将木质纤维素生物质转化为乙醇的嗜热生物体的制作方法

专利名称：将木质纤维素生物质转化为乙醇的嗜热生物体的制作方法
将木质纤维素生物质转化为乙醇的嗜热生物体相关申请本申请要求2006年10月31日提交的PCT/US06/042442的优先权，而PCT/ US06/042442要求了 2006年5月1日提交的美国申请第60/796380号的优先权。所有这些 申请通过引用并入本文。政府利益由于美国国家标准局(NIST)的合同第60NANB1D0064号资助了与其开发相关的研 究，因而美国政府可享有本发明的某些权利。背景1.发明领域本发明属于用于产生乙醇的生物质加工领域。特别是，公开了消耗多种生物质衍 生的底物并高产乙醇的新型嗜热生物体，以及产生方法和所述生物体的用途。2.相关技术的描述生物质代表了廉价且容易获得的纤维素水解底物，糖类可由其产生。这些糖类可 以被单独地使用或者被发酵产生乙醇和其他产品。由于乙醇可以用作可再生民用燃料，因 而在生物转化产品中对乙醇的兴趣很高。在反应器设计、预处理操作和分离技术领域已进行了重要的研究，以至于生物 转化方法正在变得在经济上对石油燃料技术有竞争力。然而，据估计如果将两个或者多 个方法步骤组合，那么可以最大地节约费用。例如，同步糖化发酵(SSF)和同步糖化共 发酵(SSCF)方法在单个反应器或者连续过程设备中结合了酶法糖化步骤和发酵。在 SSF方法中，由于可溶性糖被连续地发酵成乙醇，因而消除了终产物抑制(end-product inhibition) 0在使用多种生物体提供多种水解产物时，SSF方法一般被称为同步糖化共发 酵(SSCF)方法。除了和更短的反应时间以及减少的投资费用相关的节约，共发酵方法还可 以提供改进的产物产率，这是因为某些化合物会另外积累至抑制代谢或水解的水平，而共 发酵生物体消耗了它们。在一个这样的实例中，3_葡萄糖苷酶在葡萄糖存在下停止水解 纤维二糖而且反过来，纤维二糖的积累阻止了纤维素的降解。通过将葡萄糖转化为不抑制 3 -葡萄糖苷酶水解活性的一种或者多种产物，涉及纤维素和半纤维素水解产物共发酵的 SSCF方法可以缓解这个问题。联合生物加工(CBP)涉及四个生物介导的事件(1)酶的产生，⑵底物水解，(3) 己糖发酵和(4)戊糖发酵。这些事件可在单一的步骤中进行。这个策略需要利用纤维素和 半纤维素的微生物体。相比在专门的方法步骤中产生糖分解酶的更常规的方法，CBP生物 体的开发可以潜在地导致很大的成本降低。使用多于一种的生物体完成该四个生物介导事 件的CBP方法被称为联合生物加工共培养发酵。一些细菌能够将戊糖转化为己糖，并通过糖酵解将己糖发酵成有机酸和其他产物 的混合物。糖酵解途径起始自六碳葡萄糖分子至两个丙酮酸三碳分子的转化。然后丙酮 酸可以通过乳酸脱氢酶(“ldh")的作用被转化为乳酸，或者通过丙酮酸脱氢酶或丙酮 酸-铁氧还蛋白氧化还原酶的作用被转化为乙酰辅酶A("乙酰-CoA")。乙酰辅酶A进一步地被磷酸转乙酰酶和乙酸激酶转化为乙酸，或者被乙醛脱氢酶(“AcDH")和乙醇脱氢 酶(“adh")还原为乙醇。综合来看，连累产乙醇生物体的表现的是非乙醇的有机产物的 产生，特别是ldh介导的丙酮酸到乳酸的转化，和通过磷酸转乙酰酶和乙酸激酶的乙酰辅 酶A到乙酸的转化。细菌代谢工程近来已在嗜热厌氧革兰氏阳性菌解糖热厌氧杆菌 (T. saccharolyticum)中产生乳酸脱氢酶敲除。参见，Desai，S. G. ；Guerinot, M. L.； Lynd, L. R. "Cloning of L-lactate dehydrogenase and elimination oflactic acid production via gene knockout in Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum Jff/ SL-YS485” ( "L-乳酸脱氢酶克隆及通过在解糖热厌氧杆菌JW/SL-YS485中的基因敲除消 除乳酸产生”)Appl. Microbiol. Biotechnol. 65 :600_605，2004。虽然敲除ldh构成了本领域的进步，但是该生物体的一些用途是有问题的，因为 该解糖热厌氧杆菌菌株继续产生有机酸一特别是乙酸。概述本装置通过提供消耗多种生物质衍生的底物并以近于理论产率产生乙醇的嗜热 厌氧细菌促进了本领域技术进步并克服了上文概括的问题。本文还公开了使用该生物体产 生乙醇的方法。本文报道的装置导致多种基因单独地或组合地被敲除，其中天然生物体中的这些 基因会另外导致有机酸的形成。例如，可以敲除解糖热厌氧杆菌JW/SL-YS485的(a)乙 酸激酶和/或磷酸转乙酰酶，以及(b)乳酸脱氢酶(ldh)、乙酸激酶(ack)和磷酸转乙酰酶 (pta)。