专利名称：：与细胞pH相关的植物核酸及其用途的制作方法
技术领域：
：概括而言，本发明涉及植物分子生物学以及可用于操控植物生理或生物化学特性的试剂的领域。更具体地，本发明提供了基因和蛋白质试剂，其能够调节或改变在植物的细胞、细胞群、细胞器(organelle)、部分或生殖部分中的酸性或碱性水平。还提供了经基因改造的植物、植物部分、子代(progeny)、后代(subsequentgenerations)和生殖材料(包括花或开花的部分)，其具有相对未经基因改造的植物而言展示出改变的细胞pH的细胞。
背景技术：
：在本说明书中涉及的任何现有技术在任何国家都不被，也不应该被理解为是对于该现有技术形成普遍常识的一部分的认可或任何形式的暗示。在本说明书的末尾列出了本说明书中提供的参考文献的详细目录。切花、观赏植物和农业植物产业努力开发新的和不同的植物品种，其带有例如如下的特征新型花颜色、水果(fruit)(例如葡萄、苹果、柠檬、柑橘)和浆果(例如草莓、蓝莓)的更好的味道/香味、产量增加、寿命延长、营养更多、用于用作专有标签的具有新颜色的种子，等等。此外，利用植物部分的植物副产品产业重视新型产物，所述新型产物有可能赋予其产品(例如汁液、酒)改变的特征，例如外观、风格、p木道、气p木和质地。在切花和观赏植物产业中，用于创造此类新型品种的一种有效方法是通过操控花颜色。已经采用了经典的育种技术，并取得一些成功，对于几乎所有的现在可得的花卉和/或植物的商业化品种产生了广泛的颜色。但是，这种方法是受到限制的，受特定物种基因库的限制，因此，单一物种罕见能具有全谱系有颜色的品种。例如，开发植物或植物部分(例如花、叶和茎)的新颜色品种将为切花和观赏植物市场提供重要的机会。在切花和观赏植物市场中，开发主要开花物种(例如蔷薇(rose)、菊花、郁金香、百合、康乃馨、大丁草、兰花、洋桔梗(lisianthus)、秋海棠、蝴蝶草、老鹳草、碧冬茄、赛亚麻、天竺葵、鸳尾、凤仙花和仙客来)的新颜色品种将具有巨大的利益。一个更具体的例子是为切花市场开发蓝色玫瑰。迄今为止，在切花中创造一种"真正的"蓝色色调(shade)已经被证明是极端困难的。在形成在"蓝色"范围内的颜色方面的成功已经提供了一系列的紫色康乃馨花(见FlorigenePtyLtd,Melbourne,Australia的网站；和国际专利申请PCT/AU96/00296)。这些现在已经在全世界一些国家上市销售。但是，除了在康乃馨和其他切花物种(1^列^口蕃^莱属4勿种(Wosa)、石叶十属物种(i/a/2/^"s577.)、大丁草属物种(^e由ra早)、茼蒿属物种(C力iy5"a/^力e/z7咖577.)、菊属物种("e/^ra/^力e则s/7.)、百合、丝石竹属物种(C/;75"o/^/7a跟)、蝴蝶草属物种(7bre/2/s)、碧冬痴属物种(尸"固.<2季)、兰花、兰属净勿种(f/zz76/d/"辺57.)、石斜属物种("e/2^ro6iw/z)、蝴蝶兰属物种(尸力a7ae/o;^/s)、j山客来属物种(C/c/a/ze")、秋海棠属物种(&卯/72'a)、鹜尾属物种(/r/s)、六出花属斗勿种(爿7sfroe迈er/a)、花烛属物种(爿//^ur/"/7)、长春花属净勿种(Caf力ara/2f力w51)、龙血树属斗勿种(Zrscae"a57.)、欧石南属物种(Ar/")、榕属物种(尸/cmm.)、香雪兰属物种(Fre"/a^p.)、倒挂金钟属物种(尸wc力s/a)、老鹳草属物种(^r膨'咖^.)、唐菖蒲属物种(tofiT/o/〃"/.)、向曰葵属物种(i^//a/7f/z"s)、风信子属物种(^rac//^/7)、金丝桃属物种(〃7per/c咖m.)、凤仙花属物种(/，〃e/7S早)、秀尾属物种(/r/sm.)、玉梅属物种(c力緒e/a腦'咖)、伽蓝菜属物种(fa/a/7c力oe)、洋枯梗属物种(Z/s/a/^力us)、半边莲属物种(Zo6e//am.)、7jc仙属物种(胁".證ss/7.)、赛亚麻属物种(vV/ere/s6erg/as/.)、虎目艮万年青属物种(0r/z"力c^7a咖s/.)、蓝眼菊属物种(05^eo^er迈咖s/7.)、芍药属物种(尸aeo//a)、天竺葵属物种(尸e/argo/7/u迈s/7.)、白花丹属物种(/Vw辺6ago)、才艮春花属物种(尸r/yz7ro")、假叶树属物种(iwsci^)、非洲紫罗兰属物种(i^i/7^aw//a)、一枝黄花属物种(Soh'cTa^w.)、白鹤芋属物种()、郁金香属物种(TW//^;.)、马鞭草属物种(rer6e刀a)、堇菜属物种(Wo/s)、马蹄莲属物种(Za/^ec^"//aw.))中更蓝的颜色以外，还需要在其他物种中产生改变的花颜色。明显的是，由于细胞的某些生理学特征，因而其他植物并不顺从对于花颜色的遗传操作。此类生理学特征中的一个是液泡pH。在所有活细胞中，细胞质的pH为大约中性，然而在液泡和溶酶体中维持酸性环境。跨液泡膜的H+-梯度是使得各种反向转运蛋白和同向转运蛋白能够跨越液泡膜转运化合物的驱动力。液泡腔的酸化是一种活动进程(activeprocess)。生理学研究表明，有两种质子泵参与液泡酸化，一种为液泡的泵送H+的ATP酶(vATPase)和另一种为液泡的焦石粦酸酶(V-PPase)。液泡具有许多不同的功能，并且不同类型的液泡可以执行这些不同的功能。问题。致力于找到此问题的答案的研究是复杂的，因为细胞的分离和空泡形成(evacuolation)(原生质体分离和培养)会引起应激，其导致液泡环境和内含物的性质发生变化。液泡产生过程和/或内部液泡环境控制受到影响的突变体是高度有价值的，以允许对在原始组织中的完整细胞中的这些现象进行研究。9在文献中对这种类型的突变体没有进行充分描述。这妨碍了该领域中的研究。花的颜色主要由三种类型的色素决定类黄酮、类胡萝卜素和甜菜红碱。其中，类黄酮是最常见的，并且对于形成从黄色到红色到蓝色的一系列颜色有贡献。类黄酮色素是苯基丙酸类(phenylpropanoidpathway)途径的次级代谢产物。类黄酮色素的生物合成途径(类黄酮途径)已经充分确立了(Holton和Cornish，户/a/^7:1071-1083，1995;Mol等人，7Ye/2c^P7aWSci.J:212-217,1998;Winkel-Shirley，尸/a;^726:485-493，2001a;Winke卜Shirley，户/a/^/^/s/o/."7:1399-1404，2001b;Tanaka等人，尸/a/^Ce//，77^ye。rga/z《0(1):1-24，2005;Koes等人，7>e/zc^//_P/3/^Sc/e刀ce，2005年5月)对于花或果实颜色作出主要贡献的类黄酮分子是花青苷，其是花青素的糖基化衍生物。花青苷通常位于花瓣或果实的表皮细胞的液泡中或叶子的表皮下细胞的液泡中。可以通过加入糖基基团、酰基基团和曱基基团来进一步修饰花青苷。花或果实的最终的可视颜色通常是许多因素的综合结果，所述因素包括花青苷积聚的类型，花青素分子的修饰，与其他类黄酮例如黄酮醇和黄酮的共色素沉着，与金属离子的络合，和液泡的pH。液泡pH是在花青苷稳定性和颜色中的一个因素。虽然中性到碱性pH通常产生更蓝的花青素颜色，但是这些分子在这种pH下稳定性较差。液泡，占据植物细胞体积的大部分，并且在维持细胞内环境稳定中起着关键作用。在成熟细胞中，这些细胞器能接近总细胞体积的90%，能储存各种各样的分子(离子、有机酸、糖、酶、贮存蛋白和不同类型的次级代谢产物)，并且用作质子和其他在代谢中重要的离子的贮存器。液泡膜上的不同转运蛋白调节此区室中溶质的积聚并驱动水的聚集从而使细胞膨胀。这些结构上简单的细胞器在植物的一生中起着广泛的基本作用，但这需要对其内环境进行紧密调控。为了产生所需花颜色，需要能够操控植物细胞和细胞器中的pH。发明概述在整个说明书中，除非上下文特别要求，词语"含有"或其变化形式例如"包括"或"包含"，将被理解为暗示包括所述要素或整数或者要素或整数的组，但是不排除任何其他要素或整数或者要素或整数的组。核苷酸和氨基酸序列由序列标识号(SEQIDNO:)来提及。这些SEQIDN0:在数字上对应于序列标识符〈400〉1(SEQIDNO:1)、<400>2(SEQIDNO:2)，依此类推。在表l中提供了序列识别符的概要。序列表在权利要求后给出。本发明提供了源自、可获得自或来自蔷薇属植物的核酸分子，所述核酸分子编码具有pH调节或改变活性(pHmodulatingoraltering基因试剂或构建体或其他分子的用途，所述基因试剂或构建体或其他分子操控在植物的细胞、细胞群、细胞器、部分或生殖部分中的pH。液泡pH的操控是一个特定的实施方案。pH途径的控制，以及任选地，与花青苷途径的操控一起，提供了一种强有力的用于产生改变的颜色或其他性状例如味道或香味的技术，尤其是在蔷薇、康乃馨、大丁草、菊花、百合、丝石竹、苹果、秋海裳、大戟属(^/p力or62'a)、三色堇、赛亚麻属(#/ere/z76erg/a)、洋桔梗、葡萄藤、伽蓝菜属(h/s/c力oe)、天竺蔡、凤4山花属(/yz^af/e/^)、长春花属(^ara/^力i/5")、4山客来、蝴蝶草属(7bre/7/a)、兰花、碧冬茄属(户Ww2/a)、秀尾、倒挂金钟属(,wc力Wa)、柠檬、柑橘、葡萄和浆果(例如草莓、蓝莓)中。因此，提供了增加或降低植物细胞中的酸性或碱性水平的基因试剂和蛋白质试剂。改变液泡pH的能力使得能够操控花的颜色。所述试剂包括核酸分子例如cDM和基因组DNA或其部分或片段，反义、有义ii或RNAi分子或包含它们的复合体，核酶，肽和蛋白质。在一个特定的实施方案中，液泡的pH被改变。另一方面涉及核酸分子，其包含编码对细胞pH(特别是液泡pH)酸序列。通常，所述核酸源自蔷薇属植物。被操控或被引入植物细胞中的主题核酸分子的表达水平改变细胞pH，特别是液泡pH。这反过来允许操控花颜色或味道或其他特征。提供了经基因修饰的植物，其展现出改变的花颜色或味道或其他特征。当提及经基因修饰的植物时，包括第一代植物或小植抹，以及植物的营养繁殖体以及子代和后代。当提及"植物"时，包括植物部分，所述植物部分包括生殖部分、种子、花、茎、叶、柄、花粉、生殖质、愈伤组织(包括未成熟的和成熟的愈伤组织)。此处所描述的一个具体的方面涉及下调能够调节或改变酸性或碱性水平的pH调节或改变性基因和蛋白质试剂，这引起植物中的细胞(特别是液泡)pH上升，进而导致所述植物的花更蓝。还提供了切花，包括经基因改造的植物或其子代的包含花的切下的茎，其为分离的形式或进行包装用于销售或在展览中排列。此处特别地考虑了来自于蔷薇的核酸分子及由其编码的多肽，其中涉及与来自于诸如大丁草、菊花和康乃馨的植物的序列相组合的蔷薇核酸序列或多肽。在表l中提供了在整个本说明书中所使用的序列标识符的概要表1序列标识符的概要<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>附图简述图1是复制子pK7GWIWG2(1)PPM1-110639bp的图解表示。图2是复制子pK7GWIWG2(1)PPM1-211171bp的图解表示。图3是复制子pK7GWIWG2(1)MAC9F110801bp的图解表示。图4是复制子pK7GWIWG2(1)CAC16.510763bp的图解表示。图5是用"P-标记的蔷薇PPM1片段探测的Southern印迹的放射自显影照片。每个泳道含有用i"cMI消化的10jugDNA。洗涤条件为在5(TC下用6xSSC/l%w/wSDS洗涤1小时，两次。泳道含有的DNA来自M:标准参照，1:银莲花，2:康乃馨，3:菊花，4:大丁草，5:风信子，6:秀尾，7:蛇鞭菊(Liatrus)，8:三色堇(堇茱属)，9:碧冬茄，10:赛亚麻(Nierembergia)，11:蔷薇，12:烟草。图6是用32P-标记的碧冬茄CAC16.5片段探测的Southern印迹的放射自显影照片。每个泳道含有用Aco7I消化的10MgDNA。洗涤条件为在50。C下用6xSSC/l%w/wSDS洗涤30分钟。泳道含有的DM来自M:标准参照，1:4艮莲花，2:康乃馨，3:菊花，4:大丁草，5:风信子，6:秀尾，7:蛇鞭菊，8:三色堇(堇菜属)，9:碧冬茄，10:赛亚麻，11:蔷薇，12:烟草。图7是用"P-标记的碧冬茄MAC9F1片段探测的Southern印迹的放射自显影照片。每个泳道含有用消化的10MgDNA。洗涤条件为在50。C下用6xSSC/l%w/wSDS洗涤30分钟。泳道含有的DNA来自M:标准参照，1:银莲花，2:康乃馨，3:菊花，4:大丁草，5:风信子，6:豸尾，7:蛇鞭菊，8:三色堇(堇菜属)，9:碧冬茄，10:赛亚麻，11:蔷薇，12:烟草。图8是pSFL631(~14kb)的图解表示。图9是pCGP1275(~6.4kb)的图解表示。图10是pCGP3210(~7.5kb)的图解表示。图11是复制子pWTT2132(~19.5kb)的图解表示。图12是pCGP3211(~23.8kb)的图解表示。图13是pCGP3215(~16.7kb)的图解表示。图14是复制子pCGP2355(~26.8kb)的图解表示。图15是pCGP2355(~30kb)的图解表示。图16是pCGP2756(~3.3kb)的图解表示。16图17是pCGP3212(~4.5kb)的图解表示。图18是pCGP3213(~21.2kb)的图解表示。