酶的演化和对组合和医药化学的用途的制作方法

专利名称：酶的演化和对组合和医药化学的用途的制作方法
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背景技术：
发明领域本发明涉及采用演化的酶酶促合成有机分子的组合文库领域。本发明提供了酶文库，它通过定向演化，能生物催化合成许多有机分子衍生物。可筛选该有机分子衍生物文库，来鉴定活性化合物，如抗生素和其它治疗剂，、除草剂和杀虫剂等。
背景在发现药物的过程中，优化前导化合物代表了众多的挑战之一。前导化合物通常缺乏完全的药理功能，如高效、选择性、低毒性、生物利用率等所需的一些药理性质。因此，对于实现具有理想性质的完整组合的优化药物常常需要对前导化合物作额外修饰。传统的衍生方法主要依赖于经验来指导医药化学师选择要合成和测试的化学类似物。选择一些化合物用于合成，另一些不用于合成。类似的，当用组合化学产生前导化合物的衍生物时，选择特定的建筑组件来平行合成许多同类物，而其它组件不用于合成。这些选择通常是根据对医药化学的经验作出的，能对可导致改进的修饰，能导致新的不良性质或恶化现有性质的修饰提供指导。然而不幸的是，这些经验大多数是个别医药化学师独有的，没有完整的描述，仅在许多文献的章节片段中提到。
对具有潜在药用性能的前导化合物的改进并不是衍生改变有机分子的唯一感兴趣的事情。有机分子具有许多用途，包括例如杀虫剂、除草剂等。为了获得对某具体应用具有改进性质的化合物，常常需要产生可供筛选的有机分子衍生物文库，来鉴定显示理想特性的那些衍生物。
组合合成方法能提供合成各种各样前导化合物衍生物的方法，而不需要预先猜测哪种衍生物可能最理想。人们可同时制备大量不同的衍生物，而不需要各个合成并对其进行测试。组合合成不仅可用于前导化合物的衍生，还可用于合成筛选用的化合物，以鉴定作为可能的前导化合物，那些化合物值得进一步研究。然而，有机分子衍生物组合物文库的合成非常有限，因为仅通过化学方法难于或甚至不可能合成许多种类的有机分子衍生物。
酶对可供鉴定显示所需性质的化合物的化合物文库的合成，提供了引人注目的方法。酶可在溶液中作用于复杂分子的混合物，催化这些分子衍生物的合成而不产生副产物。前导化合物衍生的传统化学方法通常是非选择性的，需要多次保护和去保护步骤，但是酶促合成不需要这些步骤。而且，酶可在相对温和，不破坏反应产物的条件下起作用。另外，酶可对有机分子，如目前已有的和潜在的前导化合物和其它感兴趣的生物活性分子进行多种不同类型的修饰。例如，酶可催化在化合物上加上一个基团(如酯、酰胺、羧酸、氨基甲酸酯或糖苷键等)。酶还可在有机分子上加上新的官能团，或可修饰存在于化合物上的现存官能团。酶生物催化还可提供某些特别的优点，如底物、立体和区域选择性。
虽然酶的组合性生物催化作用具有强大的功能，但仍存在显著的缺点。例如，还不能得到能够促进全部有机分子衍生物(合成)的足够多种多样的酶。从一组天然存在的酶中不可能得到对于任何感兴趣的具体有机分子具有所需底物、立体和区域特异性的酶。因此，存在着对能够产生各种各样有机分子衍生物的衍生酶的需要。缺乏这些酶限制了用组合生物催化可获得的有机分子衍生物的数量和种类。因此，存在着对获得能催化各种各样不同有机分子衍生物的衍生酶的方法的需要，以及对这些有机分子衍生物文库的需要。本发明满足了这些和其它需要。
发明简述本发明提供了获得有机分子衍生物文库的方法。该方法涉及将一有机分子与重组衍生性酶文库的一个或多个成员和其它必需的反应试剂接触，形成有机分子衍生物文库。该衍生性酶能催化如下反应a)有机分子上一个或多个官能团的修饰；b)在存在于该有机分子上的一个或多个官能团上加上化学基团；或c)在该有机分子上引入新的官能团。此方法可用于各种各样的有机分子，包括例如具有药物、除草剂、杀虫剂等活性的分子，或在工业加工中有用的分子。
在一些实施例中，此方法还涉及通过与衍生性酶接触获得的衍生物上进行一次或多次加成反应。因此，最初反应的产物作为进一步反应的中间物。进一步反应包括例如使有机分子衍生物文库与第二个重组衍生性酶文库的一个或多个成员以及其它必需的反应试剂接触，形成另一个有机分子衍生物文库。另外，可用化学方法或用其它酶修饰该中间物。
在一些实施例中，可通过(1)重组编码某衍生性酶的至少第一和第二形式的某核酸(其中第一和第二形式在两个或多个核苷酸上彼此不同)，产生一重组多核苷酸文库；和(2)表达此重组多核苷酸文库，获得重组衍生性酶文库。如果需要，该方法还包括(3)重组至少一种重组多核苷酸(它编码此重组衍生性酶文库的一个成员)和编码某衍生性酶的核酸的另一种形式(它与第一和第二种形式相同或不同)，从而产生另一个重组核酸文库；(4)表达该另一个重组多核苷酸文库，获得重组衍生性酶的另一个文库；和(5)如需要，重复(3)和(4)，直到重组衍生性酶的另一个文库含有所需数量的不同重组衍生性酶。
本发明还提供了获得能催化所需有机分子衍生物合成的酶的方法。这些方法包括使一有机分子与重组衍生性酶文库的成员和其它必需的反应试剂接触，形成一有机分子衍生物文库；鉴定该有机分子衍生物文库中所需的有机分子衍生物；和鉴定能催化所需有机分子衍生物合成的该重组衍生性酶文库成员。
本发明还提供了重组衍生性酶文库，其中当重组衍生性酶与具有一个或多个官能团的有机分子接触时，能催化以下反应，例如a)一个或多个官能团的修饰；b)在一个或多个官能团上加入一个化学基团；或c)引入一新的官能团。
在另一个实施例中，本发明提供了有机分子衍生物文库。通过使具有一个或多个官能团的有机分子与一重组衍生性酶文库的多个成员接触，生物催化性合成该文库。这些酶能催化如下反应例如a)一个或多个官能团的修饰；b)在一个或多个官能团上加入一个化学基团；或c)引入一新的官能团。
附图简述


图1显示了万古霉素盐酸盐上可能的糖结合点。
图2显示了促生长素抑制素上可能的糖结合点。
图3显示了胆酸上可能的糖结合点。
图4显示了L-甲状腺素上可能的糖结合点。
图5显示了诺加霉素上可能的糖结合点。
图6显示了丁香醛连氮上可能的糖结合点。
图7显示了阿柔比星上可能的糖结合点。
图8显示了盐酸羟苄羟麻黄碱上可能的糖结合点。
图9显示了利福霉素上可能的糖结合点。
图10显示了硫酸瑞斯托霉素上可能的糖结合点。还显示了骨架上的5个另外的羟基(未用箭头标出)；这些基团构成了可能的糖结合点。
图11显示了红霉素A的多步化学甲基化及其同类物。
图12显示了用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖性甲基转移酶催化的反应。
图13显示了可进行改组获得使用红霉素及其同类物作为底物的具有6-OMT酶活性的O-甲基转移酶的专一性。
图14显示了通过改组获得使用红霉素及其同类物作为底物的具有6-OMT酶活性的O-甲基转移酶的DNA序列和蛋白质序列的相似性。
图15显示了鉴定具有新专一性的甲基转移酶的微量滴定板高通量初步筛选。
图16显示了采用红霉素A 6-O-甲基转移酶生物催化合成甲红霉素的示意图。
图17显示了甲红霉素合成酶的二次试验。590/158对的MS/MS检测鉴定了大环内酯环的甲基化。
图18显示了甲红霉素合成酶的另一二次试验。硼酸苯酯在中性pH时特异性与顺式二醇反应。只有甲红霉素具有能反应的11-12-顺式二醇，得到834.5离子。
图19显示了载体pCKZEBB的基因图。
发明详述定义“衍生性酶”是能在有机分子上催化反应的酶。例如，衍生性酶能修饰存在于分子上的官能团，在官能团上加上一个化学基团，或在有机分子上加上一新的官能团。有机分子可包括合成的(包括例如非天然存在的化合物如含卤素的化合物等)和天然存在的化合物。
“重组衍生性酶”是非天然存在的酶，与天然存在的衍生性酶在序列上至少有一个氨基酸残基不同。重组衍生性酶包括由多种氨基酸组件组成的衍生性酶，这些组件在天然存在的酶中不连续。这些组件通常为随机长度。重组衍生性酶可能是嵌合的，因此其部分序列衍生自至少两条不同亲本酶的序列。嵌合的重组衍生性酶是由含有衍生自至少两条不同亲本基因或亲本基因区段的嵌合基因编码的。亲本基因可任选地编码一衍生性酶。
本文所用的术语“文库”指多种分子的集合，例如重组衍生性酶和有机化合物同类物的集合。本发明的文库具有至少两种不同成员分子，但大小可以不同。通常本发明的文库具有至少约5个不同分子，更通常具有至少约10个不同成员分子。本发明较大的文库通常具有至少约100个不同成员分子，有时多于约10,000个，甚至多于约100,000个。本发明非常大的文库可具有多于1,000,000个成员。
“官能团”指一个或一组原子，它限定于具体有机化合物家族的结构并确定其性质。官能团包括例如链烯、炔烃、芳族、卤素、羟基、醚、酯、醛、酮、羧酸、酰胺、胺等。
“前导化合物”是一种具有所需生物学或药物活性，但可能具有其它不需要的特征的原型化合物。例如，前导化合物可能有毒，不溶，具有其它生物活性，具有较差的生物利用率(如吸收、分布、代谢和排泄(即ADME))或较差的生物活性等。
“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其单链或双链形式的多聚物。此术语包括含有已知核苷酸同类物或修饰的骨架残基或连接键的合成性、天然存在或非天然存在的核酸，其具有与参比核酸相似的结合性质，并以参比核苷酸相类似的方式代谢。这些同类物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、磷酸酰胺、磷酸甲酯、手性磷酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等。
除非另外说明，特定的核酸序列还默认包括其保守性修饰变体(如简并密码子取代)和互补序列，以及明白说明的序列。术语“核酸”在本文中与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用。
本文中术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基的多聚物。此术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在氨基酸以及天然存在的氨基酸多聚物的的同类物或模拟物。
术语“氨基酸”指天然存在和合成的氨基酸，以及功能与天然存在的氨基酸相似的氨基酸同类物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是遗传密码子编码的氨基酸，以及随后修饰的氨基酸如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸同类物指与天然存在的氨基酸具有相同基础化学结构的化合物，即α碳和一个氢、一个羧基、一个氨基和一个R基团结合(如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。这些同类物具有修饰的R基团(如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的通用化学结构不同的结构，但功能与天然存在的氨基酸相似的化合物。
本文的氨基酸可以用它们一般已知的IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的三字母符号或一字母符号表示。类似的，核苷酸可用它们通常接受的一字母码表示。
“保守性修饰变体”可同时用于氨基酸和核酸序列。对于具体核酸序列，保守性修饰变体指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列。具体讲可以通过一个或多个所选(或全部)密码子的第三位用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代序列来进行简并密码子取代(Batzer等，Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 891-98(1994))。由于基因密码子的简并性，大部分功能相同的核苷酸可编码任一给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸中某密码子限定的每一处，可将此密码子改变成所述的任一对应密码子，而不会改变编码的多肽。这些核酸变体是“沉默变体”，它们是一种保守性修饰的变体。本文引用的编码某多肽的每一种核酸序列还包括该核酸的每一种可能的沉默变体。本领域技术人员懂得核酸中的每一个密码子(除了AUG，它和一些生物中的GUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子；和TGG，它通常是酪氨酸的唯一密码子)都可被修饰，以产生功能相同的分子。因此，在各描述的序列中包括编码多肽的核酸的每一个沉默变体。
对于氨基酸序列，本领域技术人员懂得对核酸进行个别取代、缺失或加成，可改变肽、多肽或蛋白质的序列、在其序列上加入或缺失一个氨基酸或小比例的氨基酸是一种“保守修饰变体”，其中的改变导致用化学上类似的氨基酸取代一氨基酸。提供功能上类似的氨基酸的保守性取代表是本领域熟知的。这些保守性修饰变体补充但不排除本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。
本文所用的术语“改组”表示不相同序列之间的重组，在一些实施例中改组可包括通过同源重组或通过非同源重组，例如通过cre/lox和flp/frt系统进行交换。改组可使用各种不同形式，包括例如体外和体内改组形式、硅内(in silico)改组形式、利用双链或单链模板的改组形式、基于引物的改组形式、基于核酸片段化的改组形式、寡核苷酸介导的改组形式，所有这些都基于不相同序列之间的重组活动，以及其它类似的基于重组的形式将在下文中更详细的描述或引用。
优选例描述本发明提供了用于产生化合物，特别是有机分子的组合文库的重组衍生性酶文库。还提供了用该重组衍生性酶文库获得的有机分子衍生物文库。此有机分子衍生物文库可用于例如鉴定具有理想生物活性的那些衍生物，因此适用于作为药用或其它用途的前导化合物的测试，和用于建立先前已鉴定的前导化合物的衍生物组合文库，该前导化合物用于测试改进的药物学或其它参数。这些化合物通常是有机分子，包括合成分子(包括例如非天然存在的化合物)和天然存在的化合物例如抗生素。
本发明提供的重组衍生性酶文库对获得有机分子衍生物文库提供了优于现有方法的几个优点。例如，此重组文库将含有显示彼此催化特性不同的酶，催化特征包括催化速率和催化常数、立体、区域和对映体特异性、底物选择性的多样性、产物抑制、在用于生物催化合成的溶剂中的稳定性、在化学加工中的稳定性等。所产生的一群不同酶增加了通过生物催化反应产生的不同化合物的数量。当用一种酶与一有机分子和一化学基团供体作生物催化时，通常仅产生一种衍生物。相反，一群重组酶中包括的酶可能催化与原来的酶不同的反应，从而能产生不同产物，即使开始时采用原来的酶的同一底物。而且用酶合成感兴趣的有机化合物大大促进了合成反应的规模。
在优选实施例中，用DNA改组或递归重组的其它方法来产生重组酶文库。DNA改组已证明在改进生物催化剂的已知活性水平上非常有效。该技术的其他价值在于能够产生先前在野生型酶中未知的催化活性。因此，该技术提供了一种生物催化生成的可靠方法，减少或甚至避免了靶向反应对获得天然存在的生物催化剂的需要。例如，一类相关基因的DNA改组产生了具有不同生理性质的功能多样的基因文库，该文库包括的序列比一特定蛋白质天然可发现的序列范围更复杂。由于这些酶文库的新成员从未在生物中经历选择性压力，它们没有偏向，可对其筛选是否具有天然样品中很少或不存在的新活性。因此人们可建立多样和复杂的能催化一系列重要化学物质的酶文库。例如，酶可催化存在于有机分子上的官能团的修饰，在官能团上加上化学基团(如酰基化、糖基化、和甲基化)，和在有机分子中引入新的官能团(如通过氧化引入羟基，通过还原引入双键等)。可用此酶文库直接从底物混合物开始合成一批产物，或从一组确定的底物开始合成一特定化合物。另外，可用该重组酶文库的一个成员通过使其与底物混合物的诸成员接触，合成众多化合物的混合物。在本发明的另一个优选实施例中，可用一组确定的底物测试该重组衍生性酶文库的每一个成员，来鉴定具有新的和有用的底物选择性或其它有用特征的酶。
