BLAST检索结果，与这些GDH的序列有超过55%同源性的氨基酸序列至今还不为人所知。因此，作为赋予根据本发明的GDH特征的指标之一，可例举为序列号2或序列号4所示的同源性的高度为具有80%以上，更优选85%以上，进一步优选90%以上同源性的蛋白质在工业上有优势。且本发明提供培养真核微生物，并提取及纯化具有上述特性的葡萄糖脱氢酶的制造方法。真核微生物可例举丝状菌、酵母、真核藻类，如在此范围内可生产GDH，无特别限定，但优选丝状菌，更优选青霉属丝状菌，进一步优选薄刺青霉或意大利青霉。只要是相当于上述属、种名的菌株，均可用于本发明，可进一步优选使用薄刺青霉NBRC6231或意大利青霉NBRC32032。培养微生物的培养基，如微生物可生长发育且可生产本发明中所示的GDH，无特别限定，但更优选含有微生物生长发育必需的碳源、无机氮源^/或有机氮源，进一步优选可适于通气搅拌的液体培养基。为液体培养基时，碳源例如可例举葡萄糖、葡聚糖、甘油、可溶性淀粉、蔗糖等，氮源例如可例举铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉浸膏、脱脂大豆及马铃薯提取液。且根据需要，还可含有其他营养素(例如氯化铞、磷酸二氢钠及氯化镁等的无机盐类、维生素类)。培养方法根据该领域中已知的方法。例如，在含有上述营养素的液体培养基中接种微生物的孢子或生育状态的菌体，通过静置或通气搅拌增殖菌体，但可优选通过通气搅拌培养。培养液的pH值优选59，进一步优选68。温度通常为1442。C，更优选2040。C。通常持续培养14144小时，但可优选在各种培养条件下，GDH的表达量为最大时终止培养。分辨此时的对策，可通过进行培养液的抽样、测定培养液中的GDH活性来监测其变化，将GDH活性无经时上升时视为峰值以终止培养。从上述培养液中提取GDH的方法，在回收菌体内积累的GDH时通过离心分离或过滤等的操作只收集菌体，将此菌体在溶剂、优选水或缓冲液中再悬浮。再悬浮的菌体通过公知的方法破碎，可在溶剂中提取菌体中的GDH。破碎方法，可使用溶菌酶或物理破碎的方法。溶菌酶只要是具有消化真菌细胞壁的能力的酶，无特别限定，但可适用的酶可例举Sigma公司制的"溶细胞酶(1yticase)"等。此外，物理破碎的方法，例如可例举超声波破碎、玻璃珠破碎及弗式压碎器等。破碎处理后的溶液，可通过离心分离或过滤去除残渣，得到GDH粗提液。当回收菌体外分泌的GDH时，通过离心分离或过滤等的操作去除菌体将培养液上清作为粗提取GDH，可用于以下工序。此外，作为本发明中的培养方法，也可通过固体培养。优选在适当控制的温度、湿度等的条件下，在小麦等麸子上使具有本发明的GDH生产能力的真核微生物繁殖。此时，培养可静置，或也可搅拌使其生长发育。GDH的提取是在培养物中加入溶剂、优选水或缓冲液使GDH溶解，通过离心分离或过滤除去菌体、麸子等的固体物质。本发明的GDH，可通过克隆(或化学合成)编码该蛋白质的核酸(以下也记为GDH基因)，从含有载持该核酸的表达载体或在基因组DNA中重组插入该核酸而成的转化微生物的培养物中分离/纯化来审隨。酶基因的克隆可根据公知的方法进行。从生产所需酶的组织或细胞中完全或部分纯化该酶，将其N末端的氨基酸序列通过Edman分析及质谱分析进行。此外，对于将该酶使用位点特异性肽键内切酶等部分分解后得到的肽同样确定氨基酸序列。以具有对应如此确定的氨基酸序列的碱基序列的寡核苷酸为探针，从CDNA文库或基因组文库中通过菌銜或噬菌斑)杂交来克隆。作为探针，可使用以酶产生生物的基因组DNA或cDNA为模板，以上述寡核苷酸为引物进行PCR扩增的GDH基因部分序列。或将上述部分序列的旁侧序列通过反向PCR法或RACE法确定来确定基因序列全长的碱基序列，也可将相当于GDH基因的部分进行PCR扩增。或也可对该酶或其部分分解产物使用抗体，通过从基因组DNA或cDNA文库中进行抗体筛选来进行克隆。编码本发明的GDH的核酸，是编码含有例如序列号2及序列号4所示的氨基酸序列的多肽或与其实质上同一的肽的核酸。作为此种核酸序列的例子，例如，可例举为序列号1及序列号3所示的序列，但也可进一步去除编码相当于该多肽中的信号序列的部分的序列。或也可取代为编码全体同一或對以的氨基酸的其他密码子，或也可在导入丝状菌或昆虫细胞或动物细胞等真核宿主中时，插入相当于内含子的序列。且编码本发明的GDH的核酸，可例举为包含与序列号1或序列号3所示的碱基序列的互补碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，且编码与具有序列号2或序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质实质上具有同等性质的蛋白质的核酸。本领域技术人员通过使杂交反应及洗涤时的温度、杂交反应液及洗涤液的盐浓度等发生改变，可容易地选择严谨条件。具体地说，6xSSC(0.9MNaCl，0.09M柠檬酸三钠)或6XSSPE(3MNaCl，0.2MNaH2P04，20mMEDTA2Na，pH7.4)在42。C下杂交，进一步在42。C通过0.5xSSC洗涤的条件，可作本发明的严谨条件的1例，但不限于此。优选50%甲酰胺、6xSSC(0.9MNaCl，0.09M柠檬酸三钠)或6xSSPE(3MNaCl，0.2MNaH2P04，20mMEDTA2Na，pH7.4)在42。C进行杂交，且进一步在42。C下通过0.1xSSC洗涤的条件。核酸可以是DNA也可以是RNA、或也可以是DNA/RNA嵌合体，但优选DNA，且该核酸为RNA时，就例如碱基序列中的"t"读成V。本发明还提供包含编码本发明的GDH的核酸的核酸分子。此种核酸分子，可例如在质粒载体或病毒载体中插入GDH基因后的重组载体。本发明的重组质粒优选在宿主细胞中可保持复制或自主增殖的质粒，但以在基因组DNA中导入所需核酸为目的时，则不必需在宿主细胞中复制。使用的载体可使用适合原核^/或真核细胞的各种宿主细胞的重组表达系统，优选在插入所需核酸的位点，进一步优选在宿主细胞中在可起作用的启动子的下游的可控制的位点具有限制酶位点的载体。可将上述GDH基因使用限制酶及连接酶、或根据需要使用接头或衔接子(adaptor)DNA连接。或使用如Taq聚合酶的在扩增末端附加一碱基的DNA聚合酶扩增制备的基因片段，也可通过TA克隆与载体连接。此外，该核酸分子中的GDH基因中，以提高培养表达中目的蛋白的可溶性或容易进行培养液中的该GDH蛋白质的纯化为目的，可连接报告基因及标签序列等，此种序列可例举谷胱甘肽-S-转移酶基因、麦芽糖结合蛋白基因或6xHis标签等。且这些基因、标签序列与该GDH基因间也可进一步插入间隔序列。用于本发明的载体，例如可例举大肠杆菌用pBR322、pUC18、pBluescript及SK(-)等，酵母用pSH19、pSH15等，枯草杆菌用pUB110及pTP5等，但不限于此。在宿主细胞中的功能性启动子，例如，可例举大肠杆菌中的trp启动子、lac启动子，酵母中的GAP启动子、AGH启动子，枯草杆菌中的SP01启动子及penP启动子等，但不限定于此。且质粒中优选进一步含有用于转化体筛选的选择标记基因，但此种标记基因可例举针对以氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、潮霉素等为代表的抗生物质的抗性基因或与宿主的营养缺陷型突变互补的基因等。导入制备的核酸分子的宿主，除可使用确立了重组表达系统的各种菌、放线菌、酵母、丝状菌等的微生物以外，还可使用昆虫细胞、动物细胞、高等植物等，但优选微生物。转化的方法可使用该领域公知的方法，但无特别限定，除可使用电穿孔以外，还可使用通过细胞壁溶解酶、各种药剂处理成为感受态的细胞，使用这些时的核酸的导入可通过将核酸分子与感受态细胞混合后孵育或进一步给予热激等的适当的方法。转化微生物的培养方法，可通过根据上述微生物培养方法的方法，但由于只使导入了所需核酸分子的转化微生物选择性生长，因此优选使用添加了与标记基因对应的抗生物质的培养基、除去与互补营养缺陷型对应的物质的最少培28养基进行培养纯化。另外，在GDH的培养生产中添加与用于强化该GDH表达的各启动子对应的表达诱导物质，或通过温度条件诱导的启动子，均可作为与其相适应的温度条件。此外，培养后培养液中的该GDH的提取方法，也可根据上述真核微生物培养物中的GDH提取方法进行。GDH的纯化，可通过适当组合与存在GDH活性的组分相应的通常使用的各种的分离技术来进行。从上述GDH提取液，例如可适当选择盐析、溶剂沉淀、透析、超滤、凝胶过滤、非改性PAGE、SDS-PAGE、离子交换色谱法、羟基磷灰石色谱法、亲和色谱法、反相高效液相色谱法、等电点电泳等的公知的分离方法进行。特别是在该GDH上附加标签时，可使用对其标签具有亲和性的色谱柱。例如，附加6xHis标签时通过使用镍柱可简便地提高该GDH的纯度。此外，可在提取的GDH或纯化的GDH溶液中添加各种稳定剂。此种物质，例如可例举甘露糖醇、海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、赤藓糖醇、甘油等为代表的糖*糖醇类，谷氨酸、精氨酸等为代表的氨基酸，牛血清白蛋白、卵白白蛋白、各种伴侣蛋白等为代表的蛋白质《肽类等。这些物质可单独添加或适当选择2种以上同时使用。且本发明的GDH可以液状提供，但也可通过冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥等进行粉末化。此时，GDH可使用溶解在缓冲液中的物质，进一步优选作为赋形剂或稳定剂添加糖糖醇、氨基酸、蛋白质、肽等。且也可在粉末化后进一步造粒。用于上述所示的GDH的提取纯化粉末化的缓冲液的组成，无特别限定，但优选只要在pH58的范围内具有缓冲能力的物质即可，例如可例举硼酸、Tris盐酸、磷酸钾等的缓冲液，BES、Bicine、Bis-Tris、CHES、EPPS、HEPES、HEPPSO、MES、MOPS、MOPSO、PIPES、POPSO、TAPS、TAPSO、TES及Tricine的Good's缓冲液。第2实施方式本发明者为实现上述目的，禾U用NCBI数据库，发现了推测为葡萄糖脱氢酶的基因DNA。含有序列号7记载的碱基序列的DNA僅因)由NCBI数据库预测，包含编码来自米曲霉RIB40株的葡萄糖脱氢酶的DNA(基因)，是不除去内含子的基因组基因序列。含有序列号8记载的碱基序列的DNA(基因)，是从序列号7中除去内含子的基因组基因序列。编码含有序列号9记载的氨基酸序列的蛋白质的基因，表示由NCBI数据库预测的葡萄糖脱氢酶基因的全序列。本发明者预测，由非专利文献14、NCBI数据库等中，可容易地鉴定来自米曲霉的编码具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA(基因)。具体地说，本发明者虽未特定NCBI数据库中编码来自米曲霉的黄素结合型葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列及碱基序列部分，但参考非专利文献14中记载的方法及公知的技术，尝试了以下方法，即培养米曲霉，由其培养上清中使用各种色谱法纯化GDH，分析其末端氨基酸序列等制备探针，分离编码葡萄糖脱氢酶的基因。同样，本发明者独自得到属于土曲霉的微生物，尝试分离编码葡萄糖脱氢酶的基因。本发明者进行种种探讨，证实了使用通常实施的盐析及色谱等的纯化法中，从米曲霉TI株培养上清中，获得高纯度、在SDS-PAGE上可清楚确认的GDH标准品是困难的。与酶蛋白质结合的糖链推测是纯化、确认困难的原因之一。因此，判断为必须放弃利用获得基因的通常方法之一的部分氨基酸序列进行克隆的想法。因此，基因获得虽然伴随了大量的试验失败，且极为困难，但锐意研究的结果，分离出了编码来自米曲霉的黄素结合型葡萄糖脱氢酶的基因，从而完成了本发明。其详细内容如实施例1B3B中所述。本发明的实施方式之一是制造方法，其是具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的制造方法，其特征在于，通过含有具有以下(a)，(b)，(c)，(d)中任一项的基因或编码以下(e)或(f)的蛋白质的基因的重组载体，在营养培养基中培养转化体，提取具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。(a)含有序列号11中记载的碱基序列的DNA(基因)，是本申请发明者鉴定的，表示后述的编码来自米曲霉TI株的具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA(基因)的全序列。(c)和含有与具有序列号ll中记载的碱基序列的DNA相互补的碱基序列的DNA在严谨条件下杂交，且编码具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA(基因)，也包含于本发明。(b)含有序列号14记载的碱基序列的DNA(基因)，包含后述的编码来自米曲霉TI株的具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA(基因)，是不除去内含子的基因组基因序列。(d)和含有与具有序列号14中记载的碱基序列的DNA相互补的碱基序列的DNA在严谨条件下杂交，且包含编码葡萄糖脱氢酶活性区域的DNA，也包含于本发明。(e)编码含有序列号10中记载的氨基酸序列的蛋白质的基因，表示后述的编码来自米曲霉TI株的具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA谨因)的全序列。①由编码序列号10中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加(插入)后的氨基酸序列组成，且具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA(基因)，也包含于本发明。本发明的DNA(基因)，也可包含为使该GDH表达提高而改变了密码子选择(CodonUsage)的。例如，将上述来自米曲霉的GDH基因插入到表达用载体(质粒等多个载体在该