图19是pGCP3214(~14kb)的图解表示。图20是pCGP3216(~28.5kb)的图解表示。图21是蔷薇PPM1核苷酸序列的显示。图22是蔷薇PPM1氨基酸序列的显示。图23是在pBluescriptSK载体中包含rosePPMlcDNA克隆(SEQIDNo:98)的质粒pRosePPMl的图解表示。标示出了所选择的限制性核酸内切酶位点。图24是SEQIDNO:2(碧冬茄PPM1的推断的氨基酸序列)和SEQIDNO:99(蔷薇PPM1的推断的氨基酸序列)的ClustalW(vl.4)多重序列比对。比对得分=5014，插入的缺口-3，保守的同一的位置=795，成对比对参数开放缺口罚分-10.O，延伸缺口罚分-0.1，相似性矩阵blosum，比对的长度-955,缺口=3，同一的位置-795(83%)，和相似的位置=77(8%)。"*"代表相同的残基，和"."代表保守性置换。发明详述已经鉴定、克隆和评估了编码具有pH调节或改变活性的多肽的核酸序列。此处描述的重组体基因序列允许调节基因或核酸的表达，所述基因或核酸编码pH调节或改变活性，通过例如从新表达，过表达，有义抑制，反义抑制，核酶、小核酶(minizyme)和DNA核酶活性，RMi-诱导或曱基化-诱导或者其他转录或转录后沉默活性。RNAi-诱导包括遗传分子，例如发夹、短的双链DNA或RNA和具有一个或两个单链核苷酸突出(overhangs)的部分双链DNA或RNA。因而，控制植物中细胞pH(特别是液泡pH)的能力使得能够响应于pH改变而操控花瓣颜色。此外，此处考虑了植物及其生殖或营养性部分，包括花、果实、种子、营养部分、叶、茎等。其他方面包括观赏的转基因或经基因修饰的植物。术语"转基因的"还包括营养繁殖体和子代植物和来自于从最初转基因植物开始的其随后的基因操作和/或杂交的植物。因此，一个方面提供了分离的核酸分子，其包含编码pH调节或改变基因(pHmodulatingoralteringgene)或具有pH调节或改变活性的多肽的核苷酸序列或者与编码pH调节或改变基因或具有pH调节或改变活性的多肽的序列互补的核苷酸序列，其中所述核酸分子的表达改变或调节细胞内的pH。在一个方面中，改变液泡中的pH。更具体地，提供了源自蔷薇的分离的核酸分子，其包含编码pH调节或改变基因或具有pH调节或改变活性的多肽的核苷酸序列或者补的核香酸序列，其中所述核酸分子的表达改变或调节细胞内的pH。在一个具体实施方案中，所述核酸调节液泡pH。另一个方面考虑了分离的核酸分子，其包含编码pH调节或改变基因的核香酸序列或者与编码pH调节或改变基因的序列互补的核苷酸序列，所述核酸分子可操作地连接至包含编码花青苷途径基因的核苷酸序列或与编码花青苷途径基因的序列互补的核苷酸序列的核酸序列。更具体地，提供了源自蔷薇的分离的核酸分子，其包含编码pH调节或改变基因的核苦酸序列或者与编码pH调节或改变基因的序列互补的核苷酸序列，所述核酸分子可操作地连接至包含编码花青苷途列的核酸序列。本发明的另一个方面旨在从蔷薇中可获得的分离的核酸分子，其包含编码pH调节或改变基因的核苷酸序列或者与编码pH调节或改变基因的序列互补的核苷酸序列，所述核酸分子可操作地连接至包含编码花青苷途径基因的核苷酸序列或与编码花青苷途径基因的序列互补的核苷酸序列的核酸序列。还考虑了来自菊花、大丁草和康乃馨的同源核酸分子和蛋白质。当关于来自于蔷薇或其他植物的核酸分子提及"源自"时，意味18着是直接从所述植物中分离的，是从植物中可获得的，是经由在病毒、细菌或其他细胞中的核酸文库而间接获得的，或者最初来自所述植物但被不同的植物所保持。术语"核酸分子"是指在非天然出现的条件下的基因序列。一般地，这意味着从它的天然状态中分离或者在非天然出现的环境下合成或衍生。更特别地，它包括体外形成或保持的核酸分子，包括基因组DNA片段重组体或合成分子以及与异源核酸相组合的核酸。它还扩展到基因组DNA或cDNA或者其部分，其编码相对于它自身的或另一个启动子来说处于相反方向的pH调节序列或其部分。它进一步扩展到天然发生的序列，在相对于其他核酸序列来说至少部分纯化之后。术语"基因序列"在此处以其最普遍含义进行使用，并且包括任何连续的核苷酸碱基串，其直接地或通过互补的碱基串指定了pH调节蛋白中的氨基酸序列。这种氨基酸序列可以组成全长的调节或改变pH的酶，例如在SEQIDNO:99中所示，或与其具有至少50%相似性的氨基酸序列例如SEQIDNO:2、4或6，或有活性的其截短形式，或者可以相应于特定区域例如所述酶的N-末端、C-末端或内部部分。基因序列还可以指核苷酸的序列或核苷酸序列，并且包括两个或更多个序列的重组融合物。根据本发明的上述方面提供了核酸分子，其包含这样的核普酸序列或互补核苷酸序列，所述核苷酸序列或互补核苷酸序列基本上与SEQIDNO:98中所示一样，或与其具有至少大约50%相似性，或能够在低严紧条件下与SEQIDN0:98中所示的序列杂交，例如SEQIDNO:1、3或5。所述pH调节或改变核酸为SEQIDNO:98或l、3或5中所示，或与其具有至少大约50%相似性或同一性，或能够在低严紧条件下与SEQIDNO:98或l、3或5中所示的序列杂交，所述花青苷途径基因以前已经描述，例如与PCT/AU92/00334;PCTAU96/00296;PCT/AU93/00127;PCT/AU97/00124;PCT/AU93/00387;PCT/AU93/00400;19PCT/AU01/00358;PCT/AU03/00079;PCT/AU03/01111;和JP2003-293121有关的同族的专利和专利申请。表l提供了序列标识符的概要。在图21和22中以及在SEQIDNo:98和99中分别提供了蔷薇PPM1的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。本发明进一步扩展到来自菊花、大丁草和康乃馨的同源核酸和蛋白质。本发明所包括的备选的相似性和同一性百分比(在核苷酸或氨基酸水平上)包括至少大约60%，或至少大约65%，或至少大约70%，或至少大约75%，或至少大约80%,或至少大约85%，或至少大约90%，或更高，例如大约95%，或大约96%，或大约97%，或大约98%，或大约99%,例如至少大约60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%。在一个特定的实施方案中，提供了分离的核酸分子，其包含这样的核苷酸序列或互补核苷酸序列，所述核苷酸序列或互补核苷酸序列基本上与SEQIDNO:98中所示一样，或与其具有至少大约50%相似性，或能够在低严紧条件下与SEQIDNO:98中所示的序列或任一个的互补链杂交，其中所述核苷酸序列编码具有pH调节或改变活性的多肽。为了确定严紧性水平以定义能与SEQIDNO:98杂交的核酸分子，在此处提及低严紧性时，包括和嚢括至少大约0%到至少大约15%v/v甲酰胺，以及用于杂交的至少大约1M到至少大约2M的盐，和用于洗涤条件的至少大约1M到至少大约2M的盐。一般地，低严紧性为大约25-3(TC到大约42°C。可以改变温度，并且使用更高的温度来代替包含甲酰胺和/或给予备选的严紧条件。如果必要可以釆用备选的严紧条件，例如中等严紧性，其包括和嚢括至少大约16%v/v到至少大约30。/。v/v的曱酰胺，以及用于杂交的至少大约0.5M到至少大约0.9M的盐，和用于洗涤条件的至少大约0.5M到至少大约0.9M的盐；或高严紧性，其包括和嚢括至少大约31%v/v到至少大约50%v/v的甲酰胺，以及用于杂交的至少大约0.01M到至少大约0.15M的盐，和用于洗涤条件的至少大约0.OIM到至少大约0.15M的盐。一般地，洗涤在下列条件下进行Tm-69.3+0.41(G+C)%(Marmur和Doty，#0人"/o人J;109，1962)。但是，每增加1%的错配碱基对数目，双链体腿的"L下降1。C(Bonner和Laskey，紐./.肠c力e迈.83，1974)。在这些杂交条件中甲酰胺是可选的。因此，特别优选的严紧性水平如下确定低严紧性是6xSSC緩沖液，1.0%w/vSDS，在25-42。C下；中等严紧性是2xSSC緩沖液，1.0%w/vSDS，在20。C至65。C的温度下；高严紧性是O.1xSSC緩沖液，0.1%w/vSDS，在至少65。C的温度下。本发明的另一个方面提供了核酸分子，其包含这样的核苷酸序列，即所述核苷酸序列编码基本上与SEQIDNO:99中所示一样的氨基酸序列或与其具有至少大约50%相似性的氨基酸序列，或者与编码基本上与SEQIDNO:99中所示一样的氨基酸序列或与其具有至少大约50%相似性的氨基酸序列的序列互补。在此使用的术语"相似性，，包括在核苷酸或氨基酸水平上在所比较的序列之间确切的同一性。当在核苷酸水平上存在非同一性时，"相似性"包括序列之间的差异，其导致不同的氨基酸，然而所述不同的氨基酸在结构、功能、生化和/或构象水平上相互有关。当在氨基酸水平上存在非同一性时，"相似性"包括然而在结构、功能、生化和/或构象水平上相互有关的氨基酸。在特别优选的实施方案中，在同一性水平而不是相似性水平上进行核苷酸和序列的比较。用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括"参照序列"、"比较窗"、"序列相似性"、"序列同一性"、"序列相似性百分比"、"序列同一性百分比"、"基本上相似的，，和"基本同一性"。"参照序列"的长度为至少12个，但经常为15至18个和常常至少25个或以上，例如30个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。因为两条多核苷酸中的每一个可以包含(l)在所述两条多核苷酸之间相似的序列(即只是完整多核苷酸序列的部分)，和(2)在所述两条多核苷酸之间不同的序列，所以两条(或更多条)多核苷酸之间的序列比较通常通过下列方式来进行在"比较窗"上比较所述两条多核苷酸的序列以鉴定并比较序列局部区域的相似性。"比较窗"涉及通常12个连续残基的概念上的区段，将其与参照序列进行对比。为了所述两个序列的最佳比对，比较窗可以包括相比参照序列(其不含添加或缺失)而言大约20%或更少的添加或缺失(即缺口)。对于对齐比较窗，序列的最佳比对可以通过算法的计算机化执行(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDriveMadison,WI,USA)或者通过检查和由所选的各种方法中的任一种所产生的最佳比对(即在比较窗上导致最高的同源性百分比)来实施。还可以提及BLAST程序族，例如由Altschul等人(y化c厶We5",2》3389-3402,1997)所公开。序列分析的详细讨论可以在Ausubel等人(CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&SonsInc.1994-1998，第15章，1998)的单元19.3中找到。在此使用的术语"序列相似性"和"序列同一性"涉及在比较窗上，在核苷酸对核普酸(nucleotide-by-nucleotide)的基础上或在氣基酸对氛基酸(aminoacid—by—aminoacid)的基础上序歹l]相同或者功能或结构上相似的程度。因此，例如，"序列同一性百分比"通过下列方式来计算在比较窗中比较两个经最佳比对的序列，测定在两个序列中出现相同核苦酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的^f立置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目(即，窗的大小)，并且将结果乘以IOO从而产生序列同一性百分比。为了本发明的目的，"序列同一性"将被理解为表示通过DNASIS计算机程序(Version2.5forwindows;可获自HitachiSoftwareEngineeringCo.，Ltd.,SouthSanFrancisco，California:USA)并用在软件所附的参考手册中所使用的标准缺省值而计算出的22"匹配百分比"。类似的评述可应用于序列相似性。此处所考虑的核酸序列还包括寡核苷酸，其可用作用于扩增反应的基因探针或用作能调节植物中相应基因的表达的反义或有义分子。有义分子包括发夹构造、短的双链DNA和RNA以及具有一个或多个单链核苷酸突出的部分双链DNA和RNA。此处所用的反义分子还可包括基因构建体，所述基因构建体包含相对于它自己的或另一个启动子来说处于相反方向的结构基因组或cDM基因或其部分。它还可包含同源的基因序列。反义或有义分子还可以针对编码具有pH调节或改变活性的多肽的基因的末端或内部部分或者上述组合，从而该基因的表达被减少或消除。关于这一方面，提供了5-50个核苷酸例如5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17,18，19，20，21，22，23，24，25,26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55个核苷酸的寡核苷酸，其与具有SEQIDNO:98中所示核苦酸序列的分子的部分或区域具有基本相似性。