来自小麦的核酸分子、转基因植物细胞和植物及其在生产改性淀粉中的应用的制作方法

专利名称：来自小麦的核酸分子、转基因植物细胞和植物及其在生产改性淀粉中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码来自小麦的R1-蛋白质的核酸分子及其衍生物和部分、所述的R1-蛋白质、用于生产所述R1-蛋白质的方法、包括所述核酸分子的转基因植物细胞和植物、包括所述核酸分子的转基因植物细胞和植物以及可获自所述转基因植物细胞和植物的改性淀粉。
多糖淀粉构成了植物中最重要的贮存物质之一。淀粉广泛用于生产食品并且还在生产工业化产品中作为再生原料起重要作用。为了在许多不同技术领域中应用淀粉，需要各种任选地改性的淀粉以便满足加工工业的不同需求。
尽管淀粉由化学上均一的基本成分，即葡萄糖组成，但是它不构成均匀原料。它是复杂的分子混合物，所述分子在其萄糖链的聚合度和支化度方面存在差异直链淀粉型淀粉是由α-1，4-糖苷支链葡萄糖分子组成的基本上非支化聚合物，而支链淀粉型淀粉是支化葡萄糖链的混合物，它另外包括α-1，6-糖苷互连键。
淀粉的分子结构主要依赖于其支化度、直链淀粉/支链淀粉比例、平均链长、链长分布和磷酸化程度，从而进一步决定淀粉及其水溶液的功能特性。淀粉及其水溶液的重要功能特性分别是例如溶解性、退减趋势、成膜能力、粘度、糊化(粘合和胶连)特性和抗冷性。另外，淀粉颗粒的大小还可能决定淀粉对特殊应用的适合性。
由于淀粉通常通过化学和/或物理修饰得到改变以便满足工业的要求，所以对提供改性淀粉存在巨大的需求，这种改性淀粉将会使含有改性淀粉的植物细胞或植物部位更适合于工业化加工，例如生产食品或工艺产品。因此，需要避免进行耗时而昂贵的化学和/或物理修饰并提供可合成更接近地满足淀粉加工工业要求的淀粉的植物。
例如，通过传统的育种和/或产生突变株制备产生改性产物的改良植物的常规方法局限于应用同源基因且并不总是令人满意的。特别在小麦中，因小麦的多倍性(四或六倍性)而难以通过传统育种制备稳定的突变株。然而，近来通过育种方法(Nakamura等，Mol.Gen.Geent.248(1995)，253-259)获得了产生蜡质型淀粉(不含直链淀粉的淀粉)的小麦突变株。
进一步的可供选择的方法是制备包括适合于改变植物淀粉机理的核酸分子以合成改性淀粉的转基因植物。这类植物通过重组分子生物学技术并引入干扰淀粉代谢的同源和/或异源核酸分子(例如编码区、调节元件、内含子)来生产。然而，应用重组分子生物学技术需要直接或间接(例如共抑制、反义技术、蛋白质或核酶的生成)参与淀粉代谢或淀粉生物合成(即淀粉的合成、改性和/或降解)的适宜核酸的有效性。
大量基因参与淀粉代谢。因此，已经将编码例如分支酶、脱支酶、异淀粉酶、淀粉合成酶、ADP-葡萄糖-焦磷酸化酶的大量基因用于改变植物中的淀粉代谢。
尤其就淀粉磷酸化程度而言R1蛋白质参与淀粉代谢且因此适合于改变淀粉的合成。特别地，R1-蛋白质和编码来源于下列许多植物物种的R1-蛋白质的基因是公知的即来自WO 97/11188-A1和Lorberth等(Nature Biotechnology 16(1998)，473-477)的马铃薯；来自WO 98/27212-A1的玉米；来自Sakaki等、EMBL数据库登记寄存号C71741(1997-09-19)的稻米；和来自WO 99/53072-A1的鼠耳芥属、姜、藓类、香蒲(宽叶香蒲)和大豆。
然而，小麦植物中存在R1-蛋白质并未得到证实，相应的核酸分子也未得到鉴定。此外，编码R1-蛋白质的已知核酸分子并不总是令人满意的或并不总是适合于小麦植物的遗传工程或体内诱变以便改变小麦淀粉的生物合成和/或代谢。
因此，有待由本发明解决的问题是提供编码来源于小麦的R1-蛋白质的核酸分子和改变植物中，尤其是小麦植物中淀粉代谢以便提供一种改性淀粉的方法，这种改性淀粉就物理和/或化学特性而言不同于天然合成的淀粉，尤其是小麦淀粉，它表现出改善的特征，特别是应用于食品和/或非食品工业。
这些问题由如权利要求中所述的本发明的实施方案解决。
因此，本发明涉及编码包括按照Seq.ID No.2和Seq.ID No.9的氨基酸序列的R1蛋白质的核酸分子或按照质粒pTa R1-11(DSM号12810)和质粒RS26-88(DSM号13511)的cDNA插入片段的其衍生物或其部分。所述本发明的R1-蛋白质参与淀粉的代谢并且就磷酸化程度而言直接或间接参与小麦淀粉的生物合成。
在本发明的含义内，有关本发明R1-蛋白质(多肽、氨基酸序列)的术语“衍生物”包括来源于Seq.ID No.2的多肽，它包括约至少60-79个氨基酸基、优选至少80个氨基酸基、更优选至少90个氨基酸基、特别是至少100个且最优选约101-111个氨基酸基，这些氨基酸基选自下列组成的氨基酸基的组1E、2V、3V、5G、6L、7G、8E、9T、10L、11V、12G、13A、14Y、15P、16G、17R、18A、20S、21F、23C、24K、25K、27D、28L、30S、31P、34L、35G、36Y、37P、38S、39K、40P、41I、42G、43L、44F、45I、48S、49I、50I、51F、52R、53S、54D、55S、56N、57G、58E、59D、60L、6 1E、62G、63Y、64A、65G、66A、67G、68L、69Y、70D、71S、72V、73P、74M、75D、77E、80V、81V、83D、84Y、87D、88P、89L、90I、92D、95F、96R、99I、100L、101S、103I、104A、105R、106A、107G、108H、109A、110I、111E、112E、113L、114Y、115G、116S、117P、118Q、119D、121E、122G、123V、124V、126D、127G、128K、129I、130Y、131V、132V、133Q和134T；且所述多肽包括至少1个、优选2个且更优选3个选自如Seq.ID No.2所述的氨基酸基中76V、93S和97N组成的组的氨基酸基(下文由单个字母码表示)。
在本发明的含义内，有关本发明R1-蛋白质(多肽、氨基酸序列)的术语“部分”包括由本发明R1-蛋白质或其衍生物的约至少10-19个、优选至少20个、更优选至少40个、特别是至少80个且最优选约100-140个氨基酸基组成的多肽或寡肽。
本发明进一步涉及核酸分子，该核酸分子包括来源于Seq.IDNo.1和Seq.ID No.9的核酸分子或其衍生物或其部分；质粒pTa R1-11(DSM号12810)的672 bp EcoR I/Kpn I插入片段或其衍生物或其部分；特别是Seq.ID No.1的编码区(核苷酸1-449)或其衍生物或其部分；尤其是质粒pTa R1-11(DSM号12810)插入片段的编码区；和质粒RS26-88(DSM号13511)的编码区或其衍生物或其部分。