然后，可筛选这样合成的有机分子衍生物，来鉴定那些具有所需特征的有机分子，或可通过一个或多个其他的化学或酶促反应进一步修饰。人们还可筛选该酶文库来鉴定这些具有新的和有用的底物选择性或其它理想特征的酶，并用这些酶产生理想的化合物。
用本发明的方法获得的重组酶可在体外使用，或由能进行生物催化的微生物细胞表达。在一些实施例中，改进这些微生物使其表达一种或多种衍生性酶，用于有效地生物催化来制造衍生的产物。例如，该微生物可含有一种或多种，编码改进的酰基转移酶、糖基转移酶、氧化酶、甲基转移酶或其它生物催化酶的重组多核苷酸，然后由微生物细胞表达。可将这些多核苷酸引入能天然产生感兴趣的起始底物的生物。例如，可将编码某重组衍生性酶的多核苷酸引入能天然产生或通过基因工程改造能产生聚酮或其它抗生素的生物体中。因此，编码本发明的重组衍生性酶的重组多核苷酸可用于体内衍生预先制备了骨架的有机化合物，在能生物合成此有机分子骨架的生物体体内衍生这些有机化合物；和体外用于衍生预先制备的化合物。
A.重组文库的建立本发明在一些实施例中涉及建立多核苷酸的重组文库，然后筛选此文库以鉴定编码显示所需性质的酶或其它多肽的那些文库成员，所需性质包括例如增强的酶活性、立体特异性、区域特异性和对映特异性、对抑制剂易感性降低、加工稳定性(如溶剂稳定性、pH稳定性、热稳定性等)。可用多种方法之一建立该重组文库，包括本文所描述的这些。例如，可获得各种核酸改组方案，对此本领域有完全描述。可将下列出版物描述的各种这样的程序和/或方法掺入这些程序中，以及其它多样性产生方案中Stemmer等(1999)“用于靶向和其它临床性能的病毒分子育种，肿瘤靶向”41-4；Nesset等(1999)“枯草杆菌蛋白酶亚基因组序列的DNA改组”NatureBiotechnology 17893-896；Chang等(1999)“用DNA家族改组演化细胞因子”NatureBiotechnology 17793-797；Minshull和Stemmer(1999)“分子育种的蛋白质演化”Current Opioion in Chemical Biology 3284-290；Christians等(1999)“用DNA家族改组对用于AZT磷酸化的胸腺嘧啶激酶直接演化”Nature Biotechnology17259-264；Crameri等(1998)“对多个物种的基因家族的DNA改组加速了定向演化”Nature 391288-291；Crameri等“DNA改组对砷酸盐解毒途径的分子演化”Nature Biotechnology 15436-438；Zhang等(1997)“通过DNA改组和筛选从半乳糖苷酶直接演化成有效的岩藻糖酶”Proceedings of the National Academy ofScience，U.S.A.944504-4509；Patten等(1997)“DNA改组在药物和疫苗中的应用”Current Opinion in Biotechnology 8724-733；Crameri等(1996)“通过DNA改组构建和演化抗体-噬菌体文库”Nature Medicine 2100-103；Crameri等(1996)“通过采用DNA改组的分子演化改进绿色荧光蛋白”Nature Biotechnology14315-319；Gates等(1996)“通过在乳糖抑制蛋白‘头部二聚体’上展示从肽文库中亲和选择分离配体”Journal of Molecular Biology 255373-386；Stemmer(1996)“性PCR和集合PCR”于The Encyclopedia of MolecularBiology.VCH Publishers，New York，447-457页；Crameri和Stemmer(1995)“组合多基因盒诱变建立了所有突变体和野生型基因盒的置换图”Biotechniques18194-195；Stemmer等(1995)“一步装配一个基因和全质粒形成大量寡聚脱氧核糖核苷酸”Gene 16449-53；Stemmer(1995)“分子计算的演化”Science2701510；Stemmer(1995)“搜索序列空间”Bio/Technology 13549-553；Stemmer(1994)“体外蛋白质通过DNA改组快速演化”Nature 370389-391；和Stemmer(1994)“随机片段化和重新装配的DNA改组分子演化的体外重组”Proceedings of National Acadamey of Sciences，U.S.A.9110747-10751。
发明人及其同事在美国专利中发现了其它关于DNA改组方法的详细内容，包括Stemmer(1997年2月25日)的美国专利5,605,793，“体外重组的方法；”Stemmer等(1998年9月22日)的美国专利5,811,238“通过重复选择和重组产生具有所需特征的多核苷酸的方法；”Stemmer等(1998年11月3日)的美国专利5,830,721“通过随机片段化和重新装配进行DNA诱变；”Stemmer等(1998年11月10日)的美国专利5,834,252“末端互补聚合酶反应”和Minshull等(1998年11月17日)的美国专利5,837,458“细胞和代谢工程的方法和组合物”。
另外，可在各种PCT和外国专利申请出版物中找到DNA改组方案的细节和形式，包括Stemmer和Crameri“通过随机片段化和重新装配进行DNA诱变”WO95/22625；Stemmer和Lipschutz“末端互补聚合酶链式反应”WO96/33207；Stemmer和Crameri“用重复选择和重组产生具有所需特征的多核苷酸的方法”WO97/0078；Minshull和Stemmer，“细胞和代谢工程的方法和组合物”WO97/35966；Punnonen等，“基因疫苗载体的靶向”WO99/41402；Punnonen等“抗原文库免疫”WO99/41383；Punnonen等“基因疫苗载体工程”WO99/41369；Punnonen等“基因疫苗免疫调节性能的优化”WO99/41368；Stemmer和Crameri，“通过随机片段化和重新装配进行DNA诱变”EP 0934999；Stemmer“通过重复序列重组进化细胞的DNA摄取”EP0932670；Stemmer等“通过病毒基因组改组对病毒嗜性和宿主范围进行改进”WO9923107；Apt等，“人乳头瘤病毒载体”WO9921979；Del Cardayre等，“重复序列重组的全细胞和生物进化”WO9831837；Patten和Stemmer，“多肽工程的方法和组合物”WO9827230；Stemmer等，“通过重复序列改组和选择优化基因治疗的方法”WO9813487；Arnold等，“用随机或限定引物对多核苷酸序列重组”WO9842832；Arnold等“建立多核苷酸和多肽序列的方法”WO9929902；Vind，“构建DNA文库的体外方法”WO9841653；和Borchert等，“用DNA改组构建文库的方法”，WO9841622。
一些美国专利申请提供了关于DNA改组和相关技术的其他细节，以及其它多样性生成方法，包括Patten等1998年9月29日(USSN 60/102,362)，1999年1月29日(USSN 60/117,729)和1999年9月28日(USSN09/407,800)，(代理人卷宗号20-28520US/PCT)提交的“密码子改变的基因的改组”；del Cardayre等1998年7月15日(USSN 09/166,188)和1999年7月15日(USSN 09/354,922)提交的“重复序列重组的全细胞和生物进化”；Crameri等1999年2月5日(USSN 60/118,813)和1999年6月24日(USSN 60/141,049)和1999年9月28日(USSN 09/408,392，代理人卷宗号02-29620US)提交的“寡核苷酸介导的核酸重组”；和Welch等1999年9月28日(USSN 09/408,393，代理人卷宗号02-010070US)提交的“基于密码子的寡核苷酸合成在合成改组中的用途”；Selifonov和Stemmer在1999年2月5日(USSN 60/118854)和1999年10月12日(USSN 09/416,375)提交的“制备具有所需特征的特征串、多核苷酸和多肽的方法”。在Patten等，WO9827230“多肽工程的方法和组合物”；Affholter2000年3月2日提交的USSN 60/186,482“单链核酸模板介导的重组和核酸片段分离”；“产生高度多样的文库的方法”，WO0000632；和“获得体外重组的多核苷酸序列，序列库和产生序列的方法”，WO0009679中描述了使用单链模板的改组形式。
作为前述出版物、专利、出版的申请以及美国专利申请的综述，可用许多已建立的重组方法进行核酸改组，来提供具有所需性质的新核酸，这些方法可以和其它多样性生成方法联合应用。
简单说，几种不同类型的重组方法可用于本发明，在上述参考文献中已列出。第一，核酸可以在体外用任何上述参考文献中所讨论的技术(如DNA酶消化核酸，然后连接和/或PCR重新装配核酸)重组。第二，核酸可以在体内重复重组，如通过在细胞内的核酸之间发生重组。第三，可采用全基因组重组方法，其中细胞或其它生物体的全基因组进行了重组，可任选的包括用所需的文库成分掺入基因组重组混合物。第四，可采用合成重组方法，其中合成对应于感兴趣的靶的寡核苷酸，在PCR或连接反应中重新装配，包括对应于一个以上亲本核酸的寡核苷酸，从而产生新的重组核酸。可用标准核苷掺入法制备寡核苷酸，或用三核苷酸合成法制备。第五，可用硅内重组法，其中在计算机中使用遗传算法来重组对应于核酸同类物(或甚至非同源序列)的序列串。可将产生的重组序列串任选的通过核酸合成转变成对应于该重组序列的核酸，如与寡核苷酸合成/基因重新装配技术协同。可以重复方式进行前述一般重组形式之一种，来产生更多样的重组核酸组。第六，可采用实现天然多样性的方法，例如通过多样性核酸或核酸片段与单链模板杂交，随后多聚化和/或连接以再产生全长序列，然后任选地降解模板，回收产生的修饰的核酸。
为了说明，在本发明的一个实施例中，用于制备编码重组衍生性酶的多核苷酸的改组方法包括在一组变种多核苷酸的重叠区段上引发多核苷酸扩增，条件是一个区段作为另一个区段的延伸模板，产生一组重组多核苷酸；和选择或筛选具有所需特性的重组多核苷酸。
重叠区段可通过各种方法制备，这些方法如本文或本文引用的参考文献所述，例如化学合成、切割或片段化、多核苷酸群的扩增和其它本领域熟知的方法。
在另一个实施例中，用于产生重组衍生性酶的改组方法包括杂交至少两组核酸，其中第一组核酸含有单链核酸模板，第二组核酸含有至少一组核酸片段；和延长和连接杂交的核酸片段之间的序列缺口，产生至少基本全长的嵌合性核酸序列，该序列对应于此单链核酸模板，从而重组了该组核酸片段，和可任选的使至少基本全长的此嵌合性核酸序列与单链核酸模板变性；和用至少一种分离技术从单链核酸模板上分离至少基本全长的此嵌合性核酸序列；通过核酸消化或物理片段法，片段化分离的至少基本全长的此嵌合性核酸序列，以提供嵌合性核苷酸片段。
上述参考文献提供了这些和其它基本的重组方式，以及许多对这些方式的改进。不论采用什么改组方式，都可重组本发明的核酸(彼此重组或与相关的(或甚至不相关的)重组)产生一组多样性的重组核酸，包括例如同源核苷酸组。
重组后，可选择产生的任何核酸有无所需活性。在本发明中，这可能包括用任何本领域的试验以自动化方式测试和鉴定任何可检测的活性。可用任何可得到的试验测试各种相关(或甚至不相关)的性能。根据本文描述的本发明，这些方法是自动化的。
DNA诱变和改组提供了产生(用于具有改进特性的蛋白质、途径、细胞和生物体工程)多样性的强大而且广泛适用的方法。除了上述基本方式，有时候需要将改组方法与其它技术联合以产生多样性。许多产生多样性的方法可与改组法联合(或分别)实施，在本发明的系统中筛选结果(即多样核酸群)。用本领域已知的诱变法可诱导额外的多样性。
诱变方法可包括例如出版号WO98/42727中描述的那些；定点诱变(Ling等(1997)“DNA诱变的方法综述”于Anal Biochem.254(2)157-78；Dale等(1996)“用硫代磷酸酯法针对寡核苷酸随机诱变”Methods Mol Biol.57369-74；Smith(1985)“体内诱变”Ann.Rev.Genet.19，423-462；Botstein和Shortle(1985)“体内诱变的策略和应用”Science 229，1193-1201；Carter(1986)“定点诱变”Biochem J.237，1-7；Kunkel(1987)“寡核苷酸定向诱变的效果”Nucleic Acids&Molecular Biology)Eckstein，F.和Lilley，D.M.J.编SpringerVerlag，Berlin)；采用含有模板的尿嘧啶诱变(Kunkel(1985)“不经表型选择快速和有效的位点专一性诱变”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，488-492；Kunkel，T.A.，Roberts，J.D.&Zakour，R.A.(1987)“不经表型选择快速和有效的位点专一性诱变”Methods in Enzymol.154，367-382；Bass，S.，V.Sorrels和P.Youderian(1988)“具有新DNA结合专一性的突变Trp阻遏蛋白”Science 242240-245)；寡核苷酸定向诱变(对于综述参见Smith，Ann.Rev.Genet.19423-462(1985)；Botstein和Shortle，Science 2291193-1201(1985)；Carter，Biochem.J.2371-7(1986)；Kunkel，“寡核苷酸定向诱变的效果”于Nucleic Acids&Molecular Biology，Eckstein和Lilley编，Springer Verlag，Berlin(1987))；寡核苷酸定向的诱变(Methods in Enzymol.100468-500(1983)，和Methods inEnzymol.154329-350(1987)；Zoller&Smith(1982)“采用M13-衍生的载体寡核苷酸定向诱变在任一DNA片段中产生点突变的有效和通用方法”Nucleic AcidsRes.10，6487-6500，Zoller&Smith(1983)“DNA片段克隆入M13载体的寡核苷酸定向诱变”Methods in Enzymol.100，468-500；Zoller&Smith(1987)“寡核苷酸定向的诱变一种采用两条寡核苷酸引物和单链DNA模板的简单方法”，Methods inEnzymol.154，329-350)；硫代磷酸酯修饰的DNA诱变(Taylor等(1985)“在限制性酶反应中用硫代磷酸酯修饰的DNA制备带缺口的DNA”Nucl.Acids.Res.138749-8764；Taylor等(1985)“用硫代磷酸酯修饰的DNA以高频率快速产生寡核苷酸定向突变”Nucl.Acids.Res.138765-8787(1985)；Nakamaye和Eckstein(1986)“硫代磷酸酯基团对限制性内切酶Nci I的抑制及其在寡核苷酸定向诱变中的应用”Nucl.Acids.Res.149679-9698；Sayers等(1988)，Nucl.Acids.Res.“基于硫代磷酸酯的寡核苷酸定向诱变中的Y-T外切酶”16791-802；Sayers等(1988)“通过在溴乙锭存在下与限制性内切酶反应，链专一性切割含有硫代磷酸酯的DNA”Nucl.Acids.Res.16803-814)；采用含尿嘧啶的模板进行诱变(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488-492(1985)和Kunkel等，Methodsin Enzymol.154367-382))；采用缺口双链体DNA进行诱变(Kramer等“寡核苷酸定向突变构建物的缺口双链体DNA方法”Nucl.Acids.Res.129441-9456(1984)；Kramer和Fritz，Methods in Enzymol.“通过缺口双链体DNA进行突变体的寡核苷酸定向构建”154350-367(1987)；Kramer等，Nucl.Acids.Res.167207(1988)；Fritz等(1988)“突变的寡核苷酸定向构建体外无酶促反应的缺口双链体DNA法”Nucl.Acids.Res.166987-6999(1988)采用缺口双链体DNA的诱变；Kramer，W.，Ohmayer，A.&Fritz，H.-J.(1988)“在缺口双链体DNA方法中改进的体外酶促反应实现寡核苷酸定向构建突变体”Nucl.Acids.Res.16，7207；和Bass，S.，V.Sorrels和P.Youderian(1988)“具有新DNA结合专一性的突变Trp阻遏蛋白”Science，242240-245)。
