参与外遗传基因沉默的基因的制作方法

专利名称：参与外遗传基因沉默的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码调控基因沉默、特别是植物基因沉默的蛋白质的DNA。
在对发育、环境或未知信号的反应中可以观察到植物中先前活跃的基因表达的丧失，也称为基因沉默。虽然其发生的频率比突变高，但在体细胞传递过程中显著稳定。基因沉默，最初被认为是转基因表达不稳定的有害起因，现在则被看作是有目的地调控基因表达的分子工具。
看来，受影响座位的染色体位置或结构可能是决定沉默频率和强度的因素。失活似乎偏向于影响存在多拷贝的基因，并被认为是序列冗余的结果。同源依赖性的基因沉默的许多实例已有报道。进一步分析可根据受影响座位的相对位置(顺式、反式、等位、异位)、受影响基因的来源(内源的或转基因的)和相互作用的水平(转录或转录后)对沉默事件进行分类。尽管转录后沉默看起来主要包括形成异常RNA分子和偶然而非必然地伴随DNA甲基化，但干扰转录起始的沉默与DNA的高度甲基化、而且可能与沉默座位的染色质结构改变紧密关联。然而，不清楚这些分子事件是基因沉默的前提还是沉默状态的结果。
就转录沉默而言，沉默基因的失活状态通过有丝分裂和减数分裂稳定传递。同在其它生物中一样，反式作用修饰基因座位(modifier locus)可能负责沉默基因失活状态的稳定性。料想导致突变蛋白的这些座位的突变可能通过干扰沉默状态的维持或不能识别序列冗余而导致减少的基因沉默以及先前沉默座位的再活化。已经报道拟南芥(Arabidopsisthaliana)DDM1基因中的突变使基因沉默解除，并且该基因编码参与染色质重塑(remodeling)的SWI2/SNF2样的蛋白。但是，DDM1基因的突变引起严重的多效性效应。因此，为了能够使用基因技术改变这种效应，有必要鉴定更多的特异性修饰基因座位并表征相应的野生型和突变型蛋白。本发明的主要目的是提供包含编码这种蛋白的可读框的DNA。
对于带有可遗传地失活的、甲基化的潮霉素抗性基因的鼠耳芥属(Arabidopsis)株系，可通过实施例1描述的T-DNA插入诱变来鉴定根据本发明的反式作用修饰基因座位。沉默修饰基因座位的突变导致潮霉素抗性基因沉默的解除并恢复潮霉素抗性。用不同于潮霉素抗性基因的选择标记基因转化沉默的抗性基因纯合的植物，该选择标记基因受T-DNA1′-2′二元启动子的控制。选择转化体并筛选其后代的潮霉素抗性。筛选与特定T-DNA插入片段遗传共分离的突变表型(潮霉素抗性)。使用重组DNA技术的常规方法克隆标签化基因，可表征沉默修饰基因座位的突变型和野生型DNA序列及编码的蛋白。
在本发明中，提到基因应理解为是指与调控序列相连的DNA编码序列，该调控序列可使编码序列转录成RNA如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正义RNA或反义RNA。调控序列的实例为启动子序列、5′和3′非翻译序列、内含子和终止序列。
启动子理解为启始相关DNA序列转录的DNA序列，也可包括作为基因表达调控器的元件如激活子、增强子或阻遏子。
基因的表达指在活细胞内基因转录成RNA或基因转录及随后翻译成蛋白质。就反义结构而言，表达仅指反义DNA的转录。
术语转化细胞指将核酸导入宿主细胞，特别是DNA分子稳定整合到所述细胞的基因组中。
特定核苷酸或氨基酸序列的任一部分或片段称为成分序列。
根据本发明的DNA含有编码蛋白质的可读框，该蛋白质的特征为氨基酸序列含有与SEQ ID NO3有40％或更多一致性的、至少有150个氨基酸残基的成分序列。具体地，该可读框编码的蛋白可用式R1-R2-R3来描述，其中--R1、R2和R3构成由从氨基酸残基组Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg和His中独立选择的氨基酸残基组成的成分序列，--R1和R3由0-3000个氨基酸残基独立组成；--R2由至少150个氨基酸残基组成；且--R2与SEQ ID NO3的对比成分序列至少有40％相同。