在该情况下，基本相似性或互补性表示在对于寡核苷酸杂交来说特异的低的、备选且优选地中等的和备选且最优选地高的严紧性条件(Sambrook等人，#o/eci//ar67加//^,jZa60r"or7^2刀ya7，第二版，ColdSpringHarborLaboratories,ColdSpringHarbor,NY,USA,1989)下的可杂交的相似性。这种寡核苷酸例如可用于从各种来源筛选pH调节或改变基因序列，或用于在转基因植物中监测所引入的基因序列。优选的寡核苷酸针对保守的pH调节或改变基因序列或者在植物属、植物物种和/或植物品种中保守的序列。在一个方面，寡核苷酸相应于调节或改变pH的核酸序列的5'或3'末端。为了方便，5'末端在此处被认为定义了基本上位于结构基因起始密码子和基因中心部分之间的区域，和3'末端在此处被认为定义了基本上位于基因中心部分和结构基因终止密码子之间的区域。因此，清楚的是，所述寡核苷酸或探针可以与5'末端或3'末端或者与5'末端和3'末端的共同区域杂交。本发明扩展到所有这样的探针。在一个实施例中，将编码pH调节或改变蛋白(pHmodulatingoralteringprotein)或其各种功能衍生物的核酸序列用于降低内源性的pH调节或改变蛋白的水平(例如通过共抑制或反义介导的抑制)，或者将其他转录后基因沉默(PTGS)加工，包括RNAi或备选地编码这种酶或其各种衍生物或部分的核酸序列，以有义或反义方向用于降低pH调节或改变蛋白的水平。有义链、双链或部分单链的例如具有发夹环的构建体的使用在诱导PTGS应答中特别有用。在进一步的备选方案，核酶、小核酶或DM核酶能用于失活乾核酸序列。更将进一步的实施方案包括转录后抑制，以减少翻译成多肽物质。另外一个实施方案包括特异性地引起或去除曱基化。此处所提及的pH调节或改变活性的变化涉及，超过或低于活性的正常的内源或现存水平，活性提高或降低直至30%,或更优选地30-50%，更加优选地50-75%,或更加优选地75%，或更多。此类提高或降低可以称为pH调节蛋白的调节或改变。通常，调节是在pH调节或改变基因序列的转录或翻译水平上。核酸可以是核糖核酸或脱氧核糖核酸，单链或双链以及线性或共价闭合的环状分子。优选地，所述核酸分子是cDNA。本发明还扩展到其他核酸分子，所述核酸分子在低严紧条件下、优选地在中等严紧条地与SEQIDNO:98中所示核苷酸序列或其部分或区域杂交。在一个特定的实施方案中，提供了具有SEQIDNO:98中所示的核苷酸序列的核酸分子，或者扩展到在核苷酸或氨基酸序列水平上与SEQIDNO:98中所示序列的至少一个或多个区域具有至少40%，更优选地至少45%，更加优选地至少55%,更加优选而至少65%-70%，和更加优选地超过85%的相似性的分子，并且其中所述核酸编码具有pH调节或改变活性的酶或与编码具有pH调节或改变活性的酶的序列互补。但是应该注意，核苷酸或氨基酸序列可以具有低于上文给出的百分比的相似性，并且仍然编码pH调节或改变活性并且这样的分子仍然可以被考虑在本发明的范围内，当它们具有序列保守区域时。另一方面扩展到以寡核苷酸引物或探针形式的核酸分子，其能够在低严紧条件下、特别地在中等严紧条件下和最特别地在高严紧条件下与上面所考虑的核酸分子的一部分特别是在SEQIDNO:98中所示的那些杂交。优选地，该部分相应于基因的5'或3'末端。为了方便，5'末端在此处被认为定义了基本上位于结构基因序列起始密码子和基因中心部分之间的区域，和3'末端在此处被认为定义了基本上位于基因中心部分和结构基因序列终止密码子之间的区域。因此，清楚的是，所述寡核苷酸或探针可以与5'末端或3'末端或者与5'末端和3'末端的共同区域杂交。此处考虑了所有这样的探针。术语"基因"以其最广的含义进行使用，并包括相应于基因外显子的cDNA。因此，当此处提及基因时，希望包括(i)经典的基因组基因，其由转录和/或翻译调控序列和/或编码区和/或非翻译序列(即内含子，5'-和3'-非翻译序列)组成；或(n)相应于编码区(即外显子)的mRNA或cDNA和基因的5'-和3'-非翻译序列。术语"基因"还被用于描述编码表达产物的全部或部分的合成或融合分子。在特定的实施方案中，术语"核酸分子"和"基因"可以互换使用。核酸或其互补形式可以编码全长酶或其部分或^f汴生物。"汙生物"表示相对于天然存在的酶而言的任何单个或多个氨基酸的置换、缺失和/或添加，并且保留了pH调节或改变活性。在这点上，核酸包含编码pH调节或改变活性的天然存在的核苷酸序列，或者可以含有对于所述天然存在的序列的单个或多个核苷酸置换、缺失和/或添加。本发明的核酸或其互补形式还可以编码pH调节或改变蛋白的"部分，，，无论是否有活性，并且这种核酸分子可以用作寡核苷酸探针、引物，用于聚合酶链反应或用在各种诱变技术中，或者用于产生反义分子。当此处提及核酸分子、核苷酸序列或氨基酸序列的"部分"时，优选涉及合适地含有至少大约IO个连续核苷酸或5个连续氨基酸的分25子。本发明的pH调节或改变蛋白的氨基酸插入性衍生物包括氨基和/或羧基末端融合物以及单个或多个氨基酸的序列内插入物。插入性氨基酸序列变体是其中在蛋白质的预定位点处引入了一个或多个氨基酸残基的那些，虽然釆用合适地筛选结果所得的产物，随机插入也是可能的。缺失性变体的特征在于从序列中去除了一个或多个氨基酸。置换性氨基酸变体是其中已经去除了所述序列中的至少一个残基并且在此位置处插入了不同残基的那些。典型的置换是根据表2来进行的那些。表2用于氨基酸置换的合适残基原始残基示例性的置换AlaSerArgLysAsnGin;HisAspGluCysSerGinAsrijGluGluAspGlyProHisAsn;GinlieLeu^ValLeulie;ValLysArg;Gin;GluMetLeu;lie;ValPheMet;Leu;TyrSerThrThrSer26<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>当通过氨基酸置换来衍生pH调节或改变蛋白时，所述氨基酸通常被其他具有类似特性(例如疏水性、亲水性、电负性、大侧链等)的氨基酸替代。氨基酸置换通常是单个残基的。氨基酸插入通常按次序为大约l-10个氨基酸残基，并且缺失为大约l-20个残基。优选地，缺失或插入发生在相邻对上，即两个残基的缺失或两个残基的插入。可以使用本领域熟知的肽合成技术，例如固相肽合成(Merrifield/.^z7.Soc.《JT.'2149,1964)等，或通过重组DNA操作，来容易地产生上面涉及的氨基酸变体。用于在具有已知或部分已知的序列的DNA中的预定位点处产生置换突变的技术是众所周知的，并且包括例如M13诱变。操作DNA序列以产生表现为置换、插入或缺失性变体的变体蛋白已被方便地描述了，例如在Sambrook等人(1989,同上)。此处描述的pH调节或改变蛋白的重组体或合成突变体和衍生物的其他例子包括与所述酶相结合的任何分子例如糖、脂质和/或蛋白质或多肽的单个或多个置换、缺失和/或添加。术语"类似物"和"衍生物"还扩展到pH调节或改变蛋白的任何功能性化学等价物，并且还扩展到上述任何氨基酸衍生物。为了方便，当此处提及pH调节或改变蛋白时，包括提及它们的任何功能突变体、衍生物、部分、片段、同系物或类似物。在本文中特别举例说明了源自蔷薇的核酸序列，因为这代表了到目前为止最方便的材料来源。但是，本领域技术人员将会立即意识到，可以从许多来源例如其他植物或某些微生物中分离出相似的序列。所有直接或间接编码pH调节蛋白的此类核酸序列都被包括在本文之中，不管其来源。编码pH调节或改变蛋白的基因的其他合适的来源的例子包括，但不限于，Liparieae，白花丹属物种、蔷薇属物种、大丁草属物种、茼蒿属物种、菊属物种、百合、丝石竹属物种、蝴蝶草属物种、碧冬茄属物种、兰花、兰属物种、石斛属物种、蝴蝶兰属物种、仙客来、秋海裳属物种、^尾属物种、六出花属物种、花烛属物种、长春花属物种、龙血树属物种、欧石南属物种、榕属物种、香雪兰属物种、倒挂金钟属物种、老鹳草属物种、唐菖蒲属物种、向日葵属物种、风信子属物种、金丝桃属物种、凤仙花属物种、鸳尾属物种、玉梅属物种、伽蓝菜属物种、洋桔梗属物种、半边莲属物种、水仙属物种、赛亚麻属物种、虎眼万年青属物种、蓝眼菊属物种、芍药属物种、天竺葵属物种、报春花属物种、假叶树属物种、非洲紫罗兰属物种、一枝黄花属物种、白鹤芋属物种、郁金香属物种、马鞭草属物种、堇菜属物种、马蹄莲属物种、4艮莲花(anenome)、风信子、蛇鞭菊属物种U/a"^M.)、堇菜属物种、赛亚麻属物种、烟草属物种(治'co〃a/7asa)。此处描述的编码pH调节或改变蛋白的核酸序列可以以任一方向1入转基因植物中并在其中表达，由此提供了一种通过减少或消除内源或现存的pH调节或改变蛋白的活性从而使液泡pH增加来调节或改变液泡pH的手段。具体的效果是在花青苷类的颜色方面和/或在结果所得的花颜色方面转换到蓝色的可视效果。核酸序列在植物中的表达可以是组成型的、诱导型的或发育型的，并且还可以是组织特异性的。词汇"表达"以其最广含义进行使用，包括产生RNA或者RNA和蛋白质两者。它还扩展到核酸分子的部分表达。根据这个方面，提供了用于产生能够合成pH调节或改变蛋白的转基因开花植物的方法，所述方法包括用包含编码所述pH调节或改变蛋白的核苷酸序列的核酸序列在允许所述核酸序列最终表达的条件下稳定转化合适植物的细胞；从所述细胞再生转基因植物；和在足以允许表达所述核酸序列的条件下生长所述转基因植物一段时间。因此，所述转基因植物可以以相对于在相对照的非转基因植物中所表达的量而言升高的水平来产生非固有的pH调节或改变蛋白。另一个方面考虑了用于产生固有或现存的pH调节或改变活性降低的转基因植物的方法，所述方法包括用包含编码pH调节活性的核苷酸序列或与编码pH调节活性的序列互补的核苷酸序列的核酸分子稳定转化合适植物的细胞；从所述细胞再生转基因植物；和在需要时，在足以允许表达所述核酸的条件下生长所述转基因植物。另外一个方面提供了用于产生固有或现存的pH调节或改变蛋白的活性降低的经基因修饰的植物的方法，所述方法包括通过从被^1入植物细胞中的经适当改变的pH调节或改变基因或其衍生物或部分开始经过同源重组对固有序列进行修饰来使得pH调节或改变基因发生改变；和从所述细胞再生经基因修饰的植物。另外一个方面考虑了用于产生固有的PH改变蛋白的活性降低的经基因修饰的植物的方法，所述方法包括通过向植物细胞中引入核酸分子来降低编码固有的pH改变蛋白的基因的表达，从而改变pH;和从所述细胞再生经基因修饰的植物。另外一个方面提供了用于产生能够产生pH改变蛋白的转基因植物的方法，所述方法包括用从蔷薇中可获得的分离的核酸分子稳定转化合适植物的细胞，所述核酸分子包含编码pH的核苷酸序列或与编码pH的序列互补的核苷酸序列；和从所述细胞再生转基因植物。如此处所用的，"固有的"酶是对于特定细胞来说天然的或在特定细胞中天然表达的酶。"非固有的"酶是对所述细胞来说非天然的但通过将遗传材料引入植物细胞中例如通过转基因而表达的酶。"内源的"酶是由细胞产生的酶，它对于那种细胞来说可以是或不是固有的。如上文所述，特定的编码改变pH的蛋白质的核酸分子来自于蔷薇。在一个特定的实施方案中，考虑了用于产生展示出改变的花或花序特性的转基因开花植物的方法，所述方法包括用可获得自或源自蔷薇的核酸序列稳定转化合适植物的细胞；从所述细胞再生转基因植物；间。、、'、、、'土、此处所用的术语"花序"涉及植物或任何开花系统的开花部分，其具有超过一个的花并通常通过伸展的节间而与营养性部分分开，其通常包含花个体、苞片和花序梗以及花梗。如上文所述，"转基因植物"还可以被称为"经基因修饰的植物"。备选地，所述方法可以包括用可获得自或源自蔷薇的核酸序列或其互补序列稳定转化合适植物的细胞；从所述细胞再生转基因植物；和在足以改变固有或现存的pH调节或改变蛋白的活性水平的条件下生长所述转基因植物一段时间。在一个实施方案中，改变的水平应该低于在相对照的非转基因植物中pH调节或改变活性的固有或现存的水平。并不希望限制本发明，作用方式的一种理论是固有的pH调节蛋白活性的降低可能需要所引入的核酸序列或其互补序列的表达。但是，达到所需效果(即，展示出改变的花或花序特性的开花植物)可以不需要所引入的基因序列或其互补序列的表达。在一个相关的实施方案中，提供了用于产生展示出改变的花或花序特性的开花植物的方法，所述方法包括通过从被引入植物细胞中的经适当改变的pH调节或改变基因或其衍生物或部分开始经过同源重组对固有序列进行修饰来使得pH调节或改变基因发生改变；和从所述细胞再生经基因修饰的植物。在一个特定的方面，改变的花或花序包括产生不同色调的蓝色或紫色或红色的花或者其他颜色，这取决于受体植物的基因型和生理条件。在另一方面，所述靶基因来自于蔷薇。因此，考虑了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物能够表达源自蔷薇的编码pH调节或改变蛋白或其部分的重组基因或者带有与编码pH调节或改变蛋白的mRNA分子的全部或部分基本上互补的核酸序列的重组基因，所述方法包括用包含编码pH调节或改变蛋白的核苷酸序列或与编码pH调节或改变蛋白的序列互补的核苷酸序列的分离的核酸分子稳定转化合适植物的细胞，所述转化在需要时在允许所述分离的核酸分子最终表达的条件下进行；和从所述细胞再生转基因植物。本领域技术人员将会立即意识到可应用于此处描述的方法的变化30形式，例如在靶植物中增加或降低天然存在的酶的表达，从而导致不同色调的颜色，例如不同色调的蓝色、紫色或红色。