在本发明的含义内，有关本发明核酸分子(核苷酸序列或多核苷酸)的术语“衍生物”包括多核苷酸，它包括约至少150-209个核苷酸、优选至少210个核苷酸、更优选至少240个核苷酸、特别是至少270个核苷酸且最优选约280-294个核苷酸，这些核苷酸选自下列组成的核苷酸的组(a)如Seq.ID No.1所述的1C、3G、4A、6G、7T、8G、9G、10T、12A、15G、16G、18C、19T、20T、21G、22G、24G、25A、27A、28C、30C、31T、33G、34T、36G、37G、38A、39G、40C、42T、43A、44T、45C、46C、48G、49G、51C、52G、53T、54G、55C、58T、59G、60A、61G、63T、64T、67T、69T；70G、72A、73A、75A、76A、77A、79A、81G、82A、84C、85T、88A、89C、90T、91C、92T、93C、94C、97A、100T、103T、105G、106G、107T、108T、109A、110C、111C、112C、114A、115G、116C、117A、118A、120C、121C、123A、124T、126G、127G、129C、130T、132T、133T、134C、135A、136T、137A、138A、144T、145C、147A、148T、149C、150A、151T、152C、153T、154T、155C、156C、157G、159T、160C、162G、163A、165T、166C、168A、169A、171G、172G、174G、175A、177G、178A、181T、182G、183G、184A、185A、186G、187G、188T、189T、190A、192G、193C、195G、196G、198G、199C、201G、202G、205T、207T、208A、210G、211A、213A、214G、215T、216G、217T、219C、220C、222A、223T、224G、225G、226A、227T、228G、230G、231G、232A、234G、235A、238A、240G、241T、242T、243G、244T、245A、247T、249G、250A、252T、253A、256C、259C、261G、262A、263C、264C、265C、268T、270A、271T、276G、277A、281T、285T、286T、287C、288C、289G、295C、296A、297A、298T、299C、300C、301T、303T、304C、306A、308C、309A、310T、312G、313C、315C、316G、318G、319C、320T、321G、322G、324G、325A、327G、328C、330A、331T、332C、333G、334A、335G、336G、337A、338G、339C、340T、342T、343A、344T、345G、346G、348T、349C、351C、352C、354C、355A、357G、358A、361T、363G、364A、365G、366G、367G、369G、370T、371A、372G、373T、374G、375A、377G、378G、379A、380T、381G、382G、384A、385A、387A、388T、390T、391A、393G、394T、396G、397T、399C、400A、401G、402A、403C、404A、406A、407C、408C、409A、410A、411A、412G、413A、414T、415G、416T和419T；且(b)所述的多核苷酸包括约至少15-19个核苷酸、优选至少20个核苷酸、更优选至少25个核苷酸、特别是至少27个核苷酸且最优选约30-32个核苷酸，这些核苷酸选自下列核苷酸组成的组如Seq.ID No.1所述的17A、23A、50C、56C、65C、68G、71T、104G、113T、143G、159C、161A、167T、191C、203G、206G、218C、221T、229T、233A、248C、251C、257G、269C、272C、279T、280C、290G、326C、341C、347G、350A、353A、359T、383G、392C和405T。
清楚地表明不应将序列成分的编号(一方面是核酸序列而另一方面是氨基酸序列)理解为固定或限定的定义。该编号仅提供了与术语相关的序列成分彼此的位置的信息并因此是一种参考。
此外，有关编码本发明R1-蛋白质的核酸分子的术语“衍生物”包括通过添加、缺失、插入或重组一个或多个核苷酸而不同于Seq.IDNo.1和/或Seq.ID No.9且满足如上述(b)中给出的定义的核酸分子。
另外，有关编码本发明R1-蛋白质的核酸分子的术语“衍生物”包括本发明核酸分子的互补或反向互补多核苷酸或其部分。此外，有关编码本发明R1-蛋白质的核酸分子的术语“衍生物”包括与本发明核酸分子杂交的多核苷酸或其部分，它满足如上述(b)中给出的定义。
为了本发明的目的，术语“杂交”指的是在常规杂交条件下、优选在如例如Sambrook等(Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)所述的严格条件下的杂交。
“特异性杂交”尤其优选指的是下列条件杂交缓冲液2×SSC；10×Denhardt溶液(Ficoll 400+PEG+BSA；比例为1∶1∶1)；0.1％ SDS；5mM EDTA；50mM Na2HPO4；250μg/ml青鱼精子DNA；50μg/ml tRNA；或0.25M磷酸钠缓冲液(pH7.2)；1 mM EDTA；7％ SDS；杂交温度T＝55-68℃；洗涤缓冲液0.2×SSC；0.1％ SDS；和洗涤温度T＝40-68℃。
与本发明核酸分子或与适合于本发明使用的核酸分子杂交的分子还包括本发明核酸分子或适合于本发明使用的核酸分子的部分、衍生物和等位基因变体。
在本发明的上下文中，术语“衍生物”指的是这些分子的序列在一个或多个位置上不同于本发明或适合于本发明使用的核酸分子的序列且与这些序列表现出高度的同源性。同源性指的是序列同一性至少为60％、优选在70％以上、且尤其优选在85％以上、特别是在90％以上且特别优选在95％以上。已经通过一种或多种缺失、取代、插入(添加)或重组引起了相对于本发明核酸分子或相对于适合于本发明使用的核酸分子的偏差。
此外，同源性指的是在所述核酸分子与由它们编码的蛋白质之间存在功能和/或结构等价性。与本发明核酸分子或与适合于本发明使用的核酸分子同源且构成这些分子的衍生物的核酸分子通常是构成发挥相同、事实上相同或相似生物学功能的修饰的这些分子的变化形式。它们可以是例如来自其它植物物种的序列这样的天然出现的变化形式或突变，这些突变可能已经天然发生或已经通过定向诱变被引入。这些变化形式可以进一步是合成的序列。等位基因变体可以是天然出现的变体或者是合成的变体或通过重组DNA技术产生的变体。
有关编码本发明R1-蛋白质的核酸分子的术语“部分”包括由本发明编码R1-蛋白质的核酸分子或其衍生物的约至少30-99个、优选至少100个、更优选至少200个、特别是至少300个且最优选至少400个核苷酸组成的多核苷酸或寡核苷酸。术语“部分”并不限于长至足以编码如上所述R1-蛋白质功能活性部分的核酸分子的部分。
在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的术语“衍生物”和/或“部分”分别包括如上所定义的多核苷酸、多肽或寡肽，它们分别显示出来源于小麦的R1-基因(即编码R1-蛋白质的核酸分子)、R1-蛋白质的功能和/或结构等价性。术语“功能和/或结构等价性”指的是本发明分子各自相同、等价或相似的功能、尤其是生物学功能。然而，术语“部分”并不限于足以编码所述蛋白质中的功能活性部分的所述核酸分子的部分。
由本发明核酸分子编码的R1-蛋白质可以显示出某些常规特征例如酶活性、分子量、免疫反应性、构象、凝胶电泳中的迁移率、层析特征、沉降系数、溶解性、光谱特性、稳定性、酶活性的最佳pH和/或最佳温度等。
本发明的核酸分子可以分离自例如天然来源、可以由遗传工程或分子生物学方法(例如PCR)制备或可以通过化学合成方法生产。本发明的核酸分子优选是DNA或RNA分子，例如cDNA或基因组DNA分子。任选地，本发明的核酸分子包括一种或多种间插序列(内含子)。
在另一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子包括一种或多种确保在原核细胞和/或真核细胞中、优选在植物细胞中RNA分子的转录和合成的调节元件。
本发明的核酸分子适合于改变细胞、优选植物细胞中淀粉的生物合成/代谢，这种改变通过下列方式实现有义表达本发明的核酸分子、反义表达本发明的核酸分子、表达合适的核酶、共抑制或体内诱变。