大多数情况下该蛋白的总长在1000-3000氨基酸残基的范围内。在本发明优选的实施方案中成分序列R2由至少200个氨基酸残基组成。成分序列R2的具体实例为下列氨基酸范围所代表的SEQ ID NO3的成分序列1-416(相应于外显子2)；418-583(相应于外显子3-5)；584-890(相应于外显子6)；892-1472(相应于外显子7-9)；1007-1472(相应于外显子9)；1473-1631(相应于外显子10-12)；1632-1827(相应于外显子13-15)；和1829-2001(相应于外显子16)。
在本发明优选的实施方案中，成分序列R1和R3中至少有一个含有一个或多个长度至少为50个氨基酸、并与SEQ ID NO3的对比成分序列至少60％一致的额外成分序列。这类额外成分序列的具体实例为下列氨基酸范围所代表的SEQ ID NO3的成分序列420-525(相应于外显子3和4)；444-525(相应于外显子4)；526-583(相应于外显子5)；892-971(相应于外显子7)；892-1006(相应于外显子7和8)；1473-1524(相应于外显子10)；1525-1576(相应于外显子11)；1577-1631(相应于外显子12)；1632-1690(相应于外显子13)；1692-1757(相应于外显子14)；和1758-1827(相应于外显子15)。
根据本发明DNA的特别优选的实施方案编码具有由SEQ ID NO3的氨基酸478-490、584-600、617-630、654-668、676-690、718-734、776-788、1222-1233、1738-1749或1761-1770限定的成分序列的蛋白。优选地，该编码蛋白含有至少两个、三个或更多所述成分序列的不同代表。所述实施方案的具体实例编码可用SEQ ID NO3的氨基酸序列、用氨基酸残基K替代SEQ ID NO3的705位的M或用氨基酸残基D替代SEQID NO3的1219位的E的等位氨基酸序列表征的蛋白。
动态程序设计算法产生不同种类的对比。序列对比通常有两种方法。Needleman和Wunsch及Sellers提出的算法对比两个序列的全长，提供序列的总体对比。另一方面Smith-Waterman算法产生局部对比。选择计分矩阵和空位罚分后，局部对比序列中最相似的区域对。这使得数据库的搜索集中在序列的最高保守区。它也可对比待鉴定序列中的相似区域。为了提高使用Smith-Waterman算法对比的速度，BLAST(局部对比搜索基础工具)和FASTA在对比时都加了额外的限制。
在本发明中使用BLAST方便地进行对比，BLAST是一套相似性搜索的程序，设计用来探测所有提供的序列数据库，无论查询的是蛋白还是DNA。该搜索工具的BLAST 2.0版(Gapped BLAST)已在互联网(目前的http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)向公众发布。它使用寻求局部对比而非总体对比的启发式算法，因此能够检查仅共享隔离区域的序列间的关系。BLAST搜索中的对比得分有明确的统计学解释。在本发明范围内特别有用的是可在局部序列对比中导入空位的blastp程序和PSI-BLAST程序(这两种程序将查询的氨基酸序列与蛋白序列数据库比较)，以及只能对两个序列进行局部对比的blastp变异程序。优选将任选参数设定为默认值来运行所述程序。
使用BLAST的序列对比也可考虑一种氨基酸被另一种氨基酸所替代是可能保留维持蛋白结构和功能所必需的物理化学特性，还是更可能破坏蛋白的基本结构和功能特征。与相同氨基酸的百分率比较，这种序列相似性按照“阳性”氨基酸的百分率来定量，并且在两可的情况中有助于将蛋白归属于正确的蛋白家族。
使用这些计算机程序的序列对比揭示了ATP/GTP结合基元A(SEQ IDNO3中的460-467位氨基酸)的存在，其共有序列为(Ala/Gly)XaaXaaXaaXaaGlyLys(Ser/Thr)，其中(Ala/Gly)指Ala或Gly，Xaa指任意天然存在的氨基酸，(Ser/Thr)指Ser或Thr。对比还揭示了一个区域(SEQ ID NO3中的479-719位氨基酸)，其与参与染色质重塑的SWI2/SNF2家族蛋白的部分ATP酶/解旋酶结构域相似，但与已知蛋白没有显著的全序列一致性。