其它合适方法包括点错配修复(Kramer等(1984)“点错配修复”Cell38879-887(1984))，采用修复缺陷的宿主株进行诱变(Carter等(1985)，“采用M13载体的改进的寡核苷酸定点诱变”Nucl.Acids.Res.134431-4443(1985)；Carter(1987)“采用M13载体的改进寡核苷酸定向的诱变”Methods in Enzymol.154382-403)，缺失诱变(Eghtedarzadeh和Henikoff(1986)“用寡核苷酸产生大缺失”Nucl.Acids.Res.145115)，限制性选择和限制性选择与限制性纯化(Wells等(1986)“氢键形成在稳定枯草杆菌蛋白转换期中的重要性”Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317415-423)，总基因合成的诱变(Nambiar等(1984)“编码核糖核酸酶S蛋白的基因的全部合成和克隆”Science 2231299-1301；Sakamar和Khorana(1988)“牛杆状体外侧区段鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(转导素)亚单位的基因的全部合成和表达”Nucl.Acids.Res.146361-6372；Wells等“基因盒诱变在限定位点产生多重突变的有效方法”Gene 34315-323(1985)；和Grundstrm等(1985)“微量“鸟枪”基因合成的寡核苷酸定向诱变”Nucl.Acids.Res.133305-3316)，双链损伤的修复(Band aid)(Mandecki(1986)“大肠杆菌质粒中寡核苷酸定向的双链损伤的修复位点专一性诱变位点的方法”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 837177-7181)。可在Methods in Enzymol.，154卷中找到上述方法的许多其他细节，此书也是各种诱变方法疑难解答的有用对照。
诱变试剂盒是商品可得到的。例如，试剂盒可购自Stratagene(如QuickChange定点诱变试剂盒；Chameleon双链、定点诱变试剂盒)，Bio/CanScientific，Bio-Rad(如采用上述Kunkel法)，Boehringer Mannheim Corp.Clonetch Laboratories，DNA Technologies，Epicentre Technologies(如5prime3prime试剂盒)；Genpak Inc，Lemargo Inc，Life Technologies(Gibco BRL)，New England Biolabs.Pharmacia Biotech，Promega Corp.QuantumBiotechnologies，Amersham International plc(如采用上述Eckstein法)，和Anglian Biotechnology Ltd(如采用上述Carter/Winter法)。
另外，可使用任何所述的改组技术联合在基因组(如细菌基因组)中引入额外多样性的方法。例如，已提出了能产生适合转化入各种物种(包括大肠杆菌和枯草杆菌)的核酸多聚物的技术(见例如，Schellenberger美国专利号5,756,316)。当这些多聚物含有彼此不同的基因(如衍生自天然多样性或通过定点诱变、易错PCR、通过突变细菌菌株传代等)，转化入合适的宿主时，引入DNA改组的其他核酸多样性来源。转化入宿主的多聚物特别适用于作为体内改组方案的底物。另外，可将共同具有部分序列类似区域的多核苷酸重复性转化入一宿主，由该宿主细胞体内重组。可用随后的细胞分裂周期产生文库，该文库的成员各含有一个同源性单体群或合并的核酸。另外，可通过标准技术回收此单体核酸，并以任何所述的改组方式重组。
还提出了使用链终止法的改组方式(见例如美国专利号5,965,408)。在该方法中，合并对应于一个或多个共同具有序列相似性区域的基因的双链DNA，并使其在存在或不存在对该基因特异性的引物条件下变性。然后退火此单链多核苷酸并在聚合酶和链终止剂(如紫外线、γ或X-射线辐照；溴乙锭或其它插入物；DNA结合蛋白质，如单链结合蛋白，转录激活因子或组蛋白；多环芳烃；三价铬或三价铬盐；或快速热循环介导的缩短聚合等)存在下温育，产生部分双链体分子。然后变性含有部分延伸链的该部分双链体分子，在随后的复制或部分复制循环中重新退火，产生共同具有不同程度序列相似性的多核苷酸，其对DNA分子起始群而言是嵌合体。可任选的，可在此过程的一个或多个阶段扩增这些产物或这些产物的合并物。上述链终止方法产生的多核苷酸是以所述方式进一步DNA改组的合适底物。
可通过非同源性改组法(如上述出版物和申请中所述，可以是同源性或非同源性，取决于精确方式)进一步增加多样性。例如，Ostermeier等(1999)“得到不依赖于DNA同源性的杂交酶的组合方法”Nature Biotechnol.171205所述的产生杂交酶的增量截短法(ITCHY)可用于产生改组文库，此文库可任选的作为一轮或多轮体外或体内改组法的底物，另见Ostermeier等(1999)“增量截短的组合蛋白质工程”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 963562-3567；Ostermeier等(1999)“作为新生物催化工程策略的增量截短”Biologlcal and Medical Chmiestry，72139-2144。
已描述了产生多物种表达文库的方法(如美国专利号5,783,431；5,824,485)并提出了它用于鉴定感兴趣的蛋白质活性的用途(美国专利5,958,672)。多物种表达文库一般是含有多个物种或品系的cDNA或基因组序列，与合适的调控序列在表达盒中可操纵性连接的文库。cDNA和/或基因组序列可任选的随机连接，进一步增加多样性。载体可以是适合在一种以上物种的宿主有机体内(如细菌菌种、真核细胞)转化和表达的穿梭载体。在某些情况下，通过预先选择编码感兴趣的蛋白质，或与感兴趣的基因杂交的序列，使此文库具有偏向。可提供任何这样的文库作为本文所述改组方法的底物。
在某些应用中，需要在改组前预选或预筛文库(如扩增的文库、基因组文库、cDNA文库、标准化文库等)或其它底物核酸，或使底物偏向编码功能性产物的核酸(改组程序也可能独立的具有这些作用)。例如，就抗体工程而言，可以在DNA改组之前通过任何描述的方法，将改组过程通过利用体内重组事件，偏向具有功能性抗原结合位点的抗体。例如，在DNA改组前可根据任何本文所描述的方法扩增衍生自B细胞cDNA文库的重组CDR，将其装配在框架区中(如Jirholt等(1998)“探索序列空间将体内形成的互补决定区改组到主框架中”Gene 215417)。
文库可偏向编码具有所需酶活性的蛋白质的核酸。例如，从文库鉴定到一显示特定活性的克隆后，可用任何能引入DNA改变的已知方法(包括但不限于DNA改组)诱变此克隆。然后筛选含有该诱变同源物的文库中有无所需的活性，它可以与最初限定的活性相同或不同。在美国专利号5,939,250中提出了该过程的一个例子。可用本领域已知的方法鉴定所需活性。例如WO99/10539提出可通过将基因文库提取物与从代谢丰富的细胞中获得的成分组合，并鉴定显示所需活性的组合，来筛选基因文库。还提出(如WO98/58085)可通过在文库样品中插入生物活性底物，来鉴定具有所需活性的克隆，并用荧光分析仪(如流式细胞计数装置，CCD，荧光计或分光光度计)检测对应于具有所需活性的产物的生物活性荧光。
还可将文库偏向具有特定特征(如与所选核酸探针杂交)的核酸。例如，专利申请WO99/10539提出了可从基因组DNA序列中以下列方法鉴定出编码所需活性(如酶活性，例如脂肪酶、酯酶、蛋白酶、糖苷酶、糖基转移酶、磷酸酶、激酶、加氧酶、过氧化酶、水解酶、水化酶、腈水解酶、转胺酶、氨化酶或酰化酶)的多核苷酸。使来自一群基因组DNA的单链DNA分子与偶联了配体的探针杂交。此基因组DNA可衍生自培养或非培养的微生物，或来自环境样品。另外，此基因组DNA可衍生自多细胞生物，或衍生自该多细胞生物的组织。
可从捕获中使用的杂交探针预先或不预先从捕获介质上释放，或通过各种各样本领域已知的其它策略直接进行第二链合成，。另外，不经进一步克隆可片段化分离的单链基因组DNA群，直接用于使用单链模板的改组方式。在例如WO98/27239“多肽工程的方法和组合物”，Patten等；Affholter，2000年3月2日提交的USSN 60/186,482“单链核酸模板介导的重组和核酸片段分离”；WO 0000632“产生高度多样性文库的方法”；和WO 0009679“获得体外重组的多核苷酸序列库的方法和得到的序列”中描述了一些单链模板改组方式。在一个这样的方法中，将此片段群衍生的基因组文库与对应于相对链的部分或通常接近全长的ssDNA或RNA一起退火。该群的复杂嵌合基因的装配是通过核酸酶去除非杂交的片段末端，聚合填补这些片段之间的缺口，随后单链连接所介导的。可用消化(如果是RNA或者含尿嘧啶)、在变性条件下磁分离(如果以进行这种分离的方式标记)和其它可行的分离/纯化方法除去亲本链。另外，亲本链可任选的与嵌合链共同纯化，并在随后的筛选和加工步骤中除去。
在一常规方法中，将单链分子转变成双链DNA(dsDNA)，特dsDNA分子通过配体介导的结合与固态载体结合。分离未结合的DNA后，将所选DNA分子从载体上释放下来，并引入合适的宿主细胞中，产生富含能与探针杂交的序列的文库。用该方法产生的文库提供了采用本文所述的改组反应进一步改组所需的底物。
还应理解任何适合改组前能丰富文库的上述技术，可用于筛选用该DNA改组方法产生的产物。
在一个优选例中，用DNA改组制备了重组文库。可用改组和筛选或选择“演化”各基因、全质粒或病毒、多基因簇、或甚至整个基因组(Stemmer(1995)Bio/technology 13549-553)。可进行重复的重组和筛选/选择循环进一步演化感兴趣的核酸。这些技术不需要常规多肽工程方法所要求的广泛分析和计算。改组能在最少数量的筛选/选择循环中重组大量的突变，此与传统的配对重组相反。因此，本文描述的序列重组技术提供了特别的优点，在于它们提供了在这些任一或所有突变之间的重组，从而提供了一种非常迅速的方法探查不同组合的突变可能影响到所需结果的方式。然而在一些情况下，结构和/或功能信息是可得到的，虽然不是序列重组需要的，但提供了修改此技术的机会。
这些改组方法通常使用至少两种起始核酸底物的变种形式。候选底物的变种形式可能显示彼此基本序列或二级结构有相似性，但它们应该至少在两个位置是不同的。两形式之间的最初多样性可能是天然变异的结果，例如可从一种生物(包括地理变体)的不同个体或品系或同一生物构建的相关序列(如等位变体)获得此不同变异形式(同源物)。另外，可通过例如易错转录(例如易错PCR或采用缺乏第一变种形式的校阅活性的聚合酶(见例如Liao(1990)Gene 88107-111))产生第二变种形式，或通过在突变品系中复制第一形式，或通过DNase片段的突变加工和用易错聚合酶重新装配引入起始多样性。底物之间的起始多样性在重复序列重组的后续步骤中大大增加。
在本发明的优选例中，采用核酸“家族”的改组来建立重组多核苷酸的文库。当核酸家族被改组时，编码不同品系、物种或基因家族或其部分的核酸可用作该核酸的不同形式。由于基因组提供了增量的序列信息，用设计引物直接扩增同源物更加可能。例如，如果有几个物种的脂肪酶或蛋白酶基因序列，可设计引物来扩增同源物。然后可对得到的核酸区段进行改组。
在本发明的实施中不难使用本文描述的所有改组方法。例如，在密码子修饰改组(在Patten等1998年9月29日提交的“密码子改变的基因的改组”(USSN60/102,362)、1999年1月29日提交的USSN 60/117,729和1999年9月28日提交的USSN 09/102,362)中，合成了其中编码多肽的密码子被改变的核酸，使得可能在该核酸的随后突变中得到完全不同的突变区域。这增加了改组方案的起始核酸序列多样性，改变了强迫演化程序的速度和结果。可采用密码子修饰程序来修饰本文任何编码衍生性酶的核酸，例如在进行DNA改组之前，或可将密码子修饰方法与下文所述的寡核苷酸改组程序联用。
密码子修饰改组涉及编码第一多肽序列或其部分的第一核酸序列。然后选择多条密码子改变的核酸序列，其每一条都编码第一多肽的部分或全部，或修饰的或相关的多肽(如可在一生物学试验中选择密码子改变的核酸文库，该试验能识别文库成分或活性)，重组多条密码子改变的核酸序列，产生靶密码子改变的第二蛋白质的核酸编码部分或全部。然后筛选靶密码子改变的核酸是否有可检测的功能或结构性质，可任选的包括与第一多肽和/或相关多肽的性质比较。该筛选的目的是鉴定具有与第一种多肽或相关多肽结构或功能特性相等或比它卓越的多肽。基本上可在所需的任何方法中使用编码这样的多肽的核酸，包括将靶密码子改变的核酸引入细胞、载体、病毒(如作为疫苗或免疫原性组合物的成分)、转基因生物等。
“硅内”改组(Selifonov和Stemmer在“产生具有所需特性的特征串、多核苷酸和多肽的方法”详述)，1999年2月5日提交(USSN 60,118,854)和1999年10月12日(USSN 09/416,375)利用计算机算法，在计算机中用遗传操纵子进行“仿真”改组。对于本发明，在计算机系统中重组衍生性酶基因序列串，通过例如重新装配PCR合成寡核苷酸产生所需产物。简单说，遗传操纵子(代表给定遗传活动(如点突变、重组两条同源核酸链等)的算法)可用于通过例如排列对比核酸序列串(用标准排列对比软件或用手工观察和排列对比)来模拟一种或多种核酸中可能发生的重组或突变活动，并预测重组结果。例如通过寡核苷酸合成和重新装配PCR，将预测的重组结果用于产生相应的分子。
在“寡核苷酸介导的改组”(Crameri等“寡核苷酸介导的核酸重组”，1999年2月5日(USSN 60/118,813)和1999年6月24日提交的(USSN 60/141,049)和1999年9月28日提交的(USSN 09/408,392))中，对应于相关同源核酸(如本发明中所用的，编码衍生性酶的核酸的种间或等位变体)家族的寡核苷酸重组产生可选择的核酸。
寡核苷酸介导的重组的一个优点是能重组同源核酸与序列相似性低的或甚至非同源的核酸。在这些同源性低的寡核苷酸改组方法中，将一组或多组核酸区段，例如与一组交换家族多样性寡核苷酸重组。这些交换寡核苷酸每一条都具有多个序列多样性区域，对应于序列相似性低的同源或非同源核酸，的多个序列多样性区域。通过与一条或多条同源或非同源核酸比较，衍生的这种交换寡核苷酸可与这些核酸区段的一个或多个区域杂交，促进重组。
当重组同源核酸时，杂交和延伸(如通过重新装配PCR)诸组寡核苷酸重叠性家族(它们通过比较同源核酸并合成寡核苷酸区段而产生)，得到一群重组核酸，可选择所需性状或特征。通常，诸组重叠寡核苷酸包括多种寡核苷酸成员类型，它们具有衍生自多条同源靶核酸的共有区域亚序列。一般通过排列对比同源核酸序列和所选的序列相同性保守区域和序列多样性区域，提供这些重叠寡核苷酸组。(依次或平行)合成了多条对应于序列多样性的至少一个区域的寡核苷酸。