虽然本文报道的结果针对解糖热厌氧杆菌，但是所述方法和材料也应用于热厌氧菌 (Thermoanaerobacter)属的胃员，^ ^^^tS^Mft (Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes)、Thermoanaerobacteriumaotearoense、Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum、Thermo-anaerobacterium zeae、热角军糖热厌氧菌(Thermoanaero bacteriumthermosaccharolyticum)禾口角军木聚糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter-ium xylanolyticum)。所述方法和物质通常用于代谢工程化嗜热革兰氏阳性细菌领域。在一个实施方案中，不表达丙酮酸脱羧酶的分离的生物体将纤维素水解底物发 酵，从而以理论产率的至少90%的浓度产生乙醇。在一个实施方案中，转化天然状态含有至少一个赋予革兰氏阳性细菌产生发酵产 物乙酸能力的基因的革兰氏阳性细菌，从而消除所述至少一个基因的表达。所述细菌可以 为诸如解糖热厌氧杆菌的热厌氧菌。该赋予所述革兰氏阳性细菌产生发酵产物乙酸的能力 的基因可以编码表达乙酸激酶和/或磷酸转乙酰酶。在另一个实施方案中，该革兰氏阳性细菌可以进一步地经转化，而消除一个或多 个赋予所述革兰氏阳性细菌产生发酵产物乳酸的能力的基因的表达。例如，该赋予产生乳 酸的能力的基因可以是乳酸脱氢酶。在一个实施方案中，产生乙醇的方法包括转化天然生物体，从而产生革兰氏阳性 细菌，所述革兰氏阳性细菌已经转化消除了赋予所述革兰氏阳性细菌产生发酵产物有机酸 的能力的所有基因的表达，从而产生经转化的细菌宿主；并在适宜条件下，将所述经转化的 细菌宿主在培养基中培养足以允许底物糖化和发酵的时段，所述培养基含有底物，所述底 物包括选自葡萄糖、木糖、纤维二糖、蔗糖、木聚糖、淀粉及其组合的物质。
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在一个实施方案中，描述了命名为ALK1且保藏于ATCC并具有专利保藏命名第 PTA-7206号的微生物的生物学纯培养物。在一个实施方案中，分离的多聚核苷酸包括(a)序列SEQ ID NO 10或(b)序列 SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10或(c)与序列(a)或(b)具有至少约90%序列一致性的序 列。描述了含有所述分离的多聚核苷酸(a)、(b)或(c)的载体，以及经遗传工程化而表达 多聚核苷酸(a)、(b)或(c)的互补体的宿主细胞。在另一实施方案中，分离的多聚核苷酸 包括与序列(a)或(b)具有至少约95%序列一致性的序列。在又一实施方案中，分离的多 聚核苷酸包括与序列(a)或(b)具有至少约98%或至少约99%序列一致性的序列。在一个实施方案中，产生乙醇的方法包括在适宜条件下，将表达分离的多聚核苷 酸(a)、(b)或(c)的互补体的突变细菌在培养基中培养足以允许底物发酵成乙醇的时段， 所述培养基含有底物，所述底物包括选自葡萄糖、木糖、纤维二糖、蔗糖、木聚糖、淀粉及其 组合的物质。在一个实施方案中，产生乙醇的方法包括在反应器中提供包含木质纤维素底物、 纤维素酶和发酵剂的反应混合物。所述发酵剂包括革兰氏阳性细菌，其已经转化而消除了 至少一个赋予天然状态的革兰氏阳性细菌产生发酵产物乙酸的能力的基因的表达。使所述 反应混合物在适当条件下，反应足以允许木质纤维素底物糖化和发酵的时段。附图简述

图1表明了糖酵解途径的反应。图2表明了相对于解糖热厌氧杆菌的多种敲除菌株，野生型解糖热厌氧杆菌的氢产生。图3表明了整合到解糖热厌氧杆菌基因组中的自杀载体pS⑶9(SEQ ID NO 9)的 ldh区域的实验多聚核苷酸序列和预期多聚核苷酸序列的比较。图4表明了整合到解糖热厌氧杆菌基因组中的自杀载体pS⑶8-Erm(SEQ ID NO 10)的pta/ack区域的实验多聚核苷酸序列和预期多聚核苷酸序列的比较。图5-图7表明了在ALK1生长期间，各种时间间隔的发酵液的高效液相色谱 (HPLC)痕迹。图8表明了 ALK1菌株发酵期间的木糖、有机酸和乙醇的浓度。图9表明了野生型解糖热厌氧杆菌发酵期间木糖、有机酸和乙醇的浓度。图10表明了 ALK1连续培养刺激(continuous culture challenge)期间木糖、有 机酸和乙醇的浓度。图11表明了 ALK2菌株发酵期间木糖、有机酸和乙醇的浓度。图12表明了 50°C下涉及ALK2和纤维素酶的嗜热SSF反应期间，在各种微晶纤维 素(Avicel)浓度下的乙醇产生。图13表明了图12所示的嗜热SSF反应的乙醇产率。详细描述现在表明和描述的是在生物质至乙醇的转化中工程化和利用嗜热厌氧革兰氏阳 性细菌的方法。如本文所使用，如果生物体没有经遗传工程化或者另外地以有意地改变生物体遗 传构成和/或表型构成的方式经人工操作，则是“天然状态”的。例如，可认为野生型生物