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己知)，转化适合的宿主(大肠杆菌等多个宿主在该
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已知)。培养得到的转化体，从培养液中用离心分离回收菌体后，将菌体用机械式方法或溶菌酶等的酶法破坏，且根据需要可添加EDTA等的螯合剂、表面活性剂等进行可溶化处理，可得到含有GDH的水溶性组分。且通过使用适合的宿主载体系统，可使表达的GDH直接在培养液中分泌出来。可将如上所述得到的含有GDH的溶液例如通过减压浓縮、膜浓縮、进一步通过硫酸铵、硫酸钠等的盐析处理、或通过亲水性有机溶剂例如甲醇、乙醇、丙酮等的分别沉淀法来进行沉淀即可。此外，加热处理、等电点处理也是有效的纯化方法。且通过吸附剂、凝胶过滤剂等进行凝胶过滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法，也可得到经纯化的GDH，该纯化酶标准品优选在显示电泳(SDS-PAGE)的单一的条带的程度上被纯化。这些例如可根据以下文献进行。(a)夕yZ夕質実験7。口卜〕一小(蛋白质实验报告)第1巻功能分析编，第2巻结构分析编(秀润社)西村善文，大野茂男主编(b)改訂夕y^夕質実験乂一卜上抽出ir分離精製(修订蛋白质实验笔记上提取与分离纯化)(洋土社)冈田雅人，宫崎香编辑(c)夕y^夕質実験0進力力、/"c(蛋白质实验的方法)(洋土社)冈田雅人，宫崎香编辑或也可根据以下举例的方法进行。制备的具有蛋白质的遗传信息的DNA以与载体连接的状态导入宿主微生物中。载体，在宿主微生物内可自主增殖的噬菌体或质粒中作为基因重组用而构建的载体较为适合。噬菌体，例如以大肠杆菌为宿主微生物时为Lambdagt10、Lambdagtll等。质粒，例如以大肠杆菌为宿主微生物时为pBR322、pUC19、pKK223-3、pBluescript等。其中，pBluescript等优选在克隆位点上游保留在大肠杆菌内可识别的启动子。此外，适合的宿主微生物，只要是重组载体稳定，且可自主增殖、可表达外源基因的性状的宿主，无特别限定。大肠杆菌可使用大肠杆菌W3110、大肠杆菌C600、大肠杆菌HBIOI、大肠杆菌JW109、大肠杆菌DH5a等。宿主微生物导入重组载体的方法，例如宿主微生物属于埃希氏菌属的微生物时，可采用在Ca离子存在下进行重组DNA的导入的方法等，也可进一步使用电穿孔法。并且，也可使用市售的感受态细胞(例如，CompetenthighDH5a;东洋纺织制)。宿主，是用酵母时可使用锂法、电穿孔法，且使用丝状菌时可使用原生质体法等。本发明中，得到编码GDH的基因的方法可例举如下方法。使用米曲霉基因组序列信息，可发现预测GDH基因。然后，由米曲霉制备mRNA，合成cDNA。以如此得到的cDNA为模板，通过PCR扩增GLD基因，将该基因在32载体和两DNA的平末端或粘性末端中通过DNA连接酶等使其结合闭链，构建重组载体。将该重组载体导入可复制的宿主微生物后，可得到利用载体的标记物含有编码GDH的基因的重组微生物。如上述得到的转化体的微生物，通过在营养培养基中培养，可稳定生产大量的GDH。重组体的选择，如可检索同时表达载体的标记物和GDH活性的微生物即可。例如，可选择基于抗药性标记物在选择培养基上生长，且生成GDH的微生物。GDH基因的碱基序列，可通过Science214:1205，1981中记载的双脱氧法解读。此外，GDH的氨基酸序列由上述确定的碱基序列推定。如上所述，由保存有一旦被选择的GDH基因的重组载体，向其他微生物可复制的重组载体的导入，由保留GDH基因的重组载体通过限制酶、PCR法回收作为GDH基因的DNA，通过与其它载体片段结合可容易地实施。且这些载体向其他微生物的转化，可使用通过转处理的感受态细胞法、电穿孔法、原生质体法等。且本发明的GDH基因，只要具有葡萄糖脱氢酶活性，可具有该基因在翻译后的氨基酸序列的各氨基酸残基的一部分发生缺失或取代的DNA序列，也可具有其他氨基酸残基附加或取代后的DNA序列。改变编码野生型GDH的基因的方法，可使用通常进行的改变遗传信息的方法。即通过改变具有蛋白质的遗传信息的DNA的特定碱基，或通过插入或缺失特定碱基，可制成具有改变蛋白质的遗传信息的DNA。改变DNA中的碱基的具体的方法，例如可例举市售的试剂盒(TransformerMutagenesisKit;Clonetech制，EXOIII/MungBeanDeletionKit;Stratagene制，QuickChangeSiteDirectedMutagenesisKit;Stratagene制等)的使用，或聚合酶链式反应法(PCR)的利用。作为转化体的宿主微生物的培养形态，可考虑宿主的营养生理性质来选择培养条件。多个场合进行液体培养，进行工业化通气搅拌培养较为有利。但是，考虑到生产率，使用作为宿主的丝状菌，进行固体培养较为有利。培养基的营tm，可广泛使用通常用于微生物培养的物质。作为碳源，只要是可同化的碳水化合物即可，例如可使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乳糖、糖蜜及丙酮酸等。且作为氮源，只要是可利用的氮化合物即可，例如可使用蛋白胨、肉浸膏、酵母浸膏、酪蛋白水解物、大豆粕碱性提取物等。其他，还可根据需要，只用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等的盐类、特定的氨基酸、特定的维生素等。培养温度可在菌生长，生产GDH的范围内适当变更，但优选2037。C。培养时间因条件不同而多少有些不同，但可在GDH达到最高收量时的适当时期结束培养，通常为648小时左右。培养基的pH可在菌生长，生产GDH的范围内适当变更，但优选pH6.09.0左右。直接抽取、禾拥含有生产培养物中的GDH的菌体的培养液，但通常可根据常法，在GDH在培养液中存在时通过过滤、离心分离等，将含有GDH的溶液和微生物菌体分离后应用。GDH在培养液中存在时，从所得到的培养物中通过过滤或离心分离等的方法提取菌体，然后，将此菌体用机械式方法或溶菌酶等的酶法破坏，且根据需要，添加EDTA等螯合剂及表面活性剂将GDH进行可溶化处理，作为水溶液分离提取。如上所述得到的含有GDH的溶液，例如可通过减压浓縮、膜浓縮、进一步通过硫酸铵、硫酸钠等的盐析处理、或通过亲水性有机溶剂例如甲醇、乙醇、丙酮等的分别沉淀法来进行沉淀即可。此外，加热处理、等电点处理也是有效的纯化方法。而后通过吸附剂、凝胶过滤剂等进行凝胶过滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法，可得到经纯化的GDH，例如，可通过Sephadex凝胶(GEHealthCareBioscience公司制)等进行凝胶过滤、通过DEAESepharoseCL-6B(GEHealthCareBioscience公司制)OctylSepharoseCL-6B(GEHealthCareBioscience公司制)等的柱色谱法分离、纯化，可得到纯化酶标准品。该纯化酶标准品优选在显示电泳(SDS-PAGE)的单一条带的程度上纯化。第3实施方式本发明的实施方式之一GDH的生产方法，其特征在于，在重组生产来自丝状菌的GDH的方法中，通过在其N末端区存在的信号肽序列中导入突变，与导入突变前相比提高了该靶酶的表达量。本发明者为得到大收量的GDH蛋白质而锐意努力的结果，为实现上述目的，首先作为其改变的根源的基因DNA，利用上述发明中米曲霉的基因组信息，发现了推测为葡萄糖脱氢酶的基因DNA。本发明者利用NCBI数据库，发现了推测为FAD依赖性葡萄糖脱氢酶的基因DNA。本发明者预想，从非专利文献14及NCBI数据库等中，编码具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA(基因)的鉴定可容易进行。且制备含有该基因的重组载体，制作转化了的转化体，使纯化转化体表达的该基因编码的蛋白质的操作也可容易地进行。具体地说，参考非专利文献14中记载的方法、公知技术培养米曲霉，尝试所从其培养上清中使用各种色谱法纯化GDH，制备分析其末端氨基酸序列等的探针，分离编码GDH的基因。本发明者进行了种种探讨，但从通常进行的使用盐析及色谱法等的纯化法中可知，从米曲霉培养上清中，获得高纯度、在SDS-PAGE上可清楚确认的GDH标准品是困难的。与酶蛋白质结合的糖链推测是纯化、确认困难的原因之一。因此，判断为不得不放弃利用获得基因的通常方法之一的部分氨基酸序列进行克隆的想法。因此，基因获得虽然伴随了大量的试验失败，且极为困难，但经过锐意研究的结果，分离出了编码来自米曲霉的葡萄糖脱氢酶的基因。其详细内容见后述实施例。且本发明者还对其它起源的GDH基因的获得进行种种探讨，分离出了编码来自青霉属(Penicilliumlilacinoechinulatum)的GDH的基因及编码来自土曲霉的GDH。其详细内容见后述实施例。本发明的基因，包含为进一步提高该GDH的表达而变更密码子选择(CodonUsage)后的产物。信号肽作为在成熟型蛋白质的N末端延长残基数1530个的延长肽存在。该肽序列中，具有疏水性氨基酸区域，起着向新生多肽链的内质网膜附着及膜通过的先导作用，膜通过后则被切断。本发明中的来自丝状菌的GDH重组体无特别限定，但可例如将曲霉属及青霉属等作为GDH基因的供给源的GDH重组体。优选曲霉属的GDH，进一步优选米曲霉，最优选序列号10、18中任一个记载的具有氨基酸序列的GDH。这些GDH重组体，编码该GDH的基因通过PCR法获得，将此基因插入到表达用载体中，培养在适当的宿主中转化的转化体，从培养液中通过离心分离等回收菌体后，将菌体用机械式方法或溶菌酶等的酶法破坏，且根据需要可添加EDTA等的螯合剂、表面活性剂等进行可溶化处理，可得到含有GDH的水溶性组分。且通过使用适合的宿主载体系统，可使表达的GDH直接在培养液中分泌出来。本发明中，通过GDH的N末端区存在的信号肽的氨基酸序列的一部分发生缺失或取代，可使信号肽的功能斷氐。例如，具有序列号10中记载的氨基酸序列的GDH中，通过切除其N末端存在的MLFSLAFLSALSLATASPAGRA的一部分或全部，可使信号肽的功能降低。或也可通过122氨基酸取代^/或氨基酸插入来进行。具体的取代位置例如可为信号肽的切割部。优选可通过将相当于信号肽的C末端的丙氨酸与其他氨基酸取代，来使功能降低。该耙酶的表达量与信号肽存在的状态相比是否提高，可比较向该序列的突变导入前后每lml培养液中的总活性值来确认。且信号肽序列的改变，可通过使用艾德曼降解法的N末端氨基酸测序来确认。通过使N末端区存在的信号肽的功能缺失，发现可提高GDH蛋白质的表信号肽的预测工具，经常利用PSORT、SignalP软件。可分别用web从"psort.nibb.ac.jp/"或"www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/"的网址中利用。使用SignalP软件，预测由来自米曲霉的GDH基因推测的氨基酸序列(序列号9)的信号肽切害lj位置时，认为第16位丙氨酸和第17位丝氨酸之间、或第22位丙氨酸和第23位赖氨酸之间切割的可能性高(图8)。例如，将来自米曲霉的GDH基因插入到表达载体(质粒等多个载体在该
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已知)，培养在适合的宿主(大肠杆菌等多个宿主在该
