改进的化学物质检测方法

专利名称：：改进的化学物质检测方法
技术领域：
：本发明涉及使用氧电极检测化学物质的生物检测方法。本发明还涉及该方法所用的转化细胞和装置。
背景技术：
：日本环境厅从1974年至1998年连续24年每年都进行环境化学物质追踪调查，该调査结果揭示出至今一直被调查的775种化学物质中的约40%被排放到了环境中。日本目前工业上生产的化学物质据估计为约50,000种，并且化学物质的生产规模和种类处于逐年增长中。据了解，利用基于氯的水处理和焚烧处理时，会无意中产生对环境造成污染的化学物质。根据这样的事实可以预测出，有大量的化学物质聚集在环境中，但却非常难以充分单独调查所有的化学物质。利用鱼类、水蚤和贝类的个体以及细胞的生长抑制和特定生物响应作为指标的传统生物检测(基于生物材料的响应来评价对生物材料的有害影响的方法)能够测定环境中化学物质毒性的有无，但该传统生物检测并不能评价毒性的性质，亦不能评价毒性的起因。已有提案提出了基于亚硝酸盐形成细菌或者硝酸盐形成细菌的活性(日本特开123705/1994号公报、日本特开2000-206087号公报)以及铁细菌活性的评价方法，并且目前诸如急性毒剂监测仪(富士电机)等装置已有市售。在日本以外的其他国家，基于发光细菌的发光强度的评价用装置已商品化(MICROTOX,aziir，Co.,美国；LUMIS，drlange,Co.德国)。不过，这些装置仍然采用传统化::物检测，无法提供毒性化学物质的任何具体信息。在曰本，每当新发现化学物质污染时，就要重新考虑化学物质的风险控制，并将官方规章和自主规则组合用来组织风险控制体系。不过，仍未组织起能够快速响应现在复杂且多样化的状况(包括以三卤代甲垸和二恶英(dioxin)为代表的毒性化学物质的无意生产和环境排放)的任何体系。"有关化学物质的审査和制造等的法律"的毒性物质评价方法中所用动物实验昂贵而费时，在世界上未得到认可。如此，虽然控制体系--直在持续讨论，但由于其无法解决该问题因而还未成功实现。因此，需要评价化学物质对人体和生态系统的影响。作为化学物质对人体和生态系统的影响的评价方法，己知有报告基因检测。这种报告基因检测是测量作为目标的特定基因的活性以调査诸如以转录活性为主的基因功能的技术，其包括启动子检测等。此启动子检测是通过将编码标记蛋白的多核苷酸操作性连接到基因启动子碱基序列来间接测量基因表达的技术[BarelleCJ,MansonCL，MacCallumDM，OddsFC，GowNa,BrownAJ.:GFPasaquantitativereporterofgeneregulationinCandidaalbicans.Yeast2004Mar;21(4):333-40]o在传统生物检测技术中，使用微生物对化学物质的细胞响应(如细胞的生死、增殖活性、呼吸量，以及特定基因表达的变化)作为指标来检测化学物质的存在。在启动子检测技术中，使用连接到启动子的标记蛋白的细胞响应(如启动子活性的变化)作为指标来检测化学物质的存在。标记蛋白的实例包括GFP(绿色荧光蛋白)[Heim,R.,Cubitt，A.B.andTsien，R.Y.(1995)Nature373,663-664;Heim，R.,PrasherDC.andTsien,R.Y.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.,91，12501-12504;Warg,S.andHazerigg,T.(1994)Nature639，400-403;You權，D.C.andMichel-Beyerle,ME.(1996)NatureBiotechnology141219-1220;Chalfie，M.,Tu,Y.,Euskirchen，G.，Ward,W.W.andPrasher,D.C.(1994)Science263，802-805]、卩-半乳糖苷酶[CanestroC，AlbalatR,EscrivaH,Gonzalez-Duarte.R.Endogenousbeta-galactosidaseactivityinamphioxus:ausefulhistochemicalmarkerforthedigestivesystem.DevGenesEvol2001Mar211(3):154-6〗、萤光素酶[ArchToxicol2002Jun;76(5-6):257-61,EstrogenicactivityofUVfiltersdeterminedbyaninvitroreportergeneassayandaninvivotransgeniczebrafishassay.SchreursR,LanserP,SeinenW,VanDerBurgB.]禾口乙酉先车专移酶[JReceptSignalTmnsductRes2001Feb;21(l):71-84,Asimplifiedmethodforlargescalequantificationofranscriptionalactivityanditsuseinstudiesofsteroidsandsteroidreceptors.ZhangS，LuJ，IyamaK，LoSC,DanielsenM.]。例如，对于GFP等荧光蛋白，可通过荧光测定法来监测启动子活性变化；对于萤光素酶，可通过基于酶-底物的反应的光谱测定法来监测启动子活性变化。WO03/018792公开了一种通过荧光测定法来容易地鉴定环境中存在的化学物质的方法。根据此鉴定方法，将酵母用包含下述多核苷酸的载体转化，所述多核苷酸中，编码荧光标记蛋白(如GFP)的碱基序列与包含被有害物质特异性激活的酵母基因启动子的碱基序列操作性连接。在转化酵母与样品溶液接触后，通过荧光测定法来检测荧光蛋白表达量，可以通过该表达量的增多来检测有害物质的存在。
发明内容不过，荧光测量依赖于昂贵的荧光测量装置的引入，这导致化学物质检测系统的成本上升。而且，由于测量位置局限于如实验室等特定场所，所以认为其并非为方便的系统。因此，需要提供一种不依靠荧光测量法就能容易检测出环境中的化学物质的存在或存在量的系统。本发明人着眼于萤光素酶(标记蛋白的实例)与其底物萤光素之间的酶-底物反应中的氧消耗，并且已经发现标记蛋白的表达量可以通过测量酶-底物反应中的氧消耗而非荧光强度来进行检测。例如，萤火虫萤光素酶与D-萤火虫萤光素之间的酶-底物反应如下所D-萤火虫萤光素(烯醉化物)(酮类)諷化萤光素作为这样的在酶反应中消耗作为电子受体的氧来氧化底物的酶(本文中称为"氧化还原酶")，除萤光素酶之外，还可以举出例如细胞色素c氧化酶、磷酸吡哆胺氧化酶、谷胱甘肽氧化酶、葡萄糖氧化酶、脯氨酸氧化酶、氨基酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、酰基辅酶A氧化醇、半乳糖氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆固醇氧化酶、草酸氧化酶、肌氨酸氧化酶等氧化酶；以及如犬尿氨酸3-单加氧酶、鲨烯加氧酶、单加氧酶、色氨酸2,3-二加氧酶等加氧酶。例如，葡萄糖氧化酶与葡萄糖之间的酶-底物反应如下所示。葡萄糖氧化酶葡萄糖+02+H20--------葡萄糖酸+H202因此，本发明人发现，当特定化学物质激活酵母基因启动子时，样品中的化学物质的存在或存在量可以通过下述方式来检测生产在下述碱基序列的下游操作性连接有编码作为标记蛋白的氧化还原酶的多核苷酸的转化细胞，或者生产被含有在下述碱基序列的下游操作性连接有编码作为标记蛋白的氧化还原酶的多核苷酸的多核苷酸的载体转化的转化细胞，所述碱基序列选自由包含响应于化学物质的启动子的碱基序列和包含来自与所述基因同源但源自其他物种的基因的启动子的碱基序列所组成的组；将任意的转化细胞和氧化还原酶的底物添加到含有化学物质的样品中；并且通过测量溶解氧消耗来测定所表达的氧化还原酶的量。传统上，使用氧电极检测溶解氧的方法为人熟知。例如，日本特开2001-252066号公报公开了一种测量样品溶液中的细菌数的方法，该方法中，将其中含有待测细菌数的食物分散到溶液中来制备样品溶液，通过检测该样品溶液中的溶解氧来测量样品溶液中的细菌数。此外，日本特开2001-258592号公报公开了一种通过用氧电极检测溶液中的溶解氧量来测定要在短时间内准确进行待测微生物的药物敏感性的测定的方法。根据此方法，对于含有待测微生物和药物的第一溶液以及不含药物的第二溶液，由于从氧电极测得的电流值分别按时间系列存储，可根据测得的分别按时间系列存储的电流值求出移动平均值，并可用最小二乘近似法根据分别求出的一对移动平均值来求出时间微分值，因而可以十分容易并且准确地检测出待测微生物与药物之间的反应。本发明的化学物质检测方法包括(a)使用已被编码在酶反应中使用氧作为电子受体来氧化底物的酶的多核苷酸转化的转化酵母，或者使用已被含有在下述碱基序列的下游操作性连接有编码作为标记蛋白的氧化还原酶的多核苷酸的多核苷酸的载体转化的转化酵母，所述碱基序列选自由包含酵母基因启动子中响应于化学物质的启动子的碱基序列和包含来自与所述基因同源但源自其他物种的基因的启动子的碱基序列所组成的组；和(b)对于至少包含待测样品、转化酵母和作为标记蛋白的氧化还原酶的底物的溶液，通过按时间系列存储从所述氧电极测得的电流值并基于已存储的测得电流值的变化计算溶解氧消耗，检测环境中化学物质的存在或存在量。也就是说，本方法依赖于下述发现通过测量本发明的转化细胞所产生的如萤光素酶、氧化酶和加氧酶等氧化还原酶与这些酶的底物之间的酶-底物反应中消耗的氧量，可以检测出所产生的氧化还原酶的存在或存在量。由于所产生的氧化还原酶的存在量的增长是由响应于化学物质的基因启动子因该化学物质的存在而被激活所引起的，所以氧消耗的增加表明化学物质的存在或存在量。