6体是天然状态的。通过两位点定向DNA同源重组事件完全消除了天然状态解糖热厌氧杆菌的有机 酸产生。以低底物加料，在约30°C _66°C的温度范围和约3. 85-6. 5的pH范围下分批培养， 所述突变菌株解糖热厌氧杆菌JW/SL-YS485 ALK1(〃 ALK1")产生近于理论量的乙醇。在 一个实施方案中，乙醇产率是理论最大值的至少约90%。ALK1及其子代存在有助于在木质 纤维素生物质至乙醇的转化中显著地节约的潜力，这归因于对于SSF和SSCF方法中的纤维 素酶活性基本上最适的其生长条件。例如，纤维素酶活性最适参数包括4至5的pH和40°C 至50°C的温度。另外，在使用缺乏产生有机酸的能力的敲除生物体时，没有必要调整发酵液 的pH。ALK1以及类似生物体也可以适合于联合生物加工共培养发酵，其中敲除生物体会将 戊糖转化为乙醇，而且纤维素会被诸如热纤梭菌(C.thermocellum)的纤维素水解生物体 所降解。相比30°C -37°C的常规嗜温发酵温度，在嗜热温度下操作SSF、SSCF或者CBP方法 提供数种重要益处。特别是，由于嗜热温度下更高的酶活性，因而可以降低实现给定转化量 所必需的酶浓度。结果，致力于纤维素酶产生的方法步骤的成本在嗜热SSF和SSCF中基本 上降低了(例如，2倍或者更多)，而在CBP中消除了。对于嗜热SSF、SSCF和CBP，与发酵 罐冷却以及发酵前后的热交换相关的费用预期也会降低。最后，相对于以常规嗜温生物催 化剂为特征的方法，以嗜热生物催化剂为特征的方法可以对微生物污染较不易感。与诸如天然存在的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和运动发酵单胞菌 (Zymomonas mobilis)，以及大肠杆菌(Escherchia coli)和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的重组菌株的已知“单乙醇发酵(homoethanol-fermenting) ”微生物相反，本发 明公开的生物体不依赖于通过丙酮酸脱羧酶作用的丙酮酸至乙醛的转化。事实上，天然状 态的属于热厌氧菌属的细菌不表达丙酮酸脱羧酶。从图1所示的糖酵解途径的反应中可以 看到，丙酮酸可被酶丙酮酸_铁氧还蛋白氧化还原酶2代谢为乙酰辅酶A、二氧化碳和还原 态铁氧还蛋白。然而，为了产生唯一的发酵产物乙醇，还原态铁氧还蛋白所携带的电子必须 通过NAD 铁氧还蛋白氧化还原酶3被全部传递给NAD以形成NADH。随后，在乙酰辅酶A至 乙醇的两步还原过程中，NADH被乙醛脱氢酶7和乙醇脱氢酶8氧化回NAD。在图2中可以 看到NADH被有效利用的证据不能表达ack和pta的乙酸敲除生物体以及不能够表达ack， pta和ldh的双敲除生物体(ALK1)两者的氢气产生均减少。这些生物体提供了从还原态铁 氧还蛋白到NAD再到乙醇的化学计量电子传递的首个例证。在不能够表达PDC的生物体中产生化学计量的乙醇产率的上述途径与先前所述 的所有单乙醇发酵菌株所使用的途径形成了对比。先前所述的菌株使用内源的丙酮酸脱 羧酶(PDC)，或者经工程化表达外源的PDC。因为PDC的表达在微生物世界中很罕见，因 而凭借对碳流的修饰来重定向电子流的能力具有广泛的意义。例如，可以使用该方法在 解糖热厌氧杆菌以外的菌株产生高乙醇产率和/或产生乙醇以外的溶剂。特别是，诸如 热厌氧菌属成员、热纤梭菌及其他嗜热和嗜温的梭菌(Clostridia)、嗜热和嗜温的芽孢 杆菌(Bacillus)种的革兰氏阳性细菌；诸如大肠杆菌和产酸克雷伯氏菌、产琥珀酸丝状 木干胃(Fibrobacter succinogenes)禾口会千会Hff胃(Fibrobacter) ^ftkfKfrH^^W^Ifi 菌(Thermoga neopolitana)和栖热袍菌(Thermotoga)其他种的革兰氏阴性细菌；包括 Neocallimatix和Piromyces种的厌氧真菌缺乏表达PDC的能力，并可得益于本公开的方法。应当理解，经糖化产生葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、纤维二糖、 蔗糖、麦芽糖、木聚糖，甘露聚糖和淀粉中的一种或多种的木质纤维素材料可以被所公开的 生物体利用。在各种实施方案中，木质纤维素生物质包括木头、玉米秸与叶、锯屑、树皮、树 叶、木业和林业残余物、诸如柳枝稷的草类、反刍动物消化产物、城市垃圾、造纸废液、报纸、 纸板或其组合。实施例1ALK1菌株的产生材料和方法解糖热厌氧杆菌菌株JW/SL_YS485(DSM 8691)是从怀俄明黄石国家公园西拇 指(West Thumb)池分离出的嗜热厌氧细菌(Lui，S. Y ；Gherardini, F. C ；Matuschek, M.； Bahl, H. ；ffiegel, J. “ Cloning, sequencing, and expression of the gene encoding a largeS-layer-associated endoxylanase from T hermoanaerobacterium sp strainJff/ SL-YS485in Escherichia coli"( “在大肠杆菌中克隆、测序和表达编码来自热厌氧菌 菌株JW/SL-YS485的大S层相关内切木聚糖酶的基因”)J. Bacteriol. 