因此，本发明也涉及允许在改变R1-蛋白质表达水平的细胞或植物细胞中翻译或非翻译性mRNA分子合成(有义或反义作用、共抑制作用或核酶)的本发明的核酸分子、特别是DNA分子的应用。
一般来说，本发明核酸分子的应用适合于任何植物物种。然而，优选单子叶植物和双子叶植物，特别是农作物植物且最优选贮存淀粉的植物，例如黑麦、大麦、燕麦、小麦、小米、西米、稻米、玉米、豌豆、皱皮种青豌豆、木薯、马铃薯、番茄、油菜、大豆、大麻、亚麻、向日葵、豇豆、竹芋、三叶草、麦草或苜蓿，特别是是马铃薯、玉米、稻米或小麦植物。
共抑制方法对本领域技术人员来说是众所周知的(Jorgensen，Trends Biotechnol.8(1990)，340-344；Niebel等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995)，91-103；Flavell等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995)，43-56；Palaqui & Vaucheret，Plant.Mol.Biol.29(1995)，149-159；Vaucheret等，Mol.Gen.Genet.248(1995)，311-317；和de Borne等，Mol.Gen.Genet.243(1994)，613-621)。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码显示出特异性裂解本发明DNA分子转录物的核酶活性的RNA分子的DNA分子。核酶是能够裂解RNA分子和特异性靶序列的具有催化活性的RNA分子。通过重组DNA技术能够测定相对于本发明核酸分子的核酶的特异性。为了制备编码特异性裂解本发明DNA分子转录物的核酶的DNA分子，例如使编码核酶催化结构域的DNA序列(DNA分子)的两侧与本发明的DNA序列连接。编码所述催化结构域的核酸序列是例如SCMo病毒的卫星DNA的催化结构域(Davies等，Virology 177(1990)，216-224)或TobR病毒的卫星DNA的催化结构域(Steinecke等，EMBO J.11(1992)，1525-1530；Haseloff和Gerlach，Nature 334(1988)，585-591)。位于所述催化结构域侧翼的DNA序列优选是用作靶物的本发明的DNA分子或其部分。核酶表达的一般原理和方法描述在EP-B1 0 321 201中。核酶在植物细胞中的表达进一步描述在Feyter等的Mol.Gen.Genet.250(1996)，329-338中。
通过“体内诱变”的方法也可以降低本发明R1-蛋白质在植物细胞中的活性。因此，将杂种RNA/DNA寡核苷酸(嵌合体)引入细胞(Kipp等，Poster Session at the 5th International Congress of PlantMolecular Biology，1997年9月21-27日，Singapore；Dixon和Arntzen，关于“Metabolic Engineering in Transgenic Plants”的会议报告，Keystone Symposia，Copper Mountain，CO，USA，TIBTECH 15(1997)，441-447；WO 95/15972-A1；Kren等，Hepatology25(1997)，1462-1468；Cole-Strauss等，Science 273(1996)，1386-1389)。
因此，本发明的另一个目的是提供一种通过体内诱变获得的显示出本发明R1-蛋白质的改变活性的植物、优选小麦植物。
此外，本发明涉及一种适合于遗传工程的包括本发明的核酸分子(例如DNA和/或RNA)的载体，尤其是质粒、粘粒、病毒、噬菌体等；特别是适合于细菌和/或植物的遗传工程的载体。术语“载体”指的是本领域技术人员所公知的允许将单链或双链核酸分子靶向转入宿主细胞的载体，例如DNA或RNA病毒或病毒片段；在有或没有调节元件存在的情况下适合于将核酸分子转入细胞的质粒；例如在基因枪方法中使用的金属颗粒；还有可以通过化学和/或物理方法直接引入细胞的核酸分子。
在另一个实施方案中本发明涉及一种通过本发明的核酸分子或载体转化和/或重组操作的转基因宿主细胞，特别是一种转基因的原核细胞或真核细胞且更优选一种转基因的细菌或植物细胞。本发明的转基因宿主细胞、尤其是转基因的细菌或植物细胞含有一种或多种本发明的核酸分子，将它们稳定地整合入所述细胞的基因组，分别优选不在同源基因组的基因座上、不在基因组内天然出现的基因的位置上。可以通过DNA印迹、RNA印迹和/或蛋白质印迹分析鉴定本发明的转基因细胞。
另外，本发明涉及来源于本发明转基因宿主细胞和/或其含有本发明核酸分子或载体的后代的转基因细胞。
由于提供了本发明的核酸分子和/或载体，通过重组DNA技术可制备包括本发明核酸分子和/或载体的转基因植物细胞或植物，特别是单子叶植物或双子叶植物细胞或植物，优选农作物植物细胞或植物，特别是选自下列组成的组的植物细胞或植物马铃薯、玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦、豌豆、稻米、小米、皱皮种青豌豆、木薯、西米、番茄、油菜、大豆、大麻、亚麻、向日葵、豇豆、竹芋、三叶草、麦草、苜蓿或木薯。
本发明的转基因植物细胞或植物合成了就结构和/或物理和/或化学特性而言不同于在野生型(未转化)植物中合成的淀粉的改性淀粉。通过遗传工程和/或分子生物学方法将本发明的载体和/或核酸分子引入植物细胞、优选与确保在所述植物细胞中的转录和/或翻译的一种或多种调节元件连接。任选地，随后将所得的转基因植物细胞再生成完整植物。
因此，本发明涉及一种包括本发明的核酸分子和/或载体的转基因植物细胞，特别是单子叶植物或双子叶植物细胞，优选马铃薯、玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦、豌豆、稻米、小米、皱皮种青豌豆、木薯、西米、番茄、油菜、大豆、大麻、亚麻、向日葵、豇豆、竹芋、三叶草、麦草、苜蓿或木薯的细胞，特别是马铃薯、小麦、玉米或稻米的细胞。
本发明还涉及一种转基因宿主细胞、优选植物细胞的制备方法，该方法包括将本发明的核酸分子和/或载体引入属于原核细胞或真核细胞的宿主细胞的基因组、优选引入植物细胞的基因组的步骤。优选所述的细胞含有与确保在所述细胞中的转录和/或翻译的一种或多种调节元件连接的核酸分子。合适的调节元件优选相对于本发明核酸分子而言是同源或异源的。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种转基因植物细胞，其中存在的(同源的或任选地，异源的)本发明的核酸分子直接或间接导致本发明R1-蛋白质的表达或另一方面直接或间接导致抑制编码R1-蛋白质的一种或多种内源性基因的表达。优选所述的转基因植物细胞包括选自下列核酸分子组成的组的核酸分子(a)转录成导致本发明R1-蛋白质表达的有义RNA的本发明的核酸分子、优选DNA分子；(b)转录成导致编码R1-蛋白质的一种或多种内源性基因表达减少(抑制)的反义RNA的本发明的核酸分子、优选DNA分子；(c)转录成导致编码R1-蛋白质的一种或多种内源性基因表达减少(抑制)的共抑制RNA(有义RNA)的本发明的核酸分子、优选DNA分子；(d)转录成特异性裂解编码R1-蛋白质的一种或多种内源性基因转录物的核酶的本发明的核酸分子、优选DNA分子；(e)通过体内诱变引入的修饰编码R1-蛋白质的一种或多种内源性基因的本发明的核酸分子；由此改变了所述细胞中的淀粉代谢/生物合成。
如果通过反义作用改变了淀粉在植物中的代谢，那么本发明的DNA分子在反义方向上与一种或多种确保植物细胞中转录和/或翻译的调节元件连接，任选地，它包括一种或多种所表达的多核苷酸的相应基因组序列的内含子。反义RNA应具有最少约15-25个核苷酸、优选至少约50-100个核苷酸且最优选至少约200-1000个核苷酸。