在本发明中，由于转化细胞用于检测化学物质的存在或存在量，所以需要考虑在测定中转化细胞由于诸如呼吸等基础代谢所致的氧消耗在本发明中，当酶-底物反应所致的氧消耗量压倒性大于基础代谢所致的氧消耗量时，酶-底物反应所致的氧消耗量可以通过预先计算基础代谢所致的氧消耗量并从测得量减去该氧消耗量而检出。在本发明中，通过将转化细胞破碎以消除基础代谢所致的氧消耗的影响，可以仅观察到酶-底物反应。此外，酶-底物反应所致的氧消耗量可以通过在不使转化细胞破碎以避免来自破碎细胞的内容物的影响的情况下使用可渗透穿过细胞膜的氧化还原酶作为标记蛋白，并从溶液中回收这些转化细胞而检出。图1示出了显示本发明的化学物质测量装置的实施方式的框图。图2示出了解释本发明的化学物质测量装置的氧电极的原理的示意图。图3示出了显示本发明的化学物质测量方法的流程图。图4示出了表示本发明的溶解氧测定中的电流值的时间变化的图。具体实施例方式作为本发明的用于转化的宿主细胞，显然优选的是人类细胞，不过也可以使用来自如小鼠等其他哺乳类的细胞。此外，就环境毒性评价而言，可以使用已用于生物检测技术的来自鱼类和线虫等的细胞。而且，微生物细胞由于易于培养而优选使用。由于本发明的方法依赖于来自酵母细胞的基因，并且酵母的生长不受环境样品中的变化因素(如盐浓度等)的影响，所以优选酵母细胞。对细胞进行转化的方法在本领域为人熟知[参见，例如，[KaiserC,MichaelisS,MitchellA:Lithiumacetateyeasttransformation,MethodsinYeastGenetics,AColdSpringHarborLaboratoryCourseManual1994edition(ColdSpringHarborLaboratoryPress)pp.133-134,1994]。此外，本发明的目的也可以在不使用载体的情况下用编码标记蛋白的多核苷酸序列置换酵母基因的编码区而实现。上述多核苷酸构建体还可以直接导入到细胞中，这样的方法为人熟知。因此，在本发明中，转化酵母通过导入在下述核苷酸序列的下游操作性连接有编码标记蛋白的多核苷酸的碱基序列来制得，所述核苷酸序列选自包含来自选自由下述基因组成的组中的酵母基因的启动子的核苷酸序列以及包含来自于与所述基因同源但源自其他物种的基因的启动子的碱基序列，所述基因如下所示YBR072W、YCR102C、YC詣7W、YDL218W、YDL243C、YDR453C、YDR533C、YFL014W、YFL056C、YFL057C、YGR110W、YJR155W、YKL071W、YKR076W、YLL060C、YLR460C、YMR090W、YNL331C、YNL332W、YNL335W、YOL150C、YOL165C、YPL171C、YPR167C、YBL048W、YBL064C、YBL107C、YBR008C、YBR173C、YBR256C、YBR296C、YDL021W、YFL022C、YFL024C、YFL061W、YGL121C、YGL158W、YG謝3C、YHR029C、YHR112C、YHR139C、YHR179W、YHR209W、YIR030C、YJR010W、YJR048W、YKL001C、YKL107W、YKR075C、YKR097W、YLL056C、YLR297W、YLR303W、YML087C、YM膽6W、YNL274C、Y0L151W、YOR226C、YOR338W、YOR391C、YPL280W、YDR406W、YJL153C、YLR346C、YOR049C、YOR153W、YPL088W、YAL034C、YDL124W、TOL174C、YDR476C、YGL156W、YGR035C、YGR157W、YGR213C、YGR281W、YGR284C、YHL047C、YHR043C、YHR044C、YHR054C、Y则73C、YKL165C、YL膽8C、YMR315W、YNL211C、YOL031C、YOL101C、YOR303W、YAL005C、YAR031W、YBL005W-A、YBL022C、YBL041W、YBL049W、YBL075C、YBL078C、YBR062C、YBR169C、YBR294W、YCL020W、YCL035C、YCL043C、YCL050C、YCL057W、YCR012W、YCR013C、YC腿0W、YDLO07W、YDL027C、YDL097C、YDL110C、YDL126C、YDL169C、YDR070C、YDR155C、Y面58W、YD詣4W、YDR210W、YDR214W、YDR258C、YDR313C、YDR368W、YDR435C、YER012W、YER037W、YE膽1C、YER103W、YFL044C、YF膽3C、YFR010W、YF證0W、YFR024C、YFR044C、YFR053C、YGL006W、YGL048C、YGL062W、YGL141W、YGL157W、YGL163C、YGL180W、YGL184C、YGR010W、YGR028W、YGR032W、YGR048W、YGR124W、YGR135W、YGR142W、YGR161C、YGR192C、YGR197C、YGR201C、YGR212W、YGR231C、YGR244C、YGR254W、YGR268C、YHL030W、YHR016C、YHR018C、YHR055C、YHR087W、YHR166C、YIL160C、YIR017C、YJL034W、YJL048C、YJL052W、YJL144W、YJL163C、YJR009C、YJR069C、YJR074W、YJR130C、YJR149W、YKL065C、YKL073W、YKL103C、YKL142W、YKL210W、YKL218C、YKR011C、YKR018C、YKR046C、YKR049C、YLL024C、YLL026W、YLR027C、YLR080W、YLR107W、YLR121C、YLR132C、YLR133W、YLR155C、YLR158C、YLR161W、YLR195C、YLR217W、YLR328W、YLR336C、YLR345W、YLR370C、YLR423C、YML004C、YML092C、YML128C、YML130C、YML131W、YMR040W、YMR118C、YMR214W、YMR251W、YMR297W、YMR322C、YNL036W、YNL055C、YNL071W、YNL094W、YNL134C、YNL155W、YNL160W、YNL239W、YNL241C、YOL005C、YO證0C、YOR027W、YOR037W、YOR059C、YOR120W、YOR134W、YOR152C、YOR173W、YOR289W、YOR362C、YPL240C、YPR030W、YAL008W、YAL023C、YALO60W、YAL062W、YA画9C、YBL101C、YB膽6W、YB麵6C、YBR052C、YBR053C、YBR056W、YBR099C、YBR137W、YBR139W、YBR149W、YBR170C、YBR177C、YB謂3W、YBR207W、YBR212W、YBR239C、YBR284W、YBR293W、YCL018W、YCL033C、YCL040W、YCL049C、YCR062W、YCR067C、YCR082W、YDL010W、YDL020C、YDL024C、YDL054C、YDL095W、YDL100C、YDLH5C、YDL144C、YDL198C、YDL223C、YDL245C、YDL246C、YDR001C、YDR032C、YDR058C、YDR072C、YDR127W、YDR168W、YD賜9C、YDR188W、YDR231C、YDR261C、YDR264C、YDR272W、YDR293C、YDR304C、YDR330W、YDR403W、YDR411C、YDR427W、YDR436W、YDR497C、YDR511W、YDR516C、YDR519W、YDR545W、YEL012W、YEL030W、YE膽4W、YER009W、YER021W、YER035W、YER053C、YER079W、YER094C、YER096W、YER125W、YER158C、YER163C、YER175C、YER177W、YER178W、YER185W、YFL006W、YFL010C、YFL016C、YFL029C、YFL030W、YFL031W、YFL032W、YFL038C、YFL041W、YF膽4W、YPR047C、YFR050C、YFR052W、YGL011C、YGL013C、YGL037C、YGL047W、YGL053W、YGL091C、YGL094C、YGL127C、YGL150C、YGL199C、YGL207W、YGL248W、YG膽8C、YGR037C、YGR055W、YGR101W、YGR130C、YGR154C、YGR194C、YGR221C、YGR232W、YGR248W、YGR253C、YGR256W、YHL008C、YHR027C、YHR053C、YHR057C、YHR111W、YHR138C、YHR161C、YHR164C、YHR169W、YHR174W、YHR176W、YHR199C、YIL010W、YIL034C、YIL041W、YIL045W、YIL087C、YIL107C、YIL142W、YIL155C、YIR034C、YIR036C、YIR037W、YIR038C、YIR039C、YJLOO1W、YJL031C、YJL035C、YJL053W、YJL057C、YJL066C、YJL068C、YJL082W、YJL099W、YJL102W、YJL151C、YJL152W、YJL161W、YJL164C