178 1539-1547， 1996 ；Mai, V；ffiegel, J. “ Advances indevelopment of a genetic system for Thermoanaerobacterium spp -Expression of genes encoding hydrolytic enzymes, development of asecond shuttle vector, and integration of genes into the chromosome"( “热厌氧菌遗传系统开发进展编码水解酶的基因的表达，另一穿梭载体的 开发以及基因至染色体的整合”)Appl. Environ. Microbiol. 66 :4817_4821，2000)。它在 30°C _66°C的温度范围和3. 85-6. 5的pH范围生长。它消耗多种生物质衍生的底物，包括单 糖葡萄糖和木糖、二糖纤维二糖和蔗糖以及多糖木聚糖和淀粉，但不包括纤维素。该生物体 产生乙醇以及有机酸乳酸和乙酸作为初级发酵产物。克隆和测序如先前对乳酸脱氢酶(L-ldh)的报道(DeSai，2004)，使用标准技术鉴定并测 序L-ldh、磷酸转乙酰酶(pta)和乙酸激酶(ack)基因。利用C0DE-H0P算法制备简并引 物(Rose, T. ；Schultz, E. ；Henikoff, J. ；Pietrokovski, S. ；McCallum, C. ；Henikoff, S. " Consensus-degeneratehybrid oligonucleotide primers for amplification of distantly-relatedsequences "( “用于远亲缘序列扩增的共同-简并混合寡核苷酸引 物，，)Nucleic Acids Research, 26 (7) 1628-1635，1 Apr 1998)并进行 PCR 反应以获得保 守区之间的 DNA 序列。用 ThermoFidelas 酶(Fidelity Systems, Gaithersburg, MD)和 BigDye Terminator试剂盒v3. 1 (ABI，Foster CityCA)直接从基因组DNA中测序该保守区 外的基因片段。自杀载体的构建乙酸激酶和磷酸转乙酰酶敲除载体，pS⑶9遵循标准克隆技术(Sambrook)。6.2 kb自杀载体pSGD9基于pBLUESCRIPT II SK(+) (Stratagene)，其使用与较早前报道(DeSai，2004 ；Mai, 2000)类似的设计方法。使用 引物对SEQ ID N0S 1-2和SEQID N0S :3_4从基因组DNA中扩增pta/ack序列的基因片段 pta-up (约1. 2kb)和ack-down (约0. 6kb)。用pfu DNA聚合酶进行PCR扩增。从1 %电泳
8凝胶中提取所述片段。然后用Taq聚合酶使片段pta-up和ack-down A_加尾，并将其克隆 到 T0P0 pCR2. 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)。从 pIKMl 的 Pstl/Xbal 消化物中获得含有卡 那霉素标志物的1. 5kb片段，并将其亚克隆到pBLUESCRIPT II SK(+)。将含有pta-up的 T0P0 用 XhoI/BsiHKAI 消化，并将其亚克隆到 XhoI/PstI 消化的 pBLUESCRIPT II SK (+)，且 位于先前亚克隆的卡那霉素标志物的上游。将含有ack-down的T0P0用Xbal/SphI消化， 并亚克隆到pUC19 (Invitrogen)中。将含有ack-down的Xbal/Afllll片段消化并克隆到 卡那霉素标志物下游以获得最终的构建体PSGD9。带有红霉素抗性的乳酸脱氢酶敲除载体，pS⑶8-Erm5. 5kb自杀载体pSGD8-Erm基于pSGD8质粒，其如Desai et al. 2004所产生。基 于来自pIKMl质粒的aph启动子和来自pCTCl质粒的赋予红霉素抗性的腺嘌呤甲基化酶基 因的融合基因代替了 aph卡那霉素抗生素标志物(Klapatch，T. R. ；Guerinot, MX. ；Lynd, L. R. " Electrotransformation of Clostridium thermosaccharolyticum“(“热角军糖 梭菌的电转化法”)J. Ind. Microbiol. 16(6) :342_7，June 1996)而被用于选择。使用pfu 聚合酶(Stategene)针对aph启动子的引物SEQ ID N0S :5_6和针对腺嘌呤甲基化酶开放 阅读框的引物SEQ ID N0S 7-8产生PCR基因片段。用Xbal/BamHI (aph片段)和BamHI/ EcoRI (腺嘌呤甲基化酶)消化片段，并将其连接到pIKMl的多克隆位点。然后用BseRI/ EcoRI将该融合基因切离并连接到类似消化的pS⑶8中。