根据本发明的具体DNA实例在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中有描述，其编码SEQ ID NO3描述的鼠耳芥属蛋白。对比后，长50-500个氨基酸的SEQ ID NO3的序列片段显示与已知蛋白序列的片段有20-50％的序列一致性。然而，SEQ ID NO3的总体对比导致低于30％的序列一致性。因此，本发明定义了一个新的蛋白家族，其成员的特征为其氨基酸序列含有与SEQ ID NO3的对比成分序列有40％或更多一致性的、至少150个氨基酸残基的成分序列。优选该氨基酸序列一致性高于50％或甚至高于55％。
编码属于本发明新蛋白质家族的蛋白的DNA可从单子叶和双子叶植物分离。优选来源为谷物、甜菜、向日葵、冬油菜、大豆、棉花、小麦、稻、马铃薯、嫩茎花椰菜、花椰菜、甘蓝、黄瓜、甜玉米、日本萝卜(daikon)、蚕豆、莴苣、甜瓜、胡椒、南瓜、番茄或西瓜。但它们也可由哺乳动物来源如小鼠或人的组织中分离。本领域技术人员知晓，可使用以下普通方法来适应特定的任务。由至少15个，优选20-30个或甚至多于100个连续核苷酸组成的SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的单链片段可用作探针来筛选DNA文库中与所述片段杂交的克隆。杂交要注意的要素在Sambrook等在(分子克隆实验室手册》(Molecular cloningAlaboratory manual)，冷泉港实验室出版社，9.47-9.57和11.45-11.49章，1989)中有描述。测定杂交克隆的序列并纯化含有如下完整编码区的克隆的DNA，该编码区编码蛋白的特征为其氨基酸序列含有与SEQ ID NO3有40％或更多一致性的至少有150个氨基酸残基的成分序列。然后，所述DNA可用许多常规重组DNA技术如限制酶消化、连接或聚合酶链式反应分析进一步处理。
SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的公开使本领域技术人员能够设计用于如下聚合酶链式反应的寡核苷酸，该反应试图从包含核苷酸序列的模板扩增DNA片段，其中核苷酸序列的特征为SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中的15个、优选20-30个或更多碱基对的任意连续序列。所述核苷酸含有代表SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的15个并且优选20-30个或更多碱基对的核苷酸序列。使用至少一个这种核苷酸进行的聚合酶链式反应以及其扩增产物构成本发明的另一个实施方案。
实施例实施例1T-DNA插入在Mittelsten Scheid等，Mol Gen Genet 228104-112，1991和Mittelsten Scheid等，Proc Natl Acad Sci USA 937114-7119，1996中描述了携带含有多拷贝嵌合潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的转录沉默座位的拟南芥苏黎世生态型(ecotype Zürich)转基因株系A。通过植物真空浸入(in planta vacuum infiltration)(Bechtold等，C R Acad SciParis Life Science 3161194-1199，1993)对所述株系纯合二倍体基因型进行农杆菌介导的基因转移，产生4000个以上的独立T-DNA转化体。Mengiste等(Plant J 12945-948，1997)描述了带有由转录融合到1′启动子的bar基因编码区组成的T-DNA的二元载体(p1′barbi)、农杆菌株(C58CIRifR)和转化方案。通过用Basta溶液(150mg/l)反复喷洒萌发的幼苗来选择转化体(T1植物)并使其生长成熟。