在另一个实施方案中，通过一种包括本发明核酸分子的核酶使转基因植物细胞中的R1-蛋白质的量得到减少。为了在本发明的转基因植物细胞中表达所述的核酶分子，使编码所述核酶的DNA分子与确保转录和/或翻译的一种或多种调节元件连接。
通过本领域技术人员众所周知的方法可以将所述的转基因植物细胞再生成完整植物。可通过再生本发明的转基因植物细胞获得的包括本发明的转基因植物细胞的转基因植物和所述转基因植物的制备方法也是本发明的主题。
本发明的转基因植物是一种单子叶植物或双子叶植物，优选农作物植物，特别是黑麦、大麦、燕麦、稻米、小麦、小米、西米、玉米、豌豆、皱皮种青豌豆、木薯、马铃薯、番茄、木薯、油菜、大豆、大麻、亚麻、向日葵、豇豆、白三叶草、麦草、苜蓿或竹芋植物，特别是玉米、小麦、稻米或马铃薯植物。
此外，本发明涉及本发明植物的繁殖材料、种子、器官和部位。
本发明还涉及一种用于生产淀粉的方法，该方法包括将本发明的转基因植物细胞、植物和/或植物部位引入淀粉的生产/提取工艺中的步骤。
本发明进一步涉及一种用于生产改性淀粉的方法，该方法包括将本发明的淀粉引入淀粉的化学和/或物理修饰/处理的工艺中的步骤。
从植物、植物细胞或其部位中提取淀粉的工艺在本领域中是众所周知的。例如，这类工艺描述在Eckhoff等的Cereal Chem.73(1996)，54-57中。例如通过“湿磨法”来提取玉米淀粉。用于从各种植物中提取淀粉的其它方法描述在下列文献中例如StarchChemistry andTechnology(编辑Whistler，BeMiller和Paschall(1994)第2版，Academic Press Inc.London LTD；ISBN 0-12-746270-8；第XII章，417-468页；Watson，S.A.Corn and Sorghum StarchesProduction，第XIII章，469-479页；Corbishley和MillerTapioca，Arrowroot and Sago StarchesProduction；第XIV章，479-490页；MitchPotato StarchProduction and Uses；第XV章，491-506页；Knight和OlsonWheat StarchProduction，Modification and Uses；第XVI章，507-528页；Rohwer和KlemRiceStarchProduction and Uses)。用于从植物材料中提取淀粉的方法中常用的设备是分离器、滗析器、水力旋流器和例如喷雾干燥器或喷射干燥器这样不同种类的用于干燥淀粉的机器。
本发明还涉及可获自本发明的转基因植物细胞、植物和/或植物部位、优选获自小麦的改性淀粉。本发明的转基因细胞或植物合成了就磷酸化程度而言不同于可获自未转化植物的淀粉的改性淀粉。在本发明一个特定的实施方案中，本发明的淀粉显示出比可获自相应未转化细胞或植物的淀粉增加的磷酸酯含量。增加的磷酸酯含量(磷酸一酯含量)指的是淀粉的硫酸酯含量比可获自相应未转化植物的淀粉的磷酸酯含量至少增加约10-30％、更优选至少增加30％、甚至更优选至少增加50％、且特别优选增加100％以上到约1000-5000％。一般来说，百分比值指的是例如按照Lim等在Cereal Chem.(1994)71，448中所述的方法测定的小麦淀粉的葡糖-6-磷酸(glu-6-P)含量约为0.3nmol glu-6-P/mg淀粉。因此，本发明的小麦淀粉包括至少0.4nmol/mg淀粉的葡糖-6-磷酸含量、更优选至少0.8nmol/mg淀粉的葡糖-6-磷酸含量、特别是至少1.0nmol/mg淀粉的葡糖-6-磷酸含量、尤其是至少约1.5nmol/mg淀粉的葡糖-6-磷酸含量且最优选至少3.0nmol/mg淀粉的葡糖-6-磷酸含量。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的淀粉显示出的降低的磷酸酯含量(磷酸一酯含量)为可获自相应未转化植物的淀粉的磷酸酯含量至少约5-20％、优选至少约21-50％、甚至更优选约为51-95％。因此，本发明的小麦淀粉显示出的葡糖-6-磷酸含量低于0.2nmol/mg淀粉、优选低于0.1nmol/mg淀粉、更优选低于0.05nmol/mg淀粉、特别是低于0.02nmol/mg淀粉、尤其是低于0.01nmol/mg淀粉且最优选低于0.001nmol/mg淀粉。
本发明的另一个目的是提供一种用于制备本发明R1-蛋白质或其衍生物或其部分的方法，该方法包括在允许表达所述R1-蛋白质或其衍生物或其部分的条件下培养本发明的转基因宿主细胞并从所述细胞和/或所述细胞的培养基中分离所述R1-蛋白质或其衍生物或其部分的步骤。
此外，本发明涉及由通过用于生产本发明的R1-蛋白质或其衍生物或其部分的方法可获得的本发明的核酸分子编码的R1-蛋白质(R1-多肽)或其衍生物或其部分，优选来源于小麦的R1-蛋白质或其衍生物或其部分，尤其是按照Seq.ID No.2和Seq.ID No.10的R1-蛋白质或其衍生物或其部分。
在本发明中，术语“确保转录和/或翻译的调节元件”优选具有诸如启动子、增强子、终止子等这样使细胞中的转录启动和/或终止的核酸分子(例如DNA和/或RNA)的含义。术语“确保转录和/或翻译的调节元件”还可以包括导致植物和/或植物细胞中受时间和/或区域(胚乳、根、块茎、叶、茎、种子、果实、质外体、液泡、细胞溶胶、质体、线粒体、溶酶体)限制的转录或可化学诱导的核酸分子。
为了在植物细胞中表达本发明的核酸分子，可以使用任意活性启动子。所述的启动子相对于所转化的植物细胞而言可以是同源或异源的，例如用于组成型表达的花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子(Odell等，Nature 313(1985)，810-812；Mitsuhara等，Plant andCell Physiology 37(1996)，49-59)或WO 94/01571-A1中描述的启动子构建体。合适的还有导致由例如就植物特定组织或部位而言有限表达这样的内源性和/或外源性因素(例如WO 93/07279-A1)确定/诱导的受区域和/或时间限制的表达的启动子(Stockhaus等，EMBO J.8(1989)，2245-2251)。优选在所转化植物中贮存淀粉的部位内具有活性的启动子。例如玉米、小麦和稻米谷粒或种子和马铃薯块茎等这样优选的植物部位用于表达本发明的核酸分子。为了转化马铃薯，可以使用块茎特异性B33-启动子(Rocha-Sosa等，EMBO J.8(1989)，23-29)。除启动子外，启动转录的DNA区还可以含有诸如所谓增强子-元件这样确保转录进一步增加的DNA序列。