因此，本公开内容扩展到所有转基因植物或者转基因植物的部分或来自于其的细胞或者转基因植物的子代，它们含有本发明的核酸序列的全部或部分，或者其反义形式和/或其任何同系物或相关形式，特别是那些展示出改变的花或花序特性的转基因植物。转基因植物可以含有引入的核酸分子，其包含编码pH调节或改变蛋白的核苷酸序列或与编码pH调节或改变蛋白的序列互补的核苷酸序列。一般地，将核酸稳定地引入植物基因组中，虽然本发明还扩展到在自主复制的核酸序列例如能在所述植物细胞中复制的DNA或RNA病毒中引入pH调节或改变核苷酸序列。这一方面还扩展到来自于这种转基因植物的种子。这样的种子，尤其是如果有颜色，可用作植物的专有标签。用于将遗传的转化、生物射弹粒子轰击等，它们都被包括在本文中。另一个方面考虑了来自于下列来源的提取物的用途转基因植物(它们含有此处描述的核酸序列的全部或部分)，特别是蔷薇，例如当用作调味料或食品添加剂或保健产品或饮料或汁液或颜料时。此处所考虑的植物部分包括但不限于花、果实、营养部分、坚果、根、茎、叶或种子。其的细胞，粉碎。植物、植物部分或来自于其的细胞或者提取物可以以许多不同的方式使用，例如用于产生调味料(例如食物香精)、食品添加剂(例如稳定剂、着色剂)、保健产品(例如抗氧化剂、片剂)、饮料(例如酒、醑剂、茶)或汁液(例如果汁)或颜料(例如食物颜料、纺织品颜料、染料、涂料、色彩)。进一步的方面旨在重组形式的pH调节或改变蛋白，其例如来自于蔷薇。所述重组形式的酶提供了用于研究的材料来源，例如活性更高的酶，和可用来开发用于产生有色化合物的体外系统。更进一步的方面考虑了此处所述的基因序列(例如来自于蔷薇)在制备基因构建体中的用途，所述基因构建体能够在植物中表达pH调节或改变蛋白或者下调固有的pH调节蛋白。术语"基因构建体"已经在整个说明书和权利要求书中与术语"融合分子"、"重组分子"、"重组核苷酸序列"可互换地使用。基因构建体可以包括包含编码单个蛋白质的核苷酸序列的单个核酸分子，或者可以含有编码两个或更多个蛋白质的多个开放阅读框。它还可以包含启动子，其可操作地连接至所述开放阅读框中的一个或多个。另一个方面旨在原核或真核生物，其在染色体外以质粒形式带有编码pH调节或改变蛋白的基因序列(例如来自于蔷薇)。还提供了重组多肽，其包含基本上与SEQIDNO:99中所示一样的氨基酸序列，或与SEQIDNO:99具有至少大约50°/。相似性的氨基酸序列，或者所述多肽的衍生物。"重组多肽"是指由核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列通他亲缘(relative)或前体细胞中。还可以使用无细胞的体外转录系统来产生重组多肽。术语"重组多肽"包括分离的多肽或者当存在于物或植物部分中。"多肽"包括肽或蛋白质，并且被包括在术语"酶"中。重组多肽还可以是包含两个或更多个异源氨基酸序列的融合分子。另外一个方面考虑了连接至参与调节或改变花青苷途径的核酸序列的pH调节或改变核酸序列。另一个方面旨在从蔷薇中可获得的编码pH改变多肽的核酸分子的用途，所述用途为用于制造与同一物种的非制造植物中的pH相比较而言具有改变的pH的植物。在特定的实施方案中，改变了液泡pH。本发明通过下列非限定性实施例进一步进行描述。关于这些实施例，采用下面的方法和试剂一般地，下述方法在下列文献中描述Sambrook等人(1989，同上)，或Sambrook和Russell,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第三版,ColdSpringHarborLaboratories,ColdSpringHarbor,NY，USA,2001，或PlantMolecularBiologyManual(第二版)，Gelvin和Schilperoot(编者)，KluwerAcademicPublisherTheNetherlands,1994，或PlantMolecularBiologyLabfax,Croy(编者)，BiosscientificPublishers,Oxford,UK，1993。在发f,发在如下所定义的发育阶段收获矮牵牛(尸Ww/a栽培种MlxV30的花阶段1:未着色的(Unpigmented)花芽(长度小于10mm)阶段2:未着色的花芽(长度为10至20mm)阶段3:轻微着色的闭合的花芽(长度为20至27mm)阶段4:着色的闭合的花芽(长度为27至35mm)阶段5:完全着色的闭合的花芽(长度为35至45mm)阶段6:正出现花冠的完全着色的花芽(长度为45至55mm)阶段7:完全开放的花(长度为55至60mm)其他矮牵牛栽培种(例如R27和W115)被分组入如上所述的相似发育阶段中，但是在不同栽培种之间，芽的总长不同。著處杂交蔷薇(Wow力j^r/^)栽培种Roterose的花获自日本东京的一家苗种场。杂交蔷薇花的发育阶段如下进行定义阶段l:未着色的(Unpigmented)紧闭的芽阶段2:着色的紧闭的芽阶段3:着色的闭合的芽；萼片开始打开阶段4:花芽开始打开；花瓣深着色；萼片已分开。阶段5:萼片完全展开，有些巻曲。花瓣深着色并展开。在cDNA-AFLP筛选中使用的矮牵牛品系是R27(野生型(wt))、W225(a/入在R27背景中的移码)、R144(在R27背景中的/WJ之中的p力J-V2068转座子插入)、R147(在R27背景中的/W4之中的p/^-J"J《转座子插入)和R153(在杂交入R27背景中的尸VJ之中的ph5转座子插入)。所有品系都具有遗传上相同的背景以减少能导致转录水平差异的环境条件的差异，植物在温室中相邻地生长。在转化实验中使用的矮牵牛品系MlxV30是M1(^W,^T^，j#《尸#《尸/W2)与品系V30(Ji\7，」#义」#《尸〃《尸/W7，杂交的F1杂种。MlxV30的花是红-紫色的，并且通常积聚基于二曱翠雀素的花青苷类和低水平的黄酮醇槲皮素。如Holton等人(iY"wre，276—279，1993)或Brugliera等人(？h/2/1/.J，81-92，1994)或deVettenN等人(^/esa/cT"ere/o//ze/^77:1422-1434，1997)所述的，或者通过本领域熟知的其他任何方法。冬^c/W」X岸使用如Holton等人(1993，同上)或Brugliera等人(1994，同上)或deVettenN等人(1997，同上)所述的标准方法，从R27花瓣中制备碧冬茄花瓣cDNA文库。如以前所述(deVetten等人，1997，同上；Quattrocchio等人，34尸"/^/.7J,475-488，1998)，通过碧冬茄花瓣的粒子轰击来进4亍瞬时表达测定法。通过在6mL蒸馏水中磨碎两个花冠的花瓣冠檐来测量花瓣提取物的pH。使用常规pH电极直接测量pH(1分钟内)，以避免空气中的0)2改变提取物的pH。紙C和7Z"、浙HPLC分析如Vetten等人(尸/a/^CW/7请1433-1444，1999)中所述。TLC分析如vanHouwelingen等人(尸/a/^/."(7人'39-50，1998)中所述。裙吾^和豫ww^差凝^/y时为v,除非另夕卜说明，否贝'J用程序Geneworks(Intel1igenetics，MountainView,CA)或MacVectorTM应用软件(版本6.5.3)(OxfordMolecularLtd.，Oxford,England)来分冲斤核苷酸和预测的氨基酸序列。^f吏用程序ClustalW的基于网络的版本(http://dot,imgen.bcm.tmc.edu:9331/multi-align/multi-align.html)，采用缺省设置(Matrix=blossom;GAP0PEN=0，GAPEXT=0,GAPDIST=8，MAXDIV=40),进行多序列对比。通过相同的网址用PHYLIP(自展计数(bootstrapcount)=1000)构建了系统树，并用Treeviewer版本1.6.6(http://taxonomy,zoology,gla.ac.uk/rod/rod,html)进行可纟见化。使用FASTA和TFASTA程序(Pearson和Lipman，户roc.#a〃.JcacT.Sc/.《iYW,2444-2448，1988)或BLAST程序(J/"c力"/爭乂，/,A/o人"^5Y".'403-410，1990)针对Genebank、SWISS-PR0T和EMBL数据库进行同源性搜索。采用缺省设置，使用LALIGN程序(Huang和Miller,Jc^.jpp/.7么'373-381，1991)或在MacVectorTM应用软件(OxfordMolecularLtd.,England)中的ClustalW程序(Thompson等人，细/e/cJc油7esearc力，"..4673-4680，1994)来获得序列同一性和相似性百分比。WW为、岸和i77-如deVetten等人(1997，同上)所述来进行RNA分离和RT-PCR分析。如Frohman等人(/^A9《3V8998-9002，1988)所述来进行cDNA(3')末端的快速扩增(RACE)。实施例1转录物i普分析为了鉴定在s"r、；力J和p力f突变体中下调的转录物，使用cDNA-AFLP和微阵列分析的组合。结果概要显示在表3中。表3通过cDNA-AFLP或微阵列分析鉴定的转录物，其在a/r、；力r和名称大小(bp)正常下调NCBIBlast搜索CAC4.4116『^■377,jO力4没有显著相似性CAC5.6250/力<2，p力5S/j2,j9力i1,i力^推测的外膜蛋白CAC7.0300a刀,p力4没有显著相似性CAC7.4150(f。jO力义p力5S/3人/7力Ap力4没有显著相似性CAC7.5170『。；力《p力5a"7,p力4推测的PM-型蛋白CAC8.3150『。p力《a"7,p力^没有显著相似性CAC8.9252『f,p力《<2/j7，p力J,/)力^/preg1样负调节物CAC10.6181『f,/7力2,;力:5"a刀,P力J，推测的磷脂酰肌醇激酶CAC12.171TBDTBDTBDCAC12.3803fr。p力2,p力Ja/z7,p力4包含3'-5'核酸外切酶的蛋白CAC13.4126a/jJ,p力^未知蛋白CAC13.10452H^,p力5a/jJ，p力4膜转运蛋白样蛋白CAC14.21276^。p力2,a/j_7，p力"/没有长的ORFCAC14.31312『tj7jW,a;J，/7力J，p力4推测的含SPFH结构域的蛋白36<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>0RF=开放阅读框TBD=待完成CAC=使用cDNA-AFLP鉴定的转录物MAC=使用微阵列鉴定的转录物NCBI-Blast搜索=通过在NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)网站(如2005年2月)上使用BLAST搜索(Altschul等人，We义i\5V3389-3402，1997)来发现与已知序列的任〈可相似性。实施例2c腿-AFLP的描述使用脸el+NN/AcdlI+NN的256种引物组合，分析了覆盖总转录物的大约25%的大约20，000个片段。从凝胶中分离80个片段，并通过分离自碧冬茄突变品系的总RNA的RT-PCR来进一步表征其中的20个片段，所述碧冬茄突变品系包括野生型和a"7、p力么p力J、如J突变体。与它们在野生型、p/^和p/J碧冬茄品系中的表达水平相比，这些片段中的16个(见表3)被证实在ad、p力J和；7力4碧冬茄品系中下调。W假合^在cDNA-AFLP篩选中使用了碧冬茄品系R27(wt)、W225"W—)、R144(p力J)、R147(p力0和R153从每个碧冬茄品系收集大约25至30个花芽(花发育阶段5、6)，并贮存于-7(TC。根据Logemann等人(j力a/S/oc力e瓜JWf7人16-20，1987),从10个花冠中提取总RNA。随后使用偶联至磁珠的oligo(dT)并根据PolyATract⑧System(PROMEGA)操作方案，从500微克的总RNA中分离polyA+RNA。随后将1微克？017〃RNA用于通过使用GIBCO-BRLSuperscriptII系统来合成双链(ds)c亂合成dscDNAs后，用酚抽提cDNA(Sambrook等人，2001同上)，并通过加入盐和乙醇来沉淀cDNA。随后将DNA沉淀重悬于30蒸馏水中。微浙务使用限制性核酸内切酶#"1(其消化4碱基识别序列)和AcoRI(其消化6碱基识别序列)来制备模板以用于cDNA-AFLP分析。用这两种限制性核酸内切酶消化cDNA,并与之相组合地将适配体(互相退火的MseAl(SEQIDNO:7)和MseA2(SEQIDNO:8)，和也互相退火的EcoAl(SEQIDNO:14)和EcoA2(SEQIDNO:15)，从而分别形成对于位点和对于Acdll位点的PCR衔接体)连接至和fcdll末端。每个"限制性酶切-连接"反应都在50总体积下进行，其中包括24dscDNA、10jaL5xRL緩沖液(50mMTrisHAcpH7.5、50mMMgAc、250mMKAc、25mMDTT、250jug/^LBSA)、0.1lOOmMATP、5个单位的(NewEnglandBiolabs)、5个单4立的^coRI(NewEnglandBiolabs)、50pmol适配体(MseAl和MseA2)(SEQIDNO:7和8)和50pmol五coRI适酉己体(EcoAl和EcoA2)(SEQIDNO:14和15)。