实施例2突变体选择从各转化体收获自交种子(T2家族)。在筛选沉默表型的回复突变体之前，种子在室温下干燥1周并在4℃冷处理最少1周。大约1000粒种子的混合等分试样(由来自20个T2家族的50粒种子组成)表面灭菌7分钟两次(用含有0.1％Tween 80的5％次氯酸钠)，并用灭菌双蒸水冼涤。每一等分试样放入含有75ml用0.8％琼脂固化并含有10mg/l潮霉素B(Calbiochem)的萌发培养基(按照Masson等，Plant J 2829-933，1992)的14-cm培养皿中用于选择。为了确保在播种时平均分配，将种子与30ml含有0.4％琼脂的相同培养基混合。作为阳性对照，来自潮霉素抗性株系的两粒种子播种在每个培养皿的标记位置。平板在4℃冷处理2天，随后让其接受21℃光照16小时和16℃黑暗8小时的交替周期。播种后每天估计潮霉素抗性，共8-15天。
实施例3突变体的分子和遗传分析鉴定了其中一份混合试样的11株潮霉素抗性幼苗之后，对形成该混合库的家族重新进行个别筛选。一个家族含有大约25％的潮霉素抗性幼苗。将该家族的6株抗性幼苗转移到更大的含有无潮霉素的萌发培养基的容器中。在花结形成和根系发育之后，将植物转移到土壤中进一步生长并形成种子。在盆栽之前，从每株植物中取出组织外植体，使其在含有或不含10mg/l潮霉素B的RCA培养基(表1)上产生愈伤组织培养物。愈伤组织培养物用作DNA和RNA分析的材料来源并用于进一步证实该组织中的潮霉素抗性。
使用Mittelsten Scheid等描述的(Mol Gen Genet 224325-330，1994)基于CTAB的方法分离基因组DNA，并与限制酶BamhI，HpaII，MspII，DraI，EcoRV，RcaI或HindIII一起孵育。使用RNAeasy试剂盒(Qiagen)根据厂商的说明获得总RNA。使用通过随机引发标记用32P标记的DNA片段，在Church和Gilbert(Proc Natl Acad Sci USA 811991-1995，1984)描述的条件下进行Southern和Northern杂交分析。hpt基因的编码区、或由P35S启动子、hpt编码区和终止子区组成的DNA、或bar基因的编码区和1′启动子用作探针。
4个潮霉素抗性姊妹株的Northern杂交分析显示了hpt基因转录的恢复。所述姊妹株的Southern杂交分析表明在复合的hpt插入片段内部没有可检测的重排。通过用甲基化敏感限制酶HpaII和MspI的Southern杂交分析以及用硫酸氢盐处理后对启动子区进行基因组测序，可以叛定突变体中hpt转基因复合体象原始株系A中一样仍为高度甲基化的。与som突变中观察到的相反，该突变对重复基因组DNA的甲基化也没有影响。
潮霉素抗性植株和来自同一家族非选择的姊妹株生长产生种子，在下一代中检查Basta抗性，并通过Southern分析记录T-DNA插入片段的数目和大小。结果证明初始T-DNA转化体一定含有2个在姊妹株中独立分离的T-DNA插入片段。一个插入片段与潮霉素抗性突变体表型共分离。用该插入片段纯合并缺少另一个T-DNA插入片段的植株来克隆相应的T-DNA插入位点。
对突变表型的植株与含有携带多拷贝嵌合β-葡糖醛酸糖苷酶(gus)基因的转录沉默座位的拟南芥哥伦比亚生态型(ecotype Colombia)转基因植物株系GUS-TS(可获自Dr.H.Vauccheret，INRA，Versailles Cedex，法国)之间的杂种进行组织化学GUS染色，揭示了在mom等位基因纯合的F2代中沉默GUS基因的再活化。
moml突变表型的植株近交即使在近交第9代中也不导致任何形态学上的异常。这与som突变体相反。
由于在F1杂种中导入野生型MOM等位基因，mom1突变表型与株系A(见实施例1)的回交导致重新活化的hpt基因的立即再沉默。这也与som突变体相反。
表1RCA培养基的组成RCA培养基MS macro 10× 100mlB5 micro 1000× 1ml柠檬酸铁5mlNT维生素100× 10ml蔗糖10gMES 5ml琼脂10gNAA 0.1mgBAP 1mgpH5.8(KOH)加至1升MS macro 10×硝酸钾 19g硝酸铵 16.5g氯化钙(×2H2O) 4.4g硫酸镁(×7H2O) 3.7g磷酸二氢钾 1.7g加至1升B5 micro 1000×硫酸镁(×H2O) 1000mg硼酸 300mg硫酸锌(×7H2O) 200mg碘化钾 75mg钼酸钠(×2H2O) 25mg硫酸铜(×5H2O) 2.5mg氯化钴(×6H2O) 2.5mg加至100ml柠檬酸铁柠檬酸铁铵 10g加至1升NT维生素100×肌醇 1000mg盐酸硫胺素 10mg加至1升MESMES14gpH6(NaOH)加至100ml