为了在植物细胞且特别是在小麦细胞中进行表达，可以使用下列启动子35S启动子(Odell等，上文；Mitsuhara等，上文)；遍在蛋白质启动子(US 5,614,399，Christensen等，Plant Mol.Biol.18(1992)，675-689；Takimoto等，Plant Mol.Biol.26(1994)，1007-1012；Corne jo等，PlantMol.Biol.23(1993)，567-581；Toki等，Plant Phys.100(1992)，1503-1507)；谷蛋白启动子(Leisy等，Plant Mol.Biol.14(1990)，41-50；Zheng等，Plant J.4(1993)，357-366；Kononowicz等，JointAnnual Meeting of The American Society of Plant Physiologistsand The Canadian Society of Plant Physiologists，Minneapolis，Minnesota，USA，1993年7月1日-8月4日；Plant Physiol.102(增刊)(1993)166；Zhao等，Annual Meeting of The AmericanSociety of Plant Physiologists，Pittsburgh，Pennsylvania，USA，1992年8月1-5日；Plant Physiol.99(增刊1)(1992)，85；Yoshihara等，FEBS Lett.383(1996)，213-218)；肌动蛋白启动子(McElroy等，Plant Cell 2(1990)，163-171)；cab-6启动子(Plant and Cell Physiology 35(1994)，773-778)；RTBV启动子(Yin等，Plant J.12(1997)，1179-1188)；CVMV启动子(Verdaguer等，Plant Mol.Biol.31(1996)，1129-1139)；rab 16B启动子(Plant Physiol.112(1996)，483-491)；psbD-C操纵子的启动子(To等，Plant and Cell Physiology 37(1996)，660-666)；Tpi启动子(Snowden等，Plant Mol.Biol.31(1996)，689-692)；Osgrpl启动子(Xu等，Plant Mol.Biol.28(1995)，455-471)；Ltp2启动子(Kalla等，Plant J.6(1994)，849-860)，ADH1启动子(Kyozuka等，Mol.Gen.Genet.228(1991)，40-48)和LHCP启动子(EMBO J.10(1991)，1803-1808)。
此外，术语“调节元件”还包括适合于终止转录和/或将聚腺苷酸尾添加到转录的核酸分子上的终止信号。终止信号的实例是包括来自土壤杆菌属的胭脂氨酸合酶基因(NOS基因)或章鱼氨酸合酶基因(Gielen等，EMBO J.8(1989)，23-29)的聚腺苷酸化信号的3’-非翻译区、来自大豆的贮存蛋白基因的3’-非翻译区或核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亚单位(ssRUBISCO)。任选地，术语“调节元件”包括例如确保本发明核酸分子在特定的组织(例如胚乳、叶、茎、块茎、分生组织、果实、根、种子)或细胞区室(例如细胞溶胶、质外体、质体、线粒体、液泡、溶酶体)中的转录和/或翻译的特异性定位的核酸分子。任选地，术语“调节元件”还包括例如确保本发明核酸分子受时间限制转录和/或翻译的核酸分子。此外，“调节元件”可以任选地以化学方式被触发。
一般使用确保所述核酸分子稳定整合入植物基因组的克隆载体将本发明的核酸分子、优选DNA或RNA分子引入植物细胞。为了将核酸分子引入高等植物，可应用大量含有大肠杆菌复制信号和例如pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184这样用于筛选转化细菌细胞的标记基因的克隆载体。通过使用一种或多种限制性内切核酸酶可以将本发明的核酸分子整合入载体的适当限制位点上。将获得的质粒用于转化例如大肠杆菌细胞。在合适的培养基中培养转化的细胞且随后收集并裂解，通过标准方法回收质粒DNA且一般通过限制酶切和/或序列分析来对其进行分析。在每一种操作后，可以将所述质粒DNA切割并将获得的DNA片段与其它DNA序列连接。为了将DNA引入植物宿主细胞，可应用大量转化方法和技术例如，通过使用根癌土壤杆菌或毛根土壤杆菌的T-DNA转化；原生质体融合；DNA注射；DNA电穿孔；和通过膜渗透(PEG)或通过生物(biolistic)方法和其它方法引入DNA。如果欲由转基因植物细胞再生完整植物，那么应含有选择标记基因。如果使用Ti-或Ri-质粒，例如为了转化植物细胞，那么应将Ti-或Ri-质粒T-DNA的至少右侧边缘、优选其右侧和左侧边缘与欲引入所述植物细胞作为侧翼区的多核苷酸连接。如果将土壤杆菌属用于转化，那么应将欲引入的DNA克隆到中间载体或二元载体中。由于序列与T-DNA的序列同源，所以可以通过同源重组将中间载体整合入土壤杆菌属的Ti-或Ri-质粒。所述的中间载体还含有转移T-DNA必不可少的vir-区。因为中间载体不能在土壤杆菌属中复制，所以辅助质粒可以将中间载体转移到土壤杆菌属中(接合作用)。二元载体可以在大肠杆菌和在土壤杆菌属中复制。它们含有选择标记基因和位于右侧和左侧T-DNA边缘区侧翼的接头或多接头。可以将它们直接转化入土壤杆菌属(Hoslters等，Mol.Gen.Genet.163(1978)，181-187)。用于转化土壤杆菌属的质粒进一步包括一种选择标记基因，例如允许选择转化的细菌的NPTII基因。该质粒可以包括例如对壮观霉素(Svab等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87(1990)，8526-8530；Sval等，Plant Mol.Biol.14(1990)，197-206)、链霉素(Jones等，Mol.Gen.Genet.91(1987)，86-91；Svab等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87(1990)，8526-8530；Svab等，Plant Mol.Biol.14(1990)，197-206)、膦丝菌素(De Block等，EMBO J.6(1987)，2513-2518)、草甘膦(Thompson等，EMBO J.6(1987)，2519-2523；Thompson等，Weed Sci.35(1987)，19-23(增刊))或潮霉素(Waldron等，Plant Mol.Biol.5(1985)，103-108)产生抗性的其它选择标记基因。土壤杆菌属宿主细胞应含有携带vir-区的质粒。vir-区对将T-DNA转移到植物细胞中是必不可少的。可以含有附加的T-DNA。将所转化的土壤杆菌属进一步用于转化植物细胞。
T-DNA在转化植物细胞中的应用描述在下列文献中EP-A-120516；HoekemaThe Binary Plant Vector System OffsetdrukkerijKanters B.V.，Alblasserdam(1985)，第V章；Fraley等，Crit.Rev.Plant.Sci.，4，1-46和An等，EMBO J.4(1985)，277-287。二元载体是商购的，例如pBIN19(Clontech Laboratories，Inc.，USA)。
为了将DNA转移到植物细胞中，可以将植物的外植体与根癌土壤杆菌或毛根土壤杆菌一起共培育。可以在允许选择转化细胞的合适的培养基(例如含有抗生素或杀生物剂等)中从感染的植物材料(例如叶片、茎节、根，还有原生质体或悬浮液培育的植物细胞)再生完整植物。对获得的植物筛选存在的引入的DNA。为通过使用例如生物(biolistic)方法或通过转化原生质体而引入外源DNA的其它可能性对本领域技术人员来说是公知的(例如，Willmitzer，L.，1993Transgenic plantsBiotechnology，A Multi-VolumeComprehensive Treatise(H.J.Rehm，G.Reed，A.Pühler，P.Stadler编辑)，Vol.2，627-659，VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge)。
通过根癌土壤杆菌由Ti-质粒-载体系统转化双子叶植物是一种完全确立的方法。还可以将土壤杆菌属用于转化单子叶植物(Chan等，Plant Mol.Biol.22(1993)，491-506；Hiei等，Plant J.6(1994)，271-282)。