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已知)转化的转化体，从培养液中用离心分离回收菌体后，将菌体用机械式方法或溶菌酶等的酶法破坏，且根据需要可添加EDTA等的螯合剂、表面活性剂等进行可溶化处理，可得到含有GDH的水溶性组分。且通过使用适合的宿主载体系统，可使表达的GDH直接在培养液中分泌出来。36可将如上所述得到的含有GDH的溶液例如通过减压浓縮、膜浓縮、进一步通过硫酸铵、硫酸钠等的盐析处理、或通过亲水性有机溶剂例如甲醇、乙醇、丙酮等的分别沉淀法来进行沉淀即可。此外，加热处理、等电点处理也是有效的纯化方法。且通过吸附剂、凝胶过滤剂等进行凝胶过滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法，也可得到经纯化的FADGDH，该纯化酶标准品优选在显示电泳(SDS-PAGE)的单一条带的程度上被纯化。这些例如可根据以下文献进行。(a)夕://、°夕質実験7°口卜〕一/K蛋白质实验报告)第l巻功能分析编，第2巻结构分析编(秀润社)西村善文，大野茂男主编(b)改訂夕乂八°夕質実験/一卜上抽出^分離精製(修订蛋白质实验笔记上提取与分离纯化)(洋土社)冈田雅人，宫崎香编辑(c)夕乂^夕質実験(D進&力、t(蛋白质实验的方法)(洋土社)冈田雅人，宫崎香编辑或也可根据以下举例的方法进行。本发明进一步包含含有编码GDH的基因、用该载体转化的转化体。具有制备的蛋白质的遗传信息的DNA，以与载体连接的状态导入宿主微生物，形成生产改变蛋白质的转化体。作为载体使用质粒时，例如，以大肠杆菌(Escherichiacoli)为宿主微生物时，可使用pBluescript、pUC18等。作为宿主微生物，例如，可利用大肠杆菌W3110、大肠杆菌C600、大肠杆菌JM109、大肠杆菌DH5a等。作为向宿主微生物导入重组载体的方法，例如，宿主微生物为属于埃希氏菌属的微生物时，可采用在钙离子存在下进行重组DNA的导入的方法等，还可使用电穿孔法。还可使用市售的感受态细胞(CompetenthighDH5ct;东洋纺织制)。此种基因可从这些菌株中提取，也可化学合成。还可通过PCR法的利用，得到含有GDH基因的DNA片段。本发明中，获得编码来自丝状菌的GDH的基因的方法，可例举如下方法。首先，参照米曲霉的GDH基因的序列信息，可获得目的丝状菌的预测GDH基因。由该丝状菌制备mRNA，合成cDNA。将如此得到的cDNA作为模板，通过PCR扩增GDH基因，将该基因在载体和两DNA的平末端或粘性末端中通过DNA连接酶等使其结合闭链，构建重组载体。将该重组载体导入可复制的宿主微生物后，可得到利用载体的标记物含有编码GDH的基因的重组微生物。GDH基因的碱基序列，通过Science214:1205，1981中记载的双脱氧法解读。且GDH氨基酸序列由上述确定的碱基序列确定。如上所述，由保存有一旦被选择的GDH基因的重组载体，向其他微生物导入可复制的重组载体，由保留GDH基因的重组载体通过限制酶、PCR法回收作为GDH基因的DNA，通过与其它载体片段结合可容易地实施。且由这些载体向其他微生物的转化，可使用通过钙处理的感受态细胞法、电穿孔法、原生质体法等。且本发明的GDH基因，只要具有葡萄糖脱氢酶活性，可具有该基因在翻译后的氨基酸序列的各氨基酸残基的一部分发生缺失或取代的DNA序列，也可具有其他氨基酸残基附加或取代后的DNA序列。改变编码野生型GDH的基因的方法，可使用通常进行的改变遗传信息的方法。即通过改变具有蛋白质的遗传信息的DNA的特定碱基，或通过插入或缺失特定碱基，可制成具有改变蛋白质的遗传信息的DNA。改变DNA中的碱基的具体的方法，例如可例举市售的试剂盒(TransformerMutagenesisKit;Clonetech制，EXOIII/MungBeanDeletionKit;Stratagene制，QuickChangeSiteDirectedMutagenesisKit;Stratagene制等)的使用，或聚合酶链式反应法(PCR)的利用。作为转化体的宿主微生物的培养形态，可考虑宿主的营养生理的性质择培养条件。多个场合进行液体培养，进行工业化通气搅拌培养较为有利。培养基的营养源，可广泛使用通常用于微生物培养的物质。作为碳源，只要是可同化的碳水化合物即可，例如可使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乳糖、糖蜜及丙酮酸等。且作为氮源，只要是可利用的氮化合物即可，例如可使用蛋白胨、肉浸膏、酵母浸膏、酪蛋白水解物、大豆粕碱性提取物等。其他，还可根据需要，只用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等的盐类、特定的氨基酸、特定的维生素等。培养温度可在菌生长、生产GDH的范围内适当变更，但优选2037。C。培养时间因条件不同而多少有些不同，但可在GDH达到最高收量时的适当时期结束培养，通过为648小时左右。来自丝状菌的GDH的重组体的培养中，控制该培养基的pH特别重要，优选在pH7.17.3以下控制，特别优选在pH6.07.3的范围控制培养。这样，通过控制pH来培养，可大量制备丝状菌GDH蛋白质。但是，来自丝状菌的GDH虽在pH7.0以下的酸性条件下保持高的稳定性，但在pH7.17.3以上却不稳定，可见急速的活性下降。因此，在本发明中，来自丝状菌的葡萄糖脱氢酶(GDH)的重组生产，优选将pH控制在培养时的7.3以下。来自丝状菌的GDH的培养生产中，此活性降低的比例，如pH值提高O.2，与原活性值相比会降低10%以上，因GDH不同最大可降低30%左右。因此，本专利中，从pH提高0.2，与原活性相比降低了10%以上的现象中，通过控制至赔性降低前培养液的pH以下，具体为7.3以下、优选7.1以下，来推测pH控制的有效性，实际上进行了研究确认。在重组体培养中，因担心菌体的死灭、目的蛋白质的分解，一般均进行pH控制，但一般将pH值保持在中性区域，如来自丝状菌的葡萄糖脱氢酶，还没有将pH{直控制在中性以下的必要性的先例。直接抽取、利用含有生产培养物中的GDH的菌体的培养液，但通常可根据常法，在GDH在培养液中存在时通过过滤、离心分离等，将含有GDH的溶液和微生物菌体分离后应用。GDH在培养液中存在时，从所得到的培养物中通过过滤或离心分离等的方法提取菌体，然后，将此菌体用机械式方法或溶菌酶等的酶法破坏，且根据需要，添加EDTA等螯合剂及表面活性剂将GDH进行可溶化处理，作为水溶液分离提取。如上所述得到的含有GDH的溶液，例如可通过减压浓縮、膜浓缩、进一步通过硫酸铵、硫酸钠等的盐析处理、或通过亲水性有机溶剂例如甲醇、乙醇、丙酮等的分别沉淀法来进行沉淀即可。此外，加热处理、等电点处理也是有效的纯化方法。而后通过吸附剂、凝胶过滤剂等进行凝胶过滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法，可得到经纯化的GDH，例如，可通过Sephadex凝胶(PharmaciaBiotech公司制)等进行凝胶过滤、通过DEAESepharoseCL-6B(PharmaciaBiotech公司制)、OctylSepharoseCL-6B(PharmaciaBiotech公司制)等的柱色谱法法分离、纯化，可得到纯化酶标准品。该纯化酶标准品优选在显示电泳(SDS-PAGE)的单一条带的程度上纯化。第4实施方式GDH是催化以下反应的酶。0-葡萄糖+电子传递物质(氧化型)—D-葡糖酸-S-内酯+电子传递物质(还原型)是催化氧化D-葡萄糖，生成D-葡糖酸-l，5-内脂的反应的酶，有关来源、结构无特别限定。可适用本发明的方法的GDH，只要是可溶性葡萄糖脱氢酶(GDH)，无特别限定。辅酶，例如，可为黄素化合物。可适用本发明的方法，作为辅酶使用FAD的GDH(FAD-结合型GDH)，无特别限定，例如，可例举来自属于真核生物范畴的丝状菌的青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)等的微生物的辅酶。这些微生物菌株可通过委托各菌株保藏机关转让，均可容易地获得。例如，青霉属的薄刺青霉(Penicilliumlilacinoechinulatum)，作为保藏编号NBRC6231在产品评价技术基础机构生物资源部门注册，且曲霉属的土曲霉，作为保藏编号NBRC33026在产品评价技术基础机构，生物资源部门注册。对于米曲霉，可根据实施例1B获得GDH基因。可适用本发明的方法的GDH，只要具有葡萄糖脱氢酶活性，上述例举的物质中其他的氨基酸残基可发生缺失或取代，还可附加其他的氨基酸残基。此种改变只要是本领域技术人员，均可利用该
技术领域：
公知的技术容易地实施。例如，为在蛋白质中定点诱变，用于取代或插入编码该蛋白质的基因的碱基序列的种种方法，如Sambrook等著，MelecularCloning(分子克隆)；ALaboratoryManual第2版(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,纽约40中记载。例如，使生产上述GDH的天然微生物或编码天然GDH的基因直接或发生突变后，插入表达载体(多个载体在该
技术领域：
已知，例如质粒)，培养在适当的宿主(多个宿主等在该
技术领域：
已知，例如大肠杆菌)中转化的转化体，从培养液中通过离心分离回收菌体后，将菌体用机械式方法或溶菌酶等的酶法破坏，且根据需要可添加EDTA等的螯合剂、表面活性剂等进行可溶化处理，可得到含有GDH的水溶性组分。且通过使用适合的宿主载体系统，可使表达的GDH直接在培养液中分泌出来。可将如上所述得到的含有GDH的溶液例如通过减压浓縮、膜浓缩、进一步通过硫酸铵、硫酸钠等的盐析处理、或通过亲水性有机溶剂例如甲醇、乙醇、丙酮等的分别沉淀法来进行沉淀即可。此外，加热处理、等电点处理也是有效的纯化方法。且通过吸附剂、凝胶过滤剂等进行凝胶过滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法，也可得到经纯化的GDH，该纯化酶标准品优选在显示电泳(SDS-PAGE)的单一的条带的程度上被纯化。在上述工序前后，为使相对于整体GDH酶蛋白质而提高完全型GDH的比例，优选2550。C、更优选3045°C的加热处理。本发明中GDH的浓度无特别限制。由于使用的酶的特性等不同适合的范围也不同，但从实用上，只要是使用该酶而可使葡萄糖的测定具有足够的可信性、为本领域技术人员可判断的浓度即可。例如，本发明中FADGDH的浓度无特别限定，但在溶液中，优选下限为0.01U/mL，进一步优选0.1U/mL，进一步优选0.2U/mL。优选上限为5000U/mL，进一步优选500U/mL，进一步优选50U/mL。在粉末或冷冻干燥物中优选同等程度的浓度，但为制备粉末标准品，可为5000U/mL以上的浓度。培养上述微生物的培养基，如微生物可生长发育且可生产本发明中所示的GDH，无特别限定，但更优选含有微生物生长发育必需的碳源、无机氮源^/或有机氮源，进一步优选可适于通气搅拌的液体培养基。为液体培养基时，碳源例如可例举葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等，氮源例如可例举铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉浸膏、脱脂大豆及马铃薯提取液等。且根据需要，还可含有其他营养素(例如氯化钙、磷酸二氢钠及氯化镁等的无机盐类、维生素类)。培养方法根据该领域中己知的方法。例如，在含有上述营养素的液体培养基中接种微生物的孢子或生长发育状态的菌体，通过静置或通气搅拌增殖菌体，但可优选通过通气搅拌培养。培养液的pH值优选59，进一步优选68。温度通常为1442°C，更优选2040。C。通常持续培养14144小时，但可优选在各种培养条件下，GDH的表达量为最大时终止培养。分辨此时的方法，可通过进行培养液的抽样、测定培养液中的GDH活性以监测其变化，将GDH活性无经时上升时看作峰值以终止培养。从上述培养液中提取GDH的方法，在回收菌体内积累的GDH时通过离心分离或过滤等的操作只收集菌体，将此菌体在溶剂、优选水或缓冲液中再悬浮。再悬浮的菌体通过公知的方法破碎，可在溶剂中提取菌体中的GDH。破碎方法，可使用溶菌酶或物理破碎的方法。溶菌酶无特别限定，但可适用的酶可例举Sigma公司制的"溶细胞酶(lyticase)"等。此外，物理破碎的方法，例如可例举超声波破碎、玻璃珠破碎及均质机破碎等。对于破碎处理后的溶液，可通过离心分离或过滤去除残渣来得到的GDH粗提液。此外，作为本发明中的培养方法，也可通过固体培养。优选在适当控制的显度、湿度等上，在小麦等的麸子上使具有本发明的GDH生产能力的真核微生物能繁殖。此时，培养可静置，或也可搅拌培养物等混合。GDH的提取是在培养物中加入溶剂优选水或缓冲液，使GDH溶解，通过离心分离或过滤除去菌体、麸子等的固体物质。GDH的纯化，可通过适当组合与存在GDH活性的组分相应的通常使用的各种的分离技术来进行。从上述GDH提取液，例如可适当选择盐析、溶剂沉淀、透析、超滤、凝胶过滤、非改性PAGE、SDS-PAGE、离子交换色谱法、羟基磷灰石色谱法、亲和色谱法、反相高效液相色谱法、等电点电泳等的公知的分离方法进行。本发明的提高GDH热稳定性的方法的一种形态，是在含有可溶性辅酶结核型葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物中，包括使(1)该酶与(2)选自不以该酶为底物的糖类或氨基酸类中的任一个以上的化合物共存的工序。添加的化合物优选选自海藻糖、甘露糖、松三糖、葡萄糖酸钠、葡糖醛酸钠、半乳糖、甲基-a-D-葡萄糖苷、环糊精、(X-D-蜜二糖、蔗糖、纤维二糖、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、BSA中的任一种以上。这些共存的各化合物的浓度无特别限定，在溶液中时，优选下限为0.001重量％，更优选0.01%，进一步优选0.1%。从混入异物的危险性来看，优选上限为30重量％，更优选20%及进一步优选10%。且实施例中记载的化合物的浓度，在溶液中时，用相对于溶剂的重量％表示，相对于粉末干燥物时，用相对于GDH酶的重量°/。表示。例如，对于粉末干燥物，相对于40mg/mL的GDH添加60%的稳定剂时，会溶解24mg稳定剂，此时溶液中的浓度为约2.4%。粉末稳定化的验证实验中，在显示溶液中热稳定化效果的浓度范围内有粉末稳定化效果，因而对于粉末稳定性，也可容易地推测为在与溶液中的浓度同样的范围内发挥效果。与这些共存的各化合物的浓度无特别限定，在溶液中，优选下限为0.01mM，更4尤选0.1mM，及进一步优选1mM。优选上限为10M，更优选5M，进一歩优选1M.制备粉末或冷冻干燥物时，通过在含有与溶液中同等程度的化合物浓度的组成中进行干燥处理，也可获得具有同样效果的干燥标准品。且在实施例中记载的化合物的浓度，为与GDH酶共存保存时的最终浓度。此外，本发明的含有GDH的组合物也可以液状提供，可通过冷冻干燥，真空干燥或喷雾干燥等进行粉末化处理。此时，GDH可使用溶解在缓冲液等中的物质，且作为赋形剂或稳定剂可添加上述化合物以外的糖'糖醇、氨基酸、蛋白质、肽等。此外，在粉末化处理后也可造粒。