实施例4“沉默基因”的克隆从仅含有与潮霉素抗性突变表型共分离的T-DNA的植株中分离基因组DNA。使用靠近T-DNA右边界指向外侧的3个特异性巢式引物(5′-CAT CTACGG CAA TGT ACC AGC-3′(SEQ ID NO4)，5′-GAT GGG AAT TGG CTG AGTGGC-3′(SEQ ID NO5)，5′-CAG TTC CAA ACG TAA AAC GGC-3′(SEQ ID NO6))，和可能与旁侧植物DNA结合的几个简并性引物中的一个，对该DNA进行根据Liu等(Plant J 8457-463，1995)的TAIL(热不对称交织)PCR。实际上下面7个简并性引物中的2个可导致特异性片段的扩增。AD15′-NTC GAS TWT SGW GTT-3′(Liu等，同上；SEQ ID NO7)AD25′-NGT CGA SWG ANA WGA A-3′(Liu等，同上；SEQ ID NO8)AD35′-WGT GNA GWA NCA NAG A-3′(Liu等，同上；SEQ ID NO9)AD45′-WGG WAN CWG AWA NGC A-3′(SEQ ID NO10)AD55′-WCG WWG AWC ANG NCG A-3′(SEQ ID NO11)AD65′-WGC NAG TNA GWA NAA G-3′(SEQ ID NO12)AD75′-AWG CAN GNC WGA NAT A-3′(SEQ ID NO13)使用AD7获得的较大的片段被克隆和测序。它含有50bp的T-DNA和275bp的旁侧植物DNA。Southern杂交分析显示该PCR片段含有位于T-DNA旁侧的植物DNA。用该PCR片段筛选野生型拟南芥哥伦比亚生态型的基因组文库(Stratagene)。鉴定了三个与此PCR片段杂交的基因组克隆。这些基因组克隆进一步用限制酶作图，与PCR片段杂交并互相对比。在获得的其中一个基因组克隆(p4A-11)中，插入突变的T-DNA的旁侧序列大约位于基因组序列的中部。使用pA4-11的大约800bp的EcoRI-SalI片段来获得重叠的基因组克隆p5-6，并且使用p5-6的大约700bp的EcoRI片段来获得与p5-6重叠的基因组克隆p30-1。使用p30-1的大约700bp的HindIII片段来获得与p30-1重叠的基因组克隆p33-19。对所述克隆进行测序用来设计RT-PCR的引物。进一步使用p5-6的大约700bp的EcoRI片段来筛选根据Elledge等(Proc Natl Acad Sci USA 881737-1735，1991)的野生型拟南芥苏黎世生态型cDNA文库。得到了9个cDNA克隆，并测定了长度为2.6kb的最长克隆p17-8的序列。实施例5序列分析和对比考虑到上述克隆的鼠耳芥属沉默基因很大，由于克隆步骤产生的突变或由于测序反应的不确定性，不能完全排除该基因和蛋白真实的核苷酸和氨基酸序列可能与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3给出的序列在几个位置有偏差。另外，来自不同生态型的DNA序列可显示等位基因的不同。因此，SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3代表了拟南芥苏黎世生态型的相应基因和蛋白，而从拟南芥哥伦比亚生态型获得的基因组序列显示在SEQ ID NO1第4338位(A替代T)和6721位(T替代G)核苷酸的两处错配，其导致氨基酸残基K替代了SEQ ID NO3第705位的M以及氨基酸残基D替代了SEQ ID NO3第1219位的E。
顺序地从两端对2.6kb的cDNA克隆进行序列分析，结果显示其含有一个大的ORF和3′非翻译序列。