用于转化单子叶植物的可供选择的方法有例如，通过生物(biolistic)手段转化；原生质体转化；部分通透细胞的电穿孔；通过玻璃纤维引入DNA。各种参考文献涉及玉米的转化(WO 95/06128-A1；EP-A-0 513 849；EP-A-0 465 875)。EP-A-292 435中描述了如何由无粘液的脆粒玉米愈伤组织作为原料获得能育植物的方法。Shillito等(Bio/Technology 7(1989)，581)以产生能够再生成完整植物的分化原生质体的愈伤组织悬浮液培养物作为原料。
就转化小麦而言，可以应用各种方法例如土壤杆菌属介导的基因转移(Hiei等，Plant J.6(1994)，271-282；Hiei等，PlantMol.Biol.35(1997)，205-218；Park等，J.Plant.Biol.38(1995)，365-371)；原生质体转化(数据见Gene transfer to plants，I.Potrykus，G.Spangenberg(编辑)，Springer-Verlag BerlinHeidelberg，1995，66-75页；Datta等，Plant Mol.Biol.20(1992)，619-629；Sadasivam等，Plant Cell Rep.(1994)，394-396)；生物(biolistic)手段(Li等，Plant Cell Rep.12(1993)，250-255；Cao等，，Plant Cell Rep.11(1992)，586-591；Christou，Plant Mol.Biol.81997，197-203)；和电穿孔(Xu等Gene transferto plants，I.Potrykus，G.Spangenberg(编辑)，Springer-VerlagBerlin Heidelberg(1995)，201-208)。
一旦将引入的DNA整合入植物细胞的基因组，则它通常被稳定地整合并保留在原始转化的细胞的后代基因组内。转化的细胞通常含有一种选择标记基因，它允许在有某些糖类、氨基酸、杀生物剂或例如卡那霉素、G 428、博来霉素、潮霉素或膦丝菌素这样的抗生素存在的情况下选择转化体。因此，各选择标记基因允许对照缺乏引入的DNA的细胞选择转化的细胞。
在选择后，在正常条件下培养所转化的细胞且使它生长成完整植物(McCormick等，Plant Cell Reports 5(1986)，81-84)。可以将所得的植物与具有相同转化的遗传性或不同遗传性的植物杂交育种。所得的个体或杂交体具有相应的表型特性。应使两代或多代生长以便确保无论哪一种表型特征均稳定且可转化。此外，应采集种子以便确保相应的表型或其它特性保留下来。
可获自植物细胞、可获自本发明的植物或可通过本发明方法获得的改性淀粉适合于大量工业化应用。基本上，可以将淀粉再划分成两个主要领域。一个领域包括淀粉的水解产物，另一个是所谓的天然淀粉。水解主要包括通过酶或化学方法获得的葡萄糖或葡聚糖组分。可以将它们用于进一步的工艺，诸如发酵和化学修饰。目前基本上使用淀粉葡糖苷酶以酶促方式进行淀粉的水解。通过使用较少量的水解用酶可以降低成本，这是因为淀粉的结构发生了改变，例如谷粒的表面积增加、因支化较少而导致可消化性改善或空间结构改变，其限制了所用酶进入。可以将所谓天然淀粉的应用再划分成下列领域(a)制备食品的应用淀粉是传统的各种食品的添加剂，其中它主要用于粘合水性添加剂的目的或使粘度增加或胶凝增加。重要的特征性特性是流动性和吸着性、溶胀温度和糊化温度、粘度和增稠性、淀粉的溶解性、透明度和糊结构、耐热性、抗剪强度和耐酸性、退减趋势、成膜能力、冷冻/融化阻力、可消化性以及与例如无机或有机离子形成复合物的能力。
(b)制备非食品的应用另一个主要应用领域是可以将淀粉用作各种生产过程中的辅助剂或用作工艺产品的添加剂。淀粉用作辅助剂的主要应用领域首先是造纸业和纸板工业。在该领域中，淀粉主要用于固定(保持固态)、用于上胶填料和细颗粒、作为固化物质并用于脱水。此外，应用有关劲度、硬度、固定性、手感、光泽、平滑性、撕裂强度以及表面积的淀粉的有利特性。
在纸的生产过程中，可以在4个应用领域即表面、涂布、团块和喷雾之间进行区分。
对有关淀粉表面处理的要求主要是高度的亮度、相应的粘度、高粘度稳定性、良好的成膜性以及形成较少的灰尘。当用于涂布固体内含物时，相应的粘度、高粘合能力和高色素亲合性起重要作用。作为团块的添加剂快速、均匀、无损耗分散、高机械稳定性和在纸浆中完全的保留性具有重要性。当将淀粉用于喷雾时，相应的固体含量、高粘度和高粘合能力也是重要的。一个主要的应用领域例如是在粘合剂工业中，其中将淀粉的应用领域再划分成4个领域用作纯淀粉胶、用于用特殊化学物质制备的淀粉胶、将淀粉用作合成树脂和聚合物分散体的添加剂以及将淀粉用作合成粘合剂的补充剂。将全部基于淀粉的粘合剂的90％用于生产波面纸板、纸囊和纸袋、纸和铝的复合材料、信封用盒和胶水、邮票等。
淀粉作为辅助剂和添加剂的另一个可能的应用是用于织物护理产品的生产过程中。在纺织工业中，可以在下列4个应用领域中进行区分将淀粉用作胶粘剂，即作为熨平和强化用于防止编织过程中主动张力和用于增加编织过程中耐磨性的去毛刺特性的辅助剂；作为主要在变质预处理后织物改善，诸如漂白、染色等的试剂；作为用于防止染料扩散的染料浆生产过程中的增稠剂；和作为用于缝线用缠绕剂的添加剂。
此外，可以将淀粉用作建筑材料的添加剂。一个实例是生产石膏板，其中薄石膏粉中混合的淀粉与水成膏状、在石膏板表面扩散且由此使纸板与所述石膏板粘合。其它应用领域是将淀粉与石膏粉和矿物纤维混合。在预拌混凝土中，可以将淀粉用于使上浆过程减速。
此外，淀粉有利地用于生产暂时防止土壤颗粒受到人为地层移动中水的影响的土壤稳定化工具。根据现有技术的知识，可以将由淀粉和聚合物乳液组成的组合产品看作与迄今为止所用产品具有相同的减侵蚀和减结壳作用；然而，它们相当低廉。
另一个应用领域是淀粉在用于改变这些制品的特殊特性的植物保护剂中的应用。例如，将淀粉用于改善植物防护剂和肥料的湿润性；用于活性组分的定量释放；用于将液体、挥发性和/或有气味的活性成分转化成微晶、稳定、可变形的物质；用于混合不相容的组成；和因分解较缓慢而用于延长作用期限。
还可以将淀粉用于药物、医疗和化妆品工业领域。在制药工业中，可以将淀粉用作片剂的粘合剂或用于稀释胶囊中的粘合剂。此外，淀粉适合用作片剂的崩解剂，这是因为在吞咽时它吸收液体并在短时后它溶胀到使活性成分释放。它也是一种达到时间延迟型释放活性成分的适宜助剂(阻滞作用)。由于性质上的原因，药用流动剂型(flowance)和撒粉是其它的应用领域。在化妆品领域中，例如，将淀粉用作诸如香料和水杨酸这样的粉末添加剂的载体。淀粉相对广泛的应用领域是牙膏。
将淀粉用作煤和煤砖的添加剂也是合适的。通过添加淀粉，煤可以定量地成块和/或团成高质量的煤砖，由此防止了煤砖的过早崩解。烧煤含有4-6％的添加淀粉、0.1-0.5％的热量煤。此外，淀粉适合用作粘合剂，因为向煤和煤砖中添加它可以明显减少毒性物质的散发。
此外，可以将淀粉用作加工矿石和煤泥中的絮凝剂。
另一个应用领域是将淀粉用作浇铸中加工物料的添加剂。就各种浇铸工艺而言，需要由混有粘合剂的砂子生产的芯。目前，最常用的粘合剂是混有改性淀粉，大部分是溶胀淀粉的膨润土。
添加淀粉的目的在于增加流阻和改善粘合强度。此外，溶胀淀粉可以满足生产工艺的其它先决条件，诸如在冷水中的分散性、再水化程度、在砂子中良好的混溶性和高度结合水的能力。
在橡胶工业中，可以将淀粉用于改善工艺和光学质量。由于这一原因就要求改善表面光泽、手感和外观。为了这一目的，在冷硫化前将淀粉分散在橡胶物质的粘性涂胶表面上。还可以将淀粉用于改善橡胶的可印性。
改性淀粉的另一个应用领域是生产皮革替代物。
在塑料市场上，正在涌现出下列应用领域将来源于淀粉的产物整合入加工过程(淀粉仅是填料，在合成聚合物与淀粉之间不存在直接粘合)或另一方面将来源于淀粉的产物整合入聚合物的产生过程中(淀粉和聚合物形成稳定的粘合)。