所述适配体已经事先被煮沸2分钟，随后在加入到反应体系中之前让其緩慢冷却到室温。将"限制性酶切-连接"反应体系在37。C下温育4小时。扩增在扩增前，将cDNA模板在水中稀释10倍，随后将10^L的体积用于第一个非放射性PCR扩增步骤，该PCR扩增步骤在递降PCR程序中使用一核苦酸选择性延伸(AcoRI+N,#seI+N)引物(SEQIDNO:10至13和16至19)(见表4)。PCR循环包括94'C变性步骤，随后为30秒的退火步骤，退火温度从65。C起始，并以0.7。C的向下增量经过17个循环降低至56°C，随后为56°C30秒的18个循环，最后为72'C1分钟的延长步骤。在ly。w/v琼脂糖凝胶中电泳8微升来自该第一次PCR的产物，在200和750bp之间检测到预期的DNA成片条带。随后，将0.5jtL的这些产物用作第二次"热"PCR的模板，所述第二次"热，，PCR以如前所述的递降PCR程序在标准PCR条件下使用二核苷酸延伸(fcoRI+NN，#s>eI+NN)引物(SEQIDNO.20至51)(见表5)来进行。在第二次PCR中的fcoRI引物用反应体系中的"P进行放射性标记，该反应体系包括50ng引物、510xT4激酶緩冲液、10pL"P-CTP、24nL水和9个单位的T4多核苷酸激酶。该反应体系在37。C下温育1小时，随后通过在65。C下处理10分钟来失活T4激酶。表4在cDNA-AFLP分析中所使用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>尸CT,參的分奸通过5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析反应产物。在电泳后，将凝胶在平板凝胶干燥器中干燥，并啄露过夜。然后使用Phosphorimager(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA，USA)检观'J反应产物的放射标记信号。总而言之，使用)^el+NN/i"coRI+NN的256种引物组合，分析了覆盖总转录物的大约25%的大约20，000个片段。从凝胶中分离80个片段，并通过分离自碧冬茄突变品系的总RM的RT-PCR来进一步表征其中的20个片段，所述碧冬茄突变品系包括野生型和a/入/7力J、;力么p力JT突变体。与它们在野生型、p力2和p力J碧冬茄品系中的表达水平相比，这些CAC片段中的16个(见表3)被证实在a/入/7力J和/7力^碧冬茄品系中下调。在表6中显示了所述CAC片段及其相应大小以及与已知序列的所检测的序列相似性的概要。表6通过cDNA-AFLP分离的片段的概要，所述片段与它们在野生型、p/^和p力J碧冬茄品系中的表达水平相比而言在a"7、；力J和/力4碧冬茄品系中是下调的<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>CAC12.33包含3'-5'核酸外切酶结构域2xE—5845bpCAC13.4未知蛋白(拟南芥)2xE-1。124bpCAC13.10膜转运蛋白lxE-1。346bpCAC14.2和16.2—样—1261bpCAC14.3推定的SPFH蛋白lxE-1371312bpCAC14.4没有序列数据一—CAC16.1组蛋白H2B-样蛋白(TAIR)0.007787bpCAC16.2没有长的0RF—1405bpCAC16.4没有序列数据——CAC16.5半胱氨酸蛋白酶2xE-501169bpCAC13.2只在a力7突变体中下调花青苷3-^葡糖基转移酶6xE-'。215bpCAC8.11在/7力J、和a/27突变体中上调假设的蛋白AF420410lxE-18255bpCAC4.5只在aW突变体中下调花青苷5-^葡糖基转移酶lx251bp相似性E-值=由BLASTX搜索产生的一个参数，其表明对于所比对的序列的相对同一性。E-值越接近O,则匹配越显著。NSS=没有序列相似性实施例3微阵列分析对于微阵列杂交，根据供应商(polyATtractmRNAIsolationSystemIII，Promega)的操作方案，使用野生型(R27)和突变体品系(W225)的发育阶段5的花瓣组织来分离polyA+RM。采用Verdonk等人(尸力;^oc力e/z7/"/T":997-1008,2003)所述条件来制备微阵列并进行杂交。微萍/{/^裙迷在1415个点到樣O车列上的ESTs中，9个ESTs:帔发现在突变体碧冬茄品系(W225)中下调超过10倍。这些序列中的5个代表了以前分离并表征的基因(见表7)。通过分离自碧冬茄突变体品系的总RNA的RT-PCR进一步表征了4个ESTs，所述碧冬茄突变体品系包括野生型和a/入p力么/7力J、p力么pM突变体。这些ESTs中的2个(MACF55和MAC9F1)被证实在a/77碧冬茄品系中下调。表7在微阵列筛选中鉴定的克隆，其在a/7突变体中显示出50到IOO倍的下调<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>一些更多的克隆显示更低水平的下调，并且可以在第二轮分析中考虑。RTPCR确定这些基因中的一些基因的表达模式和遗传控制。这些基因的大部分显示出在花瓣中具有比在植物的其他部分中更高的表达，并且在所述突变体中的表达研究证实了先前通过转录物谱测定而看到的模式。MACF55(碧冬茄)的核苷酸序列和推断的氨基酸序列显示在SEQIDNO:1和2中；MAC9F1的核苷酸序列和推断的氨基酸序列显示在SEQIDNO:3和4中；CAC16.5的核苷酸序列和推断的氨基酸序列显示在SEQIDNO:5和6中。实施例4用于在碧冬茄中表达的RNAi构建体的构建为了评估这些基因在花表皮细胞的液泡腔酸化中的作用，过去和现在在野生型碧冬茄植物中表达每个基因的反向重复构建体，目的是沉默内源基因。到目前为止，3个基因的下调导致了花颜色的变化，并伴随着液泡pH的变化。它们包括MACF55(PPMl)(SEQIDNO:1)、MAC9F1(SEQIDNO:3)和CAC16.5(SEQIDNO:5)。露尸"("尸層？^T源MACF55克隆编码质膜ATP酶(？/W厶碧冬茄质膜ATP酶1(PetuniaPlasmaMembraneATPase1))(SEQIDNO:1),并且与已经分离的ATP酶基因具有相对较高的序列同一性。但是，ATP酶基因家族不同成员的对比显示，PPMl与来自拟南芥属(Arabidopsis)的^^7。和来自烟草的户假夕一起属于第III类胞浆ATP酶(Arango等人，WaWa，"6:335-365，2003)。这些蛋白质在C末端部分都和其他胞浆ATP酶不同，所述C末端部分代表了与调节该泵的活性的14.3.3因子相互作用的位点。对于该组的任何成员还没有确定细胞定位和功能，因此有可能的是，PPMl位于除了质膜之外的其他的细胞的膜上。Baxter等人(户A^5;M么2649-2654，2005)描述了对拟南芥^W7。突变体的分析。AHA10被描述为对于原花青素和液泡生物发生具有特殊影响。经表征的s力a7。突变体在它们的种皮中具有降低的原花青素水平，并且种皮内皮细胞展示出许多小液泡，而不是在野生型种子中所观察到的一个中央液泡。为了评估基因在花表皮细胞的液泡腔酸化中的作用，用下列44两个反向重复构建体转化了野生型碧冬茄植物(V30xMl):跨越尸/W7全尺寸cDNA(SEQIDNO:1)的核苷酸2937到核苷酸3170的233bp反向重复；和跨越户户」W全尺寸cDNA(SEQIDNO:1)的核苷酸2671到核苷酸3170的499bp反向重复，两者都在CaMV35S启动子的控制之下。反向重复构建体(Gateway)将矮牵牛R27花瓣cDNA文库和户/WJ的"P-标记的片段杂交。以来自从碧冬茄花瓣中分离的RNA的第一链cDNA为模板，和使用引物#1702(SEQIDNO:52)和#1703(SEQIDNO:53)，采用PCR扩展产生尸/W7片段。根据生产商的操作方案，使用cDM的双5'快速扩增(5V3'-RACEKIT第二代，Roche,USA)获得全长的尸尸#/序列。引物#1703(SEQIDNO:53)、#1742(SEQIDNO:55)和#1832(SEQIDNO:61)用于第一个5'-RACE，同时引物#1789(SEQIDNO:58)、#1812(SEQIDNO:59)和#1831(SEQIDNO:60)用于第二个5'-RACE。所有扩增中的PCR条件如下96°C，30秒，65°C，30秒和72。C3分钟，32个循环(T3热循环仪，Biometra)。表8在扩增PPM1片段中所使用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>使用下列引物扩增了两个/VW7cDNA片段(A和B):A，#1703(SEQIDNO:53)和#1702(SEQIDNO:52);和B,#1703(SEQIDNO:53)和#1750(SEQIDNO:56)。然后将PCR产物连接到载体pGemt-easy(Promega)中。通过PCR选择含有正确插入片段的克隆，用进行消化，随后克隆到Gateway系统(INVITROGEN)的进入载体pDONR207(l)的AcoRI限制位点中。使用GatewayLR重组反应(INVITROGEN),将插入片段易位入pK7GWIWG2(I)中，并转化入感受态大肠杆菌(丘coli)DH5ot细胞中。利用引物组合，35S启动子(并27)和pK7GWIWG2(1)内含子反向引物(#1777),以及35S终止子(#629)和内含子正向引物(#1778)，选择含有以反向重复排列的插入片段的克隆。随后，通过电穿孔将这些克隆，pK7GWIWG2(I)PPM1-1(图1)和pK7GWIWG2(I)PPM1-2(图2)，引入到根瘤土壤杆菌("r幽"er!'咖t匿尸acie/js)中，并通过叶盘转化转染入碧冬痴中。在含有250jig/ml卡那霉素的MS平板上选择转化的植物，并在生根后，在正常温室条件下生长。在使用pK7GWIWG2(I)PPM1-1产生的6个转基因植物中，6个导致花颜色从红色变为紫色/蓝色。在使用pK7GWIWG2(I)PPM1-2产生的3个转基因植物中，3个导致花颜色从红色变为紫色/蓝色。颜色的变化与内源尸月W转录物的沉默和花粗提取物的pH升高大约0.5个单位相关。通过TLC和HPLC测定，对于在经沉默的植物的花中积累的花青苷色素的量和类型没有可检测的影响。在不同碧冬茄pH座位处突变的碧冬茄植物和那些显示出戶/W7沉默的转基因植物，仍然表达来自于碧冬茄的质膜ATP酶家族的另一个成员，即PPM2。PPM2显示与II类质膜ATP酶蛋白的高同源性，所述II类质膜ATP酶蛋白包括来自于烟草属(Nicotiana)的PMA4和来自于拟南芥属的JW么对于这些蛋白已经显示了在植物细胞中的质膜定位，以及在酵母中补充/^W突变体的能力，和它们受14.3.3蛋白调控(Jahn等人，，，"7，6353-6358，2002)。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>PPM-1基因是吸引人的，因为以前从来没有提出过P-型ATP酶可能参与液泡酸化。根据对于PPM1在碧冬茄中的表达的初步分析，发现该基因在花的冠檐中特异性地表达(在植物的其他地方不表达)。因为在AN1、PH3或PH4中突变的碧冬茄花未显示任何的PPM-1表达，并且仍然看起来是健康的，所以让人认为这种特殊的基因的功能局限于控制液泡环境，虽然它对于胞质pH的调节没有贡献。还可能的是，P-ATP酶家族的其他成员在这些相同的细胞中表达，并控制通过质膜的质子梯度。一个相当重要的问题是这种蛋白质的细胞定位。P-ATP酶是膜締合性蛋白，但是在这个特殊情况中不期望PPM-1蛋白定位于质膜上，因为这将无法解释它对于液泡pH控制中的贡献。在碧冬茄细胞中表达全尺寸PPM-1cDNA的GFP融合物(通过粒子轰击在花中瞬时表达)，并通过共聚焦显微术来显现它的定位。通过标记GFP融合物鉴定了不同的细胞区室和液泡类型(DiSansebastiano等人，尸/a/7f尸力/s/o/c^7，"f，78-86,2001)。PPM-1蛋白看起来定位于液泡形成体上或在后来与花表皮细胞的中央液泡融合的小泡中，这打开了关于这些蛋白质在细胞内环境稳定中的作用的新视角。还测试了PPM-1表达构建体补充缺失内源P-ATP酶活性的酵母尸鹏/突变体的能力，来确证PPM-1编码的蛋白确实具有P-ATP酶活性。对于PPM-1在导致花的液泡酸化的途径中的作用的进一步研究将建议研究这一类的P-ATP酶的活性是如何被调控的。如已经提到的，人们对于III类P-ATP酶在植物中的功能和调控还一无所知。虽然这些蛋白质序列总的说来与其他P-ATP酶的序列非常同源，但这些蛋白在C-末端尾具有不同的序列，所述C-末端尾已被证明使得能够与H-3-3蛋白相互作用，这是达到高激活状态所需的(Arango等人，2003,同上)。这提出了这样的问题，即此类的P-ATP酶是否与14-3-3调节物相互作用。进行了碧冬茄花冠cDNA文库的酵母双杂交筛选，以寻找与PPM-1的这部分相互作用的蛋白质，并且就在体外与14-3-3蛋白的结合分析了纯化的PPM-1蛋白(覆盖测定法(overlayassay))。