上述所示的用于GDH的提取纯化粉末化及稳定性试验的缓冲液组成无特别限定，但只要在pH58的范围内具有缓冲能力即可，例如可例举硼酸、Tris盐酸、磷酸钾等缓冲液，BES、Bicine、Bis-Tris、CHES、EPPS、HEPES、HEPPSO、MES、MOPS、MOPSO、PIPES、POPSO、TAPS、TAPSO、TES及Tricine的Good's缓冲液。此外，也可为例如苯二甲酸、马来酸、戊二酸等的二羧酸作为基础的缓冲剂。可适用其中的1种，也可使用2种以上。进一步也可为含有以上以外1种以上的复合组成。且作为这些的添加浓度，只要在具有缓冲能力的范围内，无特别限定，但优选上限为100mM以下，更优选50mM以下。优选下限为5mM以上。粉末或冷冲干燥物中缓冲剂的含量无特别限定，优选0.1%(重量比)以上，更优选0.180%(重量比)的范围。这些可适用各种市售试剂。如上所述的各种化合物，优选在制备葡萄糖测定试剂、葡萄糖检测试剂盒或葡萄糖传感器前添加，也可在测定时添加。此外，也可在GDH的提取，纯化粉末化等的各制造工序中添加到工序液中。本发明中所述的热稳定性的提高，是指使含有GDH酶的组合物在某一定温度下，在一定时间的热处理后，维持的GDH酶的残存率(％)增大。本发明申请中，将几乎维持了完全的活性的4。C下保存的样品作为100。/。，将一定温度下一定时间热处理后的GDH溶液的活性值与其比较，计算其酶的残存率。此残存率与不添加该化合物时比较增大，判断为GDH的热稳定性提高了。具体地说，稳定性是否提高的判断如下进行。在后述GDH酶活性的测定方法中记载的活性测定法中，测定4°C下保存的GDH活性值(a)和一定温度下一定时间热处理后的GDH活性值(b)，求出相对于测定值(a)为100时的相对值[(b)/(a)x100]。将此相对值作为残存率(％)。然后比较该化合物添加与否，可判断为由于添加残存率增大时，热稳定性提高。本发明的效果，在含有介体的体系中更为显著。可适用本发明的方法的介体无特别限定，可例举吩R^i酸甲酯(PMS)和2，6-二氯酚靛酚(DCPIP)的组合、PMS和硝基蓝四唑(NBT)的组合、DCPIP单独、铁氰化物离子(化合物为铁氰化钾等)单独、二茂铁单独、亚硝基苯胺单独等。其中，优选铁氰化物离子(化合物为铁氰化钾)。这些介体因在灵敏度上存在各种不同，所以，不必统一规定添加浓度，但一般优选添加1mM以上。这些介体可在测定时添加，也可在制备后述葡萄糖检测试剂、葡萄糖检测试剂盒或葡萄糖传感器时预先含有。且此时不管是液体状态、干燥状态等形态，均可在测定时解离为离子状态。本发明中，可进一步根据需要使各种成分共存。例如，也可添加表面活性本发明中，可通过以下各种方法测定葡萄糖。本发明的葡萄糖检测试剂、葡萄糖检测试剂盒或葡萄糖传感器，可为液状(水溶液、悬浮液等)、通过真空干燥或喷雾干燥等粉末化的形态、冷冻干燥等的各种形态。干燥方法无特别限定，可通过常法进行。含有本发明的酶的组合物不限于冷冻干燥物，也可为将干燥物再溶解的溶液状态。本发明中，可根据以下各种方法测定葡萄糖。葡萄糖检测试剂本发明的葡萄糖检测试剂，典型地来说，含有GDH、缓冲液、介体等测定必需的试剂，用于制作校准曲线的葡萄糖标准溶液以及使用的指针。本发明的试剂盒，例如，作为冷冻干燥的试剂或作为在适合的保存溶液中的溶液来提供。优选将本发明的GDH以全酶化形态提供，但也可以酶蛋白的形态提供，使用时进行全酶化。葡萄糖检测试剂盒本发明的特征还在于，含有根据本发明的GDH的葡萄糖检测试剂盒。本发明的葡萄糖检测试剂盒，充分含有至少1次检测的根据本发明的GDH。试剂盒中，不仅含有发明的GDH，还包含检测必须的缓冲液、介体、用于制作校准曲线的葡萄糖标准溶液以及使用的指针。根据本发明的GDH，可以各种形态，例如，可以作为被冷冻干燥的试剂或作为适合的保存溶液中的溶液而提供。优选本发明的GDH以全酶的形态提供，也可以酶蛋白的形态提供，使用时进行全酶化。葡萄糖传感器本发明的特征还在于，使用根据本发明的GDH的葡萄糖传感器。电极使用碳电极、金电极、铂电极等，在此电极上固定本发明的酶。固定化方法，有使用交联试剂的方法、在高分子基质中包覆的方法、用透析膜包被的方法、光交联聚合物、导电性聚合物、氧化还原聚合物等，或也可与介体同时在聚合物中固定或在电极上吸附固定，且也可使用这些的组合。优选本发明的GDH以全酶化形态在电极上固定，但也可以酶蛋白的形态固定，将辅酶作为其他层或在溶液中提供。典型地来说，使用戊二醛将本发明的GDH在碳电极上固定后，用具有酰胺基的试剂处理封闭戊二醛。葡萄糖浓度的测定可如下进行。在恒温箱内放入缓冲液，加入介体维持在一定温度。作为作用电极使用固定化本发明的GDH的，使用对电极(例如铂电极)及参照电极(例如Ag/AgCl电购。碳电极上加一定的电压，电流恒定后，加入含有葡萄糖的试样，测定电流的增加。根据通过标准浓度的葡萄糖溶液制作的校准曲线，可计算试样中的葡萄糖浓度。本发明的葡萄糖检测组合物、葡萄糖检测试剂盒、葡萄糖传感器或用于葡萄糖测定方法的介体无特别限定，但可优选使用2，6-二氯酚靛酚(简写为DCPIP)、二茂铁或其衍生物(例如铁氰化钾、吩Ri^酸甲酯等)。这些介体也可购入市售品获得。试验例本发明中，葡萄糖脱氢酶活性的测定用以下条件进行。<试剂>50mMPIPES缓冲液pH6.5(含有0.1%Tritonx-100)14mM2，6-二氯酚靛酚(2，6-dichlorophenol-indophenol)(DCPIP)溶液1MD-葡萄糖溶液混合上述PIPES缓冲液15.8Ml、DCPIP溶液0.2mL、D-葡萄糖溶液4mL作为反应试剂。<测定条件>将反应试剂2.9mL在37。C下预加温5分钟。添加GDH溶液0.1mL，缓慢混合后，将水作为对照放入控制到37。C的分光光度计中，记录5分钟600腿的吸光度变化，从直线部分开始，测定每1分钟的吸光度变化(AOD肥t)。盲检为代替GDH溶液，将溶解了GDH的溶剂加入到试剂混合液中，同样的测定每1分钟的吸光度变化(AODBLANK)。由这些值根据下式求出GDH活性。在此，GDH活性中1单位(U)是指浓度200mMD-葡萄糖存在下，将1分钟的1jjMdcpip作为还原酶量。活性(U/mL)=[-(AODtest-AODBLANK)x3.0x稀释倍率]/(16.3x0.1xl.o)且算式中的3.0表示反应试剂+酶溶液的液量(mL)，16.3表示该活性测定条件中毫摩尔分子吸光系敬cm"umo1)，0.1表示酶溶液的液量(mL)，1.0表示比色池(cell)的光程长(cm)。实施例以下，通过实施例具体说明本发明，但本发明不限于以下实施例。第1实施方式实施例1A来自青霉属丝状菌的GDH的取得作为GDH生产菌使用薄剌青霉(Penicilliumlilacinoechinulatum)NBRC6231及意大利青霉(Penicilliumitalicum)NBRC32032(从独立行政法人产品评价技术基础机构购入)，将各个L干样接种到马铃薯右旋糖琼脂培养基(Difco制)，通过25。C温育复原。将复原后的培养皿上的菌丝连琼脂一起回收，悬浮于过滤除菌水中。2基的10L容量的发酵罐中配制生产培养基(1%麦芽浸出物、1.5%大豆肽、0.1%MgS04.7H20、2%葡萄糖，pH6.5)，在120。C高压灭菌器中灭菌15分钟后，将上述的菌丝悬浮液分别投入，开始培养。培养条件为30。C温度、2L/分钟通气量、380rpm搅拌数下进行。开始培养64小时后停止培养，使用吸滤器吸引过滤，收集滤纸上各种菌株的菌体。将菌体在20mMK-磷酸缓冲液(pH6.5)3L中再悬浮，在压力130MPa下通过弗式压碎M碎来破碎菌体。将破碎液分注到500mL容量的离心管中，用曰立高速冷却离心机8000rpm离心15分钟以沉淀残渣。将上清用分子量10000cut的中空纤维超滤膜组件浓縮至1/10量，在浓縮液中分别将硫酸铵添加溶解到最终浓度为60%饱和(456g/L)。然后，用日立高速冷却离心机8000rpm离心15分钟以沉淀残渣后，将上清吸附在Octyl-Sepharose色谱柱上，在硫酸铵浓度为0.60.0饱和下梯度洗脱，回收具有GDH活性的组分。将所得到的GDH溶液用G-25Sepharose色谱柱进行凝胶过滤，回收蛋白质组分，以进行脱盐，在脱盐液中添加溶解相当于0.6饱和的硫酸铵。将其吸附在Phenyl-Sepharose色谱柱上，在硫酸铵浓度为0.60.0饱和下梯度洗脱，回收具有GDH活性的组分。将其在50°C下加温45分钟，进行离心分离得到上清。将经过以上工序得到的溶液作为纯化GDH样品。实施例2A分子量的推定将来自实施例1A中纯化的NBRC6231及NBRC32032GDH溶液(25L)，在用50mMTris-HCl(pH7.5)缓冲的东曹株式会社(Tosoh)制TSK-凝胶G300SW(7.5mmx300mm)中装料，用流速0.5mL/分钟分离。在NBRC6231洗脱时，监测280nm的吸光度，从其峰值出现位置确定洗脱时间。NBRC32032的洗脱液通过组分收集器采液，根据试验例1测定个组分的GDH活性，特定峰组分，从中推出洗脱所需时间。以确定的洗脱时间为基础，由预先使用标准蛋白质(OrientalYeast(东方酵母)制MW-Marker(MW12400玻290000))制作的标准曲线计算GDH蛋白质的分子量。结果，推测来自NBRC6231的GDH约为270kDa，来自NBRC32032的GDH在7993kDa的范围内。实施例3A最适反应温度为知道对于用实施例1A得到的来自NBRC6231及NBRC32032的GDH纯化液的最适反应温度，以上述试验例的测定方法中预加温及反应中的反应试剂的温度为25，37，40，45，50，55，60及65。C，计算各自条件下的活性。表示作为最大活性的条件活性值为100时的相对活性的图为图1。由以上可知，在上述条件下，来自NBRC6231的GDH的最适反应温度为大于45°C、小于5485。C的范围内的约50°C，来自NBRC32032GDH的最适反应温度为大于55。C、小于65。C的范围内的约60°C。实施例4A最适反应pH值为知道对于用实施例1A得到的来自NBRC6231及NBRC32032的GDH纯化液的最适pH值，代替上述试验例中所示的试剂中PIPES缓冲液，使用pH5.58.0的范围组成的50mMK-磷酸缓冲液制备反应试剂，使用该试剂按照试验例的方法进行活性测定。以显示最大活性的pH值条件下的活性为100时，表示各pH条件下的相对活性的图为图2。来自NBRC6231及来自NBRC32032的GDH也在pH6.5附近显示最大活性。由以上可知，在上述条件下，来自NBRC6231的GDH及来自NBRC32032的GDH的最适反应pH均为大于6.0、小于7.0的范围内的约6.5。实施例5A温度稳定性为知道对于实施例1A中得到的来自NBRC6231及NBRC32032的GDH纯化液的温度稳定性，将各GDH溶液使用20mMK-磷酸缓冲液(pH6.5)稀释至lU/mL的活性，将此稀释液用热槽，在37。C65。C的范围的各温度下加温处理15分钟，比较处理前、处理后的活性。活性测定方法根据上述试验例。表示相对于加温处理前的活性的加温处理后的残存活性的图为图3。来自NBRC6231的GDH在55°C处理时显示93%、在60°C处理时显示44%的活性残存率，来自NBRC32032的GDH在55。C处理时显示98。/。、在60。C处理时显示73%的活性残存率。实施例6A。H稳定性为知道对于实施例1A中得到的来自NBRC6231及NBRC32032的GDH纯化液的pH稳定性，制备pH3.38.5范围的缓冲液(pH36:醋酸缓冲液，pH67:PIPES缓冲液，pH78.5:Tris盐酸缓冲液)，使用这些将各GDH溶液稀释到酶浓度lU/mL。将稀释液在25。C温育16小时，比较温育前后的活性。表示相对于温育前的活性的温育前后的活性残存率的图为图4(来自NBRC6231)及图5(来自NBRC32032)。在自NBRC6231的GDH在pH58的范围内显示了80%以上的活性残存率，显示了良好的稳定性。另外，来自NBRC32032的GDH在pH58.5的范围内显示了80%以上的活性残存率，但缓冲液为PIPES时，pH7.4时则为77%的活性残存率。实施例7A为知道对于实施例1A中得到的来自NBRC6231及NBRC32032的GDH纯化液的底物特异性，使用将表1A中所示的物质溶解到最终浓度为4mM时的反应试剂进行活性测定。相对于将底物为葡萄糖时的活性作为100%时的对各底物的活性如表1A所示。在葡萄糖以外的底物中，可知两酶同时对2-脱氧-D-葡萄糖及木糖起作用。但对其他糖类，为使用上没有问题的水平的反应性。表1A<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>为知道对于实施例1A中得到的来自NBRC32032及NBRC6231的GDH纯化液的各化学物质的影响，在试验例中所示的反应试剂中添加表2A中记载的物质进行GDH活性的测定。作为共通的有强抑制效果的物质，可例举硫酸铜、醋酸镉、硝酸银，此外，氯化锌、碘乙酸、N-乙基马来酰亚胺、羟胺也共通且具有抑制效果。且可知来自NBRC6231的GDH受到叠氮钠抑制，来自NBRC32032的GDH受到氯化铁(111)抑制。表2A<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>实施例9A相对于D-葡萄糖的Km值使试验例中记载的反应试剂组成中的D-葡萄糖浓度改变为200mM以下的范围，测定来自NBRC6231及来自NBRC32032的GDH活性。根据双倒数作图法(Lineweaver-Burkplot)计算Km值。结果，来自NBRC6231的GDH的Km值为13mM，来自NBRC32032的GDH的Km值为7mM。葡萄糖电极的应用在研钵中放入碳石墨(0.5g)，加入液体石蜡0.3mL，用研磨棒研磨30分钟，制备碳糊。