淀粉用作纯填料不能与诸如滑石这样的其它物质竞争。当特殊的淀粉特性变得有效且终产品的特性分布由此明显改变时，上述情况可以改变。一个实例是将淀粉产品用于加工诸如聚乙烯这样的热塑性材料。因此，通过共表达将淀粉和合成聚合物按1∶1的比例混合而形成母炼胶，由此可以通过使用成粒的聚乙烯的常规技术生产不同产品。聚乙烯薄膜中淀粉的整合可以使物质在空心体中的透性增加、水蒸汽渗透性改善、抗静电性能改善、防结块性能改善和使用含水染料的可印性改善。
另一种可能性是淀粉在聚氨酯泡沫塑料中的应用。由于淀粉衍生物的采用且由于加工技术的最优化，所以能够对合成聚合物与淀粉羟基之间的反应进行特定控制。结果是因应用了淀粉而使聚氨酯薄膜具有了下列特性分布热膨胀系数降低；收缩性能降低；压力/张力性能改善；水蒸汽渗透性增加而吸水性没有改变；可燃性和裂化密度降低；没有易燃部分溢出；不含卤化物且老化减少。目前仍然存在的缺陷在于压力和冲击强度降低。
薄膜产品的研发不再是唯一的选择。还可以产生诸如罐、盘子和碗这样具有50％以上淀粉含量的固体塑料产品。此外，淀粉/聚合物混合物提供了它们极易于生物降解的优点。
此外，由于它们比淀粉极强的结合水的能力，所以接枝聚合物已经获得了极大的重要性。这些产品是含有淀粉和按照自由基链机理接枝上的合成单体的侧链晶格的产品。目前可获得的淀粉接枝聚合物的特征在于改善的粘合和保留能力高达1000g水/g淀粉的高粘度。主要将这些超级吸收剂用于卫生保健领域，例如应用在诸如尿布和床单这样的产品中以及应用在例如种子颗粒这样的农业领域中。生物材料的寄存按照布达佩斯条约的要求将如本发明所述的下列质粒寄存在德国的Braunschweig的Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen(DSMZ)质粒pTaR1-11指的是1999年5月20日寄存的寄存号DSM No.12810。
质粒RS26-88指的是2000年5月24日寄存的寄存号DSM No.13511。
下列实施例仅用来解释本发明而不以任何方式来限定本发明。实施例1来自普通小麦L.，cv Florida的编码R1-蛋白质的cDN的制备为了鉴定和分离编码来源于小麦的R1-蛋白质的cDNA，通过使用λzap II载体(λZAP II-cDNA合成试剂盒，Stratagene GmbH，Heidelberg，Germany)、按照制造商的方案由21日龄小麦植物颍果(“含淀粉”-胚乳)聚腺苷酸化RNA制备小麦cDNA文库。该cDNA文库的原始滴度约为1.26×106pfu/ml。
使用寡核苷酸R1A和R1B作为对含有编码来源于玉米的R1-蛋白质的cDNA的质粒pBinAR Hyg(DSM 9505)DNA插入片段进行PCR(聚合酶链反应)扩增的引物来筛选cDNA文库。所述的质粒例如可按照WO98/27212的实施例14所述获得。因此，特别将WO 98/27212-A1的公开内容引入本文作为参考。
在对载体pBluescript进行Xba I/Asp 718限制内切核酸酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳和标准方案纯化cDNA片段。
作为用于对所述玉米cDNA片段进行PCR扩增的模板，使用约10pg的上述分离的玉米cDNA片段。
PCR缓冲液含有1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCL(pH 8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM引物R1A、1μM引物R1B和2.5个单位的Taq聚合酶。
R1A5’TATTGGAAGCTCGAGTTGAAC 3’(Seq.ID No.3)R1B5’TTGAGCTGTCTAATAGATGCA 3’(Seq.ID No.4)按照下列方案在TrioblockPCR-热循环仪(Biometra，Germany)中进行PCR循环以便扩增编码来源于玉米的R1-蛋白质的cDNA片段95℃下4分钟；96℃下1分钟；62℃下45秒；72℃下1分15秒；共30个循环；和72℃下5分钟。
随后，按照制造商的方案(Boehringer Mannheim，DIG系统用户指南)将获得的片段进行随机引导的毛地黄毒苷(digoxygenin)标记。
将1924bp的扩增和标记的cDNA片段进一步用作筛选上述制备的来源于小麦的cDNA文库的异源探针。
按照标准方案筛选约3.5×105噬菌体。
在55℃下的5×SSC、3％阻断液(Blocking)(BoehringerMannheim)、0.2％ SDS、0.1％月桂基肌氨酸钠和50μg/ml青鱼精子DNA中预杂交后，将该滤膜与1ng/ml毛地黄毒苷(digoxygenin)标记的(随机引导的DNA标记试剂盒)r1-蛋白质探针(1924 bp的玉米Xbal/Asp718 cDNA片段)杂交过夜。在室温下将该滤膜用2×SSC、1％ SDS洗涤2次、共5分钟；在55℃下用1×SSC、0.5％ SDS洗涤2次、共10分钟；并在55℃下用0.5×SSC、0.2％ SDS洗涤2次、共10分钟。
重新筛选并纯化阳性克隆。按照制造商的方案(Stratagene，Heidelberg)通过体内切除分离质粒(pBluescript SK Phagemide)。在通过限制分析对所述克隆进行特征记述后，进一步分析最长的cDNA插入片段。实施例2pTaR1-11的cDNA插入片段的序列分析按照双脱氧核苷酸方法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74(1977)，5463-5467)分析所分离的克隆pTaR1-11的cDNA插入片段的核苷酸序列。
克隆pTaR1-11含有672bp的插入片段，该片段代表编码按照Seq.ID No.2的来源于小麦的R1-蛋白质的按照Seq.ID No.1的部分cDNA。
Seq.ID No.1的多核苷酸的相应氨基酸序列在Seq.ID No.2中给出。实施例3来自普通小麦L.cv Florida的编码R1-蛋白质的cDNA的分离和序列鉴定为了鉴定和分离编码来自小麦的R1-蛋白质的cDNA，从来自小麦的3-6周龄的老叶中分离聚腺苷酸化RNA并使用RT-PCR-试剂盒(Titan One tube RT-PCR System，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)、按照制造商的方案对其进行反转录。使用寡核苷酸Zm-R1-2(Seq.ID No.5)和Wh-R1-5(Seq.ID No.6)和作为模板的RT-反应物的等分部分进行编码R1-蛋白质的cDNA的扩增。