Thr947的磷酸化已被认为是ATP酶活性调控中的一个重要步骤(Jahn等人，2001，同上)。已经克隆了来自于碧冬茄的尸〃2基因，并显示该基因编码h/Ser蛋白激酶，其中PPM-1可能直接或间接地(例如通过蛋白激酶的级联)是这种激酶的靶。为了测试这种可能性，在野生型和p力f碧冬茄植物中表达了融合至Hys-标签的全尺寸PPM-1cDNA。使用镍柱从花提取物中纯化出重组PPM-1蛋白，然后采用48SDS-PAGE以及使用抗-ATP酶和抗磷酸苏氨酸抗体的免疫检测来进行可视化。因此这帮助重构这种pH控制途径的新的一小部分。^V厶/WJ和尸W^乾差^船C夕/7^7"源，该差厉考f濕《凝/^€必，克隆MAC9F1的核苷酸和所导出的氨基酸序列(分别为SEQIDN0:3和4)与任何已知功能的经鉴定的核酸序列或蛋白质没有显示清楚的同源性。但是当在碧冬茄野生型植物中表达9F1的反向重复时，9F1内源基因的沉默导致蓝色的花，并伴随花提取物的pH升高。如上所述，使用表10中所述的引物和Gateway系统制备9F1的反向重复构建体pK7GWIWG2(I)MAC9F1(图3)。通过电穿孔将反向重复9F1构建体引入根瘤土壤杆菌中，并通过叶盘转化转染入碧冬茄中。在含有250jig/ml卡那霉素的MS平板上选择转化的植物，并在生根后，在正常温室条件下生长。在产生的2个转基因植物中，1个导致花颜色从红色变为紫色/蓝色。花颜色的变化与内源9F1基因的沉默和花粗提物的pH升高0.5个单位相关。通过TLC和HPLC测定，对于在经沉默的植物的花中积累的花青苷色素的量和类型没有可检测的影响。表10在扩增MAC9F1片段中所使用的引物SEQIDNO:引物NO.方向序列5'至3'821706反向GTTCGCAAGCGCAATACTTAC831707正向GGAATTCGGCACGAGGTCAC841743正向AAGAGTAGCTGATCATGG851768正向GATGAGGACATGAAGGAGCAAAGAG861876反向CTTCAGTCTTGCGTTTCTGCTTCC871877反向CTCCTGTTTTGTCAGGCTTGGTGC881878反向CGGCGGCGGTGGACTTGTCTTC892061反向GCTCTAGACTAGAATATGCCAAAAGTGGTTGCAAC902101正向ATCGAATTCATGGCTGCACCAAGCCTAACAAAACAG912178反向ACCGCTCGAGCTAGAATATGCCAAAAGTGGTTGCAAC为了更深入了解9F1基因所编码的小蛋白的功能，通过在瞬时测定法中研究GFP融合物来确定细胞定位，并寻找可能的相互作用伙伴，其通过cDNA文库的酵母双杂交筛选来筛选出来。对于9F1的生化功能的指示还来自于过表达此基因的植物的表型。使用此蛋白的BLAST搜索的结果鉴定了一个小的蛋白家族，其中与9F1具有最高同源性的两个成员来自于拟南芥和稻。因此，关于9F1同系物的拟南芥敲除(K0)突变体的表征可能是有帮助的。克隆CAC16.5的核酸和衍生的氨基酸序列分别显示于SEQIDNO:5和6。预测的氨基酸序列显示与半胱氨酸蛋白酶的相对较高的同源性。这些酶的定位通常为液泡，并且它们的活性依赖相对较低的环境pH。当将含有CAC16.5的反向重复的构建体引入碧冬茄野生型植物中时，CAC16.5内源基因的沉默令人惊讶地导致蓝色的花，并伴随花提取物的pH升高。反向重复构建体r^3&w/如上所述，使用表11中所述的引物和Gateway系统制备CAC16.5的反向重复构建体pK7GWIWG2(1)CAC16.5(图4)。通过电穿孔将反向重复CAC16.5构建体引入根瘤土壤杆菌中，并通过叶盘转化转染入碧冬茄中。在含有250ng/ml卡那霉素的MS平板上选择转化的植物，并在生根后，在正常温室条件下生长。在产生的4个转基因植物中，3个导致花颜色从红色变为紫色/蓝色。花颜色的变化与内源CAC16.5的沉默和花粗提物的pH升高0.3个单位相关。通过TLC和HPLC测定，对于在经沉默的植物的花中积累的花青苷色素的量和类型没有可检测的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>因为半胱氨酸蛋白酶的功能是切割各种其他肽，因此鉴定CAC16.5的蛋白水解作用的耙是有意义的事情。为此，构建一个构建体"斜"质粒用于酵母双杂交筛选，其中CAC16.5基因中活性位点的Cys25残基被突变。这避免当这两种蛋白质互相相互作用时底物的切割，并且将允许分离含有编码CAC16.5的靶的基因的"捕获"质粒。对于这种蛋白水解活性的靶的表征有助于进一步重构酸化途径。最近，详细分析来自野生型、pH突变体和过表达pH途径的调节物的植物的花显示了表皮细胞的液泡的结构差异。最相关的差异涉及这些细胞中的液泡的尺寸和形状，并指向了PH基因在限定液泡结构的高度和宽度中的作用。因为花冠表皮中的细胞的乳头状形状对于这种组织(如所牵涉的基因的表达研究所显示的，该整个酸化途径限制于该组织)而言是特有的，所以推测控制液泡腔中的酸度的基因还可能限定液泡类型(例如溶解或储存液泡)，并且以此限定细胞身份。为此目的，将由AN1、PH3和PH4调节的事件的途径进行分割以了解，特定的步骤与获得液泡的身份(并因此，细胞的身份)相关，还是细胞形状简单地是液泡区室的内部pH的次级效应。在沿着pH调个问题提供答案，并将可能打开关于液泡多样化机制的一扇窗户。pH4是MYB家族的转录因子中的一个成员，其在花瓣表皮中表达，并能与AN1和JAF13发生物理相互作用。这表明，AN1存在于至少两个不同的转录复合物中。一个复合物包括pH4并激活一组参与液泡酸化的未知靶基因，而另一个(pH4-非依赖性)复合物激活结构性的花青苷基因。实施例5从蔷薇中分离PPMcDNA同系物根据上述的操作程序和生产商所建议的操作程序，使用分离自处于发育阶段1-3的蔷薇花芽的花瓣的总RNA和入ZAPcDNA合成试剂盒(Stratagene)来构建蔷薇(栽培种'roterose，)花瓣cDNA文库。因此构建了3x105pfu的文库用于分离蔷薇PPM1cDNA克隆。使用DIG-标记的碧冬茄PPM1探针来篩选大约300,000pfu的蔷薇花瓣cDNA文库，其中采用如生产商所描述的低严紧条件，除了杂交緩沖液包含30%v/v曱酰胺以及在37。C下杂交过夜(如下所描述的)。使用下面描述的引物组(SEQIDNO:100和SEQIDNO:101)来制备DIG-标记的约700bp的碧冬茄PPM-1R27cDM片段。基于碧冬茄PPMl序列(SEQIDNO:1)来设计所述引物。#2124:5'-GCTAGGAGTGCTGCTGATCTTG(SEQIDNO:100)#2078:5'-GGAGCCAGAAGTTTGTTATAGGAGG(SEQIDNO:101)。用于对碧冬茄PPM1探针进行标记的PCR条件如下94°C1分钟x1个循环94°C30秒，55°C30秒，72°C1分钟x25个循环72°C7分钟x1个循环。使用Hybond-N(Amersham)膜，并根据生产商的说明书进行处理。在杂交前，一式两份的噬斑承载物在预洗涤溶液(50mMTris-HCl，pH7.5，1MNaCl,1mMEDTA，0.1%w/v肌氨酸)中于65°C洗涤30分钟。在这之后，在0.4M氢氧化钠中于65。C洗涤30分钟，然后在0.2MTris-HCl，pH8.0，0.1xSSC，0.1%w/vSDS的溶液中于65。C洗涤30分钟，并最终在2xSSC，1.0%w/vSDS中漂洗。杂交条件包括一个预杂交步骤，在杂交緩沖液(5xSSC，30%v/v曱酰胺，2。/。w/v封闭试剂，0.1%w/vN-月桂酰基肌氨酸(钠盐)，1%w/vSDS，50mM磷酸钠緩沖液(pH7.0))中于37°C2-3小时。在去除预杂交緩沖液后，加入杂交混合物，其含有杂交緩沖液(5xSSC，30%v/v曱酰胺，2。/。w/v封闭试剂，0.1%w/vN-月桂酰基肌氨酸(钠盐)，1%w/vSDS，50mM磷酸钠緩沖液(pH7.0))，加入经DIG标记的碧冬痴PPM1(SEQIDNO:1)探针。杂交在37'C进行过夜。在这之后，于55。C在5XSSC/1%w/vSDS中洗涤滤膜两次，每次1小时。两轮筛选产生36个阳性杂交克隆。根据生产商的说明书，对这些克隆进行体内切除。在每种情况下，将切出的cDNA克隆到噬菌粒载体pBluescriptSK-中，并且随后对插入片段进4亍测序。在初始的36个克隆中，3个克隆被发现编码相同的cDNA，它们中最长的那个即克隆1-2(pRosePPMl，图23)用于进一步的分析。这个序列(SEQIDNO:98)由于与碧冬茄PPM1克隆同源而被鉴定为蔷薇PPM1克隆。蔷薇PPMl核苷酸序列(SEQIDNO:98)与碧冬茄PPMl核苷酸序列(SEQID冊1)共享72%的同一性。蔷薇PPMl克隆的推断的氨基酸序列(SEQIDNO:99)与碧冬茄PPMl克隆的推断的氨基酸序列(SEQIDNO:2)共享83%的同一性和91%的相似性。此外，当与碧冬茄PPMl序列(SEQIDNO:2)进行比对时，蔷薇PPMl克隆的推断的氨基酸序列(SEQIDNO:99)在C-末端还含有同样的3个氨基酸残基("HTV")(图24)，它们已被鉴定(国际专利申请PCT/AU2006/000451)为"tell-tale"或这类P-ATP酶的典型特征。蔷薇PPMl的核苷酸和氨基酸序列分别显示在图21和图22中。实施例6构建用于下调蔷薇PPM1的植物转化载体将蔷薇PPMcDNA用作用于构建植物转化载体的基础，所述植物转化载体旨在用于在蔷薇花瓣中蔷薇PPM1的下调或基因敲除。因此，蔷薇PPM1的敲除将导致花瓣液泡pH的上升和花颜色的改变。为了实现基因敲除，采用一种旨在产生蔷薇PPM1的dsRNA的策略。因此，使用所述cDNA(SEQIDNO:98)的600bp的5'序列来设计发夹结构，并整合到二元载体pBinPLUS中的CaMV35S:mas表达盒中。这个构建体被命名为pSFL631(图8)。根据下述方法将它转移到准备用于蔷薇组织转化的根瘤土壤杆菌中。旨在蔷薇PPM1敲除盒的表达限制到花瓣组织的进一步的构建体现在正在进行中。这个策略的一个例子将包括使用蔷薇CHS启动子(国际专利申请PCT/AU03/01111)。花青普生物合成途径的其他基因将是有用的启动子来源，以用于按所期望的来将基因盒的表达限定到花瓣中。进一步构建体中所包括的序列的操作将被用于改变下列方面的特异性(U基因敲除或沉默，和(ii)基因表达，其是通常配置的pH调节序列的表达，使用技术例如RNAi来下调或沉默靶基因。这样的pH调节序列将包括来自于蔷薇的PPM1、MAC9F1和CAC16.5同系物。众^著覆户/W7,W^^末端来^^^席f7源著覆？/W7^控浙脊^我体备选的植物转化载体通过下列方式来制备使用处于蔷薇PPM-1序列(SEQIDNO:98)3'末端的序列来产生发夹结构。这将更特异于蔷薇PPM-1序列，而不下调可能对于植物或花的发育至关重要的其他质膜ATP酶。此类策略的一个实例包括从包含该cDNA克隆的3'末端的pRosePPMl(图23)中分离出~240bp的尸Wl/AcoRI片段。然后，将该片段与包含杂合启动子的pKIWI101的~5.9kbi^n/fcoRI片段相连接，所述杂合启动子由来自"#^5^基因的启动子区与来自根瘤土i裏4干菌(J^Tc^acfer/.Mfy/ze尸ac/e/^)甘露械合酵基因的启动子片段的增强子元件和来自根瘤土壤杆菌章鱼碱合酶基因的~1.6kb的终止子片段纟且成(Janssen和Gardner,尸/a/2flo/ecu/arWo/o^F,14:61-72，1989，国际专利申请PCT/AU03/01111)。通过对分离自氨千青霉素抗性转化体的质粒DNA进行限制性核酸内切酶分析，确定了所述片段的正确插入。然后，用fcoRI使所得的质粒线性化，并且修补突出末端。蔷薇PPM1片段的~240bp的户WI/fcoRI末端(如上所述的)也进行修补，并将所得的片段与经线性化的质粒的平端相连接。通过对分离自氨节青霉素抗性转化体的质粒DNA进行限制性核酸内切酶分析和测序，确定了所述片段按反义方向的正确插入。然后，通过用J力oI/J6al进行消化而释放出所包含的含有M5V才乂/"0"#_//^乂^ro;ye户尸l丄.oc^嵌合基因的2.4kb片段，并修补突出末端。分离所得的2.4kb片段，并与二元载体pCGP1969(国际专利申请PCT/AU03/01111)或包含/^7基因的其他二元栽体(国际专利申请PCT/AU03/01111，国际专利申请PCT/JP2004/011958)的S鹏I末端相连接。通过土壤杆菌介导的转化(国际专利申请PCT/AU03/01111;国际专利申请PCT/JP2004/011958)或本领域已知的其他方法，将包含在二元栽体质粒中的T-DNA引入杂交蔷薇栽培种(例^口，<旦不F艮于Kardina1、SoftPromise、Sonia、Medeo、Lavande)中。备选地，使用引物来扩增蔷薇PPM1cDNA克隆的3'末端，所述引物例如为rosePPMFl(SEQIDNO:104)(掺入fcoRI和户WI识别位点)和rosePPMlRl(SEQIDNO:107)(掺入AcoRI识别位点)，或rosePPMF2(SEQIDNO:105)(掺入fcdll和i7^1识别位点)和rosePPMlRl(SEQIDNO:107),或rosePPMF3(SEQIDNO:106)(掺入AcoRI和户WI识别位点)和rosePPMlRl(SEQIDNO:107)[表12]。