制备的液体石蜡涂到铂电极上，进一步添加根据实施例1A制备的纯化GDH溶液(来自保藏编号NBRC623，1500U/mL)IO"L，在室温下风干30分钟。在风干的酶电极上覆盖透析用纤维素半透膜，用塑料制的0-ring固定半透膜。如此制备的葡萄糖电极可用预先冰冷却的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)浸渍30分钟后使用。在25。C保t显的比色杯中加入20mL反应液，在其中作为葡萄糖电极(作用电极)、对电极浸入铂电极，及作为参照电极浸入Ag/AgCl电极，外加+0.35V电压。达到一定电流值后，添加葡萄糖，检测响应其的电流值。检观U器是将电流值1^A转换为0.1V电压输出，绘帝脾俞出的电压值的经时变化。从背景值到添加葡萄糖后的稳定值的电压上升度作为响应值(V)。使添加的葡萄糖浓度在最终浓度540mM的范围内变动，将用各个葡萄糖浓度得到的响应值绘制的图作为图6。有此结果可看出葡萄糖浓度依赖性的响应值上升，说明本发明的GDH可适用于葡萄糖定量，可作为葡萄糖传感器使用。实施例11AcDNA的制备对薄剌青霉NBRC623株及意大利青霉NBRC32032株分别按照实施例1A的方法(但在发酵罐中的培养时间为24小时)培养，使用吸滤器在滤纸上收集菌丝。所得到的菌丝直接放入液氮中冷冻，使用东洋纺制冷碾磨机(Coo1Mill)粉碎菌丝。由粉碎菌体直接使用NacalaiTesque公司制SepasolRNAI、根据该试剂盒的说明提取总RNA。由得到的总RNA使用Origotex-dt30(第一化学药品公司制)纯化mRNA，以此为模板使用东洋纺制ReverTra-Plus进行RT-PCR。所得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，切出链长相当于0.54.0kb的部分。由切出的凝胶片段使用东洋纺制MagExtractor-PCR&GdCleanUp提取纯化cDNA样品。实施例12AGDH基因序列的确定将来自纯化后的NBRC6231的GDH溶解在含有0.P/。SDS、10%甘油的Tris-HCl缓冲液(pH6.8)中，在其中添加Glu特异性V8内切蛋白酶到最终浓度为10Mg/mL，通过37。C温育16小时，进行部分分解。将此样品使用丙烯酰胺浓度16%的电泳分离肽。将此凝胶中存在的肽分子使用点样用缓冲液(1.4%甘氨酸、0.3%Tris、20%乙醇)通过半干法转印PVDF膜。在PVDF膜上转印的肽使用CBB染色试剂盒(P正RCE公司制GelCodeBlueStainReagent)染色，切取被可视化处理的肽片段的条带部分2处，通过肽测序仪进行内部氨基酸序列的分析。所得到的氨基酸序列为IGGWDTSLKVYGT(序列号5)及WGGGTKQTVRAGKALGGTST(序列号6)。以此序列为基础，制备含有混合碱基的兼并弓嫩，以来自实施例11A制备的NBRC6231的cDNA为模板进行PCR，得到扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳确认时为约1.4kb的单一条带。切出此条带，使用东洋纺制MagExtractor-PCR&GelCleanUp提取纯化。纯化DNA片段通过东洋纺制TargetClone-Plus-进行TA-克隆，将得到的载体在大肠杆菌JM109感受态细胞(东洋纺制CompetenthighJM109)通过热激而转化。对于转化克隆中通过蓝白判定确认了插入片段插入的克隆，使用东洋纺制MagExtractor-Plasmid-小量制备提取纯化质粒，使用质粒序列特异性引物，确定插入片段的碱基序列。以确定的GDH基因部分序列为基础，通过RACE法确定该部分序列5'端及3'端的旁侧区域。以确定的基因区域的起始密码子到终止密码子的序列表示为序列号1，且由此序列推测的氨基酸序列表示为序列号2。同样也确定了来自NBRC32032的GDH基因，得到了序列号3的碱基序列。且由此序列推测的氨基酸序列表示为序列号4。由这些碱基序列推测的氨基酸序列为基础，从'WCBIBLAST'的网页(http:/Avww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)检索同源性。对于来自NBRC6231株的GDH序歹寸，来自富氏葡萄孢盘菌(BotryotiniafUckeliana)的葡萄糖氧化酶具有最高同源性55%，对于来自NBRC32032的GDH序歹U，来自米曲霉的未命名蛋白产物(由ORF推测的氨基酸序列)具有最高同源性为54%。且来自NBRC6231的GDH及来自NBRC32032的GDH间的同源性为80%。此2种GDH均对热的稳定性高，其特征一致，但此2种GDH间的氨基酸序列同源性极高，且还可知还不存在与其有超过55%同源性的公知的氨基酸序列。因此，赋予本发明的GDH的特征性指标之一可例举与序列中2或4中所示的氨基酸序列的同源性的高度，具有80%以上、更优选85%以上、进一步优选90%以上的同源性的蛋白质在工业上有利用价值。实施例13AGDH基因重组质粒及转化微生物的制备制备在序列号3所示碱基序列中5'末端及3'末端的各个28碱基上、进一步在5'端附加Ndd位点，在3'端附加BamHI位点的引物，使用该引物以来自NBRC32032的cDNA为模板进行PCR。且对序列号4所示的氨基酸序列用SignalPver.3.0的服务器进行N末端序列的信号序列分析时，得到了到15残基Ala或到19残基Ala是分泌信号的可能性很高的结果。因此，为扩增切除N末端15密码子(45碱基)、附加起始密码子(ATG)后的序列，以及切除N末端19密码子(57碱萄、附加起始密码子(ATG)后的序列，制备N末端限制S每位点附加引物，得到PCR扩增产物。所得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳，从利用东洋纺制MagExtractor-PCR&GelCleanUp的凝胶中进行提取*纯化后，通过NdeI及BamHI进行限制酶处理。混合同样进行了限制酶处理的pBluescriptKSN(+)，加入与这些混合液等量的东洋纺制LigationHigh进行混合后，通过16。C温育30分钟进行连接。连接后的产物在大肠杆菌JM109株中通过热激导入，涂布在含有50pg/mL氨苄青霉素钠的LB琼脂培养基上，在37°C下培养一夜后得到转化克隆。由具有插入片段的克隆的液体培养产物中通过小量制备提取质粒，确认插入片段的碱基序列。这样，制备重组质粒pPIGDHl(导入序列号3的起始密码子开始的全长)、pPIGDH2(导入切除序列号3中的N末端15密码子附加起始密码子的序列)、pPIGDH3(导入切除序列号3中的N末端19密码子附加起始密码子的序列)。实施例14A转化微生物的培养及GDH表达将实施例13A中得到的重组质粒及作为比较对照不含插入片段的质粒，分别通过电穿孔导入至l汰肠杆菌C600株中。将所得到的转化株放入试管中，在5mL的LB培养基(含有50/xg/mL氨苄青霉素钠)上接种，及30°C振荡培养16小时。从此培养液中取50mL，添加到5mLLB培养基(含有5Owg/mL氨苄青霉素钠)中，30。C振荡培养20小时。将培养无插入片段的质粒的转化体的培养液中的GDH活性作为空白减去，各GDH基因导入株的培养液中的GDH活性如表3所示。表3A<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>如此确认大肠杆菌中的GDH基因的表达。此次再使用富营养培养基(2.4%酵母浸膏、2.4%多聚蛋白胨、1.25%磷酸氢二钾、0.23%磷酸二氢钾、0.4%甘油、50(ig/mL氨苄青霉素钠，pH7.0)，进一步在25°C振荡培养用pPIGDH3转化的大肠杆菌C600株20小时后，培养液的活性达到了1000U/L。实施例15A重组表达GDH的纯化将转化了pPIGDH3的大肠杆菌C600株在装入500mL容量斜口烧瓶中的LB培养基60mL(含有50|ig/mL氨苄青霉素钠)中接种，于30°C振荡培养16小时。将其投入装入10L发酵罐的富培养基(2.4%酵母浸膏、2.4%多聚蛋白胨、1.25%磷酸氢二钾、0.23%磷酸二氢钾、0.4%甘油、50(ig/mL氨苄青霉素纳，pH7.0)，在培I^显度25。C、通气量2L/分钟、搅拌转速330rpm条件下培养24小时。将培养菌体离心分离收集后，在50mM磷酸缓冲液(pH6.5)中用660nm菌体浊度悬浮到约50，在65MPa压力下用弗式压碎器破碎。通过在将破碎液离心分离后得到的上清中加入聚乙烯亚胺直至最终浓度为9%，使核酸沉淀，离心分离得到上清。在其中^it酸铵溶解到饱和量以使目的蛋白沉淀，使离心分离收集的沉淀再溶解到50mM磷酸缓冲液(pH6.5)中。并且通过G-25Sepharose色谱柱进行凝胶过滤，通过Octyl-Sepharose色谱柱及Phenyl-Sepharose色谱柱进行疏水色谱测定(洗脱条件是同时施加25%饱和0%的硫酸铵浓度梯度，以提取峰组分)，进一步通过G-25Sepharose色谱柱进行凝胶过滤，除去硫酸铵，作为重组GDH样品。实施例16A重组表达GDH葡萄糖电极的应用使用实施例12A中得到的重组GDH，用实施例10A的要领制备葡萄糖电极，对葡萄糖浓度定量。结果如图7所示。如图可说明，使用重组GDH制备的葡萄糖电极也显示葡萄糖浓度-依赖性响应，可适用于葡萄糖浓度定量。第2实施方式实施例中记载的米曲霉的GDH基因的获得方法的概括如下。为得到来自米曲霉的GDH基因，从米曲霉、土曲霉的培养上清中，使用盐析、色谱法等尝试GDH纯化，但获得高纯度的GDH很困难(实施例1B[l])因此，不得不放弃利用获得基因的常法之一的部分氨基酸序列的克隆的想法。因此，认真探讨除上述以外的生产GDH的微生物的结果，发现了薄刺青霉(Penicilliumlilacinoechinulatum)NBRC6231株生产GDH，从而成功地从本菌株的培养液中获得了高纯度的纯化酶(实施例1B[2])。然后，使用该酶成功地确定了部分氨基酸序列，以确定了的氨基酸序列为基础，通过PCR法，获得了来自P.lilacinoechinulatumNBRC6231的GDH基因的一部分，确定了碱基序列(1356bp)(实施例IB[3]及[4])。最后，以此碱基序歹i伪基础，根据已公开的米曲霉基因组数据库，从而推定、获得了米曲霉GDH基因(实施例1B[5])。实施例1B来自米曲霉的葡萄糖脱氢酶基因的推定[1]来自米曲霉的GDH的获得米曲霉使用从土壤中获得，根据规定方法使用作为L干燥菌株保管的米曲霉。以下也将其称为米曲霉TI株。将米曲霉TI株的L干燥菌株接种在马铃薯右旋糖琼脂培养基CDifco制)上，通过25。C温育复原。将复原后培养皿上的菌丝连同琼脂一起回收，悬浮于过滤除菌水中。2基的10L容量的发酵罐中配制6L生产培养基(1%麦芽浸出物、1.5%大豆肽、0.1%MgS04.7H20、2%葡萄糖，pH6.5)，在120°C高压灭菌器中灭菌15分钟，冷却后，将上述的菌丝悬浮液接种，在3(TC进行通气培养量。开始培养64小时后停止培养，使用滤器除去菌丝体，回收具有GDH活性的过滤液。将回收的上清通过超滤膜(截留10000分子量)除去低分子物质。然后，添加溶解硫酸铵到60%饱和度，进行硫酸铵分离，通过离心分离回收上清组分后，吸附到Octyl-Sepharose色谱柱，用硫酸铵饱和度60%0%梯度洗脱，回收具有GDH活性的组分。将得到的GDH溶液使用G-25Sepharose色谱柱进行脱盐后，添加溶解60%饱和度的硫酸铵，将其吸附到Phenyl-Sepharose色谱柱，用硫酸铵饱和度60%0%梯度洗脱，回收具有GDH活性的组分。进一步将其在50°C加温45分钟后，进行离心分离得到上清。将经过上述工序得到的溶液作为纯化GDH标准品(AOGDH)。且在上述纯化过程中，缓冲液使用20mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)。并且，为确定AOGDH的部分氨基酸序列，虽尝试了通过离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法等的各种方法，但未能得到可用于部分氨基酸序列确定的纯化标准品。且我们独自探索获得属于土曲霉的微生物，与上述同样，利用该培养上清通过盐析、Octyl-Sepharose等尝试纯化，未能得到可用于与米曲霉同样部分氨基酸序列确定的纯化标准品。通常，使用一般进行的纯化法，未能得至搞纯度、在SDS-PAGE上可清楚确认的GDH标准品，推测与酶蛋白质结合的糖链也许是原因之一。因此，不得不放弃禾佣作为得到基因的常法之一的该蛋白质的氨基酸序列的克隆。来自青霉属丝状菌的GDH的获得来自青霉属丝状菌的GDH生产菌使用薄刺青霉(Penicilliumlilacinoechinulatum)NBRC6231，根据与上述米曲霉T1株同样的方法进行培养及纯化，得到了使用SDS电泳几乎均一的纯化标准品。CDNA的制备对薄剌青霉(Penicilliumlilacinoechinulatum)NBRC6231根据上述方法进行培养，(但在发酵罐中的培养时间为24小时)，通过滤纸过滤回收菌丝体。所得到的菌丝直接放入液氮中冷冻，使用CoolMill(东洋纺公司制)粉碎菌丝。由粉碎菌体立即使用SepasolRNAI(NacalaiTesque公司制)，根据该试剂盒的说明提取总RNA。由得到的总RNA使用Origotex-dt30(第一化学药品公司制)纯化mRNA，以此为模板使用ReverTra-Plus(东洋纺公司制)进行RT-PCR。所得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，切出链长相当于0.54.0kb的部分。