、YJL171C、YJL172W、YJL210W、YJL219W、YJR008W、YJR045C、YJR046W、YJR106W、YJR117W、YJR137C、YKL007W、YKL026C、YKL035W、YKL091C、YKL104C、YKL117W、YKL145W、YKL146W、YKL151C、YKL152C、YKL153W、YKL193C、YKL195W、YKL213C、YKL215C、YLL028W、YLL039C、YLL058W、YLR054C、YLR103C、YLR120C、YLR136C、YLR149C、YLR152C、YLR178C、YLR259C、YLR299W、YLR324W、YLR327C、YLR348C、YLR350W、YLR356W、YLR362W、YLR387C、YLR429W、YML054C、YML070W、YML100W、YML117W、YML125C、YMR004W、YMR008C、YM膽9W、YMR020W、YMR067C、YMR089C、YMR097C、YMR102C、YMR105C、YMR107W、YMR152W、YMR180C、YMR184W、YMR191W、YMR219W、YMR271C、YMR275C、YMR295C、YMR314W、YMR316W、YNL006W、YNL007C、YNL012W、YNL044W、YNL045W、YNL074C、YNL092W、YNL093W、YNL104C、YNL115C、YNL156C、YNL231C、YNL234W、YNL237W、YNL281W、YNL305C、YNL333W、YNR010W、YNR019W、YNR033W、YNR059W、YN画8C、YNR069C、YOL032W、YOL036W、YOL047C、YOL071W、YOL082W、YOL083W、YOL117W、YOL119C、YOL126C、YOL131W、YOL153C、YOL162W、YOL163W、YOL164W、YOR019W、YOR035C、YOR036W、YOR099W、YOR117W、YOR124C、YOR130C、YOR132W、YOR157C、YOR185C、YOR197W、YOR259C、YOR261C、YOR273C、YOR288C、YOR332W、YOR336W、YOR347C、YPL017C、YPL087W、YPL106C、YPL109C、YPL149W、YPL154C、YPL196W、YPL206C、YPL222W、YPR023C、YPR024W、YPR026W、YP麵7W、YP詣3W、YPR108W、YPR151C、YAL012W、YBR029C、YBR222C、YCL009C、YCL027W、YCL064C、YC體8C、YDL222C、YDR055W、YDR077W、YDR502C、YEL001C、YEL042W、YER026C、YER106W、YGR136W、YGR138C、YHR137W、YHR142W、YIL023C、YIL153W、YJL073W、YJR004C、YJR054W、YKL039W、YKL086W、YKL163W、YKR091W、YLR109W、YLR194C、YLR250W、YM膽5C、YMR189W、YNL賜C、YNL169C、YNL322C、YOR181W、YOR198C、YOR208W、YOR247W、YPL089C、YAL038W、YAL053W、YBR023C、YBR214W、YBR295W、YCR048W、YDL072C、YDL204W、YD膽5C、YDR098C、YDR259C、YDR380W、YDR388W、YDR391C、YDR432W、YDR481C、YDR510W、YER069W、YGL022W、YGL126W、YGL209W、YGL255W、YGR189C、YGR282C、YHL035C、YHR030C、YIL022W、YIL024C、YIL117C、YIL123W、YIL140W、YIL154C、YJL088W、YJL108C、YJL149W、YJL159W、YJL186W、YJR148W、YKL096W、YLR180W、YLR273C、YLR300W、YLR307W、YLR378C、YLR391W、YMR094W、YMR104C、YMR276W、YMR296C、YNL190W、YNL208W、YNL300W、YNR064C、YOL013C、YOL058W、YOR248W、YOR355W、YPL052W、YPL163C、YPR079W、YAR028W、YBR146W、YBR183W、YCL038C、YC脂1C、YDL008W、YDR019C、YDR031W、YDR115W、YDR486C、YER038C、YER130C、YFL054C、YGL136C、YGR146C、YGR207C、YHL040C、YIL167W、YJL020C、YKR039W、YLR031W、YLR205C、YMR072W、YMR140W、YMR173W、YMR195W、YMR226C、YNL037C、YN膽2C、YOL143C、YOR136W、YOR215C、YOR382W、YOR383C、YPL054W、YPL271W、YPR127W、YAL044C、YAL054C、YAR010C、YAR027W、YAR071W、YBL001C、YBL043W、YBL057C、YBR014C、YB腿4W、YBR035C、YBR068C、YBR111C、YBR116C、YBR147W、YBR168W、YBR246W、YBR273C、YC膽4C、YC證1C、YCR037C、YC應8W、YDL022W、YDL128W、YDL238C、YD膽3W、YD講9W、YDR033W、YD腿4C、YDR104C、YDR270W、YDR315C、YDR340W、YDR357C、YDR358W、YDR396W、YDR405W、YDR410C、YDR434W、YDR482C、YDR487C、YDR520C、YDR534C、YDR539W、YEL011W、YEL065W、YEL066W、YER039C、YER044C、YE腿7W、YER080W、YER107C、YFL020C、YFL028C、YFL043C、YFR015C、YGL001C、YGL008C、YGL068W、YGL073W、YGL104C、YGL113W、YGL154C、YGL167C、YGL229C、YGL242C、YGL249W、YGL253W、YGR052W、YGR060W、YG腿5C、YGR106C、YGR111W、YGR220C、YGR257C、YHL023C、YHL048W、YHR004C、YHR037W、YHR071W、YHR092C、YHR190W、YIL007C、YIL033C、YIL070C、YIL088C、YIL111W、YIR002C、YIR016W、YIR035C、YIR043C、YJL012C、YJL083W、YJL089W、YJL116C、YJL131C、YJL132W、YJL196C、Y扁61W、Y则86W、YJR142W、YJR161C、YKL008C、YKL013C、YKL041W、YKL067W、YKL138C、YKL139W、YKL150W、YKL175W、YKR006C、YKR014C、YKR070W、YLL023C、YLR023C、YLR093C、YLR118C、YLR142W、YLR225C、YLR241W、YLR251W、YLR252W、YLR270W、YML030W、YML110C、YM濯1C、YMR027W、YMR148W、YMR181C、YMR262W、YMR272C、YMR298W、YNL011C、YNL130C、YNL214W、YNL259C、YOL129W、YOR042W、YOR052C、YOR137C、YOR149C、YOR165W、YOR270C、YOR285W、YOR367W、YPL018W、YPL156C、YPL186C、YPL203W、YPL216W、YPL255W、YPR006C、YPR073C、YPR098C、YB謡0C、YBR145W、YBR299W、YDR518W、YEL020C、YFL062W、YGL039W、YGL134W、YJL217W、YJR159W、YLR126C、YNL249C、YNL284C、YNL336W、YOL157C、YOR344C、YOR381W、YPL265W、YPR124W、YBR074W、YBR109C、YBR126C、YBR201W、YCR005C、YDL248W、YDR041W、YDR105C、YDR268W、YDR452W、YEL075C、YER046W、YER050C、YER136W、YER159C、YGL250W、YGR019W、YGR042W、YGR053C、YGR066C、YGR247W、YGR255C、YGR295C、YHL044W、YHR145C、YIL058W、YIL065C、YIL083C、YIL098C、YIL172C、YJL030W、YJL185C、YJL213W、YJR029W、YJR099W、YJR122W、YJR125C、YKL190W、YKR020W、YLL025W、YLL051C、YLR043C、YLR090W、YLR100W、YLR108C、YLR290C、YML068W、YMR051C、YMR139W、YMR178W、YMR193W、YNL015W、YNL079C、YNL122C、YNL223W、YNL285W、YNL293W、YNR007C、YNR035C、YNR061C、YOL016C、YOL104C、YOR220W、YOR221C、YOR374W、YPL123C、YPR077C、YPR107C、YPR147C、YBR093C、YBR196C、YEL041