解糖热厌氧杆菌的转化可交替地使用两种方法进行解糖热厌氧杆菌的转化，第一种方法如先前所描述 (Mai,V. ；Lorenz,W. ；Weigel,J. “ Transformation ofThermoanaerobacterium sp. strain JW/SL-YS485 with plasmid PIKMlconf erring kanamycin resistance"( “用赋予卡 那霉素抗性的质粒PIKMl转化热厌氧菌菌株JW/SL-YS485”)FEMS Microbiol. Lett. 148 163-167，1997)，第二种方法带有在收获细胞后的数种修改并基于为热纤梭菌所幵发的方 法(Tyurin, M. V. ；Desai, S. G. ；Lynd, L. R. “ Electrotrans-formation of Clostridium thermocellum "("热纤梭菌的电转化法”)Appl. Environ. Microbiol. 70 (2) :883_890， 2004)。用预先还原的培养基DSMZ122，在保持在55°C的培养箱的厌氧室中让细胞在无 菌一次性培养管中过夜生长。此后，用初始延滞期之后加入到培养基中的4 yg/ml细胞 壁弱化剂异烟酰胼(isoniacin)对细胞进行继代培养(Hermans，J. ；Boschloo, J. G.； de Bont, J. A. M. " Transformation of M. aurum byelectroporation :the use of glycine, lysozyme and isonicotinic acidhydrazide in enhancing transformation efficiency"( “用电穿孔法转化金色分支杆菌甘氨酸、溶菌酶和异烟酰胼在增强转化效 率中的用途”)FEMS Microbiol. Lett. 72，221-224，1990)。收获指数期的细胞并用预先还原 的无菌冷200mM纤维二糖溶液洗涤，用同样的溶液重悬并存于冰上。收获细胞后应特别注 意随时保持冷却(约4°C )，包括离心期间。将由90 ill细胞悬浮液和就在脉冲应用前加入的2 ill至6 ii IpS⑶9或 pS⑶8-Erm(l ugM3ug)构成的样品放置于用作电转杯的无菌一次性2ml聚丙烯微离心管 中。使用定制的脉冲生成器/钛电极系统，采用设置在10ms脉冲宽度的方波。当脉冲电压 以200V的增量线性增加时，将对应于细胞样品电穿孔形成的电压阈值计算成非线性电流 变化。使用提供在给定DNA浓度下，转化产率对细胞存活率的最佳比的特定电压，其在该特
9定情况是25kV/cm。经脉冲的细胞先被500 u 1 DSM122培养基稀释，保持在冰上10分钟，然 后在55°C下复性4-6小时。复性后，将经pS⑶9转化的细胞与含有75ii g/ml卡那霉素的 2%琼脂培养基混合，并倾入皮氏培养皿，并在厌氧罐中孵育4天。使经pS⑶8-Erm转化的 细胞在48°C复性4-6小时，接种于pH6. 0的含有5 u g/ml红霉素的2%琼脂培养基或者类 似的液体培养基，并在厌氧罐中于48°C下孵育6天。可无需进一步操作而使用所述转化细 胞系的任一一种。然而，通过进行第二(顺序的)转化获得了被消除了赋予产生有机酸的 能力的所有基因表达的生物体。使用第一转化体代替未转化细胞悬浮液，如上所述进行了 第二次转化。在同时含有卡那霉素和红霉素的培养基中使第二转化体ALK1生长。敲除区的测序用Taq聚合酶(New England Biolabs)和基因组与自杀载体间的同源重叠区外 的引物，通过基因组DNA的PCR完成位点定向敲除区域的测序。PCR产物内的引物被用于 使用 BigDye Terminator 试剂盒 v3. 1 (ABI，Foster City, CA)的测序。用 CAP3 软件程序 排列区域(Huang, X. “ An improved sequence assembly program"( “改良序列组合禾呈 序”)Genomics 33 =21-31,1996)并用CLUSTALW算法与所预期的DNA序列相比较(Higgins， D. G. ；Bleasby,A. J. ；Fuchs,R. " CLUSTAL V :improvedsoftware for multiple sequence alignment" ( "CLUSTAL V 改良的多序列排列软件”)Computer Applications in the Biosciences (CABI0S), 8 (2) : 189-191，1992)。在实验所得序列和基于已知野生型和自杀载 体序列的预期序列之间存在着高度同源性(百分比一致性)。“一致性”是指核酸分子对或者氨基酸分子对之间的比较。已知确定序列一致性 的方法。