由切出的凝胶片段使用MagExtractor-PCR&GelCleanUp(东洋纺公司制)提取纯化作为cDNA样品。GDH基因序列的确定将来自上述纯化的NBRC6231的GDH溶解在含有0.1%SDS、10%甘油的Tris-HCl缓冲液(pH6.8)中，在其中添加Glu特异性V8内切蛋白酶到最终浓度为10yg/mL，通过37。C温育16小时进行部分分解。对此样品使用丙烯酰胺浓度16%的凝胶来进行电泳来分离肽。将此凝胶中存在的肽分子使用点样用缓冲液(1.4%甘氨酸，0.3%Tris、20%乙醇)通过半干法转印PVDF膜。使用CBB染色试剂盒(PIERCE公司制GelCodeBlueStainReagent)将转印到PVDF膜上的肽染色，切取被可视化处理的肽片段的条带部分2处，通过肽测序仪进行内部氨基酸序列的分析。所得到的氨基酸序列为IGGWDTSLKVYGT(序列号5)及WGGGTKQTVRAGKALGGTST(序列号6)。以此序列为基础，制备含有混合碱基的兼并引物，以来自NBRC6231的cDNA为模板进行PCR，得到扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳确认时为约1.4kb的单一条带。切出此条带，使用东洋纺制MagExtractor-PCR&GelCleanUp提取纯化。纯化DNA片段通过东洋纺制TargetClone-Plus-进行TA-克隆，利用得到的载体在大肠杆菌JM109感受态细胞(东洋纺制CompetenthighJM109)通过热激转化。对于转化的克隆中通过蓝白判定确认了插入片段的克隆，使用东洋纺制MagExtmctor-Plasmid-小量制备提取纯化质粒，使用质粒序列特异性弓卿，确定插入片段的碱基序列。(B56bp)。AOGDH基因的推定以确定的GDH基因部分序列为基础，从'WCBIBLASr'的网页(h邻:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行同源性检索，由多个的候补序列考虑与公知的葡萄糖氧化酶之间的同源性，推定AOGDH基因。通过监所推定的AOGDH与来自P.maclnoechinulatumNBRC6231的GDH部分序列之间的氨基酸水平的同源性为49%。实施例2BAOGDH基因的获得、向大肠杆菌的导入为得到AOGDH基因，由米曲霉TI株的菌体制备mRNA，合成cDNA。合成序列号12、13中所示的2种寡聚DNA，以制备的cDNA为模板，使用KODPlusDNA聚合酶(东洋纺公司审lj)扩增AOGDH基因。将DNA片段用限制酶NdeI、BamH处理，插入到pBluescript(为符合LacZ翻译起始密码子atg，以符合NdeI识别序列的atg的形态导入NdeI位点)NdeI-BamHI位点构建重组质粒。使用此重组质粒，转化大肠杆菌DH5a(东洋纺公司制)。由转化体根据常法提取质粒，进行AOGDH基因碱基序列的确定(序列号ll)。由此结果可知，由cDNA序列推定的氨基酸残基由593氨基酸(序列号10)组成。在数据库中注册的RIB40株预想的GDH为588氨基酸(序列号9)，TI株GDH与氨基酸残基不同。且关于该基因，使用IT株基因组DNA确认序列，对于基因旁侧区域也可使用RACE法进行确认。因GDH基因的序列不同，所以，以含有TI株的GDH基因的重组质粒为模板，使用QuickChangeSiteDirectedMutagenesisKit(Stratagene制)，制备从数据库RIB40株的序列预想含有GDH基因序列的重组质粒，得到转化体。将这些转化体在含有100^g/mL氨节青霉素的液体培养基(Terrificbroth)200ml中，于30。C振荡培养16小时。针对菌体破碎液确认GDH活性时，具有来自RIB40株的GDH序列的转化体中未能确认GDH活性，但对于具有来自TI株GDH序列的转化体，可得到菌体内每lml的培养液有8.0U的高的GDH活性。且实施例IB中进行的米曲霉TI株的培养上清的GDH活性为0.2U/mL。此结果可说明从RIB40数据库序列预测的GDH基因为作为GDH起作用，只要比较TI株和RIB40株的基因序列，可认为RIB40株中GDH基因的序列的一部分缺失是其原因。实施例3B通过对具有来自实施例2B中培养的TI株的GDH序列的大肠杆菌DH5转化体离心分离，来回收菌体，在20mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中悬浮后，使用弗式压碎器提取GDH提取液。将其通过与用实施例1B纯化的AOGDH同样的方法，得到纯化酶标准品(rAOGDH)，进行与AOGDH纯化酶标准品的特性比较。底物特异性使用血糖传感器测定血糖值时，为不造成误诊，希望使用葡萄糖-特异性酶。因此，相对于AOGDH测定了对各种糖类的反应性。结果如表1B所示。rAOGDH显示了与AOGDH同等的底物特异性，且证实了输液使用患者在使用传感器是不对特别成为问题的麦芽糖起作用。表1B<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>[2]麦芽糖分解性血糖传感器中使用的GDH本身对麦芽糖不起作用，而酶标准品等含有将麦芽糖分解成葡萄糖的成分，这也有导致误诊可能性。即GDH酶标准品中不含分解麦芽糖的成分是至关重要的。因此，测定了GDH酶标准品中的麦芽糖分解成分的污染。麦芽糖分解酶的污染试验用以下要领进行。在配制成IOU/mL的各禾中纯化酶溶液50ML中，添加8mM麦芽糖50"L，37°C下进行反应。反应中止后，使用LiquitecglucoseHKtest(RocheDiagnostics公司制)测定反应液中含有的葡萄糖浓度。且用于计算葡萄糖浓度的校准曲线，是用该测定试剂盒测定校正系数设定用葡萄糖(和光纯药工业公司制)来制作。结果如表2B所示。在AOGDH纯化标准品中，37。C处理30秒使已为90%的麦芽糖分解成葡萄糖，10分钟反应处理后，有接近100%的麦芽糖被分解。因此，使用高度纯化的在实施例1B中以部分氨基酸序列分析为目的的AOGDH的标准品同样进行了测定，但仍然确认出有从麦芽糖的分解活性。另一方面，rAOGDH中，37。C处理10分钟后，也完全未发现葡萄糖的积累。米曲霉从很久以前就被用于发酵产业，已知大量生产淀粉酶及葡萄糖淀粉酶的sugar-related酶，在这种环境下，仅高纯度纯化GDH极为困难。由上述结果可知，对来自米曲霉的GDH使用血糖传感器时，使用由基因重组体制备的GDH是必须的。表2B<table>tableseeoriginaldocumentpage61</table第3实施方式含有序列号8记载的氨碱基序列的DNA(基因)从包含通过NCBI的数据库预测的、编码来自米曲霉RIB40株的葡萄糖脱氢酶的DNA(基因)的，且不除去内含子的基因组基因序列中除去内含子的产物。序列号9是其对应的氨基酸序列。编码由序列号9记载的氨基酸序列组成的蛋白质的基因，表示由一种NCBI数据库预测的葡萄糖脱氢酶基因的全序列。由序列号11记载的碱基序列组成的DNA(基因)，表示本发明申请人鉴定的、编码来自米曲霉TI株的具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA谨蹄的全序列。序列号10是其对应的氨基酸序列。另外，由与序列号11中记载的碱基序列组成的DNA相互补碱基序列组成的DNA在严谨条件下杂交，且编码具有葡萄糖脱氢酶活性蛋白质的DNA(基因)，也包含于本发明的适用范围内。编码由序列号IO记载的氨基酸序列组成的蛋白质的基因，表示编码来自米曲霉TI株的具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA(基因)的全序列。且编码序列号10记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加(插入)的氨基酸序列组成、且具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA(基因)，也包含于本发明的适用范围内。米曲霉GDH基因可根据实施例1B得到。实施例1C来自米曲霉的葡萄糖脱氢酶基因向大肠杆菌的导入将AOGDH基因，由米曲霉的菌体制备mRNA，合成cDNA。合成序列号12、13中所示的2种寡聚DNA，以制备的cDNA为模板，使用KODPlus(东洋纺织制)扩增AOGDH基因(野生型)。将DNA片段用限制酶NdeI、BamH处理，插入到pBluescript(为符合LacZ翻译起始密码子atg，以符合Ndel识别序列的atg的形态导入Ndel位点)NdeI-BamHI位点，构建重组质粒。将此重组质粒使用CompetenthighDH5a(东洋纺织制)导入。根据常法提取质粒，进行AOGDH基因碱基序列的确定(序列号ll)。由cDNA序列推定的氨基酸残基为593氨基酸(序列号10)。将信号肽切割后的FADGDH作为mFADGDH时，在mFADGDH的N末端只附加M，将mFADGDH的N末端作为1个氨基酸延长的形态的产物表示为S2。且使mFADGDH的N末端的K氨基酸取代为M，将mFADGDH与氨基酸总数相同的产物表示为S3。S2中，将序列号15的寡核苷酸作为N62末端引物，与序列号13组合进行PCR，用同样的方法构建具有编码S2的DNA序列的重组质粒，同样获得转化体。S3中，将序列号16的寡核苷酸作为N末端引物，与序列号13组合进行PCR，用同样的方法构建具有编码S3的DNA序列的重组质粒，同样获得转化体。且具有各自的改性FADGDH的DNA序列的质粒，用DNA测序仪确认了序列上没有错误。序列号17表示上述确定的信号肽缺失突变体S2的DNA序列。序列号18是其对应的氨基酸序列。将这些转化体在TB培养基中使用10L发酵罐培养液体l2天。将各培养期的菌体集菌后，用超声波粉碎确认GDH活性。将各转化体的该培养期与OD、pH、GDH活性活性的关系表示为表1C，2C及3C及图9，10，11中。将米曲霉野生株在液体培养基(1%麦芽浸出物、1.5%大豆肽、0.1%MaS04.7H20、2%葡萄糖、0.05mM对苯醌O.lmMEDTA，pH6.5)，使用10L发酵罐，30°C下培养1天确认菌体内或菌体外的活性时，均为约0.2U/mL的培养液(mL，broth)程度的GDH活性。且在本专利中，通过比较每lmL培养液的GDH活性量，比较表达量。在野生型FADGDH(WT)中，培养1618小时，可见谱峰[6.6U/mL-b(每1mL酶单位(U))，可发现以后活性的降低)。另一方面，在改性FADGDH的S2中，可见第2225小时的谱峰(7273U/mL-b)，S3中可见2023小时的谱峰(7475U/mL-b)，与WT同样，可见GDH的降低。比较各自谱峰中的培养效价时，通过切除被认为是信号肽的氨基酸序，可证明其GDH生产率增大了10倍以上。且在信号肽的切除前后，比较FADGDH纯化标准品的比活性(U/mg)时，野生型FADGDH(WT)为270U/mg时，切除后的改性FADGDH的S2为670U/mg，比活性增大了2.5倍。通过切除信号肽，也可表明比活性增大了。即使考虑比活性的增大，活性量也至少增大4.4倍。进一步锐意探讨的结果，来自丝状菌的FADGDH在pH7.1以上的pH范围内，可见其稳定性降低了。且在此次研究中，证实了来自丝状菌的FADGDH的重组体的生产培养中，在pH为7.17.3、优选7.1以下进行pH控制是如何的重要。另外确认了，通过加入培养控制以成为该pH以下，确保壳GDF活性的峰。且在重组生产自丝状菌的葡萄糖脱氢酶的方法中，在其N末端区存在的信号肽序列中导入突变的产物中，可将培养控制pH提高到7.3。实施例2C来自土曲霉的葡萄糖脱氢酶基因(以下，简写为ATGDH)向大肠杆菌的导入将ATGDH基因，从土曲霉菌体(保藏编号NBRC33026、在产品评价技术基础机构*生物资源部门注册)制备mRNA，合成cDNA。合成序列号21、22中所示的2种寡聚DNA，以制备的cDNA为模板，使用KODPlus(东洋纺织制)扩增ATGDH基因(除去预测信号肽序列的基因序歹ij)。将DNA片段用限制酶NdeI、BamH处理，插入到pBluescript(为符合LacZ翻译起始密码子atg，以符合Ndel识别序列的atg的形态导入Ndel位点)Ndel-BamHI位点构建重组质粒。使用competenthighDH5a(东洋纺织制)，导入此组质粒。常法提取质粒，进行ATGDH基因碱基序列的确定(序列号19)。由cDNA序列推定的氨基酸残基为568个氨基酸(序列号20)。将这些转化体在含有100/ig/mL氨苄青霉素的50mLLB培养基中，30。C培养一夜后，再在含有100/ig/mL氨苄青霉素的50mLLB培养基中，30°C培养8小时，以制备种菌。将制备的种菌在含有100Mg/mL氨苄青霉素的TB培养基中，在Kd，P0.51.5范围内在10L发酵罐内液体培养6天。将各培养期的菌体集菌后，超声波破碎以确认GDH活性。将培养期与OD、pH、GDH活性的关系表示于表4C、5C、6C、7C及图12、13、14、15。且将土曲霉野生株在液体培养基(1%麦芽浸出物、1.5%大豆肽、0.1%MaS04.7H20、2%葡萄糖、0.05mM对苯醌、0.1mMEDTA,pH6.5)使用10L发酵罐，在30°C下培养1天，确认菌体内的GDH活性时，约O.lU/mL培养液为谱峰。另一方面，在FADGDH重组体中，可通过谱峰发现约921U/mL-b的活性，有100200倍左右的培养效价的增大。且在探讨培养条件时，通过将Kd.P设定为低值得0.5，则可发现Kd.P为0.75时的约1.5倍、Kd为11,5时的约2倍的培养效价。