通过切割一条或多条同源核酸(如用Dnase)或更常见，通过合成一组对应于至少一条核酸的多个区域(通常作为一组核酸片段的成员而提供对应于全长核酸的寡核苷酸)可提供用于寡核苷酸改组方法中的区段组或区段亚组。在本文所述的改组程序中，这些区段(如编码衍生性酶的核酸区段)可与寡核苷酸的改组家族联用，例如在一个或多个重组反应中产生编码重组衍生性酶的核酸。
通常在一轮重组和筛选/选择后可实现改进。然而，可采用重复序列重组来实现所需特性的进一步改善。可用许多不同方式和方式的预突变(它们拥有一些共同的原理)实现序列重组。重复序列重组需要连续多轮重组以产生分子多样性。即建立彼此显示一些序列相同性，但突变不同的核酸分子家族。在任何给定的轮次中，重组可以在体内或体外，胞内或胞外发生。另外，重组产生的多样性可在任何轮次中通过将先前的诱变方法(如易错PCR或基因盒诱变)应用于重组的底物或产物而得到增强。在一些例子中，当使用该序列的不同变体形式作为生物体的不同个体或品系的同源物，或使用同一生物的相关序列作为等位变体时，可在体内或体外重组仅一轮之后实现新的或改进的性能或特性。
通常在细胞中完成重组多核苷酸的表达，以获得重组衍生性酶。可在体外或体内如美国专利号5,837,458中所述的建立重组多核苷酸文库。对于体外文库的产生，可将此重组多核苷酸引入细胞以表达。
B.用于生物催化合成组合文库的衍生性酶的类型本发明的方法用于能催化感兴趣的有机分子修饰的大范围的衍生性酶。这些酶可通过例如在分子上加上一个官能团或通过修饰分子上现存的官能团来修饰底物。感兴趣的修饰还包括在官能团上加上化学基团。在本文优选实施例中，衍生性酶不加到有机分子的骨架长度上。在例如Khmelnitsky等(1996)MolecularDiverisity and Combinatorial Chemistry，14章，144-157页(American ChemicalSociety)和Michels等(1998)Tibtech 16210-215中描述了感兴趣的反应类型。下文描述了不同类型的衍生性酶种类和本发明的方法应用于这些酶的例子。
除了增加重组酶文库中发现的酶活性的多样性外，还可获得在某些特性上增强的酶，这增加了此酶在修饰有机化合物(如天然化合物、非天然化合物(如5-氟尿嘧啶、叠氮胸苷等)、小分子和聚合物(如肽和肽变体、寡核苷酸/多核苷酸及其变体、多羟基链烷酸酯、多糖、聚乳酸、聚乳酸-共-乙醇酸、聚乙二醇等))中的用处。本发明实施中使用的小分子通常具有低于约2500道尔顿的分子量，通常低于约2000道尔顿，有时低于约1500道尔顿。
可筛选这些文库以鉴定与野生型酶相比较编码显示用于感兴趣的反应，所需的一个或多个性能上有所改进的酶。例如，可通过筛选，鉴定编码对于某具有化合物具有改进的底物特异性，或对于该化合物上的所需官能团具有改进的区域选择性的酶的文库成员。
在一些实施例中，重组衍生性酶是某给定的野生型基因的变体，通过本文所述的多样性产生方法(如改组和基因重装配改组方法)引入变异。因此可用密集采样在该给定序列周围提供有限但完整的多样性。在其它实施例中，通过对几种不同的野生型基因使用多样性产生方法产生了重组文库。实现了有限和不完整的多样性，它分散在整个功能性序列空间内，与分散采样相同。当产生新的酶的特异性时，后一种方法是优选的。
1.对现存官能团的修饰和将新官能团引入有机分子在一些实施例中，重组衍生性酶及其文库可催化存在于感兴趣的有机分子上现存官能团的修饰。例如，感兴趣的衍生试剂可氧化或还原一官能团、水解一基团或用一种官能团替换另一种。其它感兴趣的反应包括内酯化，异构化和差向异构化。
a.羟化在一些实施例中，有机分子中的氢被羟基取代。这常常可导致生物活性的显著改变。羟化常常与首先通过肝脏的代谢增强相关。在候选药物中引入羟基还可以赋予在随后一组转移酶(如催化甲基化、硫酸盐化、磷酸化和糖基化的酶)的作用下更快速的代谢。
在用于引入羟基的衍生性酶中有单氧和二氧化酶。本领域已知的单氧化酶范围提供了产生用于本发明的方法的重组单氧化酶文库的合适起始点。一类有用的单氧化酶的例子是亚铁血红素依赖性真核和细菌细胞色素P-450。在存在氧和完整的氧化还原再循环系统中，P450显示了单氧化酶活性。然而对许多同样的底物可利用加入过氧化氢或其它过氧化物来绕过对NAD(P)H的需要(即考虑到过氧化酶活性)。酶(如P450)在化学困难位点进行化学反应的能力是熟知的。天然存在的P450对类固醇的修饰在生物合成和药物代谢中很广泛。因此，例如P450的改组文库将对进一步化学(或酶促)衍生或筛选产生许多新结合点。本文提到的其它酶也可以用于在临床重要的化合物家族中建立新的结构多样性。
P450单氧化酶基因家族特别适用于家族改组，以获得重组衍生性酶。已知道许多不同物种的约70-80个P450单氧化酶家族。为了鉴定可作为一个家族一起改组的同源基因，可在“色素P450结构、机制和生物化学”的附录，第2版(PaulR.Ortiz de Montellano编，Plenum Press，New York，1995)(“Ortiz deMontellano”)中找到P450酶的代表性排列对比。最新的P450名单可在万维网World Wide Web上(http//drnelson.utmem.edu/homepage.html)以电子格式找到。为了说明用改组改进P450酶家族，选择了一个或多个超过1000个成员的该超家族，与相似的同源序列排列对比，并根据这些同源序列进行改组。例如，牛P450sec酶的基因(CYP11A1)属于一个紧密相关的P450基因家族。DNA改组(Crameri等，Nature 391288)可用于从该基因家族建立杂交变体，其文库可用于产生有机分子衍生物的组合文库。特别是链霉菌产生的P450单氧化酶可用于产生天然产物如抗生素。适合用于改组的P450单氧化酶的例子包括以下酶，其每一种至少在氨基酸水平上有45％的相同性细胞色素p450单氧化酶(委内瑞拉链霉菌)AF087022细胞色素p450单氧化酶(红色糖多孢菌)M83110细胞色素p450单氧化酶(红色糖多孢菌)M54983细胞色素p450单氧化酶(吸水链霉菌)X86780细胞色素p450单氧化酶(抗生链霉菌)L47200在待批的，共同拥有的美国专利申请号60/148,850中更详细地讨论了重组偏50单氧化酶基因文库的建立，它在1999年8月12日提交。
注意到下文关于单氧化酶描述的基础化学是已知的。除了Ortiz deMontellano(见上)，Stryer(1988)Biochemistry，第三版(或以后的版本)，Freemanand Co.New York，NY；Pine等，Organic_Chemistry第四版(1980)McGraw-Hill，Inc.(USA)(或以后版本)；March，Advanced_Organic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure第四版J.Wiley and Sons(New York，NY，1992)(或以后版本)；Greene等，Protective Groups In Organic Chemistry，第二版，JohnWiley&Sons，New York，NY，1991(或以后版本)；Lide(编)(1995)The CRC Handbookof Chemistry and Physics 75th版(或以后版本)；和其中的参考文献中发现了所涉及的各种化学物质的一般指南。另外，用于本发明的许多化学和工业过程的广泛指南可在Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology(第三版和第四版，1998年)，Martin Grayson，执行编辑，Wiley-Interscience，John Wiley and Sons，NY和其中的参考文献中找到(“Kirk-Othmer”)。
适用于有机分子引入羟基和其它修饰的其它单氧化酶包括具有以下活性的酶，例如烷烃氧化(如羟基化、酮、醛的形成等)、烯烃环氧化、芳族羟基化、N-去烷基化(如烷基胺的)、S-去烷基化(如还原的含硫有机物)、D-去烷基化(如烷基醚的)、酰氧基苯酚的氧化、醛转化成酸、醇转化成醛或酮、脱氢、脱羰基、卤代芳族和卤代糖类的氧化性脱卤素、Baeyer-Villiger单氧化、环孢菌素的修饰、美伐他汀的羟基化、红霉素的羟基化、N-羟基化、亚砜形成、或磺酰脲的氧化。本领域技术人员对于其它氧化性转化是清楚的。用于本发明的合适单氧化酶的例子在待批的，共同拥有的美国专利申请系列号09/373,928，标题为“产生工业化合物的单氧化酶基因的DNA改组”(1999年8月12日提交)中有所描述。
二氧化酶是另一类用于生物催化合成有机分子衍生物的衍生性酶。例如细菌芳烃二氧化酶(ADO)可将π键氧化成相应的邻位二醇。在氧的存在下和还原性化合物如NAD(P)H的存在下这些酶能催化与芳环和非芳环多键一样多样性的化合物的还原性双加氧化。芳烃二氧化酶作用产生的环状顺-二羟基化产物的非苯酚性质，通过避免聚集毒性和反应性环氧中间物(它们可显著损害生物催化剂的性能)，为制造有机分子衍生物提供了显著优点。
芳烃二氧化酶包括例如甲苯2，3-二氧化酶、异丙基苯2，3-二氧化酶、苯-1，2-二氧化酶、二苯基-2，3-二氧化酶、萘-1，2-二氧化酶和许多同源和/或功能上相似的酶。合适的芳烃二氧化酶编码的多核苷酸可用本领域技术人员已知的克隆方法从许多生物获得。下列名单提供了编码芳烃二氧化酶并适用于本发明的方法的多核苷酸例子。基因座是通过GenBank ID鉴定的，其编码芳烃二氧化酶的全部或部分蛋白质组分。合适的基因座包括例如[PSETODC1C]甲苯1，2-二氧化酶；[AF006691]、[PJU53507]、[PSECUMA]、[REU24277]、异丙基苯-2，3-[E04215]、[PSEBDO]二氧化酶；苯-1，2-二氧化酶；[AEBPHA1F]、[CTU47637]、[D78322]、[D88020]、[D88021]、[PSEBPHA]、[PSEBPHABC]、[PSEBPHABCC]、[PSU95095]、[RERBPHA1]、[RGBPHA]、[RSU27591]二苯基-2，3-二氧化酶；[PSU15298]氯苯二氧化酶；[AB004059]、[AF010471]、[AF036940]、[AF053735]、[AF053736]、[AF079317]、[AF004283]、[AF004284]、[PSENAPDOXA]、[PSENAPDOXB]、[PSENDOABC]、[PSEORF1]、[PSU49496]、萘-1，2-二氧化酶；[AF009224]、[PSEBEDC12A]苯甲酸-1，2-二氧化酶；[PWWXYL]甲苯甲酸二氧化酶；[ASCBAABC]、[U18133]3-氯苯甲酸-3，4-二氧化酶；[PCCBDABC]2-氯苯甲酸-1，2-二氧化酶；[BSU62430]2，4-二硝基甲苯二氧化酶；[PSU49504]2-硝基甲苯二氧化酶；[PPU24215]对香豆酸(cumate)-2，3-二氧化酶；[PSEPHT]邻苯二甲酸-4，5-二氧化酶；[AB008831]、[ACCANI]、[D85415]苯胺1，2-二氧化酶；[D90884]苯丙酸2，3-二氧化酶；[PPPOBAB]苯氧基苯甲酸二氧化酶；[AF060489]、[AB001723]和[D89064]咔唑二氧化酶。
还可利用的是基因组含有编码其它二氧化酶的生物，其它二氧化酶包括1，2，3，4-四氢化萘-5，6-二氧化酶，Sikkema等，Appl.Eviron.Microbiol.59567-573(1993)；对香豆酸-2，3-二氧化酶DeFrank等，J.Bacteriol 1291356-1364(1977)；芴酮1，1a-二氧化酶，Selifonov等J.Biochem.Biophys.Res.Comm.19367-76(1993)；二苯并呋喃-4，4a二氧化酶，Trenz等，J.Bacteriol 176789-795(1994)；邻苯二甲酸-3，4-二氧化酶，Eaton等J.Bacteriol.15148-58(1982)；和2-氯苯甲酸-1，2-二氧化酶(Selifonov等，Biochem Biophys.Res.Comm.213(3)759-767(1995)等)。在待批的共同拥有的美国专利申请系列号60/148,450，标题为“产生工业化学药物的二氧化酶基因的DNA改组”(1999年8月12日提交)中描述了适用于制备本发明的酶文库的这些和其它二氧化酶。
一旦将羟基引入某前导化合物或其它有机分子后，常需要如下所述在羟基上加上官能团(如糖基化、酰基化等)。因此，本发明还提供以下方法通过使该有机分子与第一重组衍生性酶文库接触获得了有机分子衍生物库，然后与第二重组衍生性酶文库接触。第二文库的酶通常但不必须是能催化在官能团上加上化学基团的酶。另外，可用化学方法或其它本领域技术人员已知的方法修饰该羟基化化合物。
b.卤化酶卤化酶组成了可用于获得有机分子衍生物文库的另一类衍生性酶的例子。卤化酶通常卤化芳环，它可成为复杂的天然或非天然产物和其它感兴趣的有机分子(如前导分子)的一部分。合适的卤化酶的例子包括以下酶卤化酶PrnA、PrnB、PrnC(U74493；(P.fluorescen)荧光变形菌)、推定的卤化酶PltM、PltD、PltA(AF081920；荧光变形菌)，推定的氧化酶/卤化酶(Y16952；东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis))。虽然这些具体的酶的氨基酸序列相同性小于35％，编码这些酶的多核苷酸也能用作探针来获得可用于DNA改组的更密切相关的卤化酶。
c.其它替代类似的，可在有机化合物中引入含硫基团。例如通常可引入硫醇，来产生硫醇根阴离子，它对重金属具有强亲和力。常常在酶活性位点发现重金属。用于这些实施例的衍生性酶包括例如酰基磺基转移酶家族。可用此酶家族将磺基转移到有机分子的芳基部分上。芳基磺基转移酶家族包括许多具有非常高的氨基酸序列相同性(＞80％)的成员，从而使它们能容易地一起改组，产生重组衍生性酶文库。可用于重组的合适的磺基转移酶的例子包括例如芳胺磺基转移酶(U33886，智人)、苯酚磺基转移酶(D85541；猕猴Macaca Fascicularis)、苯酚磺基转移酶(D29807；犬Canisfamiliaris)、苯酚磺基转移酶(U34753；Bos taurus)和长压定磺基转移酶(L19998；Rattus norvegicus)。
在其它实施例中，一个或多个碱性基团可取代先前存在的官能团。这些在医药化学中最常用的碱性基团是胺、脒、胍、和几乎所有含氮的杂环。在已具有生物活性的分子中引入这些基团的作用与引入酸性功能具有基本上相同的增溶作用。胺和碱性杂环在成功的药物中是普遍存在的。不难通过例如使用酰基转移酶或酯酶，用含有胺基的双功能化合物引入胺基。
2.在官能团上加上化学基团本发明的其它实施例提供了重组衍生性酶及其文库，它们能催化在存在于感兴趣的有机分子(如前导化合物)上的官能团上加上一个或多个化学基团。在这些实施例中，本发明的重组衍生性酶是可使一个基团与核心功能性药物基团在不破坏该药物功能的位置结合的那些酶。这样的结合可提高该药物分子作为前药的溶解度。
结合可以是可逆或不可逆的。可逆的结合包括例如酯、肽和葡萄糖苷的结合。不可逆结合包括例如通过O-和N-烷基化结合。C-C键的建立可通过移植的侧链(如二甲基氨基乙基或吗啉基乙基链)或酸性侧链(如羧基、磺基、-OSO3H、-PO3H2、-OPO3H2)，或用中性基团(如甘油基)实现。用本发明的酶和方法还可加上更大的增溶基团。这些实施例包括但不限于-O-CH2-CH2-COOH、-NH2-CH2-CH2-CH2-、-C＝N-O-CH2-CO2H、O-吗啉基乙基-和-O-CO-CH2-CH2-CO2H。
也可结合不可离子化的侧链，包括例如羟基化和聚氧亚甲基化的侧链或多种葡糖苷，以增强溶解度。这类侧链还包括聚乙二醇衍生物，它也用于提高溶解度和缓释。
用于在前导化合物或其它有机分子上预先存在的官能团上加上化学基团的衍生性酶的例子是葡糖苷转移酶、酰基转移酶、酰胺酶、N-甲基转移酶、磷酸转移酶、芳基磺基转移酶等。