W、YEL047C、YER023W、YER119C、YFL055W、YGR209C、YIL124W、YKL187C、YLL055W、YMR318C、YOL152W、YAL007C、YBR067C、YBR115C、YBR285W、YBR292C、YDL043C、YDL123W、YDL131W、YDL168W、YDL212W、YDR056C、YDR132C、YDR154C、YDR183W、YDR216W、YDR253C、YDR295C、YDR494W、YDR513W、YEL072W、YE謝5C、YE腿1C、YER181C、YFL052W、YFL058W、YFR030W、YGL089C、YGL096W、YGL114W、YGL193C、YGL202W、YGL204C、YGL259W、YG謹6W、YGR070W、YGR088W、YHL034C、YHL036W、YHR048W、YHR104W、YHR163W、YIL060W、YIL136W、YIR024C、YJL036W、YJL045W、YJL060W、YJL101C、YJL155C、YJR085C、YJR109C、YJR156C、YKL070W、YKL161C、YKL221W、YKR071C、YLL009C、YLL050C、YLR092W、YLR145W、YLR156W、YLR163C、YLR220W、YLR280C、YLR311C、YLR3卯W、YML116W、YMR034C、YMR038C、YMR081C、YMR250W、YNL240C、YNL260C、YNL277W、YNR074C、YOL044W、YOL084W、YOL147C、YOL159C、YOR184W、YOR228C、YOR255W、YPL223C、YPR160W、YDL182W、YBR047W、YBR054W、YBR291C、YD画9C、YER124C、YER131W、YGR044C、YIL094C、YK膽7W、YMR240C、YNR050C、YO腦7C、YAL015C、YBL065W、YB詣5C、YBR182C、YBR186W、YBR244W、YBR272C、YCL069W、YDL025C、YDL059C、YDL085W、YDL113C、YDL244W、YDR018C、YDR054C、YD詣2C、YDR223W、YDR350C、YDR353W、YDR374C、YDR512C、YEL052W、YEL070W、YER098W、YFR017C、YGL046W、YGL067W、YGL098W、YGL117W、YGL146C、YGL240W、YGR011W、YGR067C、YGR133W、YGR153W、YGR223C、YHR116W、YHR124W、YIL097W、YIL168W、YJL103C、YJL221C、YJR036C、YJR095W、YKL085W、YKL133C、YKL162C、YKL188C、YKL217W、YKR061W、YKR105C、YLL062C、YLR174W、YLR216C、YLR247C、YLR260W、YLR267W、YLR389C、YML007W、YMR041C、YMR177W、YMR253C、YNL009W、YNL117W、YNL128W、YNL183C、YNR073C、YOL133W、YOL158C、YOR133W、YOR225W、YOR227W、YPL161C、YPL166W、YPL202C、YPL224C、YPR015C、YPR086W、YPR201W、YAL061W、YAL067C、YA膽7C、YBL033C、YBL056W、YBL086C、YBR026C、YBR073W、YBR101C、YBR117C、YBR123C、YBR213W、YBR269C、YBR280C、YCR036W、YDL132W、YDL149W、YDL200C、YDL234C、YDL242W、YDR099W、YDR177W、YDR256C、YDR392W、YDR394W、YDR531W、YEL071W、YER014W、YER042W、YER090W、YER184C、YFL059W、YFR042W、YFR046C、YFR049W、YGL026C、YGL058W、YGL185C、YGL227W、YGL252C、YGL254W、YG画9W、YGR112W、YGR134W、YGR276C、YHL019C、YHR012W、YH麵7W、YHR028C、YHR106W、YHR109W、YHR156C、YIL036W、YIL046W、YIL143C、YIL152W、YIL159W、YIL164C、YJL071W、YJL094C、YJL154C、YJR056C、YJR072C、YJR110W、YJR139C、YKL025C、YKL034W、YKL064W、YKL171W、YKL196C、YKR012C、YKR068C、YKR069W、YLL001W、YLL057C、YLL061W、YLR064W、YLR070C、YLR099C、YLR144C、YLR157C、YLR160C、YLR164W、YLR364W、YLR421C、YML032C、YML042W、YML112W、YML118W、YMR114C、YMR115W、YMR258C、YNL181W、YNL191W、YNL212W、YNL213C、YNL250W、YNL265C、YNL312W、YNR032W、YOL038W、YOL049W、YOL064C、YOR088W、YOR155C、YOR257W、YOR265W、YOR377W、YOR386W、YPL031C、YPL113C、YPL124W、YPL151C、YPL249C、YPL260W、YPL274W、YPR048W、YP謹1C、YPR093C、YPR125W、YPR158W、YPR168W、YPR169W、YPR174C、YPR180W、YPR193C、YPR200C、YAL014C、YAL017W、YAL049C、YBL019W、YBL058W、YB騰1C、YBR013C、YBR018C、YBR037C、YBR045C、YBR051W、YBR063C、YBR128C、YBR129C、YB詣4C、YBR241C、YBR255W、YBR281C、YCL044C、YCL055W、YCR014C、YCR019W、YCR024C、YCR105W、YDL065C、YDL089W、YDL143W、YDL173W、YDL193W、YDL197C、YDL206W、YDL230W、YDL233W、YDR040C、YDR071C、YDR078C、YDR109C、YDR140W、YDR194C、YDR212W、YDR221W、YDR257C、YDR271C、YDR287W、YDR294C、YDR316W、YDR329C、YDR338C、YDR369C、YDR421W、YDR425W、YDR485C、YDR488C、YDR504C、YDR505C、YDR506C、YDR515W、YEL005C、YEL037C、YEL044W、YER017C、YER048C、YER052C、YE譜8C、YE講9C、YER092W、YER100W、YER162C、YER182W、YFL021W、YFL042C、YF腿5W、YFR051C、YFR056C、YGL040C、YGL041C、YGL045W、YGL057C、YGL093W、YGL105W、YGL125W、YGL166W、YGL181W、YGL183C、YGL215W、YGL216W、YGL221C、YGL223C、YG膽7W、YG證9W、YGR155W、YGR156W、YGR186W、YGR198W、YGR210C、YGR211W、YGR237C、YGR250C、YGR258C、YGR266W、YGR270W、YGR274C、YGR277C、YHL021C、YHL037C、YHL038C、YHR082C、YHR083W、YHR134W、YHR160C、YHR171W、YHR180W、YHR205W、YIL062C、YIL072W、YIL075C、YIL099W、YIL108W、YIL165C、YIL170W、YIR009W、YIR0I8W、YIR031C、YIR032C、YJL032W、YJL049W、YJL128C、YJL165C、YJR044C、YJR052W、Y则90C、YJR091C、YJR103W、YJ謂4C、YJR153W、YKL059C、YKL079W、YKL090W、YKL094W、YKL192C、YKL209C、YKR052C、YKR102W、YKR106W、YLL054C、YL證5W、YL膽7C、YLR200W、YLR226W、YLR248W、YLR266C、YLR392C、YLR427W、YML013W、YML029W、YML041C、YML05IW、YML078W、YML079W、YML088W、YML099C、YMR056C、YMR068W、YMR091C、YMR110C、YMR160W、YMR186W、YMR255W、YNL005C、YNL026W、YNL039W、YNL063W、YNL064C、YNL077W、YNL083W、YNL147W、YNL176C、YNL194C、YNL253W、YNL257C、YNL261W、YNL264C、YNL276C、YNR006W、YNR034W、YNR047W、YNR051C、YNR071C、YOL065C、YOL067C、YOR005C、Y0膽8C、YOR022C、YOR023C、YOR058C、YOR069W、YOR087W、YOR138C、YOR229W、YOR256C、YOR267C、YPL005W、YPL020C、YPL022W、YPL105C、YPL147W、YPL150W、YPL152W、YPL164C、YPU68W、YPL180