且将Kd.P设定为2以上时，可确认培养效价为约5U/mL-b。对于培l^显度，将培养期与OD、pH、GDH活性的关系表示于表8C、9C、IOC、IIC及图16、17、18、19。培养温度2628。C为最适，至少需要在2328。C培养，在高于29°C的温度下培养时，培养效价有减半趋势。在ATGDH基因重组体的培养中，将培养液的pH保持在7.3以下对于稳定保持酶活性非常重要，在ATGDH中，与AOGDH相比，不如说在低pH下终止培养是非常重要的且ATGDH基因，是切除了由编码来自土曲霉的FADGDH的DNA序列预测的信号肽(MLGKLSFLSALSLAVAATLSNSTSAX序列号23)序列部分后的DNA的产物。含有信号肽序列的产物，与来自米曲霉的FAD-GDH—样，因FAD-GDH的表达量缺乏，所以，使用当初不含信号肽的产物，进行培养的探讨。表1C抽样时间(hr)野生型ODPHAct(U/ml)1611.96.86.51814.27.16.62015.27.34.92215.77.51.72316.27.61.12416.87.70.92516.87.70.62616.77.80.42817.88.00.33018.18.10.2表2C<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>表6C<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>表7C<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>表10C<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>表1C3C表示各种突变体在10L发酵罐培养中的培养期与培养液的菌体浊度(OD)、pH、GDH活性值的关系。表1C对应图9，表2C对应图10，表3C对应图11。表4C7C表示在10L发酵罐培养中各个Kd.P0,5、0.75、1、1.5时的培养期与培养液的菌体浊度(OD)、pH、GDH活性值的关系。表4C对应图12，表5C对应图13，表6C对应图14。表8C11C表示在10L发酵罐培养中各培养温度20、23、26、30°C下的培养期与培养液的菌体浊度(OD)、pH、GDH活性值的关系。表8C对应图16，表9C对应图17，表10C对应图17，表11C对应图19。第4实施方式试验例1D:FAD依赖型GDH活性的测定方法本发明中，FAD依赖型GDH的活性测定用以下条件进行。〈试剂〉50mMPIPES缓冲液pH6.5(含有0,1%TritonX-lOO)163mMPMS溶液6.8mM2，6-二氯酚靛酚(DCPIP)溶液1MD-葡萄糖溶液将上述PIPES缓冲液15.6mL、DCPIP溶液0.2mL、D-葡萄糖溶液4mL混合，作为反应试剂。〈测定条件〉将反应试剂3mL在37。C下预加温5分钟。添加GDH溶液O.lmL缓慢混合后，用以水为对照的控制在37°C下的分光光度计，5分钟一次记录600nm的吸光度变化，从直线部分测定每1分钟的吸光度变化(△ODTEST)。盲检是代替GDH溶液，在试剂混合液中加入溶解GDH的溶剂，同样测定每1分钟的吸光度变化(AOD肌ANK)。由这些值根据下式求出GDH活性。在此，GDH活性中1单位(U)，是指在浓度为200mM的D-葡萄糖存在下，1分钟还原1amol的DCPIP的酶量。活性(U/mL)4-(A0D测定-AOD空白)x3.0x稀释倍率]/(16.3x0.1x1.0)且式中的3.0表示反应试剂+酶溶液的液量(mL)，16.3表示本活性测定条件中毫摩尔分子吸光系数(cmV/zmo1)，0.1表示酶溶液的液量(mL)，1.0表示比色池的光程长(cm)。实施例ID:来自丝状菌的葡萄糖脱氢酶重组体标准品的制备由米曲霉TI株(使用从土壤中取样的、根据规定方法作为L干燥菌株保管的菌株。以下将其称为米曲霉TI株)及土曲霉NBRC33026株的菌体，制备mRNA，合成cDNA。合成序列号12、13及序列号21、22所示的4种寡聚DNA，以由各个mRNA制备的各个cDNA为模板，使用KOD-Plus(东洋纺公司制)，扩增米曲霉及土曲霉的GDH(AOGDH)基因。将DNA片段用限制酶NdeI、BamH处理，插入到pBluescript(为符合LacZ翻译起始密码子atg，以符合NdeI识别序列的atg的形态导入NdeI位点)Ndel-BamHI位点构建2种重组质粒(pAOGDH，pATGDH)。将这些重组质粒使用CompetenthighDH5a(东洋纺织制)分别导入。根据常法提取质粒，进行AOGDH基因碱基序列的确定(序列号ll、19)。由cDNA序列推定的氨基酸序列为593氨基酸(序列号10)。以及土曲霉为568氨基酸(序列号20)。且通过同样的方法，也可得到导入了含有意大利青霉的GDH(PIGDH)基因的重组质粒(pPIGDH)的转化体。将这些转化体在TB培养基(2.4%酵母浸膏、1.2%多聚蛋白胨、1.25%磷酸氢二钾、0.23%磷酸二氢钾、0.4%甘油、50|ig/mL氨苄青霉素钠，pH7.0)中，使用10L发酵罐，在培养温度为25°C、通气量为2L/分钟、搅拌转速为170rpm的条件下培养48小时。用离心分离收集培养菌体后，在50mM磷酸缓冲液(pH5.5)中悬浮，使660nm下的菌体浊度为约50，在65MPa的压力下进行均质破碎。在将破碎液离心分离后得到的上清中通过添加聚乙烯亚胺使最终浓度为9%，从而使核酸等沉淀，离心分离得到上清。在其中使硫酸铵饱和量溶解以使目的蛋白质沉淀，将用离心分离收集的沉淀用50mM磷酸缓冲液(pH5.5)再溶解。然后，通过G-25Sepharose柱进行凝胶过滤，通过Octyl-Sepharose柱及Phenyl-Sepharose柱进行疏水色谱法(洗脱条件均为25%炮和0%的硫酸铵浓度梯度下提取峰组分)，进一步通过G-25Sepharose柱进行凝胶过滤除去硫酸铵，制备GDH重组体标准品。实施例2D:来自丝状菌野生株的FADGDH标准品的制备作为来自丝状菌野生株的FAD依赖型GDH生产菌使用土曲霉NBRC33026菌株和米曲霉TI株，将各个L干样接种到马铃薯右旋糖琼脂培养基(Difco制)上，通过25。C温育复原。将复原后的培养皿上的菌丝连琼脂一起回收，悬浮于过滤除菌(过滤器除菌)水中。在2基的10L容量的发酵罐中配制生产培养基(1%麦芽浸出物、1.5%大豆肽、0.1%MgS04.7H20、2%葡萄糖，pH6.5)6L，在120。C高压灭菌器中灭菌15分钟后，将上述的菌丝悬浮液分别投入，开始培养。培养条件为30。C温度、2L/分钟通气量、380rpm搅拌数下进行。开始培养64小时后停止培养，使用吸滤器吸引过滤，收集滤纸上各种菌株的菌体。将培养液5L用截留分子量10000的中空纤维超滤膜组件浓縮至1/10量，在浓縮液中分别将硫酸铵添加溶解到最终浓度为60%饱和(456g/L)。然后，用日立高速冷却离心机8000rpm离心15分钟以沉淀残渣后，将上清吸附在Octyl-Sepharose色谱柱上，在硫酸铵浓度为0.60.0饱和下梯度洗脱，回收具有GDH活性的组分。将所得到的GDH溶液用G-25Sepharose色谱柱进行凝胶过滤，回收蛋白质组分。通过G-25Sepharose柱进行凝胶过滤、回收蛋白质来进行脱盐，在脱盐液中添加溶解相当于0.6饱和的硫酸铵。将其吸附在Phenyl-Sepharose色谱柱上，在硫酸铵浓度为0.60.0饱和下梯度洗脱，回收具有GDH活性的组分。进一步将得到的GDH溶液通过G-25Sepharose柱进行凝胶过滤、回收蛋白质，将得到的纯化酶作为FAD依赖型GLD评价标准品使用。本发明的葡萄糖测定用组合物、葡萄糖检测试剂盒、葡萄糖传感器或葡萄糖测定方法中使用的介体无特别限定。可优选使用2，6-二氯酚靛酚(简写为DCPIP)，二茂铁或其衍生物(例如铁氰化钾、吩嗪硫酸甲酯等)。这些介体可购入市售品。实施例3D:使用了葡萄糖测定系统的各种稳定剂的FADGDH热稳定化效果的研究研究根据上述的试验例1的FADGDH活性的测定方法进行。首先，将实施例1D中得到的来自米曲霉的FADGDH重组体标准品(rAOFADGDH)溶解在酶稀释液(50mM磷酸钾缓冲液(pH5.5)、0.1%TritonX-100)中使其为约2U/M1，准备50mL上述产物。在此酶溶液0.9mL中，如表1D中记载，将各种稳定剂添加至各自的最终浓度，准备2个合计容量为1.0ml的样品。此外，作为对照，代替各种化合物，准备2个添加蒸馏水0.1ml的样品。2个中，1个保存在4。C，另一个在50°C下处理15分钟。处理后，测定各个样品的活性。以保存在4°C的样品的酶活性为100，比较50°C下处理15分钟后的活性值，作为活性残存率(％)来计算。这些研究的结果可证明，通过添加不作为FADGDH的底物的糖类、某种的氨基酸类，FADGDH的热稳定性增大(表1D)。与氨基酸类相比，糖类有高的热稳定性效果，其中，海藻糖、甘露糖、葡萄糖酸钠、半乳糖、甲基-a-D-葡萄糖苷、a-D-蜜二糖具有热稳定性高的效果。表ID<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>实施例4D:海藻糖的有效浓度影响FADGDH热稳定化效果的研究其次，具有高的热稳定性效果的海藻糖，对于发挥其效果的有效浓度进行了研究。方法按照上述实施例3D所述的方法进行。其结果表明，随着添加浓度的增加，效果具有增大的趋势，例如，添加海藻糖到最终浓度为0.01%时，既可发挥稳定化效果(表2D)。表2D<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>实施例5D:其他协同效果的研究基本方法是根据上述实施例3D的方法，对在其它稳定剂中通过各个组合，是否不具有协同效果进行了研究。其结果可证实，在丝氨酸xBSA的组合(表3D)中，在海藻糖和甘露糖、海藻糖和甘氨酸、甘露糖和甘氨酸的组合(表4D)中，与单独使用相比，有明显的热稳定效果。表3D<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>表4D<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>实施例6D:海藻糖和甘氨酸、甘露糖和甘氨酸的有效浓度的研究对于实施例5D的研究中可看出高热稳定效果的海藻糖和甘氨酸、甘露糖和甘氨酸的组合，对于发挥其效果的有效浓度进行了研究。方法按照上述实施例3D所述的方法进行。其结果表明，在这些混合物中，随着添加浓度的增加，效果具有增大的趋势，例如，添加各化合物到最终浓度为0.01%时，50。C下处理30分钟，具有20%左右的残存活性，与上述单独使用0.01%海藻糖时相比，具有接近2倍的稳定效果(表5D)。<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>实施例7D:各种FADGDH中稳定剂的热稳定化效果的研究基本方法按照上述实施例3D所述的方法，对各种FADGDH中稳定剂的热稳定效果进行研究。稳定剂利用4%D-葡糖醛酸钠和4%甘氨酸的混合组成。其结果表明，不论是来自野生型的GDH，还是重组GDH，均具有稳定效果(表6D)。表6D<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>实施例8D:使用葡萄糖测定系统的保存稳定性的研究研究使用实施例lD中得到的来自米曲霉的FADGLD重组体标准品(rAOFADGDH)，根据上述试验例1的FADGDH活性的测定方法进行。测定FADGDH酶溶液中的FADGDH蛋白质的量，将相对于该物质溶解有相当于60%或30%的稳定剂的物质准备1mL。例如，对于含有IOmg的酶溶液，添加相当于60。/。的BSA时，溶解了6mgBSA。准备数支从添加了各种稳定剂的酶溶液中正确分取各0.2mL每小瓶。此外，准备不添加稳定剂的对照品。将准备好的小瓶冷冻真空干燥(FDR)，将水分完全蒸发后，只对同样添加了稳定剂的样品中的2个直接进行活性测定。另一方面，对于分析物小瓶，经25°C、湿度70%的情况下处理数小时后，在37。C下保存，测定l星期后的保存活性。活性残存率是刚刚进行FDR之后的活性平均值为100%时，测定37。C下各样品的活性平均值，计算活性残存率(％)。并且活性残存率越高，保存稳定性就越咼。其结果，BSA、丝氨酸、海藻糖单独使用时，粉末酶的保存稳定性也会提高，但通过组合BSA和丝氨酸，可更加看出保存稳定性的效果。从酶标准品的量的关系来看，只进行了2，3的组合，但具有热稳定性效果的化合物中，均具有同样的保存稳定性的效果(表7D、表8D)。表7D<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>表8D<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>实施例9D:使用葡萄糖测定系统的各种稳定剂的FADGDH热稳定效果的研究研究根据上述试验例1的FADGDH活性的测定方法进行。首先，将实施例1D中得到的来自土曲霉的FADGLD重组体标准品(rATFADGDH)溶解在酶稀释液(50mM磷酸钾缓冲液(pH5.5)、0.1%TritonX-lOO中使其为约2U/mL，准备50mL上述产物。在此酶溶液0.9mL中，如表1D中记载，将各种稳定剂添加至各自的最终浓度，准备2个合计容量为1.0ml的样品。此外，作为对照，代替各种化合物，准备2个添加蒸馏水O.lml的样品。2个中，1个保存在4。C，另一个在50。C下处理15分钟。处理后，测定各个样品的活性。以保存在4。C的样品的酶活性为100，比较50°C下处理15分钟后的活性值，作为活性残存率(％)来计算。