将下列引物选作用于分离编码R1蛋白质的所需DNA的杂交探针引物结合位点定位于Seq.ID NOs.7和9中的1-24位和3402-3418位上Zm-R1-2(Seq.ID No.5)5’-CTG TGG TCT TGT CTG GAC-3’Wh-R1-5’(Seq.ID No.6)5’-GAG GAA GCA AGG AAG GAA CTG CAG-3’按照Eppendorf MastercyclerTM梯度(Eppendorf，Hamburg，Germany)进行PCR-反应且该反应中含有10mM Tris-HCl pH 8.85、25mM KCl、5mM(NH4)SO4、1.5mM MgSO4、0.8mM dNTPs、1μM引物Zm-R1-2、1μM引物Wh-R1-5和1个单位的Pwo-DNA-聚合酶。进行下列温度程序开始在94℃下2分钟；然后在94℃下1分钟、在55℃下1分钟且在72℃下3分钟，共计35个循环；和最后在72℃下5分钟的步骤。将获得的3.4 kb DNA-片段克隆入pBluescript SK(-)载体的EcoRV-位点，从而产生质粒RE 23-88，与GATC GmbH(Konstanz，Germany)配合进一步分析其核苷酸序列且如SEQ ID No.7所述。它代表其中5’-端的～1kb和3’-端的～300bp缺失的R1-基因的主要部分。缺失的3’-区与如实施例1和2中所述的部分R1-cDNA克隆的相应区互补，从而产生质粒RS 26-88且包括SEQ ID No.9。为了获得它，用限制性内切核酸酶Ec/136消化克隆RS 23-88。将所得的大片段用于进一步克隆，而弃去较小的140bp片段。用限制性内切核酸酶Xhol处理来自实施例1和2的含有来自小麦的R1 cDNA 3’-区的克隆TaR1-11，使用T4-DNA-聚合酶将限制位点填补成平端并通过用限制性内切核酸酶Ec/136消化使来自小麦的R1 cDNA的3’-区从载体中释放出来。将这种产生的片段连接到Ec/136消化的RS 23-88的平端上。通过限制酶切分析控制所连接片段的方向。通过经GATC GmbH(Konstanz，Germany)进行的序列分析再次测定完整cDNA克隆(～3.7kb)的一级结构且如SEQ IDNo.9所述。
序列表序列表<110>Aventis CropScience GmbH<120>来自小麦的核酸分子、转基因植物细胞和植物及其在生产改性淀粉中的应用<130>AGR 1999/M 214<150>DE 199 26 771.5<151>1999-06-11<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>672<212>DNA<213>普通小麦<220><221>CDS<222>(3)..(449)<400>1ct gaa gtg gtg aaa gga ctt gga gag aca ctt gtg gga gct tat cct47Glu Val Val Lys Gly Leu Gly Glu Thr Leu Val Gly Ala Tyr Pro1 5 10 15ggc cgt gcc atg agc ttc gtg tgt aag aaa gat gac ctt gac tct ccc 95Gly Arg Ala Met Ser Phe Val Cys Lys Lys Asp Asp Leu Asp Ser Pro20 25 30aag gta ctg ggt tac cct agc aag cca att ggt ctc ttc ata aag cgg 143Lys Val Leu Gly Tyr Pro Ser Lys Pro Ile Gly Leu Phe Ile Lys Arg35 40 45tca atc atc ttc cgc tca gac tct aat ggt gag gat ctg gaa ggt tac 191Ser Ile Ile Phe Arg Ser Asp Ser Asn Gly Glu Asp Leu Glu Gly Tyr50 55 60gct gga gca ggg ctg tat gat agt gtc cct atg gat gtg gaa gat gaa 239Ala Gly Ala Gly Leu Tyr Asp Ser Val Pro Met Asp Val Glu Asp Glu65 70 75gtt gta ctc gac tac acg acc gac cct ctc atc act gac tct gga ttc 287Val Val Leu Asp Tyr Thr Thr 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权利要求
1.一种编码R1-蛋白质或R1-蛋白质的部分或衍生物的核酸分子，它选自下列核酸分子组成的组(a)编码包括选自Seq.ID No.2和Seq.ID No.10组成的组的多肽的R1蛋白质的核酸分子或其部分或其衍生物；(b)编码选自Seq.ID No.1和Seq.ID No.9组成的组的核酸分子或其部分或其衍生物；(c)包括选自按照DSM号12810的质粒pTa R1-11和按照DSM号13511的质粒RS26-88组成的组的cDNA插入片段编码区的核酸分子或其部分或其衍生物；(d)编码一种多肽的核酸分子或其部分或其衍生物，所述多肽包括由cDNA插入片段编码的多肽，所述的cDNA插入片段选自按照DSM号12810的质粒pTa R1-11和按照DSM号13511的质粒RS26-88组成的组。
2.一种根据权利要求1的核酸分子，它包括一个或多个确保细胞中转录和/或翻译的调节元件。
3.一种根据权利要求1-2中一项或多项的核酸分子，它是DNA分子。
4.一种根据权利要求1-2中一项或多项的核酸分子，它是RNA分子。
5.一种包括权利要求1-4中一项或多项的核酸分子的载体。
6.根据权利要求5所述的载体，它包括一个或多个确保细菌和/或植物细胞中转录和/或翻译的调节元件。
7.一种转基因宿主细胞，它包括根据权利要求1-4中一项或多项的核酸分子和/或根据权利要求5-6中一项或多项的载体。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，它是植物细胞。
9.一种用于制备根据权利要求7-8中一项或多项的转基因细胞的方法，该方法包括将根据权利要求1-4中一项或多项的核酸分子和/或根据权利要求5-6中一项或多项的载体引入原核细胞或真核细胞的基因组中的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述的细胞是植物细胞。
11.一种包括权利要求8所述宿主细胞的转基因植物。
12.一种用于生产根据权利要求11的植物的方法，该方法包括将根据权利要求1-4中一项或多项的核酸分子和/或根据权利要求5-6中一项或多项的载体引入植物细胞并从该植物细胞再生完整植物的步骤。
13.一种来自权利要求11所述植物的繁殖材料。
14.一种来自权利要求11的转基因植物的种子。
15.一种用于生产淀粉的方法，该方法包括将根据权利要求8的植物细胞、根据权利要求11的植物、根据权利要求13的繁殖材料和/或根据权利要求14的种子引入用于生产淀粉的工艺中的步骤。
16.一种可获自根据权利要求8的植物细胞、根据权利要求11的植物、根据权利要求13的繁殖材料和/或根据权利要求14的种子或可用权利要求15的方法获得的淀粉。
17.一种用于生产改性淀粉的方法，该方法包括将根据权利要求16的淀粉引入对淀粉进行化学和/或物理修饰的工艺中的步骤。
18.一种用于生产Seq.ID No.2和Seq.ID No.10的R1-多肽或其衍生物或其部分的方法，该方法包括在允许表达蛋白质的条件下培养根据权利要求7-8中一项或多项的宿主细胞并从所述细胞和/或培养基中分离所述R1-多肽的步骤。
19.一种由根据权利要求1-4中一项或多项的核酸分子编码的R1-多肽或其衍生物或其部分。
20.根据权利要求19的R1-多肽在生产单克隆抗体或多克隆抗体中的应用。
21.根据权利要求1-4中一项或多项的核酸分子或其衍生物或其部分在筛选核酸文库和/或作为杂交探针中的应用，所述的核酸分子或其衍生物或其部分任选地被标记。
22.根据权利要求1-4中一项或多项的核酸分子或其衍生物或其部分在制备转基因细胞或转基因植物中的应用。
全文摘要
本发明描述了编码来自小麦的R1－蛋白质的核酸分子和用于生产可合成改性淀粉的转基因植物细胞和植物的方法和重组DNA分子。另外，本发明描述了由这些方法产生的植物细胞和植物以及可从中获得的淀粉。
文档编号C12N9/00GK1402789SQ00808513
公开日2003年3月12日 申请日期2000年6月2日 优先权日1999年6月11日
发明者G·阿贝尔, H·罗尔兹, S·鲁缇克, R-C·施密特 申请人:阿温提斯作物科学有限公司