W、YPL188W、YPL194W、YP厳5C、YPR047W、YPR049C、YPR066W、YP讓1C、YPR134W、YPR140W、YPR148C、YPR155C、YPR172W、YPR185W、YAL018C、YA腿4W、YBR012C、YBR076W、YBR287W、YDR043C、YDR250C、YDR373W、YFR014C、YGL191W、YGR180C、YHR136C、YJL026W、YJL037W、YLR038C、YNL058C、YOR031W、YGR087C、YIL166C、YHR008C、YIL129C、YGL256W、YJR030C、YMR077C、YBR264C、YPL177C、YKR040C、YGL056C、YDR128W、YGR139W、YBL101W-A、YOR253W、YOL026C、YDR278C、YHR095W、YCL042W、YNL200C、YPL221W、YLR415C、YMR058W、YPR037C、YER072W、YML028W、YOR325W、YAL039C、YMR112C、YJR107W、YGL088W、YJR058C、YNL142W、YD譜0C、YMR071C、YBL093C、YGR293C、YML055W、YDL017W、YDL210W、YGL055W、YCL025C、YDR080W、YDL181W、YN認0W、YJL017W、YIL127C、YDR281C、YDR366C、YF證6C、YJL212C、YPL215W、YEL019C、YBR132C、YHL018W、YNL196C、YPL038W、YAR047C、YPL262W、YHL006C、YPL225W、YBR124W、YOR148C、YKR053C、YBL044W、YER029C、YLR360W、YCL056C、YC膽7C、YGR239C、YNL256W、YPR146C、YLR377C、YKL097C、YB画6C、YLR338W、YDL229W、YBR253W、YJR027W、YKL198C、YBL030C、YBR031W、YBR118W、YBR162C、YBR221C、YCR024C-A、YCR106W、YDL046W、YDR012W、YDR133C、YDR134C、YDR276C、YDR342C、YDR343C、YEL027W、YEL034W、YGR038W、YGR243W、YGR279C、YHR094C、YHR105W、YHR175W、YHR181W、YIL056W、YIL162W、YJL059W、YJL097W、YJL158C、YJR105W、YKL051W、YKL056C、YKL097W-A、YKL100C、YKL141W、YKR066C、YLR134W、YLR258W、YLR339C、YML058W、YMR083W、YMR203W、YNL209W、YNL307C、YOL030W、YOR178C、YPL028W、YPR028W、YPR113W、YPR149W、YPR150W、YPR183W、YAL016W、YBL099W、YBL100C、YBR011C、YBR096W、YB詣OW、YBR127C、YBR283C、YBR286W、YCL008C、YCL058C、YCR030C、YCR034W、YCR069W、YDL015C、YDL023C、YDL061C、YDL086W、YD廳8C、YDR039C、YDR050C、YDR151C、YDR178W、YDR233C、YDR284C、YDR298C、YDR345C、YDR359C、YDR382W、YDR385W、YDR400W、YDR407C、YDR538W、YEL024W、YEL033W、YEL063C、YER057C、YE應1W、YER120W、YFL011W、YGL012W、YGL206C、YGR022C、YG謹6W、YG圃2W、YGR107W、YGR172C、YGR191W、YGR204W、YGR260W、YHL005C、YHL046C、YHR025W、YHR026W、YHR123W、YHR126C、YHR143W、YIL011W、YIL015W、YIL018W、YIL157C、YIR041W、YJL016W、YJL121C、YJL133W、YJL138C、YJL19IW、YJR018W、YJR047C、YJR077C、YJR119C、YJR121W、YJR123W、Y顶143C、YJR145C、YKL060C、YKL147C、YKL148C、YKL157W、YKL164C、YKL169C、YKR033C、YLL041C、YLL064C、YLR041W、YLR044C、YLR056W、YLR058C、YL讓1W、YLR089C、YLR110C、YLR177W、YLR264W、YLR284C、YLR304C、YLR340W、YLR354C、YLR372W、YLR388W、YML022W、YMR007W、YMR011W、YMR015C、YMR092C、YMR101C、YMR156C、YMR205C、YMR215W、YMR261C、YMR323W、YNL069C、YNL135C、YNL195C、YNR076W、YOL039W、YOL073C、YOL086C、YOL120C、YOU56W、YOL161C、YO画2W、YO膽9W、YOR010C、YO膽5W、YOR108W、YOR128C、YOR129C、YOR142W、YOR161C、YOR176W、YOR230W、YOR298W、YPL004C、YPL036W、YPL048W、YPL057C、YPL059W、YPL061W、YPL135W、YPL179W、YPL218W、YPL220W、YPL246C、YPL272C、YP画3C、YP謂0W、YPR181C、YBR290W、YCR010C、YCR091W、YDL107W、YDL129W、YDR066C、YDR529C、YFL026W、YGL018C、YGL059W、YNU44C、YO画3W、YAL037W、YA證3C、YB膽3W、YB證0W、YBR044C、YB膽1C、YBR185C、YBR282W、YCR015C、YCR038C、YCR043C、YDL119C、YDL146W、YDL220C、YDR057W、YDR123C、YDR125C、YDR222W、YDR225W、YDR277C、YDR286C、YDR347W、YDR408C、YDR438W、YDR479C、YDR483W、YEL039C、YEL057C、YEL073C、YER066W、YER076C、YER084W、YER121W、YER189W、YFL017C、YFL046W、YFR006W、YF膽8W、YGL115W、YGL208W、YGL214W、YGL218W、YGR021W、YGR023W、YGR024C、YGR064W、YGR076C、YGR096W、YGR雨W、YGR174C、YGR182C、YGR236C、YGR288W、YHL042W、YHR195W、YHR210C、YIL006W、YIL012W、YIL028W、YIL050W、YIL057C、YIL089W、YIL102C、YIL113W、YIL122W、YJL100W、YJL169W、YJL199C、YJR039W、YJR050W、YJ詣1W、YKL003C、YKL016C、YKL061W、YKL093W、YKL121W、YKL160W、YKL170W、YKL194C、YKR034W、YK廳7W、YL謹6C、YLR016C、YLR030W、YLR036C、YLR112W、YLR125W、YLR128W、YLR204W、YLR211C、YLR233C、YLR257W、YLR288C、YLR326W、YLR334C、YLR395C、YLR408C、YLR414C、YLR444C、YML050W、YML107C、YML120C、YMR031C、YMR053C、YMR073C、YMR162C、YMR204C、YMR206W、YMR284W、YNL010W、YNL025C、YNL127W、YNL139C、YNL217W、YOL116W、YOL118C、YOR053W、YOR100C、YOR103C、YOR122C、YOR150W、YOR187W、YOR251C、YOR312C、YOR327C、YOR348C、YOR352W、YOR388C、YOR394W、YPL001W、YPL033C、YPL066W、YPL148C、YPL230W、YPL275W、YPL276W、YPR005C、YPR014C、YPR192W、YPR194C、YB膽5W、YER025W、YFL027C、YGL080W、YGL205W、YHL028W、YHR185C、YIL076W、YJL166W、YLR046C、YMR035W、YMR238W、YMR252C、YNL192W、YNL202W、YOL108C、YOR385W、YPR165W、YAR033W、YBL038W、YB膽9C、YBR010W、YBR151W、YCL067C、YCR096C、YDL137W、YDL192W、YDR073W、YDR086C、YDR224C、YDR377W、YDR378C、YER015W、YGL187C、YHR162W、YJL167W、YJL216C、YKR009C、YLR165C、YMR197C、YNL157W、YOL002C、YOL109W、YOR180C、YPL010W、YPL233W、YBR036C、YDR297W、YGR149W、YGR224W、YNL043C、YPL067C、YPL170W、YCR046C、YDR387C、YFL050C、YGL051W、YHR32C、YIL112W、YJL141C、YKR098C、YLR052W、YLR206W、YML129C、YNL203