见，例如，为此目的经常采用的诸如Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package (威斯康星序列分析包)，Version8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wisconsin)的计算机禾呈序，其使用 Smith and Waterman, 1981，Adv. Appl. Math. 2 :482_489 所述的算法。突变菌株的验证通过DNA测序，突变菌株解糖热厌氧杆菌JW/SL-YS485ALK1 (“ ALK1 “)的基因组 DNA显示了在L-ldh和pta/ack基因座的预期的位点定向同源重组。两次整合事件都是双 整合，其是在遗传上更稳定的基因型。实施例2表明ALK1和野生型解糖热厌氧杆菌的乙醇产生的比较性数据使解糖热厌氧杆菌在含有2. 5g/L酵母提取物的成分部分确定的MTC培养 基中生长(Zhang, Y. ；Lynd, L. R. “ Quantification of cell andcellulase mass concentrations during anaerobic cellulose fermentation :development of an enzyme-linked immunosorbent assay-based methodwith application to Clostridium thermocellum batch cultures"(“纤维素厌氧发酵期间细胞和纤维素酶质量浓度的 定量应用于热纤梭菌分批培养的基于酶联免疫吸收剂的方法的开发”)Anal. Chem. 75 219-222，2003)。通过 HPLC 在 Aminex 87H 柱(BioRad Laboratories, Hercules, CA)上 于55°C下分析葡萄糖、木糖、乙酸、乳酸和乙醇。流动相由0. 7ml/min流速下的5mM硫酸构 成。用Waters 410折射计(Milford，MA)通过折射率进行检测。乙酸盐的最低检测水平是 1. OmM。图5表明了含有5g/L木糖、5g/L乳酸、5g/L乙酸和5g/L乙醇的标准痕迹。
用高达17g/L的木糖，或者用5g/L的木糖和5g/L的葡萄糖，ALK1菌株只产生了 乙醇，并无可被HPLC检测到的有机酸或其他产物。图6表明了在0小时时间的ALK1菌株 发酵，而图7表明了在72小时的同一发酵。ALK1和野生型菌株在用8g/L MES缓冲的木糖 培养基上、6. 0的初始pH值、55°C和lOOrpm下的时间进程发酵图显示，ALK1菌株能够将超 过99%的木糖转化为乙醇(图8)，而相似条件下野生型由于有机酸的产生而受pH限制，并 且不能消耗所有存在的木糖(图9)。野生型生物体产出0. 15mM乙醇，而ALK1产出0. 46mM 乙醇。实施例3ALK1 的进化如图10所示，用加料底物浓度随时间升高的连续培养来刺激ALK1。图10表明了 连续培养期间木糖、木酮糖和乙醇的浓度。在暴露于这种压力进化周期(stress-evolution cycle)超过1000小时之后，从发酵液分离出经改进的菌株ALK2。在分批培养中，ALK2能够 在50g/L木糖下开始生长。图11表明了 ALK2菌株发酵期间木糖、有机酸、光密度(0D)和 乙醇浓度。实施例4嗜热同步糖化发酵通过40°C _45°C温度下的SSF测试了一些耐热酵母菌株的乙醇产生，在高于此温 iSW/^^T^ (Banat, I. M. ；Nigam, P. ；Singh, D. ；Marchant, R. ；McHale, A. P. " Review Ethanol production at elevatedtemperatures and alcohol concentrations :Part I-Yeasts in general.“( “综述在升高的温度和乙醇浓度下的乙醇产生第一部分-酵 母总论，，)World Journal of Microbiology and Biotechnology 14:809-821,1998)。此 外，Patel等证实了利用芽孢杆菌菌株产生乳酸的50°C下SSF(Patel，M.A. ；0u, M. S.； Ingram, L. 0. ；Shanmugam, K. T. “ Simultaneoussaccharification and co-fermentation of crystalline cellulose and sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate to lactate by a thermoto 1 erantacidophi 1 ic Bacillus sp. " (ifiiiit^BW|if 从结晶纤维素和糖甘蔗渣半纤维素水解产物至乳酸盐的同步糖化共发酵)Biotechnol. Prog. 21 1453-1460，2005)。然而，先前并未证实50°C下的嗜热SSF在减少的酶需求下产 生乙醇。如上所述，如本公开所述的转化的嗜热生物体由于其对SSF方法中纤维素酶活性 基本上最适的生长条件，而具有有助于显著地节约木质纤维素生物质至乙醇转化的成本的 潜力。例如，ALK1和ALK2是可以在50°C和pH5. 