a.酰基转移酶酰基化是一类修饰化学，理论上对有机分子的衍生可提供很大的多样性。然而酰基化的常规化学方法通常是非选择性的，需要多次保护和去保护步骤。在有机溶剂中通过酰基转移酶(包括脂肪酶和蛋白酶)实现的酶酰基化可提供某些优点，例如底物-、立体-和区域选择性。然而不能从一组天然存在的酰基转移酶中获得对于任何具体有机分子拥有所需的各种底物-、立体-、区域特异性的-种酶。因此，本发明提供了含有可用于合成前导化合物和其它有机分子的酰基化衍生物的群重组酰基转移酶的文库。
因此，本发明提供了编码脂肪酶和蛋白酶和酰基转移酶的重组多核苷酸文库。这些方法涉及建立重组多核苷酸文库作为编码能进行乙酰化反应的酶的底物多核苷酸。这些酶包括例如脂肪酶和蛋白酶。脂肪酶和蛋白酶在有机溶剂中的逆反应可将各种酰基转移到复杂天然产物的羟基位点上。这些酶通常具有广谱底物专一性但活性很低。
例如，脂肪酶家族不难从公众可得的数据库中鉴定到。适用于改组(氨基酸相同性大于50％)的脂肪酶家族的一个例子包括下列成员Y00557，霍乱弧菌(Vibriocholae)；D50587假单胞菌KFCC10818(AAD22078)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(BAA23128)、铜绿假单胞菌(D50587)；乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)(AF047691)；和威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(U88907和2072017)、假单胞菌(P26877)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)(M74101)；短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)(A34992)；Galactomyces geotrichium(A02813)；皱落假丝酵母(Candida rugosa)(WO99/14338)；和乙酸钙不动杆菌(S61927)。
许多编码酰基转移酶的基因(此酰基转移酶利用辅酶A的各种羧酸衍生物作为底物)是已知的，催化这些反应的酶在原核和真核生物中是普通存在的。适合用作底物的核酸的例子包括例如糖苷6-O乙酰转移酶(EC 2.3.1.18)；大肠杆菌的lacA(B0342(lacA)或其它生物体的lacA(GENBANK座位号MG396；D02_orf152(lacA)；MJ1064(lacA)，MJ1678，MTH1067)；丝氨酸O-乙酰基转移酶(EC 2.3.1.30)，(GENBANK座位号B3607(cysE)、HI0606(cysE)、HP1210(cysE)、SLR1348(cysE))；醇O-乙酰基转移酶(EC 2.3.1.84)，来自例如酿酒酵母(座位YGR177C、YOR377W)；芳胺N-乙酰基转移酶(EC 2.3.1.118，代表性GENBANK座位包括Q00267、D90786、Z92774、I78931、AF030398、AF008204、AF042740)；肉毒碱O-乙酰转移酶(EC 2.3.1.7)来自例如哺乳动物或酵母(GENBANK座位YAR035(YAT1)和YM8054.01(CAT2))；胆碱O-乙酰转移酶(EC 2.3.1.6)、例如哺乳动物来源的；和乙酰辅酶A去乙酰长春刀灵4-O-乙酰转移酶(EC 2.3.1.107)(St-Pierre等(1998)Plant J.14703-713)。
本发明改进酶的合适酰基供体包括例如可作为特定酶的供体的那些化合物。代表性酰基供体底物包括乙烯酯、三氟乙酯和其它脂肪族酯，以及苄基和脂肪酸等。见例如Mozhaev等(1998)Tetrahedron 543791-3982，具体是3976页。
在本发明的一个优选模式中，改组的酰基转移酶基因是编码对酰基提供转移的酶的基因，并使用宿主微生物菌株细胞中的内源乙酰辅酶A化合物池。还可通过在进行酰基化反应的宿主微生物菌株中引入乙酰辅酶A连接酶(可任选的通过DNA改组来改进)来增强乙酰辅酶A的内源性池。然后给菌株提供培养液中的外源乙酸或其它羧酸，它们随后通过酰基连接酶与辅酶A连接。在待批的共同拥有的美国专利申请系列号09/373,928，题为“产生工业用化学药物的单氧化酶基因的DNA改组”(1999年8月12日提交)中描述了合适的酰基连接酶及其优化方法。
酰基化衍生的感兴趣化合物包括例如天然产物和例如多酮、视黄酮、肽抗生素等，以及非天然存在的化合物。这些化合物可作为例如抗生素、化疗药物等用途。一般底物分子在可发生酰基化的位置具有一个或多个羟基残基。区域选择性对于在可发生酰基化的位置具有多个官能团的分子特别重要。本发明的方法中提供了一种方法，通过它可获得一种酶，此酶能酰基化感兴趣的官能团，但不酰基化其它可能易被酰基化的基团。
特定分子的酰基化可减少不良特性。在采用本发明的方法开发的具有改进性能的药物衍生物中，有抗癌药，包括通过破坏微管蛋白运动而起作用的药物。这些化合物包括例如秋水仙碱、秋水仙胺、足叶草毒素、紫杉酚、长春碱、长春新碱等。感兴趣的底物的一个特别例子是艾泼昔龙，它是一种候选的强抗癌药，目前正在研究阶段。选择性在该化合物的两个羟基上可酰基化提高其水溶性。可用本发明的重组酰基转移酶文库获得在这些位点专一性酰基化的衍生物。其它例子有雷帕霉素和FK506。可利用酰基化雷帕霉素的C-28羟基或FK506非脱水的C-35羟基来将其免疫抑制活性与其神经再生活性分离开(Gold，B.G.(1997)Mol.Neurobiol.15285-306)。已知雷帕霉素或FK506与FKBP(FK结合蛋白)的一部分结合负责神经再生活性。酰基化可破坏FKBP-雷帕霉素(或FK506)与效应蛋白神经钙蛋白(calcineurin)的结合。因此，上述羟基的酰基化将破坏神经钙蛋白结合。区域选择性将在这些修饰中起主要作用，因为在这两种分子中都有几个羟基。
不论重组多核苷酸文库(编码脂肪酶、蛋白酶或其它酰基化酶)是通过DNA改组或其它上述方法获得，对该文库的筛选在体外用纯化或部分纯化的酶或细菌或酵母裂解液在有机溶剂系统中，通过下面所述的一种或多种筛选方法更容易进行。例如，可通过检测底物和酶促催化反应产生的衍生物之间的物理差异检测天然产物和小分子的酰基化衍生物增加的信息。这些方法包括HPLC、质谱、UV/Vis和IR光谱、NMR等。
另一种目前优选的方法采用标记的酰基供体前体，如标记的羧酸或其衍生物，给予表达编码改组脂肪酶、蛋白酶或其它酰基转移酶的基因文库的细胞。测量反应产物中标记物的量。对于疏水性反应产物，可将衍生物抽提到合适的有机溶剂中，或可以通过加入足量疏水多孔树脂珠(如XAD1180、XAD-2、-4、-8)用固相法抽提这些化合物。就放射性标记而言，闪烁染料可存在于有机溶剂中，加到样品中，或用化学方法掺入珠聚合物中。后者是一种闪烁临近试验法的改进。
检测酰基化反应的区域选择性的方法包括例如HPLC和以HTP模式的流通NMR谱。当用NMR谱测定天然产物或小分子的不同区域酰基化衍生物的相对量时，优选通过酶对同位素(13C和/或2H)标记底物的作用获得后者。NMR技术的另一种变化包括采用对酰基供体中间物的前体同位素标记。
b.糖基转移酶产生有机分子衍生物组合文库的另一个感兴趣的衍生性酶的例子是糖基转移酶。糖基化可提高有机分子(包括前导分子)的生物利用率，降低毒性，和提高的水溶性。因为糖基化难于用化学方法进行，含糖的新抗生素(如新的糖肽和糖基化的大环内酯抗生素)难于制备。
然而用糖基转移酶能够实现含有一个或多个羟基的有机受体化合物的糖基化。因此伴随着本发明重组酶文库提供的糖基化活性的变化越多，可获得许多有机分子变体。用本文提供的技术，提供了能催化各种先前不能实现的糖基化的新酶。例如，本发明文库中的重组衍生性酶可显示对受体(如复杂的天然和合成的有机分子)和供体(如不同的糖)的改变的专一性。还可获得合成氨基脱氧糖能力的提高，如通过生物转化。用本发明的重组衍生性酶，可得到新的底物，建立和改进新的酶活性；可用生物催化代替困难的化学方法，实现大规模生产。
用本文所述的多样性产生方法(包括例如改组)可演化糖基转移酶，产生在各种不同的反应参数上显示最佳性能的重组糖基转移酶。典型的反应参数包括但不限于反应专一性、酶的混杂程度和立体化学。例如，可任选地将酶演化成能转移不同的核苷二磷酸(NDP)糖和NDP-糖类似物；能将糖转移到不同的受体分子；能使糖结合在(与天然存在的酶相比)不同的位置上，以具有在含有受体的多样位点中位置的模糊性，和能催化多步糖基化。
在另一个实施例中，可演化酶产生重组衍生性酶，该酶能利用其它可任选合成的糖。例如激活的糖(如脱氧和硫酸化的糖)；非天然糖(如硝基化、磺酸化、磷酸化和双脱氧糖)；聚醇(如肌醇(inositol)、肌醇磷酸酯和肌醇膦酸)；其它类似糖的结构和化合物以及其它核苷。
可任选的用重组糖基转移酶将糖转移到另外的糖受体上，包括但不限于聚酮、非核糖体肽、有机合成的复杂分子和化合物文库。本发明中感兴趣的其它糖接受体包括但不限于无糖基万古霉素盐酸盐(一种肽抗生素)、促生长素抑制素(一种生长激素)、胰岛素和胰高血糖释放抑制蛋白、胆酸(一种去污剂类固醇)、诺加霉素(抗肿瘤抗生素)、L-甲状腺素(一种甲状腺激素)、丁香醛连氮、阿柔比星(抗肿瘤抗生素和商品RNA合成抑制蛋白)、盐酸羟苄羟麻黄碱(一种肾上腺能激动剂和平滑肌松弛剂)、利福霉素(一种抗生素)和硫酸瑞斯托霉素(一种抗生素)。这些化合物都具有与万古霉素糖苷配基的3-二维相似性，如通过与从Chemweb(http//www.chemweb.com/databases)获得的化学数据库的分子动态界面定义的那样。
图1-10显示了这些分子和它们的感兴趣的糖结合位点。其它可糖基化的感兴趣的天然产物包括例如洛伐他丁、无糖基红霉素、海胆霉素、紫杉酚和头孢氨苄。
可任选的用演化的糖基转移酶糖基化任何含有至少一个羟基的分子。优选药物学上感兴趣的化合物。可任选的仅在一个位置糖基化具有一个以上的羟基的糖接受体。如此可通过在一个或其它位置糖基化来产生不同的异构体。另外，例如当限于NDP时，可任选在不同位置以不同程度糖基化具有一个以上羟基的化合物。在另一个实施例中，用NDP-糖和糖基转移酶组合在多维上处理化合物，可提供重复糖基化。
在一些实施例中，选择的糖基转移酶是能从UDP-己糖衍生物上转移己糖残基的糖基转移酶。优选的己糖包括例如D-葡萄糖、D-半乳糖和D-N-乙酰葡糖胺。结合中需采用演化的糖基转移酶的感兴趣的糖包括但不限于以下的糖UDP-N-乙酰半乳糖胺、UDP-N-乙酰葡糖胺、UDP-半乳糖、UDP-半乳糖醛酸、UDP-葡糖醛酸、UDP-甘露糖、UDP-木糖、UDP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、ADP-葡萄糖、ADP-核糖、ADP-甘露糖、GDP-海藻糖、GDP-葡萄糖和GDP-甘露糖，所有都可购自Sigma(St.Louis，MO)。脱氧糖，如2-脱氧-D-木己糖、2-脱氧-D-阿拉伯糖己糖、L-海藻糖、L-鼠李糖、D-霉菌素糖、L-瓦拉糖(vallarose)、D-海藻糖、D-奎诺糖、D-鼠李糖、D-坎那糖(canarose)、D-奥利糖(oliose)、D-毛地黄糖(digitose)、D-波伊文糖、L-夹竹桃糖、抑素糖(chalcose)、D-阿米糖(amicetose)、L-香草糖(rhodinose)、蛔糖、阿比可糖、泊雷糖、泰威糖、可立糖等。这些糖和其它糖在Annu Rev.Microbiol，48223-256(1994)中有所描述。
本发明提供了获得重组多核苷酸的方法，这些多核苷酸编码某些性能增强的糖基转移酶，其特性的增强提高了这些酶在糖基化有机化合物合成中的用处。在目前的优选例中，在加到生物催化反应混合物中的微生物中引入编码改进的糖基转移酶的多核苷酸。在一些实施例中，用获得糖基转移酶基因以外的微生物表达糖基转移酶。
在目前优选例中，发明方法中所用的糖基转移酶，是通过使编码该酶的核酸重组，然后经过选择鉴定得到编码具有增强的感兴趣特性的酶的重组多核苷酸而优化的。例如，可选择那些重组多核苷酸，它们编码的酶能选择性只糖基化一个羟基。这样可控制区域选择性，以提供两种可能的异构化合物，或者能糖基化各种各样的化合物，如能利用天然糖基转移酶通常不利用的各种糖和糖同类物的酶，和能糖基化各种天然糖基转移酶不能结合糖分子的有机化合物的酶。
可通过对编码这些酶的核酸(即作为重组底物的核酸)应用例如本文所述的各种多样性产生的重组方法(例如改组)，来建立用于鉴定编码具有增强特性的重组糖基转移酶，经过选择或筛选的重组多核苷酸文库。在建立重组多核苷酸文库中，适合用作底物的糖基转移酶来源包括例如东方拟无枝酸菌(A.orientalis)的gtf基因，它编码能催化例如葡萄糖转移到无糖基万古霉素的糖基转移酶。催化这些反应的酶在原核和真核生物中是普通存在的。
可从糖基转移酶超家族中选择一个或多个糖基转移酶，与相似的同源序列排列对比，针对这些同源序列进行改组。糖基转移反应在自然界普遍存在，本领域技术人员可从各种生物中用一种或多种已知方法分离得到这些基因。以下例举可用作建立重组文库核酸来源的编码糖基转移酶的核酸，然后筛选文库鉴定显示有机化合物的糖基化改进(如改变的底物专一性)的那些。例如在建立本发明的重组文库中可用肌醇1-α-半乳糖转移酶，EC2.4.1.123；苯酚β-葡萄糖转移酶，EC2.4.1.35(NTU32643、NTU32644)；视黄酮7-O-β-葡萄糖转移酶，EC2.4.1.81；视黄醇3-O-葡萄糖转移酶，EC2.4.1.91(AB002818、ZMMCCBZ1、AF000372、AF028237、AF078079、D85186、ZMMC2BZ1、VVUFGT)；o-二羟基香豆素7-O-葡萄糖转移酶，EC2.4.1.104；牡荆葡基黄酮β-葡萄糖转移酶，EC2.4.1.105；松果醇葡萄糖转移酶EC2.4.1.111；单萜醇β-葡萄糖转移酶，EC2.4.1.127；芳胺葡萄糖转移酶EC2.4.1.71；sn-甘油-3-磷酸1-半乳糖基转移酶，EC2.4.1.96；葡糖醛酸转移酶，EC2.4.1.17(RNUDPGTR、AA912188、AA932333)；人UGT和同工酶(约35个基因)；水杨基-醇葡萄糖转移酶，EC2.4.1.172；4-羟基苯甲酸4-O-β-D-半乳糖转移酶，EC2.4.1.194；玉米素O-β-D-葡萄糖转移酶，EC2.4.1.203；D-海藻糖-2-葡萄糖转移酶，VFAUDPGFTA；和脱皮甾醇UDP-葡萄糖转移酶(egt)MBU41999作为底物。
本领域技术人员可通过富集培养技术从各种土壤、沉淀、空气和水样分离的许多微生物中找到合适的糖基转移酶基因。特别是从土壤细菌分离出的糖基转移酶，能糖基化多种多酮苷元，这些糖基化的天然产物具有许多不同的生物活性，如抗生素和抗癌药的活性。编码这些酶的基因不难从公共数据库得到。例如糖基转移酶(抗生链霉菌(S.antibioticus)，AJ002638；红色酵母(Sac erythraea)Y14332；委内瑞拉链霉菌(S.venezuelae)，AF079762；波塞链霉菌(S.peucetius)，L47164和弗式链霉菌(S.fradiae)，X81885)。这些基因具有50％的氨基酸序列相同性，因此任何两条或多条是作为一个家族一起改组是理想的。