C、YNR014W、YOL043C、YOL096C、YPR184W、YAL028W、YAL055W、YAR062W、YBL095W、YBL102W、YBR122C、YBR157C、YBR161W、YBR251W、YB肪8C、YCR039C、YCR083W、YDL018C、YDL067C、YDL078C、YDL091C、YDL215C、YDL216C、YD證2C、YDR067C、YD脂9W、YDR181C、YDR186C、YDR196C、YDR262W、YDR306C、YDR319C、YER188W、YGL004C、YGL035C、YGR036C、YGR062C、YGR120C、YGR131W、YGR141W、YGR167W、YGR287C、YHL024W、YHR080C、YHR097C、YIL077C、YJL046W、Y几070C、YJL096W、YJL113W、YJL146W、YJL180C、YJR019C、YJR049C、YKR058W、YLL005C、YLR078C、YLR151C、YLR271W、YLR295C、YLR351C、YLR375W、YMR023C、YMR025W、YMR135C、YMR210W、YMR267W、YMR278W、YMR293C、YNL073W、YNR037C、YNR040W、YNR072W、YO證8C、YOR316C、YOR328W、YOR363C、YPL039W、YPL040C、YPL099C、YPL107W、YPL134C、YPL138C、YPL140C。酵母基因的碱基序列和氨基酸序列在公共数据库(德国的MIPS:MunichInformationCenterforProteinSequence，禾口美国的SGD:SaccharomycesGenomeDatabase)中公开，经互联网为人所知。启动子序列也在公共数据库(SCPD:ThePromoterDatabaseofSacc/wframycescereWWae)中公开。除上述的来自酵母基因的启动子之外，在本发明中还可以使用来自与所述酵母基因同源但产生自其他物种的基因的启动子。在本文中，"与酵母基因同源的基因"指包含与所述酵母基因碱基序列有50%以上、优选80%以上同源性的碱基序列的基因，其中，该碱基序列编码与所述酵母基因编码的蛋白具有相同功能的蛋白。编码标记蛋白的多核苷酸操作性连接在来自上述基因的启动子的碱基序列下游，从而提供多核苷酸构建体。将编码蛋白的多核苷酸操作性连接至启动子的方法在本领域为人熟知。例如参见R.W.Old,S.B.PrimrosePrinciplesofGeneManipulation5thEd.,BAIFUKANCO.,LTD,ppl38-165,pp.234-263,2000。标记蛋白的实例包括萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶、叩头虫萤光素酶等萤光素酶；细胞色素C氧化酶、磷酸吡哆胺氧化酶、谷胱甘肽氧化酶、葡萄糖氧化酶、脯氨酸氧化酶、氨基酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、酰基辅酶A氧化酶、半乳糖氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆固醇氧化酶、草酸氧化酶、肌氨酸氧化酶等氧化酶；以及犬尿氨酸3-单加氧酶、鲨烯加氧酶、单加氧酶、色氨酸2，3-二加氧酶等加氧酶。作为编码萤光素酶的碱基序列的实例，在序列编号1中示出了来自pGL3-BasicVector(Promega)的萤光素酶序列。在基因组序列已知的酵母基因中，氧化酶相关基因包括Q0045、Q0250、Q0275、YBL064c、YBR035c、YBR244w、YDL067c、YDR044w、YDR079w、YDR231c、YDR453c、YD詣6c、YEL045c、YER0I4w、YER021w、YER058w、YER141w、YER145c、YER153c、YER154w、YFL041w、YGU87c、YGU91w、YGL205w、YGR029w、YGR060w、YGR062c、YGR112w、YGR234w、YHR051w、YHR116w、YILlllw、YIR037w、YJL003w、YJR034w、YKL026c、YKR066c、YLL009c、YLL018c-a、YLR038c、YLR142w、YLR205c、YLR395c、YML086c、YML129c、YMR020w、YMR058w、YMR256c、YNL052w、YOR350c、YPL132w和YPR037c。在基因组序列己知的酵母基因中，加氧酶相关基因包括YBL098w、YDR402c、YGL055w、YGR175c、YGR255c、YHR007c、YHR176w、YJR025c、YJR069c、YJR078w、YJR149w、YLL057c、YLR205c和YMR015c。这些酵母基因的碱基序列和氨基酸序列在公共数据库(如德国的MIPS:MunichInformationCenterforProteinS叫uence，和美国的SGD:SaccharomycesGenomeDatabase)中公开，经互联网为人所知。启动子序列也在公共数据库(SCPD:ThePromoterDatabaseofSacc/zaramycescere由'"e)中公开。在本发明中，可以使用与所述氧化酶相关基因和加氧酶相关基因同源但产生自其他物种的基因。根据本发明可检出的毒性物质包括但不限于Na2As、CdCl2、HgCl2、PbCl2、4-硝基喹啉-N-氧化物、2,4，5-三氯苯酚、Y-六氯环己烷、亚乙基双(二硫代氮基甲酸)锰、2，4,5,6-四氯-1，3-苯二腈、四甲基秋兰姆二硫化物、N，N，-亚乙基双(二硫代氨基甲酸)锌、8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺、姜醇、丙烯醛、二甲亚砜、Roundup(注册商标；为除草剂)(41.0。/。N-(膦酸甲基)甘氨酸铵、59.0%表面活性剂)、十二烷基苯磺酸钠、月桂基硫酸钠、2，4-二氯苯氧乙酸、氰化钾、苯并芘、甲醛、双酚-A、2，5-二氯苯酚、氯化甲基汞、对-壬基苯酚、五氯苯酚、氯化镍(II)、重铬酸钾、氯化三苯基锡、苯酚、S-4-氯苯甲基-N，N-二乙基氨基甲酸盐、六氯苯、三氯生和硫酸铜。当使用两种以上的转化微生物、也即使用两种以上的经包含来自操作性连接有编码标记蛋白的多核苷酸的不同的酵母基因的启动子的多核苷酸的载体转化的微生物进行上述方法时，可以进一步检査毒性物质。例如，如下述实例所示，YLL057C可以用作检出2,4-二氯苯氧乙酸、亚砷酸或其盐、镉盐、以及氰化物或其盐的酵母基因启动子，YLR303W可以用作检出2,4-二氯苯氧乙酸、亚砷酸或其盐、镉盐、氰化物或其盐、苯并芘、甲醛、亚乙基双(二硫代氨基甲酸)锰和汞盐的酵母基因启动子。因此，当例如标记蛋白的表达是使用YLR303W作为酵母基因来进行诱导而不是由YLL057C来进行诱导时，则毒性物质被识别为苯并芘、汞盐、亚乙基双(二硫代氨基甲酸)锰或甲醛。当标记蛋白的表达是使用这两种酵母基因来进行诱导时，则毒性物质被识别为2,4-二氯苯氧乙酸、亚砷酸或其盐、镉盐、或氰化物或其盐。图1示出了显示本发明的化学物质测量装置的实施方式的框图。该装置包括第一池l(盛装第一溶液，第一溶液包含待检测化学物质的存在或存在量的待测样品、转化细胞和由导入到转化细胞中的多核苷酸编码的氧化还原酶的底物)；第二池2(盛装第二溶液，第二溶液包含转化细胞，不含所述样品)；第一氧传感器la(连接到第一池1以检测第一溶液中的溶解氧量并输出测得电流值)；第二氧传感器2a(连接到第二池2以检测第二溶液中的溶解氧量并输出测得电流值)；第一存储部3(按时间系列存储从第一氧传感器la输出的测得电流值)；第二存储部4(按时间系列存储从第二氧传感器2a输出的测得电流值)；第一移动平均值计算/存储部5(根据第一存储部3中按时间系列存储的测得电流值计算移动平均值并将其按时间系列存储)；第二移动平均值计算/存储部6(根据第二存储部4中按时间系列存储的测得电流值计算移动平均值并将其按时间系列存储)；第一时间微分值计算部7(根据第一移动平均值计算/存储部5中按时间系列存储的移动平均值计算第一时间微分值)；第二时间微分值计算部8(根据第二移动平均值计算/存储部6中按时间系列存储的移动平均值计算第二时间微分值)；和化学物质检测部9(基于第一时间微分值和第二时间微分值检测化学物质的存在或存在量)。图2示出了解释本发明的化学物质测量装置的氧电极的原理的示意图。如图2所示，该装置包括工作位址(工作电极)21、参比位址(参比电极)22和对位址(对电极)23，设置有连接到测量仪器24的氧电极的池1含有溶液25。在该溶液中，反应02+41{+—2H20发生在工作位址21以输送4e-，由此产生电流流动。由于该反应取决于溶解氧浓度，所以流动电流量也取决于溶解氧浓度。因此，当分别测量第一溶液和第二溶液的电流值并且第一溶液的电流值小于第二溶液的电流值时，即当溶解氧量较小时，则被认为酶-底物反应得到增强。酶-底物反应的增强表明响应于化学物质的启动子被化学物质激活，使得表达的酶的浓度上升。因此，经测量溶解氧量，可以检出待测样品中化学物质的存在或存在量。本发明还提供了一种检测化学物质的方法，所述方法包括在包含待测样品、转化细胞和在酶反应中使用氧作为电子受体来氧化底物的酶的底物的溶液中用氧电极检测溶解氧量，所述转化细胞被编码所述在酶反应中使用氧作为电子受体来氧化底物的酶的多核苷酸转化，或者被操作性连接有编码所述在酶反应中使用氧作为电子受体来氧化底物的酶的多核苷酸的多核苷酸的载体转化；在第一时间段，以第二时间间隔收集来自所述氧电极的输出信号；和基于所述输出信号的变化来计算所述溶解氧量的变化，从而检测所述待测样品中的化学物质的存在或存在量。