0下生长的厌氧嗜热菌，而对纤维素酶活性 最适的参数包括4至5的pH值和40°C至50°C的温度。在50°C下于分批反应器以1.5L级进行的嗜热同步糖化发酵(tSSF)反应中，使 用4FPU/g里氏木霉(T. reesei)纤维素酶(Genencor, Palo Alto, CA)和ALK2从固体底物 Avicel (20g/L, 50g/L和80g/L)产生乙醇。16小时发酵后未测到可溶性糖，并且在任一试 验中产生的乳酸都低于0. 5g/L。图12表明，用80g/L Avicel进行tSSF反应时，在140小 时内产生了 30g/L乙醇，且在第一个50小时内产生了 30g/L乙醇中的25g/L。图13表明了 图12所示反应的乙醇产率。产率的计算基于每克葡萄糖等价物0. 51g乙醇的理论最大值。 用20g/L Avicel，在140小时内实现了约90%的转化。
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应当理解，解糖热厌氧杆菌能将戊糖和己糖两者发酵。因此，本文公开的生物体可 用于同步糖化共发酵(SSCF)反应，其中将半纤维素转化为戊糖的酶(例如，木聚糖酶)可 以和纤维素酶联用。ALK1 的保藏ALK1已保藏于弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas, VA 20110-2209)。2005 年 11 月 1 日提交保藏并获得了专 利保藏命名第PTA-7206号。本保藏的提交符合布达佩斯协议的要求保藏应当持续至自保 藏日起三十(30)年或者向保藏处最后一次请求之后五(5)年或者至源自本申请的美国专 利的可实施期，以较长者为准。保藏处的ALK1 —旦失去存活力，便重新提供ALK1。具体实施方案的描述表明了一般性概念，即他人可以修改和/或调整不偏离一般 性概念的各种应用或用途。因此，该调整和修改应当并且意在被理解成在本文公开的实施 方案的等价物的含义和范围之内。应当理解，本文采用的措辞或术语是用于描述而非限制 的目的。前述的实施例可经适当修改用于任何革兰氏阳性细菌，并且特别用于包括 ^ fti S ^ M ft Thermoanaerobacterium aotearoense> Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum、Thermoanaerobacteriumzeae、热角军糖热厌氧菌禾口角军木聚糖热厌氧 杆菌的热厌氧菌属成员。在本申请中提及的所有文献均通过与仿佛在本文完整复制相同的程度的引用而 并入本文。
权利要求
发酵纤维素水解底物的糖化产物从而以理论产率的至少90％的浓度产生乙醇的分离的生物体，其中所述生物体不表达丙酮酸脱羧酶。
2.产生乙醇的方法，所述方法包括转化天然生物体以产生如权利要求1所述的分离的生物体，从而提供转化的宿主；以及在适当条件下，将所述转化的宿主在培养基中培养足以允许底物的糖化和发酵的时 段，所述培养基含有所述底物，所述底物包括选自葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、 果糖、纤维二糖、蔗糖、麦芽糖、木聚糖、甘露聚糖、淀粉及其组合的物质。
3.经转化的生物体，包括革兰氏阳性细菌，所述革兰氏阳性细菌在天然状态含有至少 一个赋予所述革兰氏阳性细菌产生发酵产物乙酸的能力的基因，所述革兰氏阳性细菌经转 化消除了所述的至少一个基因的表达。
4.如权利要求3所述的革兰氏阳性细菌，其中所述革兰氏阳性细菌是热厌氧菌 (Thermoanaerobacter)属成员。
5.如权利要求3所述的革兰氏阳性细菌，其中所述革兰氏阳性细菌是解糖热厌氧杆菌 (Thermoanaerobacterium saccharo1yticum)0
6.如权利要求3所述的革兰氏阳性细菌，其中所述的至少一个基因编码表达乙酸激酶。
7.如权利要求3所述的革兰氏阳性细菌，其中所述的至少一个基因编码表达磷酸转乙酰酶。
8.如权利要求3所述的革兰氏阳性细菌，其中所述的至少一个基因包括多个基因。
9.如权利要求8所述的革兰氏阳性细菌，其中所述多个基因表达编码乙酸激酶和磷酸 转乙酰酶。
10.如权利要求9所述的革兰氏阳性细菌，其经进一步转化以消除一个或多个赋予所 述革兰氏阳性细菌产生发酵产物乳酸的能力的基因的表达。
11.如权利要求3所述的革兰氏阳性细菌，其经进一步转化以消除一个或者多个赋予 所述革兰氏阳性细菌产生发酵产物乳酸的能力的基因的表达。
12.如权利要求11所述的革兰氏阳性细菌，其中所述的至少一个基因编码表达乳酸脱 氢酶。
13.产生乙醇的方法，所述方法包括转化天然生物体以产生如权利要求11所述的革兰氏阳性细菌，从而产生转化的细菌 宿主；以及在适当条件下，将所述转化的细菌宿主在培养基中培养足以允许底物的糖化和发酵的 时段，所述培养基含有所述底物，所述底物包括选自葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳 糖、果糖、纤维二糖、蔗糖、麦芽糖、木聚糖、甘露聚糖、淀粉及其组合的物质。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述细菌宿主是解糖热厌氧杆菌。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述基因编码表达乳酸脱氢酶、乙酸激酶和磷酸 转乙酰酶。