对基因组克隆的分析表明，克隆p4A-11和p5-6含有比cDNA序列的同源序列和7个内含子序列。比较基因组序列与T-DNA插入片段的旁侧DNA序列，表明T-DNA的插入引起大约2kb的基因组DNA的缺失。缺失的5′端位于一个内含子(内含子12)中，缺失的3′端位于cDNA 3′端的下游。此cDNA克隆的5′端序列在基因组克隆p5-6的中部终止。进行三个独立的巢式RT-PCR来获得更上游的另外的cDNA序列。这些RT-PCR使用的引物序列如下RT1-15′-CTGTACATACTGAGTACAATCGGA-3′(SEQ ID NO14)RT1-25′-GCTTCAATTCCTGCCTCAGTTGAAC-3′ (SEQ ID NO15)RT1-35′-CTCTACGTGCTTAACATCATGCGA-3′(SEQ ID NO16)RT1-45′-CCAGCTTCTGCTACTAGAAAGTCAG-3′ (SEQ ID NO17)RT2/3-1 5′-CTGGAGTTGCATGAAATCCTGGATG-3′ (SEQ ID NO18)RT2/3-2 5′-GCTCTTTGTAAGCTGTTCACGAGAC-3′ (SEQ ID NO19)RT2-35′-TCGCATGATGTTAAGCACGTAGAG-3′(SEQ ID NO20)RT2-45′-GAGTACTGGTCCGTGAACAGGTAAT-3′ (SEQ ID NO21)
RT3-35′-ATGCTTGCACAAGCATGGTCGGAAA-3′(SEQ ID NO22)RT3-45′-TGCAACATCGTGCATTTGCTCCAGA-3′(SEQ ID NO23)RT4-15′-CACAAGCATGAGTTTTTCCTTCCGG-3′(SEQ ID NO24)RT4-25′-CTGACTTTCTAGTAGCAGAAGCTGG-3′(SEQ ID NO25)发现这些基因组克隆的几部分序列存放在鼠耳芥属数据库中(登录号B67281，B62563，B20434，B20425，B21274，B08967，B11993，B20116，B12496和B10852为BAC的末端序列，Z18494和AA597930为部分cDNA序列，1999年4月13日)。该编码蛋白序列与Swiss Protein数据库的比较揭示了其与SWI2/SNF2家族的ATP酶/解旋酶的部分相似性(SEQ IDNO3的第479-719位的氨基酸)。该编码的蛋白由2001个氨基酸组成，并且计算的分子量为219kD，等电点为5.1。在该编码蛋白上发现了一个ATP/GTP-结合基元(SEQ ID NO3的第460-467位的氨基酸)和三个核定位基元(SEQ ID NO3的第362-367、832-838和858-862位氨基酸)。对HA-标签化的MOM蛋白的亚细胞免疫检测证实了其核定位。也检测到了与鸡张力蛋白的肌动蛋白结合域的相似性(SEQ ID NO3的第1899-1941位的氨基酸)和预测的跨膜结构域(SEQ ID NO3的第995-1015位的氨基酸)。另外，该编码蛋白含有基本由SEQ ID NO3的第177-350、1462-1672和1848-1894位氨基酸限定的三种类型的重复区域或内部重复。实施例6其它种属的同源基因推定的显示与MOM蛋白有部分相似性的拟南芥富含脯氨酸/羟脯氨酸的糖蛋白公开为GenBank登录号AAD29829。基于该区域的相似性为34-47％，并且只能在MOM蛋白的后一半看到(即氨基酸1368-1944)。
使用MOM cDNA克隆通过Southern杂交分析来探测来自芜菁、番茄、烟草、玉米、小鼠、果蝇和人的基因组DNA中同源基因的存在。所有情况下都发现低严紧性条件下的杂交。可对来自文库的交叉杂交克隆进行鉴定和测序。
用MOM cDNA在严紧条件下筛选羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)的基因组文库(获自Dr.Mark Cock，INRA，CNRS，里昂，法国)。得到两个阳性克隆，对其进行亚克隆并部分测序。克隆1的部分序列显示了与MOM基因中编码MOM蛋白的N端、ATP酶和C末端部分的不同区域的相似性(DNA水平为80-86％，氨基酸水平为62-80％)。克隆1中MOM的三个推定的核定位序列完全保守。克隆2的部分序列也显示了MOM基因的相似性区域(DNA水平为64-76％，氨基酸水平为55-64％)，其编码MOM蛋白的ATP酶、推定的跨膜区、和C末端部分。克隆1和2的序列不相同，提示在甘蓝(Brassia oleracea)中至少存在两个同源基因。获自克隆1和2的部分序列的实例在SEQ ID Nos26-33中给出。