在本文中，第一时间段指从测量开始至电流值变得低于预定电流位时的时间的时间段、或者至电流值接近平台时的时间的时间段、或者至经过预订时间段时的时间为止的时间段。下面基于图3示出的流程图对本发明的化学物质测量步骤进行说明。在步骤SP1，将待测样品和转化细胞添加到第一池1中盛装的溶液中，将转化细胞添加到第二池2中盛装的溶液中但不添加待测样品。在步骤SP2，开始用第一氧传感器la和第二氧传感器2a检测溶解氧量。在步骤SP3，将由第一氧传感器la和第二氧传感器2a输出的测得电流值分别按时间系列存储。在步骤SP4，根据分别按时间系列存储的测得电流值计算移动平均值。在步骤SP5，用最小二乘近似法根据一对分别算得的移动平均值计算时间微分值。在步骤SP6，基于分别算得的时间微分值检测化学物质的存在，停止一系列处理。如上所述，对包括同步测量第一溶液和第二溶液的溶解氧量和基于移动平均值检测化学物质的存在或存在量的实施方式进行了说明。不过,第一溶液和第二溶液的溶解氧量可以分步测量。此外，优选的是使用移动平均值的测量方法，因为该方法的测量精度高，不过也可优选进行测量直至充分消耗池中盛装的溶液的溶解氧的时间段。陈述以下实施例以进一步描述本发明，这些实施例并非意欲在任何方面限制本发明。实施例进行下述实验以检查何种酵母基因适用于检测毒性物质。在YPD培养基(酵母提取物1%、多聚蛋白胨2%、葡萄糖2%)上于25°C培养酵母(^cc/",謂少cascerevz'i7.aeS288C(aSUC2malmelgap2CUPl))。将毒性化学物质的一种添加到处于对数生长期的细胞中，并将该细胞再培养2小时。在相同条件在无任何化学物质的情况下培养细胞，将其用作对照。化学物质的浓度限定为抑制酵母生长但不导致死亡。化学物质_浓度(1)Na2As0.3mM(2)CdCl20.3mMC3)HgCl20.7mMC4)PbCl22mM(5)^硝基喹啉-N-氧化物0.2jiM(6)2，4,5-三氯苯酚16(7h-六氯环己烷1.3mM(8)亚乙基双(二硫代氨基甲酸)锰2ppm(9)2，4，5，6-四氯-l,3-苯二腈(TPN)10)iM(10)四甲基秋兰姆二硫化物75|iiM(11)N，N，-亚乙基双(二硫代氨基甲酸)锌2ppm(12)8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺0.82mM(13)姜醇1.36mM(14)丙烯醛(15)二甲亚砜(16)Roundup(注册商标(17)十二烷基苯磺酸钠(18)月桂基硫酸钠除草剂)"1500倍稀释液0.01%0.20mM1.41M1)41.0Q/oN-(膦酸甲基)甘氨酸铵、59.0%表面活性剂在培养完成后，将培养物离心以收集细胞。向这些细胞中添加乙酸钠缓冲液(50mM乙酸钠，10mMEDTA，1%SDS)，并将混合物在65°C振摇5分钟，然后回到室温，获得上清液，该过程重复两次。向上清液中添加1/2量的苯酚/氯仿(l:l)溶液，并将混合物离心以获得上清液，添加等量的氯仿，将混合物离心以获得上清液。向该上清液中添加等量的含有0.3M乙酸钠的异丙醇，使混合物在室温静置30分钟，然后将混合物离心，从而获得总RNA的沉淀物。将70%乙醇添加到该沉淀物中，将混合物再次离心以获得沉淀物，然后将其干燥并溶于水d如下所示从总RNA中分离mRNA。鉴于polyA链连接到mRNA的3'端，采用固定在胶乳珠表面上的具有polyT结构的多核苷酸来俘获mRNA，然后将用spine柱(01igotex-dT3(KSuper〉mRNAPurificationKit，Takara)对mRNA进行洗涤和洗脱。使用荧光标记核苷酸用反转录酶(SuperScriptIIReverseTranscriptase;目录编号18064-014，GibcoBRL)进行mRNA的反转录，从而获得在反转录时引入Cy3-dUTP或Cy5-dUTP的cDNA。将标记cDNA溶于TE缓冲液(IOmMTris-HC1/1mMEDTA，pH8.0)，将该溶液滴在含有全部酵母基因的DNA芯片(DNAChipResearchInc.日本)上，从而于65X:在DNA芯片上使cDNA杂交超过12小时。用荧光扫描仪读取DNA芯片的荧光强度，如下计算相对于无化学物质存在时产生的荧光强度的比率，结果示于表19中。在表格中，右列所示"强度"为对照细胞中每种基因的mRNA表达水平除以全部基因表达的平均水平的值。mRNA水平在对照中较低而在加入化学物质的情况中较高的基因特别适用于检测毒性物质。酵母基因(1)(2)YCR102C3.43.2YDL218W3.51.2YDR533C3.44.9YGR110W1.63.1YKL071W8.33.8YLR460C2.12.1YMR090W6.99.5YOL150C4.13.7YBL048W2.07.9YBL107C1,41.1YFL024C1.01.1YGL121C2.65.0YHR029C2.81.8YHR209W2.8UYKL107W2.42.5YKR075C1.50.7YLL056C2.12.3YLR297W2.42.1YOR338W1.81.8YOR391C2.12.0YPL280W1.71.9YLR346C4.42.0YO腿9C2.50.9YAL034CU1.8YDR476C0.71.8YGR035C1.60.6YGR284C1.02.0YHR054C1.70.9YL画8C0.90.5表1未知蛋白酵母基因化学物质存在时的mRNA表达水平/化学物质不存在时的mRNA表达水平(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)强度U0.70.41.14.99.861.513.50.51.14.10.91.21.11.20.531.40.70.91.11.572.512.65.70.9U4.81.13.51.10.90.421.81.32.21.75.47.312.77.71.43.02.92.56.72.32.71.825.90.90.91.71.56.44.80.51.43.62.81.217.10.92.10.192.81.118.63.724.7162.2109.240.31.08.421.91.72.21.00.90.311.11.30.61.18.113.931.614.30.40.73.50.71.81.01.10.483.50.73.82.73.916.76.18.82.26.96.51.95.11.82.81.300.91.05.22.4.3.710,88.39.42.98.95.71.83.12.72.20.472.81.32.01.91.27.24.42.01.22.72.04.15.71.31.00.291.51.21.12.11.91.03.12,91.42.62.51.41.50.91.41.030.71.12,03.30.90.50.50.60.80.93.30.9U0.90.80.374.20.99.84.73.07.015.06.11.67.85,81.68.52.73.50.601.81.02.72.02.713.68.63.81.54.73.51,01.02.12.10.874.51.83.25.02.02.96.43.31.02.02.25.03.52.62.60.560.81.12.01.10.928.28.32.01.01.93.41.73.51.60.90.174.51.21.51.42.00.20,6U2.33.82.70.44.32.41.91.152.01.10.61.01.358.88.81.71.36.811.01.54.85.32.50.321.71.30.81.11.32.15.53.50.80.82.30.71.80.71.00.811.71.62.61.32.20.63.50.81.21.42.5.81.0U0.50.521.21.31.62.02.818.818.13.2.12.32.45.82.21.00.90.222.01.41.91.82.349.814.01.90.92.42,44.31.51.20.90.224.51.45.55.61.38.66.60.54.26.22.21.02.410.67.80.531.41.38.44.20.9U1.91.16.77.11.51.34.32.62.90.221.11.01.51.81.03.03.31.52.84.91.21.41.01.21.30.521.20.53.11,51.31.73.41.62.12.81.12.22.02.41.50.580.61.33.3U0.91.10.50.43.32.10.80.31.92.54.31.041.41.21.42.21.14.31.81.72.13.61.23.91.91.32.12.571.01.02.91.61.82.67.70.93.65.81.00.82.25.13.40.800.9I_32.72.01.00.40.70.83.56.21.60.71.75.44.92.00<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>酵母基因^iDNA修复蛋白基因化学物质存在时的mRNA表达水平/化学物质不存在时的mRNA表达水平<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>酵母基因^应激蛋白基因化学物质存在时的mRNA表达水平/化学物质不存在时的mRNA表达水平<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>酵母基因表8解毒蛋白基因化学物质存在时的mRNA表达水平/化学物质不存在时的mRNA表达水平<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>这些表格显示出，在2400种未知酵母基因中，约700种的mRNA表达被诸如重金属、农药、表面活性剂等化学物质中的任一种所诱导(表1)，并且167种线粒体基因(表2)、52种DNA修复基因(表3)、161种能量基因(表4)、142种转运促进蛋白基因(表5)、卯种应激蛋白基因(表6)、142种代谢基因(表7)、60种脱毒基因(表8)和507种属于其他种类的基因(表9)的mRNA表达亦被上述毒性化学物质中的任一种所诱导。