表12在扩增蔷薇PPM1片段中所使用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>将PCR产物克隆入克隆载体例如pCR2.1(Invitrogen)中，并且进行测序并与rosePPMl(SEQIDNO:98)的核苷酸序列进行比较以确保已经扩增出了正确的产物。然后，使用限制性核酸内切酶尸WI和fcoRI从该克隆载体中释放出包含蔷薇PPM13'末端的片段，并且将所得的~240bp片段与包含杂合启动子的pKIWI101的~5.9kb尸WlMcoRI片段相连接，所述杂合启动子由来自C3#F"S基因的启动子区与来自根瘤土壤杆菌甘露碱合酶(，s)基因的启动子片段的增强子元件和来自根瘤土壤杆菌章鱼碱合酶基因的~1.6kb的终止子片段组成(如上所述的)。通过对分离自氨卡青霉素抗性转化体的质粒DNA进行限制性核酸内切酶分析，确定了所述片段的正确插入。然后，用AcoRI使所得的质粒线性化。然后，通过釆用EcoRI限制性消化而以~240bp的片段释放出蔷薇PPM1克隆的3'末端的PCR产物，并与经线性化的质粒相连接，并且通过对分离自氨爷青霉素抗性转化体的质粒DM进行限制性核酸内切酶分析和测序而确定了所述片段按反义方向的正确插入。通过用J力oI/J&I进行消化而释放出含有才乂^rwe尸戶W/^乂^i7^e户7W丄'o"嵌合基因的~2.4kb片段，并修补突出末端。分离所得的2.4kb片段，并与二元载体pCGP1969(国际专利申请PCT/AU03/01111)或包含尸^T5W基因的其他二元栽体(国际专利申请PCT/AU03/01111，国际专利申请PCT/JP2004/011958)的S鹏I末端相连接。通过土壤杆菌介导的转化(国际专利申请PCT/AU03/01111;国际专利申请PCT/JP2004/011958)或本领域已知的其他方法，将包含在二元载体质粒中的T-DNA引入栽培种(例如，但不限于Kardinal、SoftP濯ise、Sonia、Medeo、Lavande)中。实施例7从康乃馨中分离PPMcDNA同系物可以使用组合的蔷薇和碧冬茄探针或者单独的探针来筛选康乃馨PPM1cDNA。最初，使用蔷薇PPM1来筛选康乃馨cDNA文库。康乃,4培神i^r〃加C力a/e7cZM^X岸的为建从阶段1、2和3的KortinaChanel(KC)花中分离20总RNA，并在50iliL体积中进行逆转录，该50pL体积包含1xSuperscript反应缓冲液，10mM二硫苏糖醇(DTT),500pMdATP，500dGTP，500juMdTTP，5005-曱基-dCTP,2.8]ug来自于ZAP-cDNAGigapackIIIGold克隆试剂盒(Stratagene)的引物-连接体(Primer-Linker)oligo和2pLSuperscriptTM逆转录酶(BRL)。将反应混合物在37。C下孵育60分钟，然后置于水上。使用ZAP-cDNAGigapackIIIGold克隆试剂盒(Stratagene)来完成文库构建。重组体的总数为2.4x106。随后在筛选PPM1序列前，将KC康乃馨花瓣cDNA文库的容量定为1.95x105pfu(总)。将在补充有250p120%麦芽糖和250ju1lMMgS04的25mlLB中的25mlXL1BlueMRF，细胞培养物进行孵育直到0D6。。为0.6-1。以4，000rpm离心细月包10分钟，然后温和地重悬于10mMMgS(^中。将混合物储存在冰上。将200|u1等分试样的XL1BlueMRF，细胞置于12mlfalcon管(其中具有10M1等分试样的稀释的康乃馨花瓣cDNA文库)中，并于37C孵育15分钟。然后，加入5mlNZY顶层琼脂(保持50'C)，并温和地倒置内容物以确保没有气泡，然后倾注到在42。C预热的小的(30ml)NZY平板上。这些平板在室温下孵育大约15分钟并让其凝固。然活，将平板倒置并在37。C下孵育过夜以让噬斑形成。以每平板40，OOQpfu将KC康乃馨花瓣cDNA文库铺板到12个大平板上，因此在初次筛选中包括了500，000个噬斑。将在补充有250M120%w/v麦芽糖和250jn11MMgS04的25mlLB中的25mlXL1BlueMRF,纟田胞培养物进行解育直到OD鋼为0.6—1.0。在eppendorf离心机中以4，OOOrpm(大约3，OOOg)离心细胞10分钟，然后温和地重悬于10mMMgS04+，并置于冰上。将文库进行合适的稀释从而产生每平板40，000pfu/10|d1。在上面概述的程序之后，产生了12个平板用于转移到尼龙膜上，其预备用于筛选pH调节序列，例如PPM1、MAC9F1和cac16.5。在转移后，将滤膜转到预洗涤溶液中并于65。C保持15分钟，然后转到变性溶液中并于室温保持15分钟，然后转到中和溶液中并于室温保持15分钟。将滤膜在20ml20%w/vNEN杂交混合物(低严紧性)中于42°C进行预杂交至少1小时(每瓶6个大的)，随后于42。C与使用PCR而产生的经32p标记的蔷薇PPM1dna探针杂交过夜。如下进行低严紧性洗涤6xSSC/1%w/vSDS55°C1小时x2，2xSSC/1%w/vSDS42°C40分钟，2xSSC/1%w/vSDS50°C20分钟，和2xSSC/1%w/vSDS65。C30分钟。基于相对杂交信号选择出24个推定的阳性以用于第二次筛选。切出阳性"塞(plugs)",并置于含有500m1psb(phagestoragebuffer)(噬菌体储存緩沖液)[Sambrook等人，同上]和MjLU氯仿的eppendorf管中。将这些在室温下搅动4小时，并让其沉降，随后取出11等分试样到PSB中以如前所述进行铺板。选择14个噬斑以进行解救(rescue)和测序。与在蔷薇的情况下一样(见上)，借助于序列比对以及更接近地检查从如所述而分离的cDNA得到的推断的氨基酸序列的C-末端序列，序列分析将揭示出任何分离的克隆是否实际上是康乃馨PPM1。实施例8构建用于下调康乃馨PPM1的植物转化载体将康乃馨PPMcDM用作用于构建植物转化载体的基础，所述植物转化栽体旨在用于在康乃馨花瓣中康乃馨PPM1的下调或基因敲除。因此，康乃馨PPM1的敲除将导致花瓣液泡pH的上升和花颜色的改变。为了实现基因敲除，釆用一种旨在产生康乃馨PPM1的dsRNA的策略。因此，使用来自于对于康乃馨PPM1序列来说特异的区域的cDNA序列来改造发夹结构，并整合到(i)组成型，和(ii)花瓣特异性基因表达盒中。在前者中，CaMV35S表达盒(CaMV35S启动子和终止子元件)，和在后者中，来自于康乃馨的花瓣特异性启动子。来自于康乃馨ANS^青苷途径基因提供了用于控制花瓣特异性基因表达的启动子^有用来源。但是，这种表达不限定于使用这些启动子。dsRNA(RNAi)基因沉默构建体基于500bp反向重复，带有间插性182bp内含子，所有都在35S启动子或花瓣特异性启动子例如来自于康乃馨ANS基因的启动子的控制之下。康乃馨PPM1-ANS中间体使用^;z7HI将内含子克隆入pCGP1275(图9)中，从而形成pCGP1275i。然后，使用J6al/^/z/HI将有义康乃馨PPMI(carnPPMl)克隆入pCGP1275i中，从而形成pCGP1275i-s-carnPPMl。然后，使用尸WI/iTal将反义PPM1克隆入pCGP1275i-s-carnPPMl中，从而形成pCGP3210(图10)。康乃馨PPM1-ANS，在pWTT2132二元转化载体中用J力ol(平端)将carnPPMl/ANS盒从pCGP3210中切出，并连接到二元转化载体pWTT2132(图11)中，从而形成二元转化载体pCGP3211(图12)。康乃馨PPM1—ANS，在pBinPLUS二元中再次将carnPPMl/ANS从pCGP3210Zfto1(平端)中切出，并连接到pBinPLUS//7/7l(平端)中，从而形成二元转化载体pCGP3215(图13)。康乃馨PPM1-ANS,在pCGP2355二元中再次将carnPPMl/ANS盒从pCGP3210中切出，并连接到pCGP2355(图14)中，从而形成二元转化栽体pCGP3217(图15)。PPMl—35S中间体使用万a/zHI将康乃馨ANS内含子克隆入pCGP2756(图16)中，从而形成pCGP2756i。使用fc^I/^3/zHI将有义carnPPMI克隆入pCGP2756i中，从而形成pCGP2756i-s-carnPPMl。使用5M/扁I将反义PPM1克隆入pCGP2756i-s-carnPPMl中，从而形成pCGP3212(图17)。康乃馨PPM1-35S,在pWTT2132二元中然后，用i3〃1将carnPPMl/ANS盒从pCGP3212中切出，以连接到pWTT2132中，从而形成二元转化载体pCGP3213(图18)。康乃馨PPM1-35S,在pBinPLUS二元中然后，用将carnPPMl/ANS盒从pCGP3212中切出，以连接到pWTT2132中，从而形成二元转化载体pCGP3214(图19)。康乃馨PPM1-35S，在pCGP2355二元中用化'j2cni1将carnPPMl/ANS盒从pCGP3212中切出，并连接到pCGP2355中，从而形成二元转化载体pCGP3216(图20)。将上面产生的转化载体用于在许多不同靶和组织中实施pH调节。一般地，pH调节序列的表达，例如康乃馨PPM1的沉默，是组成型或花瓣特异性的。用于转化的靶包括产生翠雀素的康乃馨和不产生翠雀素的康乃馨。在每种情况下，pH调节效率的评估通过pH的测量和/或颜色变化的显现来测量。实施例9从其他物种中分离pH调节cDNA在各种物种中产生了一系列颜色的花青苷类，所述物种例如为但不限于六出花属物种(J/5^roe/zer/a)、花烛属物种(J/^/"r/";T7早)、龙血树属物种(/,acae刀a51/7.)、欧石南属物种(fr/ca</7.)、榕属物种(&'cm)、香雪兰属物种(,rees")、倒挂金钟属物种(Fi;c力W3)、唐菖蒲属物种(67acr/o7M)、碧冬茄属物种(尸et"//a^,)、白花丹属物种(P7咖^《o^.)、葡萄属物种(r/"、)、条叶狒狒花(^Wa/as"/"a)、松属物种(,i'/7M)、云杉属物种(？/cea^.)、落叶松属物种(ZarAr^.)、菜豆属物种(泡，7usm.)、痴属物种(5Wa/7咖)、越桔属物种(rac"'/2/咖57.)、仙客来属物种(Cyc/諸e/7m.)、秀尾属物种(/r/sm.)、天竺葵属物种(尸e/argw3/咖sp.)、老鹳草属物种(fera/n'zy/Tsp.)、豌豆属净勿种(尸/swm577.)、山黧豆属4勿种(Zaf力7,us)、蝶豆属4勿种(C///^/"/3)、长春花属净勿种(Ca/^ara/2^ws)、、油麻藤属物种(他c画m.)、野豌豆属物种(P7c/aM.)、非洲紫罗兰属物种(^//7&a"/h)、紫薇属物种(Zager5^roe/z7/a<y/7.)、野4土丹属物种(776oi/c力/刀as/.)、A/poca/y/^i^、4土瞎花属物种(W/odc^e/2^nT3sp.)、亚麻属物种(sa)、大翼豆属物种(#acro/^/7/wz7^.)、木槿属物种(V/6/scws)、向曰蔡属物种("e/2.a力^ws)、风4言子属物种(^/ac/z^A^;.)、金丝书&属物种(^T7er/cws)、綉球属物种(外dr呵ea)、凤仙花属物种(/迈pa〃e/7Ss/.)、秀尾属物种(/r/ssp)、玉梅属物种(CAa迈e/awc/f/迈)、伽蓝菜属物种(iTa/a/2C力oe)、洋枯梗属物种(^/s/s/7^i^s;7.)、半边莲属物种(Zo6e7/sm.)、水仙属物种(iVai"c/^M)、番薯属物种(/pcwoes57.)、烟草属物种(A7co〃a/a577.)、兰属物种(0^6油'認)、鸡血藤属物种(w.)、岩黄芪属物种(^ecTj^ar"/z7s/7.)、古月冲支子属4勿种(Zes;eo^za)、珊炎月膝属物种(爿刀/^.go/20/7)、豌豆属物种(尸/swz7)、矛大海棠属物种(begonias/7.)、矢车菊属物种(Ce/ra盯ea)、鸭媒草属物种(Co/M7e///^)、蔷薇属物种(v^a^.)、石竹属物种("/a/^力^^A)(康乃馨)、茼蒿属物种(C//r^/^力e/77咖)(菊类)、菊属物种("e/^ra/^力e则M.)、大丁草属物种(Cer6era)、龙胆属物种(Ce/7〃a/2a)、蝴蝶草属物种(7bre/^'a)、赛亚麻属物种(iV/ere/z^erg/a)、蛇鞭菊属物种(Z/"r")、百合、丝石竹属物种(6>7^叩力//3)、蝴蝶草属物种(7bre/2/s)、兰花、石斛属物种("e/7^r^/w7sa)、蝴蝶兰属物种(户力a/ae/7o;^/s)、鸳尾属物种(/WsM.)、虎眼万年青属物种(。r/n7力(^7s咖)、蓝目艮菊属物种(。"ew/7ei7Z7咖)、芍药属并勿种(尸aeo//a)、天竺蔡属物种(户e/ar^^"/wz7)、白花丹属物种(尸/M7^3go57.)、才艮春花属物种(尸W/zrose)、假叶树属物种(W"""s".)、非洲紫罗兰属物种(&//7/^3"//3".)