用MOM cDNA在严紧条件下又筛选了Brassia rapa的基因组文库(获自Dr.Kinya Toriyama，Tohoku University，Sendai，日本)。得到了与MOM cDNA的5′部分和3′部分杂交的阳性信号。
此外，用MOM cDNA在不太严紧的条件下筛选了碧冬茄(Petuniahybrida)的基因组文库(获逢Dr.Jan Kooter，Vrije Universiteit，Amsterdam，荷兰)。得到了与MOM cDNA的5′部分和3′部分杂交的阳性信号。
实施例7通过反义结构操纵标记基因表达2.6kb的cDNA片段以及第一次PCR使用引物RT1-1和RT1-2、第二次PCR使用引物RT1-3和RT1-4进行巢式RT-PCR扩增的1.8kb的RT-PCR片段都反向克隆到二元载体pbarbi53的多克隆位点以产生反义RNA。pbarbi53是p1′barbi的修饰载体，带有一个由花椰菜花叶病毒35S启动子、含有Xho I、SnaBI、Hpa I和Cla I限制位点的多克隆位点以及在pl′barbi HindIII位点的花椰菜花叶病毒35S终止子组成的表达盒。如实施例1所描述的将产生的重组质粒导入农杆菌属。拟南芥哥伦比亚生态型的转基因植株系GUS-TS(获自Dr.H.Vaucheret，INRA，Versailles，Cedex，法国)含有携带多拷贝嵌合β-葡糖醛酸糖苷酶(gus)基因的转录沉默座位，按实施例1的描述用此重组质粒转化该株系并按照Mengiste等(Plant J 12945-948，1997)描述的方法选择转化体。在对照转化中使用pbarbi53载体DNA。通过组织化学染色来检查转化体gus基因的再活化。将一片子叶在gus染色溶液(100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，0.05％5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸糖苷酶，0.1％叠氮钠)中真空浸泡10分钟，然后在37℃孵育过夜。用带有2.6kb cDNA的重组质粒转化的植物可观察到强的gus活性，而用带有1.8kb RT-PCR片段的重组质粒或pbarbi53转化的植物没有显示高于背景的任何gus活性。因此，2.6kb cDNA的反义RNA的表达模拟了突变表型，并且证实SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3中显示的序列代表了转录基因沉默系统成分的遗传信息。
序列表<110>Novartis AGNovartis Research Foundation<120>参与外遗传基因沉默的基因<130>S-31005A<140><141><150>GB 9914623.5<151>1999-06-23<160>33<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>10329<212>DNA<213>拟南芥<220><221>内含子<222>(1009)..(1295)<220><221>内含子<222>(2551)..(2673)<220><221>内含子<222>(2753)..(2867)<220><221>内含子<222>(3114)..(3506)<220><221>内含子<222>(3681)..(3973)<220><221>内含子<222>(4896)..(4975)<220><221>内含子<222>(5218)..(5777)<220><221>内含子<222>(5883)..(6082)<220><221>内含子<222>(7481)..(7615)<220><221>内含子<222>(7772)..(7914)<220><221>内含子<222>(8071)..(8153)<220><221>内含子<222>(8319)..(8451)<220><221>内含子<222>(8630)..(8718)<220><221>内含子<222>(8919)..