16.命名为ALK1且经保藏而具有专利保藏命名第PTA-7206号的微生物的生物学纯培养物。
17.分离的多聚核苷酸，包括(a)序列SEQ ID NO 10 ；(b)序列SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 10 ；或者(c)与所述序列(a)或(b)具有至少约90%序列一致性的序列。
18.如权利要求17所述的多聚核苷酸，其与所述序列(a)或(b)具有至少95%的序列 一致性。
19.包括如权利要求18所述的分离的多聚核苷酸的载体。
20.经遗传工程化而表达如权利要求18所述的多聚核苷酸的互补体的宿主细胞。
21.如权利要求20所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
22.产生乙醇的方法，包括下列步骤在适当条件下，将如权利要求21所述的突变细菌在培养基中培养足以允许底物发酵 成乙醇的时段，所述培养基含有所述底物，所述底物选自葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、 半乳糖、果糖、纤维二糖、蔗糖、麦芽糖、木聚糖、甘露聚糖、淀粉及其组合。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述突变细菌是解糖热厌氧杆菌。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述突变细菌是解糖热厌氧杆菌ALK1(JW/ SL-YS485 ALK1)。
25.包括可操作地连接到可在细菌中表达的启动子的SEQID NO :10的遗传构建体。
26.包括如权利要求25所述的遗传构建体的重组细菌。
27.如权利要求26所述的重组细菌，其中所述细菌是解糖热厌氧杆菌。
28.产生乙醇的方法，所述方法包括在反应器中提供包含木质纤维素底物、纤维素酶和发酵剂的反应混合物，所述发酵剂 包括革兰氏阳性细菌，其经转化而消除了至少一个赋予天然状态的所述革兰氏阳性细菌产 生发酵产物乙酸的能力的基因的表达，其中使所述反应混合物在适当条件下反应足以允许 所述木质纤维素底物糖化和发酵的时段。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述适当条件包括至少50°C的温度。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述革兰氏阳性细菌是热厌氧菌属成员。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述革兰氏阳性细菌是解糖热厌氧杆菌。
32.如权利要求28所述的方法，其中所述的至少一个基因编码乙酸激酶的表达。
33.如权利要求28所述的方法，其中所述的至少一个基因编码磷酸转乙酰酶的表达。
34.如权利要求28所述的方法，其中所述的至少一个基因包括多个基因。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述多个基因编码表达乙酸激酶和磷酸转乙酰酶。
36.如权利要求35所述的方法，还包括转化所述革兰氏阳性细菌而消除一个或者多个 赋予所述革兰氏阳性细菌产生发酵产物乳酸的能力的基因的表达。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述的至少一个基因编码表达乳酸脱氢酶。
38.如权利要求28所述的方法，还包括转化所述革兰氏阳性细菌而消除一个或者多个 赋予所述革兰氏阳性细菌产生发酵产物乳酸的能力的基因的表达。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述的至少一个基因编码表达乳酸脱氢酶。
全文摘要
本文公开了消耗多种生物质衍生的底物的嗜热突变生物体。本文公开了消除乙酸激酶和磷酸转乙酰酶表达的解糖热厌氧杆菌菌株。此外，ALK1菌株经位点定向同源重组被工程化而敲除了乙酸和乳酸两者的产生。涉及底物浓度刺激的连续培养导致了ALK1的进化，并形成了命名为ALK2的更为强力的菌株。所述生物体可以用于，例如，在对纤维素酶活性最适的温度下进行的嗜热SSF和SSCF反应，以产生近于理论的乙醇产率，而不表达丙酮酸脱羧酶。
文档编号C12P7/06GK101868548SQ200780019959
公开日2010年10月20日 申请日期2007年5月1日 优先权日2006年5月1日
发明者亚瑟·约瑟夫斯·肖, 卡拉·波德卡米纳, 大卫·安东尼·霍格赛特, 李·R·林德, 米哈伊尔·V·秋林, 约翰·巴德斯利, 苏尼尔·G·德赛 申请人:达特默斯大学托管会;麦斯科玛公司