此处，当化学物质存在时的mRNA表达量与化学物质不存在时的mRNA表达量之比为2以上时，则其被认为有意义。本发明人认识到，毒性物质对某些酵母基因的诱导是通过毒性物质对基因启动子的激活而引起的。因此，本发明人制备了一种载体，该载体包含含有酵母基因启动子的多核苷酸序列，该序列与编码标记蛋白的多核苷酸操作性连接；并用该载体转化酵母细胞。以下实例描述了制备这样的载体、使用所述载体转化酵母细胞和使用转化细胞检测毒性物质。启动子检测是基于标记蛋白表达的水平而非mRNA表达的水平而在不破坏细胞的条件下测定细胞内基因水平变化的方法。所选择的用以检测化学物质的基因在化学物质不存在时得到表达，因而在化学物质不存在时也存在标记蛋白。在本发明的方法中，添加测试材料时的酵母基因的行为基于标记蛋白的表达水平确定，从而可以预测毒性化学物质的有无和种类。因此，希望在化学物质不存在时标记蛋白产生较少，而在化学物质存在时标记蛋白产生较多。在该情况下，选择用于启动子检测的酵母基因，其强度(对照细胞中的基因表达水平/全部基因表达的平均水平)优选为1.5以下，更优选为1以下，进而更优选为0.5以下，其表达倍率(化学物质存在时的tnRNA表达/化学物质不存在时的mRNA表达)优选为3以上，更优选为10以上，进而更优选为20以上。制备了用于通过PCR扩增包含酵母基因YKL071w启动子的多核苷酸的PCR用引物。使用引物设计软件(Oligo4.0-S，S叫uencherIMackintosh版)来设计引物。上游引物的碱基序列为cgcaataatactggaaacatcaa(序歹l)编号2)，而下游引物的碱基序列为atcgactttgtttgcttagaat(序列编号3).对于PCR，使用酵母染色体(Sacc/zarawycesce^WWaeS288C,Cat40802,ResearchGenetics,Inc.)作为模板，使用商品化试剂盒(KODDNAPolymerase;编号KOD-lOl，Toyobo)作为试剂。使用能够在大肠杆菌和酵母中进行复制的YEp型穿梭载体pYES2(pYES2，Catno:V825-20，InvirtogenCorporation,美国)作为载体(R.W.Old，S.B.PrimrosePrinciplesofGeneManipulation5thEd.,BAIFUKANCO.,LTD,ppl38-165,pp.234-263，2000)。载体pQBI63(Catno.54-0082，WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)对应于标记蛋白GFP的部分用作编码GFP的多核苷酸(序列编号4)。首先，将氧化酶插入到pYES2的多克隆位点中，从而产生载体。之后，将pYES2的GALl启动子用包含目标酵母基因YKL071w(序列编号4)的启动子序列的多核苷酸置换，从而产生目标质粒载体。选择合适的限制酶，进行包含氧化酶和启动子序列的多核苷酸的插入。下一步，按照以下过程用所得质粒载体转化酵母^cc/wm^yc^cerevz'w'aeW303:1)在振摇下在200ml的SD培养基中对酵母&cc/^ww>^^cwev&aeW303进行温育，直至OD660达到0.5;2)将收集的细胞悬浮在5ml的TE缓冲液中；3)添加250pi的2.5M乙酸锂；4)分配为每份300^，向其中添加10pi的上述质粒载体，然后在3(TC温育该悬浮液30分钟；5)添加700(il的50%PEG4000，在振摇下在3(TC温育该混合物60分钟；6)对该混合物施加热激(42t:，5分钟)，然后立即冷却；7)将该混合物用1M山梨醇洗涤两次；和8)将其接种在由最低基础培养基制成的琼脂盘中。在选择培养基(SD培养基(无氨基酸酵母氮源(Difco0919-15)+葡萄糖+氨基酸(腺嘌呤、组氨酸、色氨酸))上确认转化。对选择培养基的琼脂盘上生长的菌落进行进一步检査氨基酸的营养要求性。在25i:在SD培养基(腺嘌呤、组氨酸、色氨酸、亮氨酸)中通过振动培养使实施例2中制造的转化酵母生长到稳态。用SD培养基将处于稳态的酵母稀释500倍，并在25"C振动培养15小时。在确认600nm吸光度为0.20.5的对数生长期之后，加入不同浓度的TPN。所含有的最终浓度为0.0053ppm、0.053ppm和0.53ppm的溶液分别被定义为溶液A、B和C。此外，作为参比溶液，不含TPN的溶液被定义为标准溶液S。将样品溶液A、B或C放入图2的框图中所示的化学物质测量系统的第一池中，然后开始测量溶解氧量。向样品溶液A、B或C以及标准溶液S中，添加磷酸吡哆胺，然后开始测量。通过对样品溶液A、B或C的测得电流值的时间变化与标准溶液的测得电流值的时间变化进行比较，可以确定各测量用溶液中由于化学物质(TPN)刺激而产生的磷酸吡哆胺氧化酶的量，从而可以检出化学物质的存在或存在量。样品溶液A、B和C以及标准溶液S的溶解氧测定的电流值时间变化如图4所示。图4显示，标准溶液S由于缺少氧化酶表达而未显示出任何电流值变化，而对于样品溶液A、B和C，当化学物质(TPN)的浓度变大时，初始阶段的电流值降低速率变大，达到平台后的稳态值变小。权利要求1.一种转化细胞，所述转化细胞被编码在酶反应中使用氧作为电子受体来氧化底物的酶的多核苷酸转化，或者被含有在下述碱基序列的下游操作性连接有编码氧化还原酶作为标记蛋白的多核苷酸的多核苷酸的载体转化，所述碱基序列选自由包含酵母基因的启动子中响应于化学物质的启动子的碱基序列和包含来自与所述酵母基因同源但源自其他物种的基因的启动子的碱基序列所组成的组。2.如权利要求1所述的转化细胞，其中，所述在酶反应中使用氧作为电子受体来氧化底物的酶是选自由氧化酶和加氧酶所组成的组屮的酶。3.如权利要求1所述的转化细胞，其中，所述编码在酶反应中使用氧作为电子受体来氧化底物的酶的多核苷酸包含酵母基因组序列中的氧化酶相关基因的碱基序列或者加氧酶相关基因的碱基序列。4.如权利要求3所述的转化细胞，其中，所述氧化酶相关基因包括选自酵母基因Q0045、Q0250、Q0275、YBL064c、YBR035c、YBR244w、YDL067c、YDR044w、YDR079w、YDR231c、YDR453c、YDR506c、YEL045c、YER014w、YER021w、YER058w、YER141w、YER145c、YER153c、YER154w、YFL041w、YGL187c、YGL191w、YGL205w、YG證9w、YGR060w、YGR062c、YGR112w、YGR234w、YHR051w、YHR116w、YILlllw、YIR037w、YJL003w、YJR034w、YKL026c、YKR066c、YLL009c、YLL018c-a、YLR038c、YLR142w、YLR205c、YLR395c、YML086c、YML129c、YMR020w、YMR058w、YMR256c、YNL052w、YOR350c、YPL132w和YPR037c中的基因的碱基序列以及与上述基因同源但源自其他物种的基因的碱基序列。5.如权利要求3所述的转化细胞，其中，所述加氧酶相关基因包括选自酵母基因YBL098w、YDR402c、YGL055w、YGRI75c、YGR255c、YHR007c、YHR176w、YJ謹5c、YJR069c、YJR078w、YJR149w、YLL057c、YLR205c和YMR015c中的基因的碱基序列以及与上述基因同源但源自其他物种的基因的碱基序列。6.如权利要求15中任一项所述的转化细胞，其中，所述转化细胞为转化酵母。7.—种检测化学物质的方法，所述方法包括在包含待测样品、转化细胞和在酶反应中使用氧作为电子受体来氧化底物的酶的底物的溶液中用氧电极检测溶解氧量，所述转化细胞被编码所述在酶反应中使用氧作为电子受体来氧化底物的酶的多核苷酸转化，或者被含有操作性连接有编码所述在酶反应中使用氧作为电子受体来氧化底物的酶的多核苷酸的多核苷酸的载体转化；在第一时间段，以第二时间间隔收集来自所述氧电极的输出信号；禾口基于所述输出信号的变化来计算所述溶解氧量的变化，从而检测所述待测样品中的化学物质的存在或存在量。8.—种化学物质测量装置，所述装置包含用于盛装一种溶液的测量池，所述测量池在内部预定位置具有氧电极面；和能够载置多个测量池的主体，所述主体具有信号输出装置，所述信号输出装置基于来自各个氧电极的输出信号来输出表示所述溶液中的化学物质的存在或存在量的信号。全文摘要本发明提供了一种不依靠荧光测定法中所用的昂贵测量装置来方便且容易地检测环境中的化学物质的存在或存在量的检测方法。更具体而言，本发明的特征在于使用了下述转化细胞，所述转化细胞通过将编码氧化还原酶的多核苷酸操作性连接在下述启动子基因的下游而被转化，所述启动子基因为响应于化学物质启动子活性发生变化的监测用启动子基因。文档编号C12N1/19GK101460608SQ20078002006公开日2009年6月17日申请日期2007年5月29日优先权日2006年5月29日发明者加藤千明申请人:大金工业株式会社