例如，用于初始改组的糖基转移酶是gtfA、gtfB、gtfC、gtfD和gtfE，来自不同的东方拟无枝酸菌菌株。这些基因编码将糖基转移到万古霉素和艾里莫霉素(eremomycin)的糖苷配基上的糖基转移酶，它们是非核糖体肽抗生素。Zmijewski&Briggs FEMS Microbiology Letters 59，129-134(1989)。Solenberg等，Chem&Biol.4，195-202(1997)。Wageningen等Chem&Biol.5，155-162(1998)。例如，GtfB和gtfE从TDP-葡萄糖或UDP-葡萄糖上将糖基转移到万古霉素上。这些糖基转移酶基因具有59％(gtfA-gtfD)-82％(gtfB-gtfE)之间的相似性。蛋白质序列具有52％(gtfA-gtfD)-80％(gtfB-gtfE)之间的相似性。可从不同的东方拟无枝酸菌东方亚种菌株扩增得到5个公开的基因(gtfD和gtfE来自ATCC 43490或ATCC 43491，gtfA、gtfB、gtfC来自NNRL18098)。其它许多未确定特征，但是相关的糖基转移酶基因可任选的从其它东方拟无枝酸菌菌株(ATCC 19795、21425、35164、15165、15166、39444、43333、53550和53630)进行PCR扩增，并克隆入合适的克隆和表达载体中。可从产巴尔西霉素(balhimycin)的地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)菌株DSM5908和其它拟无枝酸菌扩增其它基因(Pelzer等(1997)J.Biotechnol.57115-128)。可用SDS-PAGE和考马斯染色和/或如果加入检测标记，可用蛋白质印迹测试gtf编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达。可测试单个克隆如gtfB和gtfE的野生型活性。例如，gtfB和gtfE可从TDP-葡萄糖或UDP-葡萄糖上将葡萄糖转移到万古霉素的苷元上。(Folena-Wassermann等，J.of Antibiotics 39，1395-1406(1986))。可用反相HPLC监测万古霉素苷元的体外糖基化。(Solenberg等Chem&Biol.4，195-202(1997))。然后，用功能性gtfB和gtfE克隆和几个表达所需大小多肽链的其它基因的克隆(如gtfA、gtfC、gtfD等)在筛选载体存在下产生gtf基因的PCR产物。例如，用各种上述改组方法产生和重新装配各PCR产物的DNAsel片断。通常片断大小在25个碱基对和250个碱基对之间，但该大小可用本领域熟知的方法通过实验不难测定。
c.甲基转移酶甲基转移酶是可将一个化学基团加到存在于前导化合物或其它有机分子上的官能团上的另一种感兴趣的衍生性酶。例如，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖性甲基转移酶(MT)构成了一类酶，它们形成蛋白质、核酸、糖、多糖、脂类、木质素和各种低分子量化合物(如大环内酯)的甲基-酯、甲基-醚、甲基-硫酯、甲基-胺和甲基-酰胺衍生物。SAM携带有活化的甲基，此甲基能有效的转移到具有广大范围化学反应性的亲核试剂上。活化甲基从SAM转移到受体亲核试剂上是热力学理想的，因此驱动甲基转移反应至完成。
一类感兴趣的甲基转移酶是N-甲基转移酶。作为例子，下列N-甲基转移酶具有至少59％的氨基酸序列相同性，因此使该家族非常适合改组推定的TDP-N-二甲基德氨糖-N-甲基转移酶(U77459；红色酵母(Saccharomyces erythraea))、甲基转移酶(AJ002638；抗生链霉菌(S.antibiotics))、N，N-二甲基转移酶(AF079762；委内瑞拉链霉菌(S.venezuelae))、N-甲基转移酶(X81885；弗式链霉菌(S.fradiae))。该酶家族常常甲基化与复杂天然产物结合的氨基脱氧糖的氨基。
还感兴趣的是O-甲基转移酶，其几个家族是已知的。例如，下列甲基转移酶家族能甲基化复杂天然产物的羟基31-去甲基-FK506甲基转移酶(U65940；链霉菌)；甲基转移酶(X86780；吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus))、碳霉素4-O-甲基转移酶(D30759；耐热链霉菌(Streptomyces thermotolerans))和O-甲基转移酶(M93958；生米卡链霉菌(Streptomyces mycarofaciens))。这些家族成员在氨基酸水平具有45％以上的相同性。
d.酰胺酶本发明还提供了重组酰胺酶文库。该酶家族可用于在有机分子中引入酰胺基团。酰胺酶反应的逆反应将羧酸基团转变成羧酰胺。适合本发明方法中使用的一个这样的家族包括下列酰胺酶，它们在氨基酸水平具有55％以上的相同性N-乙酰基-脱水胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(AF082575；铜绿假单胞菌)，N-乙酰基-脱水胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(U40785；阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae))、AmpD蛋白(X15237；大肠杆菌)和AmpD蛋白质(U32716；流感嗜血菌(Haemophilus influenzae Rd)。
e.磷酸转移酶还感兴趣的是在前导化合物或其它有机分子的现有官能团上加上磷酸基团。因此，本发明提供了用于获得磷酰基化有机分子衍生物的重组磷酸转移酶的文库。例如，可对大环内酯和肽磷酸转移酶家族(其成员具有至少36％的氨基酸序列相同性)进行重组(如大环内酯2’-磷酸转移酶I(D16251；大肠杆菌)、大环内酯2’-磷酸转移酶II(D85892；大肠杆菌)、紫霉素磷酸转移酶(X02393；酒红链霉菌(S.vinaceus))。这组酶能将磷酰基转移到大环内酯或肽抗生素上，从而灭活它们。通过使用全组磷酸转移酶文库可获得大环内酯或肽抗生素不同位点的磷酰基化。
f.其它酶类除以上列出的以外的酶类，在前导产生或/和优化中引入或修饰功能基团也很重要。例如，能催化氧化-还原反应的酶对于在有机化合物中将功能性醇氧化成醛/酮，或将醛/酮基团还原成醇是重要的。然后可用所述的其它类酶进一步修饰这些新建立的基团。适用于改组的一个这样的家族是乳糖脱氢酶，它能将酮转变成醇，具有80％以上的氨基酸序列相同性(Y00711。智人；U07181，褐家鼠(Rattusnorvegicus)；77022A，猪(Sus scrofa domestica)；L79954，(Trachemys script)等)。醇脱氢酶是另一种能将醇氧化成醛的酶家族。该酶家族的合适基因不难得到用于改组(M84409，智人；L15704，(Peromyscus maniculatus)；156882，鸵鸟(Struthiocamelus)；P80222，密西西比鳄(Alligator mississippiensis)等)。这两个酶家族的改组可改变它们对更复杂的有机化合物的底物专一性。
其它酶家族，例如能将硫化物氧化成亚砜，硫醇氧化成硫醛的酶，和能催化羟腈形成和环氧化等的酶也是DNA改组的目标，因此在组合生物合成中是有价值的催化剂。
C.用重组衍生性酶文库获得有机分子衍生物的组合文库在其它实施例中，本发明提供了获得有机分子衍生物文库的方法。这些方法涉及将一种有机分子(一种底物)与重组衍生性酶文库和其它必需的试剂接触，形成有机分子衍生物文库。如上所述的衍生性酶可催化下列反应，例如a)修饰存在于有机分子上的一个或多个官能团；b)在存在于有机分子上的一个或多个官能团上加上一化学基团；或c)在有机分子上引入新的官能团。
1.用于衍生的感兴趣的有机分子感兴趣的有机分子包括例如具有药物学活性、除草剂或杀虫剂活性等的有机分子。在感兴趣的有机分子中有天然产物，如抗生素(包括例如聚酮、类固醇、非核糖体肽抗生素等)。例如，类固醇是药物的使用非常广泛的基础结构，其中环上的取代基可将药物靶向许多不同的治疗目标。这些结构大多数是从天然来源衍生的，并作过效力筛选。类固醇药物上观察到的取代基包括羟基、甲氧基、烷氧基、糖基化、硫酸化、卤化、双键和三键、羰基等。类固醇环结构的化学衍生可在几个已有详细描述的位点上进行，或通过修饰天然存在的结构或其非天然存在的变体来实现。
环状糖肽和大环内酯(如万古霉素和红霉素)也是化学上困难的结构，它们可通过使用改组酶文库修饰。在自然界分离得到了许多这样的结构，文献中、公司库存中也有描述，具有令人感兴趣的生物活性但是其它方面是失败的。如毒性、生物利用率、溶解度、药物动力学、缺乏选择性是候选药物不能成为药物的一些原因。可利用改组文库改善这些缺点和其它特征。
前列腺素、生物碱、蒽醌是其它具有许多生物活性成员的分子家族。这些也是用改组酶文库改进的良好候选对象。
可用重组衍生性酶衍生的药物化合物的具体例子包括例如筒箭毒碱盐酸盐、阿库氯铵、泮库溴铵、维库溴铵、阿曲库铵苯磺酸盐、776C85、7CIMe-MDO-CPT、9-氨基喜树碱、A-007、A-108835、A-121798、紫花洋地黄甙A和B、毛花甙A、B和C、α-乙酰地高辛、β-乙酰地高辛、地高辛、β-甲基地高辛、κ-毒毛旋花苷、κ-毒毛旋花素-β、铃兰苷、铃兰毒甙、葡萄糖海葱甙A、海葱甙A、海葱次甙、海葱拟素。还感兴趣的有利胆药和胆动力药，包括例如羟甲香豆素、肝泰乐、鹅去氧胆酸和乌索脱氧胆酸盐。氟可龙、帕拉米松、地塞米松、倍他米松、可的松、氢化可的松、强的松、泼尼松龙、曲安奈德、曲安西龙、甲基泼尼松龙和泼尼立定是适合衍生的糖皮质激素。感兴趣的皮质类固醇还包括例如泼尼卡酯、氢可的松醋丙酯、氟考丁酯、(ioteprednol etabonate)等。
2.酶反应为了获得有机分子衍生物文库，使底物与重组酶文库的成员接触。可用许多方法进行酶促反应，包括用全细胞生物转化、渗透的细胞、细胞裂解液和纯化的蛋白质。
当底物(如有机分子)与含有重组衍生性酶文库的细胞接触时，发生全细胞生物转化。此文库可表达成可复制基因包(如噬菌体或酵母展示)上的表面蛋白质，或作为与溶液中的底物相互作用的分泌蛋白质。还可在细胞内表达这些酶，此时底物扩散进入细胞然后发生反应。在每一种情况下，用本领域技术人员已知的方法(包括例如离心、沉淀、用有机溶剂抽提和过滤)从细胞中分离得到衍生性酶作用的产物。
可通过加入许多熟知的渗透剂(如硫酸多粘菌素B)渗透表达此文库的细胞。可改进渗透剂水平，使底物和产物通过自由扩散到文库的酶中，并再次离开细胞。在渗透剂水平较高时，蛋白质可释放到溶液中。感兴趣的化合物将从全细胞中分离得到。
可以细胞裂解液形式利用此文库，其中可通过施加以下熟知的裂解条件来破碎表达此文库的细胞，包括加入去污剂、PMBS和溶菌酶或超声。可在反应前通过离心除去细胞碎片，虽然这不是必需的。然后在裂解液中加入底物，在确定温度下培育一定的时间。然后如前所述抽提产物并如下分析。
另外，可用许多熟知的技术在筛选或用于制备有机分子衍生物之前纯化此文库编码的重组衍生性酶。这些方法包括例如凝胶过滤、离子交换、亲和或疏水层析，得到部分或完全纯化的蛋白质。本领域技术人员还知道许多其它纯化方法。然后使纯化的蛋白质在有利于酶活性的条件下接触底物。
可用标准方法使用于转化的反应条件对最大程度酶促转化最优，这些方法包括用最佳的盐水平、缓冲液、温度和反应时间长度。酶促反应中使用的底物和任何其它物质优选采用能促进高转化率的浓度。
有机分子和其它反应试剂与重组衍生性酶的接触可一次用整个酶文库，或与此文库中重组酶的混合物，或在一次反应中与一个重组酶接触。如果使用混合物，一旦用所述方法鉴定到活性的混合，可展开此混合物，以分离得到显示所需活性的具体克隆。例如，可将表达重组衍生性酶文库各个成员的集落置于微量滴定板或其它合适的容器中，进行高通量筛选。
在一些实施例中，在与其它反应物接触之前，重组酶的文库成员被固定在固相载体上。例如，可将编码酶的重组多核苷酸引入一表达载体，该载体还包括标记的编码序列，从而使重组衍生性酶作为带有标记的融合蛋白而表达。另外，标记可以在表达后与衍生性酶结合。此标记通常是一结合对的成员，其中对应的成员易于获得，并固定在固相载体上。例如，重组酶可表达成与生物素的融合蛋白，然后通过与链霉亲和素结合而固定。其它合适的结合对包括例如甘露糖结合蛋白和淀粉、组氨酸标记和固定化的金属离子、谷胱甘肽-S-转移酶和还原的谷胱甘肽、链霉亲和素结合标记和链霉亲和素、表位标记(如E-标记、myc-标记、HAG-标记、His-标记)和相应的抗体、几丁质结合功能域和几丁质、S-标记和RNase减去S-肽突变体、纤维素结合蛋白和功能域与纤维素、硫氧还蛋白和DsbA与硫醇化合物(如ThiobondTM)、聚阳离子标记(如聚精氨酸)和聚阴离子柱、IgG和IgG衍生的肽与蛋白质A、蛋白质G等、钙调蛋白结合肽和钙调蛋白、histactophilin和固定的金属螯合层析。
与酶连接的标记结合的结合对成员优选与固相载体结合。适用的固相载体是本领域技术人员已知的。本文所用的固相载体是基本固定排列的材料基质。固相载体的例子包括玻璃、塑料、聚合物、金属、非金属、陶瓷、有机物等。固相载体可以是平面或平坦的，或可以是几乎不同的构型。例如，底物可以作为颗粒、珠、束、沉淀、凝胶、片层、管、球、容器、毛细管、垫、薄片、薄膜、盘、蘸棒、滑片等形式存在。磁珠或颗粒(如磁性乳胶珠和氧化铁颗粒)是可用于本发明的固相底物的例子。在例如美国专利号4,672,040中描述了磁性颗粒，可从例如PerSeptiveBiosystems，Inc.(Framingham MA)、Ciba Corning(Medfield MA)、BangsLaboratories(Carmel IN)和BioQuest，Inc.(Atkinson NH)购得。选择底物扩大信噪比，主要是使背景结合最小化，从而容易洗涤和节约成本。
可通过例如从储器取出珠或蘸棒，倾空或稀释储器如微量滴定板孔，漂洗珠(如具有铁核心的珠可用磁铁轻易的分离和洗涤)、颗粒、层析柱或用洗液或溶剂过滤，将其它细胞组分或从反应物等与重组酶分离。分离步骤有时包括延长漂洗或洗涤，或多次漂洗或洗涤。例如，当固相物质是微量滴定板时，可用洗液洗涤诸孔数次，该洗液通常含有能干扰以后有机分子衍生物的筛选的反应混合物的成分，如盐、缓冲液、去污剂、非特异性蛋白等。
本发明提供的重组衍生性酶文库不仅可用于获得有机分子衍生物文库，还提供了一个来源，可从该来源鉴定能催化感兴趣的特定反应的重组酶。例如，一旦鉴定出特定的有机分子衍生物具有所需特性，可从酶文库中鉴定出能催化特定衍生物的形成的特定的重组酶。
3.有机分子衍生物的筛选此重组衍生性酶文库可用于产生有机分子衍生物的组合文库，进而筛选后一文库，以鉴定显示所需活性的衍生物。在这些实施例中，筛选的产物常常是以前未曾制备过的化合物。另外，此重组酶文库提供了一种来源，可从此来源鉴定到能催化某有机分子的特定已知修饰的酶。因此例如，可从此文库获得一种酶，该酶能酶促合成已知的化合物，该化合物先前仅能通过效果较差的方法(如化学合成)来合成。
一旦合成了有机分子衍生物文库，一般对该文库进行筛选，以鉴定具有特别兴趣的衍生物。通常为了鉴定在特定生物活性上显示有改进的衍生物，可采用设计来检测和/或定量检测所需活性的生物试验。可随机进行所需生物活性(包括例如细胞毒性、基因毒性等)、所需的生物利用率(包括血浆半衰期、肾清除等特性)、所需物理化学特性(包括水溶性、脂溶性、有机溶剂(如正辛醇)中的溶解度、pH稳定性(如胃中的低pH环境)、温度稳定性、对小肠酶的抗性、肝脏酶的抗性、血浆酶的抗性、组织渗透性(如皮肤、粘膜等)、血脑屏障渗透性)和其它可通过衍生实现的所需特性的筛选，例如与化合物的结构无关，或可以先分析文库中化合物的结构，以鉴定具有感兴趣特定结构的化合物。一旦鉴定到具有所需生物活性的化合物，可使用结构分析鉴定此重组衍生性酶文库赋予的结构特征。
在大多数情况下，预计文库中存在的重组衍生性酶以可预测的方式化学修饰某给定底物。例如，糖基转移酶将糖基转移到底物的氨基或羟基上。这可导致该分子物理行为可预测的改变，而用于筛选。此特定酶文库催化任何给定底物的化学转化很可能是相同的，例如糖基转移酶将一糖基置于底物上，甲基转移酶将加上一个甲基，P450将加上一个羟基等。这使得能对于各文库设计基因筛选方法。例如，糖基转移酶总是产生一种糖-底物连接，因此对于某种连接的糖的特定化学测试将能检测产物的形成。激酶文库将把一个磷酸基团转移到底物上，特定磷酸试验将能检测产物的存在。
可得到许多分析筛选工具来检测组合文库中的化合物结构。例如，已知许多方法能以高通量形式检测低浓度化合物，包括流式分析NMR和质谱。这些分析工具或其它工具包括UV/Vis和IR谱、荧光光谱、发光等可用于同时检测和定量酶促反应中产生的新化合物。
在文库筛选中不期望100％的底物转化成产物，因此宜建立分析技术，来检测酶活性产生的特定变化。例如，可通过观察与酶接触后质谱中14amu的增加，检测重组酶文库中对特定的感兴趣的底物具有甲基转移酶活性的酶的存在。因此，常常可特异性地监测和检测此文库导致的底物化学结构中的改变。然后可将这些变化与能催化该特定反应的重组酶文库成员联系起来。