(9000)<220><221>内含子<222>(9212)..(9284)<400>1aatatttaag tttggtttat attctttcta gtaatctttg aaatattgta agagataatg 60cttctaataa ataacattgg atttattgga attaatgtat tgaaaaaact atgcaaatac 120tacagtgtat tttggaacga ccaaaatgat atatgtaaac tttcgttcta gtcttctaca 180tagtgtaata ggatagcgga caaggttgat cgactctaaa cattatgggt acgtaattcc 240gcagtggtta cagtctactg tcgaggccaa actggtaatt aaacgtttga 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1.含有编码蛋白质的可读框的DNA，该蛋白质的特征为氨基酸序列含有与SEQ ID NO3的对比成分序列有40％或更多一致性的、至少有150个氨基酸残基的成分序列。
2.根据权利要求1的DNA，其含有编码具有式R1-R2-R3的蛋白质的可读框，其中--R1、R2和R3构成由从氨基酸残基组Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg和His中独立选择的氨基酸残基组成的成分序列，--R1和R3由0-3000个氨基酸残基独立组成；--R2由至少150个氨基酸残基组成；且--R2与SEQ ID NO3的对比成分序列至少有40％相同。
3.根据权利要求1的DNA，其含有编码一个或多个SWI2/SNF2样ATP酶/解旋酶基元。
4.根据权利要求1的DNA，其含有编码蛋白质的可读框，该蛋白质具有SEQ ID NO3的第478-490、584-600、617-630、654-668、676-690、718-734、776-788、1222-1233、1738-1749或1761-1770位氨基酸限定的成分序列。
5.根据权利要求1的DNA，其中可读框编码的蛋白的特征为SEQ IDNO3的氨基酸序列，或者用氨基酸残基K替代SEQ ID NO3第705位的M或用氨基酸残基D替代SEQ ID NO3第1219位的E的等位氨基酸序列。
6.根据权利要求1的DNA，其以SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的核苷酸序列为特征。
7.根据权利要求1的DNA，其中与其转录的mRNA互补的RNA的表达，解除了转基因标记基因的沉默。
8.根据权利要求1-7之任意一项的可读框编码的蛋白质。
9.产生根据权利要求1的DNA的方法，包括-筛选DNA文库中能够与SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所限定DNA的片段杂交的克隆，其中所述片段长度至少为15个氨基酸；-将杂交克隆测序；-纯化含有编码蛋白质的可读框的克隆的载体DNA，该蛋白质的特征为氨基酸序列含有与SEQ ID NO3具有40％或更多一致性的、至少有150个氨基酸残基的成分序列；-任选地对纯化DNA进一步处理。
10.多聚酶链式反应，其中使用的至少一个寡核苷酸含有代表SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的15个或更多碱基对的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及编码参与基因沉默的蛋白的DNA。相关基因可从不同来源如哺乳动物或植物的细胞中分离,其编码蛋白的特征为氨基酸序列含有与SEQ ID NO:3的对比成分序列有40%或更多一致性的、至少有150个氨基酸残基的成分序列。进一步公开的是一种分离根据本发明的DNA的方法。
文档编号C12N15/09GK1364194SQ00809325
公开日2002年8月14日 申请日期2000年6月21日 优先权日1999年6月23日
发明者Y·羽部, O·米特尔斯坦施德, P·阿麦德欧, J·帕茨克斯基 申请人:辛根塔参与股份公司