这些研究的结果表明，通过添加不作为FADGDH的底物的糖类、某种氨基酸类，FADGDH的热稳定性增大(表9D、表10D)。与氨基酸类相比，糖类有高的热稳定性效果，其中，海藻糖、甘露糖、松三糖、葡萄糖酸钠、葡糖醛酸钠、半乳糖、甲基-(x-D-葡萄糖苷、ct-D-蜜二糖、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、氯化钠、硫酸钠、柠檬酸三钠、硫酸铵、琥珀酸、丙二酸、戊二酸、阿拉伯糖、脱水山梨糖醇、2-脱氧-D-葡萄糖、木糖、果糖、天冬氨酸钠、谷氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、牛磺酸具有优良的效果。表9D稳定剂GDH活性(kU/小瓶)GDH活性残存率(%)刚粉末化之后37。C1星期后对照(无添加)18.31.68.960%BSA16.74.325.960%丝氨酸19.88.241.360%BSAx60%丝氨酸19.514.071.6*湿度70%下25°C处理24小时后，37°C放置1星期表10D稳定剂GDH活性(U/小瓶)GDH活性残存率(%)临要粉末化之前刚粉末化之后37。C1星期后对照(无添加)40335261.660%海藻糖39740119548.630%海藻糖和30%丝胶蛋白40538528874.7*湿度70%下25°C处理7小时后，37°C放置1星期产业利用的可能性根据本发明，可获得葡萄糖测定用组合物或葡萄糖测定方法。该葡萄糖测定用组合物或葡萄糖测定方法可利用于葡萄糖检测试剂盒、葡萄糖传感器。本发明通过使用重组大肠杆菌，可大量生产来自米曲霉的葡萄糖脱氢酶。且通过本发明，可生产广泛意义上对麦芽糖不起作用、适合葡萄糖传感器的葡萄糖脱氢酶。本发明通过使用重组大肠杆菌，可大量生产来自米曲霉的葡萄糖脱氢酶。且通过本发明，可生产广泛意义上对麦芽糖不起作用、适合葡萄糖传感器的葡萄糖脱氢酶。根据本发明，GDH组合物稳定性的提高，可降低葡萄糖测定试剂、葡萄糖检测试剂盒及葡萄糖传感器制备时酶的热失活、减少该酶的使用量、提高测定精度。还可提供使用保存稳定性优异的GDH组合物的血糖值测定试剂。权利要求1.一种葡萄糖脱氢酶，其特征在于，来自青霉属丝状菌，具有以下(a)～(f)所示的理化性质(a)～(f)所示的理化性质(a)最适反应温度50℃；(b)最适反应pH值约6.5；(c)温度稳定性55℃加热处理15分钟后GDH活性残存率为90％以上，60℃加热处理15分钟后GDH活性残存率为40％以上；(d)pH稳定性5.0～8.0(25℃处理16小时后活性残存率为90％以上)；(e)底物特异性具有对葡萄糖的作用性为100％时对木糖为约10％、对2-脱氧-D-葡萄糖为约14％的作用性，对麦芽糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、松三糖、山梨糖、核糖、麦芽三糖、麦芽四糖及海藻糖的反应性低于2％；(f)化学影响受到铜、银及镉的强抑制，受到碘乙酸、N-乙基马来酰亚胺、羟胺及叠氮钠的抑制。2.—种葡萄糖脱氢酶，其特征在于，来自青霉属丝状菌，具有以下(a)(f)所示的理化性质(a)最适反应温度60°C;(b)最适反应pH值约6.5;(c)温度稳定性55°C加热处理15分钟后GDH活性残存率为95%以上，60°C加热处理15分钟后GDH活性残存率为70%以上；(d)pH稳定性5.08.0(25。C处理16小时后活性残存率为80%以上；(e)底物特异性具有对葡萄糖的作用性为100%时对木糖为约10%、对2-脱氧-D-葡萄糖为约17%的作用性，对麦芽糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、松三糖、山梨糖、核糖、麦芽三糖、麦芽四糖及海藻糖的反应性低于2%;(f)化学影响受到铜、银及镉的强抑制，受到铁、锌、碘乙酸、N-乙基马来酰亚胺及羟胺的抑制。3.根据权利要求1中所述的葡萄糖脱氢酶，其特征在于，青霉属丝状菌为薄朿ll青霉(Penicilliumlilacinoechinulatum)或意大禾U青霉(Penicilliumitalicum)。4.一种蛋白质，其特征在于，其为以下(a)(e)中任一项所述蛋白质(a)—种蛋白质，其含有序列号2所示的氨基酸序列，且具有葡萄糖脱氢酶活性；(b)—种蛋白质，其在序列号2所示的氨基酸序列中，在不失去葡萄糖脱氢酶活性的范围内，缺失N末端的连续多个氨基酸残基；(c)一种蛋白质，其在序列号2所示的氨基酸序列中，缺失N末端15个以上22个以下的连续的氨基酸；(d)—种蛋白质，其含有上述(a)(c)中任一项所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入或附加后的氨基酸序列，且具有葡萄糖脱氢酶活性；及(e)—种蛋白质，其与序列号2所示的氨基酸序列有80%以上的同源性，且具有葡萄糖脱氢酶活性。5.—种蛋白质，其特征在于，其为以下(a)(e)中任一项所述蛋白质(a)—种蛋白质，其含有序列号4所示的氨基酸序列，且具有葡萄糖脱氢酶活性；(b)—种蛋白质，其在序列号4所示的氨基酸序列中，在不失去葡萄糖脱氢酶活性的范围内，缺失N末端的连续多个氨基酸残基；(c)一种蛋白质，其在序列号4所示的氨基酸序列中，缺失N末端15个以上19个以下的连续的氨基酸；(d)—种蛋白质，其含有上述(a)(c)中任一项所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入或附加后的氨基酸序列，且具有葡萄糖脱氢酶活性；及(e)—种蛋白质，其与序列号4所示的氨基酸序列有80%以上的同源性，且具有葡萄糖脱氢酶活性。6.—种核酸，其特征在于，具有编码权利要求4或5所述的蛋白质的7.—种重组质粒，其特征在于，其是使权利要求6所述的核酸在宿主生物中连接到功能性启动子下而成。8.—种重组微生物，其特征在于，其是将权利要求7中所述的重组质粒转化到宿主微生物的重组微生物。9.根据权利要求8所述的重组微生物，其特征在于，宿主微生物是大肠杆菌。10.—种葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于，培养权利要求9所述的微生物，提取，纯化葡萄糖脱氢酶。11.一种葡萄糖浓度的测定方法，其特征在于，其使用权利要求l所述的葡萄糖脱氢酶。12.—种葡萄糖检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶。13.--种葡萄糖传感器，其特征在于，包含权利要求1中所述的葡萄糖脱氢酶。14.一种基因，其特征在于，含有以下(a)，(b)，(c)或(d)的DNA:(a)DNA，含有序列号11中记载的碱基序列；(b)DNA，其包含序列号11中记载的碱基序列及内含子、序列号14中记载的碱基序列，(c)DNA，其和含有与(a)的DNA相互补碱基序列的DNA在严谨条件下杂交，且编码具有葡萄糖脱氢酶活性蛋白质；(d)DNA，其和含有与(b)的DNA相互补碱基序列的DNA在严谨条件下杂交，且含有编码具有葡萄糖脱氢酶活性蛋白质的区域。15.—种基因，其特征在于，编码以下(a)或(b)的蛋白质(a)—种蛋白质，其含有序列号IO中记载的氨基酸序列；(b)—种蛋白质，其含有序列号10中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加(插入)后的氨基酸序列，且具有葡萄糖脱氢酶活性。16.—种重组载体，其特征在于，包含权利要求14中所述的基因。17.—种转化体，其特征在于，通过权利要求16中所述的重组载体被转化。18.根据权利要求17中所述的转化体，其特征在于，宿主为大肠杆菌。19.一种制造具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的方法，其特征在于，在营养培养基中培养权利要求17所述的转化体，提取具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。20.—种GDH的生产方法，其特征在于，在重组生产来自丝状菌的葡萄糖脱氢酶的方法中，通过将突变导入到其N末端区中存在的信号肽序列中，从而与导入突变前相比增加该耙酶的表达量。21.根据权利要求20中所述的GDH的生产方法，其特征在于，在重组生产来自丝状菌的GDH的方法中，通过使其N末端区中存在的信号肽的氨基酸序列的一部分发生缺失或取代，从而与导入突变前相比增加该靶酶的表达量。22.根据权利要求20中所述的GDH的生产方法，其特征在于，通过在序列号9或10的任一个记载的氨基酸序列中去除其N末端区存在的MLFSLAFLSALSLATASPAGRA的氨基酸序列的一部分或全部且使其表达，从而与这些氨基酸序列存在时相比提高表达量。23.根据权利要求20中所述的GDH的生产方法，其特征在于，通过在序列号9或10的任一个记载的氨基酸序列中的N末端区存在的MLFSLAFLSALSLATASPAGRA的氨基酸序列中进行122个氨基酸取代或/及氨基酸插入，与原氨基酸序列存在时相比提高表达活性。24.根据权利要求20中所述的GDH的生产方法，其特征在于，通过去除来自丝状菌的葡萄糖脱氢酶的N末端存在的MLGKLSFLSALSLAVAATLSNSTSA的氨基酸序列的一部分或全部且使其表达，从而与这些氨基酸序列存在时相比提高表达量，或通过进行125个氨基酸取代或/及氨基酸插入，与原氨基酸序列存在时相比提高表达活性。25.权利要求20中所述的生产方法中使用的DNA序列，其特征在于，编码来自丝状菌的葡萄糖脱氢酶(GDH)中使编码其N末端区存在的信号肽的DNA序列一部分或全部发生取代或/及缺失后的GDH基因。26.—种重组载体，其特征在于，包含权利要求25所述的DNA。27.—种转化体，其特征在于，将权利要求26中所述的重组载体导入宿主而成。28.—种GDH蛋白质，其特征在于，是使用权利要求27中所述的转化体生产的。29.—种组合物，其特征在于，包含权利要求28中所述的GDH蛋白质。30.—种葡萄糖浓度的测定方法，其特征在于，使用权利要求29中所述的组合物。31.—种葡萄糖传感器，其特征在于，包含权利要求30中所述的组合32.—种提高GDH的稳定性的方法，其特征在于，包括在含有以黄素化合物为辅酶的可溶性葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物中，使该酶与选自不为该酶底物的糖类或氨基酸类中的任一种以上的化合物共存的工序，与不使该化合物共存时比较，提高了GDH的稳定性。33.根据权利要求32中所述的提高稳定性的方法，其特征在于，溶液中共存的各化合物的最终浓度为0.01重量％以上，且各化合物的合计浓度为30重量％以下。34.根据权利要求32中所述的提高热稳定性的方法，其特征在于，添加的化合物选自海藻糖、甘露糖、松三糖、葡萄糖酸钠、葡糖醛酸钠、半乳糖、甲基-(x-D-葡萄糖苷、环糊精、(x-D-蜜二糖、蔗糖、纤维二糖、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、BSA、氯化钠、硫酸钠、柠檬酸三钠、硫酸铵、琥珀酸、丙二酸、戊二酸、阿拉伯糖、脱水山梨糖醇、2-脱氧-D-葡萄糖、木糖、果糖、天冬氨酸钠、谷氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸及牛磺酸中的任一种以上。35.根据权利要求32中所述的提高热稳定性的方法，其特征在于，以黄素化合物为辅酶的GDH来自丝状菌。36.—种含有可溶性GDH的组合物，其特征在于，通过权利要求32中所述的方法包提高热稳定性。37.根据权利要求36中所述的含有GDH的组合物，其特征在于，在含有黄素化合物结合型葡萄糖脱氢酶(GDH)重组体的组合物中，与4°C下保存的该组合物相比，即使在5(TC、处理15分钟时，也可残存20%以上的活性。38.根据权利要求36中所述的含有GDH的组合物，其特征在于，在含有黄素化合物结合型GDH的组合物中，与(C下保存的该组合物相比，即使在50。C、处理30分钟时，也可残存10%以上的活性。39.—种葡萄糖浓度的测定方法，其特征在于，使用权利要求36中所述的组合物。40.—种葡萄糖传感器，其特征在于，包含权利要求36中所述的组合41.一种组合物的制造方法，其特征在于，包括在含有可溶性辅酶结合型的葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物中使该酶与选自不为该酶底物的糖类或氨基酸类中的任一种以上的化合物共存的工序，与不使该化合物共存时比较，提高了GDH的热稳定性。全文摘要本发明提供耐热性及底物特异性优异、且不受溶解氧影响的葡萄糖脱氢酶。具体地说，本发明涉及葡萄糖脱氢酶，其特征在于，来自真核生物，与加热处理前相比，液状下55℃加热处理15分钟后也保持90％以上的活性，本发明提供高效生产来自米曲霉的葡萄糖脱氢酶，且更实用的葡萄糖脱氢酶。本发明提供将底物特异性优异的来自丝状菌的FAD-GDH用重组体高表达生产的方法，以及用该方法得到的FAD-GDH蛋白质，及使用该蛋白质的葡萄糖测定试剂。本发明涉及提高包含可溶性葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物的稳定性的方法。可溶性GDH优选来自丝状菌的FAD依赖型GDH，特别是在来自丝状菌的FAD-GDH或来自土曲霉的FAD-GDH中最有效果。文档编号C12N15/09GK101454449SQ20078002006公开日2009年6月10日申请日期2007年3月27日优先权日2006年3月31日发明者北林雅夫,岸本高英,川南裕,相场洋志,西矢芳昭,辻裕二申请人:东洋纺织株式会社