另一种检测酶文库中能催化新底物的特定反应的重组酶是否存在的方法是例如，在反应过程中掺入一分子标记。合适的标记包括例如放射性标记如3H、14C、32P等。这可用放射性协同底物(如3H3甲基S-腺苷甲硫氨酸)来实现，其中仅标记甲基化的反应产物。还可采用其它标记；许多是本领域已知的。例如，可用含有标记的糖分子检测糖基化。
在一些情况下，预计此改组文库对底物作用的产物可提供一种比底物在外部应力(如极端pH)下更稳定的产物，或提高此化合物在特定溶剂中的稳定性。还可用合适的分析方法或生物试验方法监测这种行为的改变。
在某些情况下，检测新形成的产物可能需要通过标准层析方法(如TLC、HPLC、CE或GC)将该产物与底物分开。这之后可以进行分光光度或其它(如火焰离子化、质谱)方法，以检测感兴趣的新化合物的形成。
实施例提供下列实施例是为了说明，不是为了限制本发明。
实施例1糖基转移酶文库的产生和去万古胺万古霉素的产生的高通量筛选方法该实施例描述了如何产生重组糖基转移酶文库，和用这些酶产生去万古胺万古霉素的方法。
A.从东方拟无枝酸菌东方亚种菌株克隆gtfA、B、C、D、E基因1.gtf编码DNA的产生基因组DNA的制备从ATCC和NRR1获得了东方拟无枝酸菌东方亚种菌株ATCC43490和NRRL18098。根据提供者的推荐制备了琼脂糖培养皿中的起始培养物。液态培养物在TSB，25℃-28℃生长2-5天。根据标准方法(Ausubel等(1987)Current Protocolsin Molecular Biology，第一版，John Wiley&Sons，Inc.NY)抽提基因组DNA。
加入引物进行PCR用基因组DNA、1皮摩尔基因特异性引物、200微摩尔dNTP、2单位Deep Vent聚合酶和0.2单位其5’-3’外切核酸酶活性缺乏变体，在1.5M三甲铵乙内酯和1-3.5mM MgSO4的50微升体积中，根据酶供应商(New England Biolabs)的指南进行PCR。在所有情况下使用用蜡珠(MβP)的热起始。在DNA工程热循环仪上，按下列方案设置循环开始95℃5分钟；5轮95℃45秒，76℃1分钟20秒；5轮95℃45秒，75℃1分钟20秒；5轮95℃45秒，74℃1分钟20秒；10轮95℃45秒，73℃1分钟20秒；10轮95℃45秒，73℃1分钟20秒。根据输入序列U84349和U84350设计了所有引物。对于gtfA的扩增，使用了引物gtfA.For和gtfA.Rev。对于gtfB的扩增，使用了引物gtfB.For和gtfB.Rev。对于gtfC的扩增，使用了引物gtfC.For和gtfC.Rev。对于gtfD的扩增，使用了引物gtfD.For和gtfD.Rev。对于gtfE的扩增，使用了引物gtfE.For和gtfE.Rev(表1)。
表1引物、寡核苷酸和多核苷酸
用NdeI和EcoRV消化得到的PCR产物。用琼脂糖凝胶电泳和QIAEXII(Qiagen)纯化对应于gtf基因的消化的PCR产物。
2.载体pCKZEBB的性质和结构载体pCKZEBB衍生自pAK400(Krebber等(1997)J.Immunol.Meth.20135-55)。保留了pAK400的下列特征。保留lacIq基因压制lac操纵子，保留lacIq基因和lac启动子(lacp/o)之间的转录终止子(hpt)，以终止从lacI启动子通读转录入lac启动子控制的操纵子，降低基线非诱导表达，保留lac启动子操纵子，以引发转录和控制转录，保留在靶基因起始密码子前面的来自T7噬菌体基因10的T7g10前导序列，能从NdeI限制性位点的ATG起始密码子引发强翻译。在NdeI-HindIII lac启动子操纵子控制的表达盒后是lpp转录终止子(lppt)，然后是f1复制起始点，以产生单链RNA，然后是氯霉素抗性基因(camR)和双链DNA复制的ColE1起点。
在pCKZEBB中，lac启动子操纵子控制的多顺反子信息，替换了pAK400中的lac启动子操纵子控制的单顺反子信息。lac启动子转录的操纵子位于pAK400载体唯一的NdeI和HindIII之间。在pCKZEEB中，lacZ基因的变体(起始密码子ATG掺入NdeI位点，除去内部NdeI位点，在基因末端，终止密码子前加入EcoRV位点，产生的EcoRv lacZ片段在载体中倒转)作为编辑片段插入NdeI EcoRV靶基因克隆位点。可用靶糖基转移酶基因替换该lacZ片段。在lacZ后面是生物素化的标记(aa序列)，然后是衍生自trp基因末端的翻译偶联标记。当替换lacZ编辑(stuffer)片段时两个标记都在框内与靶糖基转移酶融合。翻译偶联标记(TGA)终止密码子的A核苷酸构成了绿色荧光蛋白编码基因(GFP；Crameri等(1996)Nature Biotechnol.14315-319)的翻译起始密码子部分。GFP基因后面是PCR克隆的birA基因，它含有BL21(DE3)的核糖体结合位点。似乎在birA基因中存在序列模糊性，因为在该区域中存在一个NcoI限制性位点。
图19显示了pCKZEBB的图，此载体的核苷酸序列为SEQ ID NO19。
当在30微克/毫升的氯霉素和1mMIPTG上生长时，用pCKZEBB转化的大肠杆菌不显示绿色荧光。当编辑lacZ片段被全长靶基因(框内含有生物素化-翻译偶联标记)所替换时，A)IPTG诱导的靶基因表达通过与GFP基因翻译性偶联打开了携带细菌绿色荧光的质粒(Oppenheim&Yanofsky(1980)Genetics 95，785-795)，和B)该靶基因将在体内通过birA衍生的生物素全酶连接酶(Smith等(1998)Nul.Acids.Res.261414-1420)加上生物素化标记而生物素化。(Schartz(1993)Bio/Technology111138-1143)。
3.gtfPCR克隆入pCKZEBB用NdeI和EcoRV切割载体pCKZEBB，作为两部分除去lacZ基因编辑。得到的载体用牛小肠磷酸酶脱去磷酰基。用QIAEXII(Qiagen)从琼脂糖凝胶上分离出对应于该载体的DNA片段。将上述的EcoRV和NdeI消化的PCR产物按照标准方法连接到此载体片段中。连接后，用连接混合物转化电穿孔的大肠杆菌TG1电感受细胞(Stratagene)，接种于含有30微克/毫升氯霉素和1mM IPTG的LB-琼脂培养平板上，37℃生长过夜。挑选显示不同程度荧光的绿色荧光菌落，并制备质粒DNA。
4.限制性分析和测序用限制性酶分析得到的载体，测序含有插入物的克隆。鉴定能表达作为生物素化-翻译偶联标记融合蛋白的糖基转移酶之一的质粒。采用携带了对应于公开序列的基因的克隆，作为改组模板。
B.通过家族改组重组和突变单、双、三、四和全部五个基因组合。
1.pCK载体中的wt基因扩增通过引物CK.For3和H3.Rev用聚合酶按照厂商推荐，从得到的质粒(包括一些载体衍生的旁侧序列)扩增糖基转移酶基因。用Qiaquick柱(Qiagen)纯化PCR。
2.随机DNA片段的产生用DNAseI(Boehringer)消化衍生自各质粒的PCR产物。置于冰上停止反应，从2％琼脂糖凝胶中用玻璃过滤皿(glassfilter disks)(Whatman)和透析膜(Spectrapor)分离得到所需大小的片段(Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91107474-10751和Stemmer(1994)Nature 370389-391)。
3.糖基转移酶基因的装配对于各家族装配反应，调节了DNAsed DNA片段的几种浓度和比例以及PCR循环参数，从而在步骤4中获得最大量的改组基因(Crameri等(1998)Nature391288-291，Christians等(1999)Nature Biotechnol.17259-64)。
4.PCR拯救糖基转移酶基因用2微升最终装配反应物作为模板。在最后的PCR反应中，加入1微摩尔引物CK.For2和N3.Rev、每1单位Tag聚合酶加0.2mM各核苷酸。设定了下列PCR参数1轮96℃3分钟；30轮96℃0.5分钟，60℃0.5分钟，72℃1.5分钟；1轮，72℃5分钟。
C.gtfPCR产物克隆入pCKZEBB用XbaI和EcoRV消化表达载体pCKZEBB和PCR拯救的改组的糖基转移酶基因。载体pCKZEBB另外脱去磷酰基。从琼脂糖凝胶中分离得到载体片段和编码糖基转移酶的PCR片段，并彼此连接。
用连接混合物转化电感受态大肠杆菌TG1，接种于含30微克/毫升氯霉素、1％葡萄糖的LB-琼脂中37℃振摇1小时后，37℃培养过夜。
D.糖基转移酶文库的预筛选、主平板的产生和表达将菌落挑入LB-Cam-葡萄糖平板中，并在37℃ON培养，产生主平板。从主平板上将菌落排列到LB-Cam-Agar上，37℃培育平板过夜。将平板暴露于365纳米紫外线中，鉴定绿色荧光菌落。将主平板的各绿色荧光菌落重新排列在96孔平板上，该平板各孔中装有100微升2YT-Cam30-1％葡萄糖，37℃培养过夜。将50微升培养物转移到1毫升2YTCam30-1毫克/毫升生物素中，16℃培养7小时。然后加入50微升100微摩尔IPTG，16℃培育培养物过夜。
E.用溶菌酶和硫酸多粘菌素B的组合裂解细胞离心培养物(4000rpm15分钟)沉淀细胞。用500微升50mM甲酸铵(pH7.4)洗涤细胞沉淀，再沉淀一次。将细胞重悬于300微升裂解缓冲液(10微升Ready to Lyse溶菌酶)(Epicentre)、2微升RNaseA(Qiagen)、2微升DNAse I(Boehringer)、2微升1M MgSO4中，10毫升含1毫克/毫升硫酸多粘菌素B(sigma)的溶液、2mM DTT的50mM甲酸铵(pH7.4)的溶液，环境温度搅拌30分钟。然后离心(15分钟，4000rpm)澄清裂解液。
F.用磁珠从单克隆纯化蛋白质将链霉亲和素包裹的磁珠排列在96孔板中。洗涤磁珠，用珠的磁性和缓冲液(50微摩尔甲酸铵，pH7.4，2mM DTT)洗涤珠，重悬于每孔20微升缓冲液中。将澄清的细胞裂解液(100微升)转移到裂解平板的珠中，在环境温度下培育15分钟。然后用缓冲液(150微升)洗涤5次，最后重悬于20微升缓冲液中。
G.用文库中的糖基转移酶进行化合物的体外修饰将反应混合物(80微升)加到珠上的纯化蛋白质中，环境温度搅拌珠过夜。反应混合物含有150微摩尔万古霉素苷元(如J.Chem.Soc.ChemCommun.(1988)1306-1307所述合成)、500微摩尔UDP葡萄糖、2mM DTT的50微摩尔甲酸铵pH7.4溶液。加入1体积甲醇淬灭反应，离心混合物(2000rpm5分钟)。将上清液(100微升)移到新的96孔板中，进行质谱分析。
H.测量糖基化的发生将淬灭的反应混合物(10微升)注入正模式的三重四极电喷质谱仪装置中。使分子性离子通过第一个四极(万古霉素苷元为1143amu，去万古胺万古霉素为1305amu)，在第二个四极中进行碰撞，然后在第三个四极中检测100amu的子代离子峰。该过程获得的峰的积分与形成的产物直接成比例。这确定了文库克隆在产生去万古胺万古霉素中的相对合理性。
I.过程的重复使用如需要，这些步骤可重复。例如，可用多个编码特定衍生性酶的变体的基因，用从一个文库获得的单个基因，用回交的野生型基因改组的单个基因，用每个基因都编码具有不同活性的酶的多个基因重复步骤B-H。
在此过程的变化中，可将步骤G中的UDP-葡萄糖用其它NDP-糖取代。调整了步骤H中的MS参数，以检测预计的分子性离子。
实施例2用于产生甲红霉素的甲基转移酶文库的产生和红霉素6-O-甲基转移酶的演化该实施例描述了重组O-甲基转移酶(OMT酶)文库的产生和该文库的酶对合成甲红霉素(6-O-甲基红霉素)衍生物的用途。
已显示具有6-甲氧基的红霉素同类物家族具有有用的药物学性质。这些化合物现在是通过多步化学甲基化红霉素A及其同类物制备的(
图11)。能选择性的将活化的甲基转移到6-羟基的酶能一步高产量的在体内或作为一次生物转化在体外生产这类红霉素同类物。本实施例描述了获得这些甲基转移酶的方法。
此时未检测到红霉素6-OMT酶活性。因此必需建立一种新特异性的OMT酶。如果此文库的序列多样性源自天然存在的序列，而不是随机点突变，通过抽取改组文库104-105个成员的样品，大大提高了发现新活性的机会。这样的文库跨越更大部分的序列空间含有丰富的功能性序列。因此，采用编码(能特异性甲基化类似于红霉素6-羟基的底物的)OMT酶的同源基因家族进行DNA改组。由于不能确定该家族的那个成员在产生6-OMT酶活性中更加强影响，制备了各种改组文库。例如，对各亚家族单独改组，或整个家族一起改组。这可用几种改组方式(设计用于影响高序列相同性和低序列相同性的基因重组)实现。
S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖性甲基转移酶(MT)构成了一类酶，它们能形成蛋白质、核酸、糖、多糖、脂类、木质素和各种低分子量化合物(如大环内酯)的甲基酯、甲基醚、甲基硫醚、甲基胺和甲基酰胺衍生物。SAM携带着能有效转移到具有广谱化学反应性的亲核试剂上的活化甲基。该活化的甲基从SAM转移到接受体的亲核试剂是热力学理想的，因此能驱动此甲基转移反应至基本完成(
图12)。已知7个基因家族编码的SAM-依赖性OMT酶，对碳霉素、麦迪霉素、番红霉素(saframycin)、雷帕霉素、利福霉素和FK506的仲醇有特异性(
图13)。这些底物亲核试剂与红霉素A的6-羟基比较，提示亲代OMT酶接受红霉素作为底物只需要对局部特性上作极小的调整。其它感兴趣的基因是编码ERYG的基因，它O-甲基化红霉素C的碳霉糖基团，导致合成红霉素A。EryG在DNA水平上与rapQ共有54％的相同性，可能提供了含有叔醇OMT酶活性的其它OMT酶亚家族(
图14)。
待改组的基因可从基因组DNA或PCR合成的寡核苷酸合成。然后将这些基因克隆入合适的载体，用于表达。编码碳霉素-4-OMT酶的基因的完整序列未知，但是可克隆该基因，或用其它OMT酶的全序列改组其部分序列。
产生了几个SAM依赖性OMT酶的文库。针对红霉素A及其同类物筛选这些文库的6-OMT酶活性。合并已鉴定的克隆并进一步演化，将酶改进到实用活性水平。
通常须筛选该改组家族的104-105个克隆，以鉴定具有去氧红霉素(deserythormycin)6-OMT酶活性的克隆。在去氧红霉素A的存在下培养细胞培养物，然后取出这些培养物的上清液，检测6-O-甲基去氧红霉素A肟的存在。将OMT酶基因与已鉴定的克隆相分离，合并，改组，然后筛选活性提高的去氧红霉素A 6-OMT酶。继续进行另一轮改组和筛选，直到酶活性达到适用于生产6-O-甲基去氧红霉素的水平。
为了确保对有用活性的鉴定，可筛选此改组文库针对红霉内酯B、去氧红霉素A、红霉素A及其肟衍生物的6-OMT酶活性。虽然可能在原始文库中检测不到去氧红霉素A肟6-OMT酶活性，但具有其它6-OMT酶活性的克隆可能存在。然后这些克隆可用于下面轮次的改组，以进一步定制6-OMT酶的特异性。例如，如果检测到对红霉素A有活性，可首先筛选后面文库对去氧红霉素A的活性，最后筛选对去氧红霉素肟的活性。用该方法预计从每个新文库仅产生专一性的精细改变。
基因和文库产生分离得到了编码麦迪霉素3’O-甲基转移酶(mdmC)、黄樟霉素(safromycin)O-甲基转移酶(safC)、雷帕霉素31-O-甲基转移酶(rapI)和FK506 31-O-甲基转移酶(fkbM)(
图13)的开放阅读框的基因，将其克隆入合适的大肠杆菌表达载体(pET22B(+))中。对这些基因(相同性范围是50-80％)然后进行家族改组，改组产生一个编码嵌合性O-甲基转移酶(OMT酶)的基因文库。将此文库克隆回表达载体，在合适的大肠杆菌宿主(BL21(DE3))中表达。现在可筛选该文库中具有新特性的嵌合酶，如对于目标甲基化的新特异性。
OMT酶活性的遗传筛选可以高通量用以下试验测量OMT酶活性。该试验能测量(3H)S-腺苷甲硫氨酸放射性标记的甲基转移到转移到所需的供体分子(见
图15)。此试验是依据标记的甲基从带电荷高的分子(SAM)转移到更疏水的分子(