、一枝黄花属物种(&hV^0m.)、白鹤芋属物种(M.)、郁金香属物种(r"h》w.)、马鞭草属物种(Fer6e"a)、堇菜属物种(r/o/a)和马蹄莲属物种(Za/^ede"//")。提出这些植物含有pH调节序列，并且这些pH调节序列的下调将导致花颜色的改变。在^必控#錄神哞推^/的；^源^^/y时趁WpH调节多肽(例如PPM1(SEQIDNO:2或98)、MAC9F1(SEQIDNO:4)和CAC16.5(SEQIDNO:6)或如此鉴定的其他序列)的存在与编码这些蛋白的基因出现相关联。预期来自于其他物种的此类基因将与碧冬茄序列例如PPM1(SEQIDNO:1)、MAC9F1(SEQIDNO:3)和CAC16.5(SEQIDNO:5)或蔷薇PPM1(SEQIDNO:98)在低严紧性条件下杂交。从许多花卉物种中分离出这种DM的实例，并进行Southern分析，由此将分级的DNA转移到膜上并与下列序列杂交(i)32P-标记的蔷薇PPM1(SEQIDNO:98),图5;或(ii)"P-标记的碧冬痴MAC9F1(SEQIDNO:3)和碧冬茄CAC16.5(SEQIDNO:5)，分别为图6和图7。因此，使用碧冬茄或蔷薇的来自于被鉴定为编码pH调节蛋白的基因的探针将有可能从其他花卉物种中分离出pH调节基因。通过采用低严紧性杂交条件(例如下述那些或在本说明书导言中所描述的那些)并使用SEQIDNO:1和/或3和/或5和/或98筛选各自的花瓣cDNA文库，来完成从上述列举的植物和其他植物中分离出pH调节cDM。备选地，使用引物例如在上面实施例中列举的那些或者特别设计的简并引物，采用聚合酶链反应来完成pH调节cDNA片段的分离。将扩增产物克隆入细菌质粒栽体中，并将DNA片段用作探针来筛选各自的cDNA文库，以分离更长的和全长的pH调节cDNA克隆。使用在上述实施例中描述的方法来确定cDNA克隆的功能性和特异性。从岸必參神辦如肩^杀、义7"草、^、^"合、》《^、^^"f虞、三悉f、l亚^^、應享、银蓬在爭f为、庠；^^/y令人惊讶地调节花瓣液泡的pH而对其他代谢途径没有任何明显影响的序列(SEQIDNO:1至6以及98和99)的分离，使得能够通过各种分子生物学和/或蛋白质化学方法从其他物种中分离相似的序列。这些包括但不限于从分离自花瓣组织的RNA制备cDNA文库，采用低严紧性杂交条件并使用经标记的碧冬茄或蔷薇序列(SEQIDN0:1、3、5和98)作为探针来筛选花瓣cDNA文库，对进行杂交的纯化的cDNA克隆进行测序，并将这些序列和推断的氨基酸序列与碧冬茄序列(SEQIDN0:1至6)或蔷薇PPM1序列(SEQIDNO:98和99)进行比较，并搜索任何序列同一性和相似性，测定分离的cDNA克隆的表达特性谱，并选择优先在花瓣中表达的那些cDNA克隆，制备允许在植物中沉默特定序列的基因构建体，其使用例如反义表达、共抑制或RMi表达。理想地，目标植物产生翠雀素(或其衍生物)。在一个实施案例中，这通过表达类黄酮3'，5'羟化酶(尸yy^)序列来实现，如国际专利申请PCT/AU92/00334和/或PCT/AU96/00296和/或PCT/JP04/11958和/或PCT/AU03/01111所述的。c/WJX岸使用Turpen和Griffith(^/orec力力2々"es《.11-15，1986)的方法从花的花瓣组织中分离总RNA。使用oligotex-dT(商标)(Qiagen)或通过3个循环的oligo-dT纤维素色谱法(Aviv和Leder，■〃.JcsA^SVIf义1408，1972)，从总RNA中选择Poly(A)十RNA。使用XZAPI1/GigapackII克隆试剂盒(Stratagene，USA)(Short等人，vV"c/.Jc油紋M,7583-7600,1988)在入ZAPII中构建定向花瓣cDNA文库，其中使用大约5pg的分离自花瓣的poly(A)+RNA作为模板。在转染XL1-BlueMRF'细胞后，将包装的cDNA混合物以每15cm直径平板大约50,000pfu进行铺板。平板在37匸下孵育8小时，并在100mMNaCl，8mMMgS04，50mMTris-HC1pH8.0，0.01%(w/v)明胶(噬菌体贮存緩冲液(PhageStorageBuffer,PSB))中洗脱噬菌体(Sambrook等人，1989，同上)。加入氯仿，并将噬菌体保存于4'C作为扩增的文库。在转染XL1-BlueMRF'细胞后，将大约100，000或更高pfu的扩增文库以每15era平板大约10,000pfu的密度铺板于NZY平板上(Sambrook等人，1989，同上)，并随后于37。C孵育8小时。在4'C孵育过夜后，将一式两份的承载物(duplicatelifts)转到Colony/PlaqueScreen滤膜(DuPont)上并按生产商的建议进行处理。使用生产商所述方法，使用辅助噬菌体R408(Stratagene,USA)从扩增的XZAPII或人ZAPcDNA文库中切除含有cDNA插入片段的pBluescript嗟菌粒。谬遞《舞X岸在杂交前，一式两份的噬斑承载物(lifts)在预洗涤溶液(50mMTris-HClpH7.5，1MNaCl，1mMEDTA，0.1%w/v肌氨酸)中于65。C洗涤30分钟；随后在0.4M氢氧化钠中于65。C洗涤30分钟；然后在0.2MTris-HC1pH8.0，0,1xSSC，0.1%w/vSDS的溶液中于65。C洗涤30分钟；并最终在2xSSC，1.0%w/vSDS中漂洗。将来自花瓣cDNA文库的膜承载物与碧冬茄PPM1(SEQIDNO:1)或碧冬茄9F1(SEQIDNO:3)或碧冬茄CAC16.5(SEQIDNO:5)或蔷薇PPMl(SEQIDNO:98)的"P-标记的片段杂交。杂交条件包括一个预杂交步骤，在10%v/v甲酰胺，lMNaCl，10%w/v硫酸葡聚糖，w/vSDS中于42。C至少1小时。然后向杂交溶液中加入"P-标记的片段(每个lxl06cpm/mL)，并让杂交继续在42°C再进行16个小时。然后在2xSSC，1%w/vSDS中于42。C下洗涤滤膜2xl小时，并使用增感屏在-7(TC下对KodakXAR底片曝光16小时。将强杂交性噬斑挑入PSB(Sambrook等人，1989,同上)中，并重新筛选以分离纯化的噬斑，使用对于最初cDNA文库篩选所描述的铺板和杂交条件。解救出包含在XZAPII或XZAP噬菌体载体中的质粒，并且从cDNA插入片段的3'和5'末端产生序列数据。基于与碧冬茄尸/W7(SEQIDNO:1和2)、#J(^/7(SEQIDNO:3和4)或"676.J"(SEQIDNO:5和6)或蔷薇尸/W7(SEQIDNO:98和99)的核酸和预测的氨基酸序列相似性，来鉴定新的pH调节cDNA克隆。实施例10pH调节序列的用途为了调节(增加或降低)不正常产生基于翠雀素的色素并且不含有类黄酮3'5'幾化酶(其能够羟化二氢黄酮醇，特别是二氢莰非醇和/或二氢槲皮素)的物种或物种栽培种的花瓣液泡pH,将含有^"W基因(例如但不限于在国际专利申请PCT/AU92/00334和/或PCT/AU03/0111中所述的/^zy〃基因)和pH调节或改变序列的组合的构建体引入不正常产生基于翠雀素的色素的物种中。这样的植物可以包括但不限于蔷薇、康乃馨、菊、大丁草、兰花、百合、丝石竹、大戟属、秋海裳属和苹果。为了调节产生翠雀素或矢车菊色素但是具有使得所显示的颜色不为蓝色的液泡pH的物种或物种栽培种的花瓣液泡pH，将含有一个或多个pH调节序列的构建体引入这样的物种中。这样的植物包括但不限于三色堇、赛亚麻属、洋桔梗、葡萄藤的栽培种、百合、伽蓝菜属、天竺葵、凤仙花属、长春花属、仙客来、蝴蝶草属、兰花、碧冬茄属、鸳尾和倒挂金钟属。构建用于下调pH调节基因的植物转化载体将上面的策略用于下调或沉默pH调节基因，例如PPM1、MAC9F1和CAC16.5,以及它们在康乃馨、蔷薇、大丁草、菊和其他具有商业价值的花卉物种中的同系物。通常，这种策略包括从靶物种中分离同系物。但是，该策略未限定于这个方法，因为基因沉默技术例如RNAi可以在不同物种间应用，如果存在合适序列的保守的话。通过分离和表征来自粑物种的同系物来确定这种策略是否在不同物种间有效。这种表征包括确定pH调节基因例如PPM1、MAC9F1和CAC16.5的核苷酸序列，随后确定推断的氨基酸序列。因此，将蔷薇PPM1序列用于设计有效的沉默pH调节基因的构建体，所述构建体在另一个物种例如康乃馨、大丁草或菊中使用。二元转化载体，例如上述那些，被用于植物转化实验中，以产生带有所需基因的植物，在这种情况下为pH调节基因。照此，希望使用来自于碧冬茄、蔷薇和康乃馨的pH调节基因以改变花瓣pH，并由此改变蔷薇、康乃馨、大丁草、菊和其他具有商业价值的花卉物种的花颜色。植物转化染it著覆的^^4吏用在美国专利申请号542,841(PCT/US91/04412)或Robinson和Hroozabady(6We/7〃a紐〃cu"固e，W:83-99，1993)或Rout等人(5We刀〃a胁〃ci/"訓e，W:201-238，1999)或Marchant等人(#o/ecy7<3rAree力'/^《187-194,1998)或Li等人(,/s/fS/oc力e瓜，W,453—459，2002)或Kim等人(户/a/^Ce//77w"es/d0r^3/z0//"re，7《，107-111,2004)中所述的方法或者通过本领域熟知的任何其他方法，将pH调节序列引入蔷薇中。J^^S"付(^/a/2^uscar/o;7/7//7iA^^转/么使用在国际专利申请号PCT/US92/02612或国际专利申请号PCT/AU96/00296、Lu等人(^yo/Tec/wo/o^F夕864-868，1991)、Robinson和Firoozabady(1993，同上)中所述的方法或者通过本领域熟知的任何其他方法，将pH调节序列引入康乃馨中。4吏用在daSilva(A/Cec力/7o/o^FJdra刀ce^i7.'715—766，2003)或Aswath等人(尸/a/7fSc/e腳緣847-854，2004)或Aida等人(5reetf//^51-58，2004)中所述的方法或者通过本领域熟知的任何其他方法，将pH调节序列引入菊中。义T革W脊^使用在Elomaa和Tee"(在YPSBajaj，编者，BiotechnologyinAgricultureandForestry,TransgenicCropsIII，.Springer-Verlag，Berlin,139-154，2001中)中所述的方法或者通过本领域熟知的任何其他方法，将pH调节序列引入大丁草中。應#潜橫的脊化使用在Deroles等人(GeneveRL，PreeceJE&MarkleSA(编者)j9/c^ec/刀o/og7^r/7ay77e/^a/尸/a/^5"CABInternatio'ns1,WalUngford87-119，1997)或Tanaka等人(ChopraVL，MalikVS&BhatSR(编者)^p/77/ed尸73/^5/0/^c力/2o/o^r.Oxford&IBH，NewDelhi,177—231，1999)或Tanaka等人(尸/a/ffe7/，7Vi^wea刀d(9rga/7Cw/^re》ft1-24，2005)中所描述或综述的方法或者通过本领域熟知的任何其他方法，将pH调节序列引入观赏植物中。本领域技术人员将会意识到，除了具体描述的那些之外，此处所描述的本发明是可以进行变化和修改的。应当理解，本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还包括所有的在本说明书中单独或共同地提及或指出的步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或更多个所述步骤或特征的任何的和所有的组合。68文献目录Aida"。/,iBwec//"-"'.W:51-58，2004AltschulWa/,M/c/.ylciVfa3389-3402，1997Altschulera/.,/M/.刀W'403-410，1990Arangoe/^/,ZV朋to,2/6:335-365，2003AswathWfl/,尸/a"fSc!em:e766,847-854，2004Ausubela/.,"Cu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QIDNO:99的截短形式。45.^l利要求44的方法，其中所述核酸序列编码SEQIDNO:99中所示的氨基酸序列。46.权利要求41的用途，其中所述植物是蔷薇。全文摘要概括而言，本发明涉及植物分子生物学以及可用于操控植物生理或生物化学特性的试剂的领域。更具体地，本发明提供了基因和蛋白质试剂，其能够调节或改变在植物的细胞、细胞群、细胞器、部分或生殖部分中的酸性或碱性水平。还提供了经基因改造的植物、植物部分、子代、后代和生殖材料(包括花或开花的部分)，其具有相对未经基因改造的植物而言展示出改变的细胞pH的细胞。文档编号C12N15/05GK101454447SQ200780019809公开日2009年6月10日申请日期2007年5月28日优先权日2006年6月1日发明者F·夸特罗基奥,F·布鲁格里拉,K·斯贝尔特,R·科伊斯,W·弗尔维耶,水谷正子申请人:教会高等教育科研与病人护理协会;国际花卉开发有限公司