图12)。用有机溶剂抽提反应物，使未反应的SAM留在水相中，而甲基化的底物选择性地抽提入有机相。然后测量有机相中的放射性含量。该试验的优点是一般它可用于可抽提的底物，非常高通量，可用于同时对化合物集合的活性作筛选。方法如下浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)是一种特别合适的宿主，有至少两个理由第一，它可用从大肠杆菌分离的质粒DNA高效转化。第二，它对红霉素及其同类物是可渗透的，所以可试验全细胞而不是裂解液。另外，可用高通量形式测量大肠杆菌或枯草杆菌细胞抽提物的酶活性。将纯化的酶或细胞裂解液加到50mM磷酸缓冲液，pH7.5(含有0.4mM MgSO4、0.1mM DTT、0.1mM(3H)S-腺苷甲硫氨酸和1-10mM靶底物)的试验混合物中。培育后，加入乙酸乙酯淬灭反应。取出有机相的样品(50微升)，与闪烁试剂(150微升)混合，用96孔闪烁计数仪测量放射性。放射活性高于没加酶的对照样品的样品克隆，视为阳性，可在更好的定量试验中进一步研究。
甲红霉素合成酶的演化甲红霉素是6-O-甲基红霉素。目前制备甲红霉素的方法是红霉素的7步化学甲基化。能一步进行该化学反应的酶可能提供一种通过发酵或生物转化制备甲红霉素的方法(见
图16)。为了建立这样的酶，筛选OMT酶文库的红霉素6-O-甲基化活性。
将改组的OMT酶文库接种在固态培养基上，以分离各克隆。将各克隆挑入含有LB培养液(200微升)和氨苄青霉素(100微克/毫升)的96孔平板中。30℃培养平板10小时，或直到培养物达到0.7的光密度。加入0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，以诱导MT酶的表达，细胞再培养3个小时。离心平板，丢弃上清。将细胞沉淀重悬于50mM磷酸缓冲液配的pH7.5裂解缓冲液(200微升)中，该缓冲液含有1mM EDTA、1mM DTT、2微克/毫升的硫酸多粘菌素B和1毫克/毫升T4溶菌酶。反应物30℃培育15分钟。
用96头液体搬运站(如MultimekTM)将各孔(20微升)样品转移到含有甲红霉素合成试验缓冲液(280微升)的96深孔平板中。此缓冲液是50mM磷酸缓冲液，pH7.5，含有0.4mM MgSO4、0.1mM DTT、0.1mM(3H)S-腺苷甲硫氨酸和1mM红霉素。反应物30℃保温1小时。在各孔中加入乙酸乙酯(300微升)，剧烈振摇平板，离心，取出上面有机相中的样品(50微升)，加到含有闪烁液(150微升)的平板中。然后用平板闪烁计数器阅读此平板。与携带亲代基因或无MT酶基因的样品相比，有机相中有放射性的样品可能含有能将甲基转移到红霉素上的酶。因为在红霉素上有5个可转移甲基的羟基，必须分辨其是否转移到6-羟基上。
甲红霉素合成酶的二次试验甲红霉素的二次试验是以用硼酸苯酯化学修饰，并用质谱分析为基础的。红霉素可以在5个位置(大环内酯环的6、11或12位，或在克拉定糖或脱氧糖胺上)被O-甲基化。硼酸苯酯可专一性的与顺式二醇结合，例如红霉素的11，12二醇。因此如果硼酸苯酯与酶促产生的甲基化红霉素结合，此甲基不可能位于11或12位。为了测定修饰的红霉素是否是甲红霉素，进行了下列试验。
如上所述进行了红霉素的酶促反应甲基化，除了修饰用的SAM未放射性标记外，一细胞的抽提物显示放射性试验阳性。从反应混合物抽提后，用二维质谱(MS/MS)分析有机相，其中亲低离子片段化成亚分子片段(见
图17)。
甲红霉素具有阳离子分子量748.48，带正电是因为脱氧糖胺的胺质子化。甲红霉素阳离子片段化后，克拉定糖和脱氧糖胺可与大环内酯环相分离，然而仅检测到含有脱氧糖胺的分子，因为它们带有胺。748.48离子的片段化得到两个不同的新离子590.4和158.12。590离子是6-O-甲基去氧红霉素A(缺乏克拉定糖基团的甲红霉素)。158.12离子是脱氢脱氧糖胺，除去大环内酯环5-羟基的结果。具有590和158离子的748.48峰的MS/MS质谱不同于大环内酯环上(即在6、11或12位)甲基化的红霉素衍生物。如果样品显示该质谱，那么须作进一步分析以确定是否它是6位甲基化的。用过量硼酸苯酯在中性条件下处理此有机抽提物，然后用质谱分析。如果只在6位修饰，11和12位游离可形成与硼酸苯酯的加合物。因此，834.52离子，甲红霉素硼酸苯酯加合物的存在表明样品含有甲红霉素，以及对应的克隆编码红霉素6-O-甲基转移酶。
应理解本文所述的例子和实施例仅为了说明，以此为根据本领域技术人员可提出各种修改或改变，这些修改和改变均包括在申请和权利要求范围内的精神和预测中。本文引用的所有出版物、专利和专利申请在此引入以供参考。
权利要求
1.一种获得有机分子衍生物文库的方法，其特征在于，该方法包括使有机分子与重组衍生性酶文库的一个或多个成员以及其它必需的反应物接触，形成有机分子衍生物文库，其中衍生性酶催化选自以下的反应a)修饰一个或多个存在于有机分子上的官能团；b)在存在于有机分子上的一个或多个官能团上加上化学基团；和c)引入新的官能团。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括将所述有机分子衍生物文库与第二个重组衍生性酶文库以及其它必需的反应物接触，形成另一个有机分子衍生物文库，其中第二个文库的衍生性酶催化选自以下的反应a)修饰一个或多个官能团；b)在一个或多个官能团上加上化学基团；和c)引入新的官能团。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，第二个文库的衍生性酶在被第一个文库的衍生性酶修饰或加上的官能团上，催化修饰或加上一个化学基团。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在与重组衍生性酶文库接触后，还通过化学或酶促反应对该有机分子衍生物文库的一个或多个成员进行衍生。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过改组方法获得此重组衍生性酶文库。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述改组方法包括(1)重组至少第一和第二种形式的编码衍生性酶的核酸来产生重组多核苷酸文库，所述第一和第二种形式的核酸彼此有两个或多个核苷酸不同；和(2)表达该重组多核苷酸的文库，获得重组衍生性酶文库。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，重组步骤在体外进行。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，该方法还包括(3)重组编码该重组衍生性酶文库一个成员的至少一种重组多核苷酸和另一种编码衍生性酶的核酸，所述核酸可以与第一和第二种形式相同或不同，来产生另一个重组核酸文库；(4)表达另一个重组多核苷酸文库，获得另一个重组衍生性酶文库；和(5)如需要重复(3)和(4)，直到另一个重组衍生性酶文库含有所需数量的不同重组衍生性酶。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，该方法中至少一个重组步骤是在体外进行的。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述改组方法包括(1)在一群不同多核苷酸的重叠区段上，引发多核苷酸扩增过程，条件是一个区段作为另一个区段延伸的模板，来产生一群重组多核苷酸；和(2)选择或筛选有所需特性的重组多核苷酸。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，重叠区段是通过切割该变种多核苷酸群产生的。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，切割是通过DNase I消化。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，重叠区段是通过化学合成产生的。
14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，重叠区段是通过扩增所述多核苷酸群产生的。
15.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述变种多核苷酸群是等位基因的变体。
16.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述变种多核苷酸群是种间变体。
17.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述改组方法包括(1)杂交至少两组核酸，其中第一组核酸含有单链核酸模板，第二组核酸含有至少一组核酸片段；和(2)延伸、连接或同时延伸和连接杂交核酸片段之间的缺口，产生至少基本全长的对应于单链核酸模板的嵌合性核酸序列，从而重组了该组核酸片段。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，该方法还包括(3)使至少基本全长的嵌合性核酸序列和单链核酸模板变性；(4)通过至少一种分离技术，将至少基本全长的嵌合性核酸序列与单链核酸模板相分离；和用核酸酶消化或物理片段化使分离的至少基本全长的嵌合性核酸序列片段化，得到嵌合性核酸片段。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机分子是前导化合物。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机分子是天然存在的化合物。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机分子是非天然存在的化合物。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使重组衍生性酶文库的成员与有机分子各个接触。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该重组衍生性酶文库的成员在与有机分子接触前细分成多个库。
24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，重组衍生性酶文库的成员以重组衍生性酶的混合物与该有机分子接触。
25.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过将重组多核苷酸引入可复制遗传包装载体中来表达此重组多核苷酸，从而产生其编码的重组衍生性酶，作为与展示在可复制遗传包装表面的蛋白质相融合的蛋白。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，可复制遗传包装选自噬菌体、细胞、孢子和病毒。
27.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生性酶催化有机分子上一个或多个官能团的修饰或用另一个官能团代替一个或多个官能团。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述官能团是氢，取代是用羟基取代。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，衍生性酶选自单氧化酶和二氧化酶。
30.如权利要求27所述的方法，其特征在于，衍生性酶催化在有机分子中引入新的官能团。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，衍生性酶选自卤化酶和磺基转移酶。
32.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生性酶能催化在一个或多个官能团上加上一化学基团。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述衍生性酶选自糖基转移酶、酰基转移酶、酰胺酶、甲基转移酶和磷酸转移酶。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述衍生性酶是酰基转移酶，所述化学基团选自乙烯酯、三卤乙基、酯、羧酸乙烯酯、氨基甲酸乙烯酯、肟酯、羧酸肟和双功能基团。
35.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述衍生性酶是糖基转移酶，所述化学基团选自糖苷、氨基糖苷和糖苷酸。
36.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述衍生性酶是糖基转移酶，所述有机分子选自无糖基万古霉素HCl、促生长素抑制素、胆酸、L-甲状腺素、诺加霉素、丁香醛连氮、阿柔比星、盐酸羟苄羟麻黄碱、利福霉素和瑞斯托霉素。
37.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述衍生性酶是O-甲基转移酶，所述有机分子是红霉素。
38.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述衍生性酶是酰胺酶，所述化学基团选自酰胺和肽。
39.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括筛选有机分子衍生物文库，以鉴定显示所需特性的那些有机分子衍生物。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所需特性是与靶分子结合。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述靶分子选自受体、信号蛋白和配体。
42.如权利要求39所述的方法，其特征在于，该方法还包括筛选重组衍生性酶文库，以鉴定能催化有机分子修饰的成员，其可赋予产生的有机分子衍生物所需特性。
43.一种获得能催化所需有机分子衍生物合成的酶的方法，其特征在于，该方法包括使有机分子与重组衍生性酶文库的成员和其它必需反应物接触，形成有机分子衍生物文库；在有机分子衍生物文库中鉴定所需的有机分子衍生物；和鉴定能催化所需有机分子衍生物合成的重组衍生性酶文库的成员。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，使重组衍生性酶文库的成员分别与有机分子接触。
45.如权利要求43所述的方法，其特征在于，将重组衍生性酶文库的成员在与有机分子接触前细分成多个库。
46.一种重组衍生性酶文库，其特征在于，当该重组衍生性酶与具有一个或多个官能团的有机分子接触时，能催化选自以下的反应a)修饰一个或多个官能团；b)在一个或多个官能团上加上化学基团；和c)引入新的官能团。
47.如权利要求46所述的文库，其特征在于，重组衍生性酶各含有多个氨基酸组件，所述组件在天然存在的衍生性酶中是不邻接的。
48.如权利要求47所述的文库，其特征在于，重组衍生性酶各含有多个氨基酸组件，所述组件起源于两个或多个衍生性酶的同源物。
49.一种有机分子衍生物文库，其特征在于，该文库是通过使具有一个或多官能团的有机分子与多个重组衍生性酶文库的成员接触而经生物催化合成的，所述重组衍生性酶文库成员能催化选自以下的反应a)修饰一个或多个官能团；b)在一个或多个官能团上加上化学基团；和c)引入新的官能团。
50.如权利要求49所述的文库，其特征在于，所述重组衍生性酶是通过以下获得的重组至少第一和第二种形式的编码衍生性酶的核酸，其中第一和第二种形式彼此至少有两个或多个核苷酸不同，来产生重组多核苷酸文库；和表达所述重组多核苷酸文库，获得重组衍生性酶文库。
全文摘要
本发明提供了重组衍生酶文库,这些酶可用于生物催化合成有机分子的衍生物,包括药用前导化合物。该重组衍生性酶能催化有机分子上官能团的修饰或置换等反应,或在已存在的官能团上加上化学基团。使用重组酶文库能获得催化有机分子衍生物形成的酶,这种衍生物仅用天然存在的酶是不能产生的。
文档编号C12N15/52GK1378598SQ00811801
公开日2002年11月6日 申请日期2000年8月11日 优先权日1999年8月12日
发明者C·克雷布尔, S·C·戴维斯, S·德尔卡德雷, S·A·塞利冯弗, R·霍华德, 刘璐 申请人:麦克西根股份有限公司