专利名称：细胞的条件性永生化的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗性应用的哺乳动物细胞的永生化。
背景技术：
人们对于移植疗法治疗组织和器官损伤的重要性的认识和理解正在不断增加。而当器官移植正在被广泛实施的时候，以单个细胞移植为基础的移植疗法仍然处于临床发展的相对早期。
举例来说，人们正在不断增加关于将合适的细胞移植进受损伤的大脑可能改进或纠正任何由损伤所引起的知觉、运动、行为、心理上的缺损的认识。
要使以细胞为基础的疗法得以应用，就一定要有可能获得充足的可供移植的细胞。确保这一点的一个方法是在允许重复细胞分裂和生长的条件下培养未分化细胞。使用未分化细胞的一个困难之处是不受调节的细胞分裂一定要在细胞移植进入患者体内之前或之时被关闭掉，以避免它在移植部位不受抑制地生长。
人们发展了许多不同的技术以提供合适的细胞供移植使用。关于神经移植的一项研究是在允许发生细胞分裂的条件下维持培养未分化的胎儿细胞，随即在移植之前，在体外诱导分化。
Reynolds和Weiss，科学(Science)，1992；2551707，表明使用上皮生长因子(EGF)可以在体外诱导成年鼠脑细胞增殖。据认为在合适的条件下，该细胞可以被诱导分化为星形胶质细胞和神经元。
国际专利申请WO-A-94/16059号透露了一项体外维持原代神经细胞培养的技术，就是在补充了至少一种营养因子的无血清培养基中培养该细胞。
国际专利申请WO-A-97/10329号透露了另一项备选技术，就是使用条件性永生细胞系。该细胞系含有一个永生化温度敏感癌基因，该癌基因在允许情况下，维持神经上皮干细胞处于未分化状态。移植后，由于人的体温较高(37℃)，癌基因被关闭，并且细胞也分化成所需要的细胞类型以修补损伤。使用癌基因的优点是能使细胞维持在未分化状态直到移植，此时，细胞对应于特有的损伤，分化为受损伤或丢失的细胞的表型。美国专利5688692也展示了表达非DNA结合的、温度敏感的T抗原的细胞。
然而应当承认，虽然表达癌基因的人类细胞的生命得以延长，但是它们仍然会停止分裂并最终经历极期(细胞死亡)。
也有人建议通过整合人的端粒末端转移酶催化亚基的外源拷贝而重建端粒末端转移酶活性，从而使人类细胞永生化(Bodnar等，科学(Science)，1998；279249-252)。端粒末端转移酶起着维持染色体末端的端粒的作用，而且人们相信正是在细胞复制期间端粒的逐渐缩短促成了衰老，因此重新构建了端粒末端转移酶以使细胞永生化。人的端粒末端转移酶现在已经被用来使许多不同类型的细胞永生化。
Counter等，PNAS(美国)，1998；95(25)4723-14728，也表明端粒末端转移酶催化亚基(hTERT)的异常表达能允许终末衰老细胞增殖，超越极期而达到细胞永生化。被研究的细胞是用表达SV40 T抗原的癌基因转化的。然而，作者推断单独hTERT表达可能足以使细胞永生化，而且hTERT的激活作用可能是肿瘤进展的一个关键性步骤。因此，该文章的综合结论就是用hTERT转化细胞会使细胞永生化。这意味着这样的细胞不适合用于移植疗法。
因此，尽管许多上述公开的技术可能是有用的，但仍然需要某些方法，以获得在移植之前保留无限增殖能力，而在移植后则失去无限增殖能力的细胞。
发明概述本发明的基础是实现了用条件性诱导癌基因和至少端粒末端转移酶复合物的催化亚基转导的细胞在允许条件下是可以无限增殖的，但在非允许条件下则失去无限增殖性。
依照本发明的一个方面，重组或遗传工程哺乳动物细胞包含条件性诱导或温度敏感癌基因，和编码至少端粒末端转移酶复合物的催化亚基的外源性多核苷酸。
依照本发明的第二方面，重组多核苷酸结构包含编码至少端粒末端转移酶复合物催化亚基的基因，和条件性诱导或温度敏感的癌基因。
依照本发明的第三方面，使哺乳动物细胞永生化的方法包括在正在增殖的哺乳动物细胞中引入条件性诱导癌基因和编码端粒末端转移酶基因催化亚基的外源性多核苷酸。
依照本发明的第四方面，本发明的细胞可以用在治疗方面，特别是用于制造药物，以治疗与细胞丧失或损伤有关的疾病。举例来说，神经上皮干细胞可以用于治疗与脑损伤有关的病症，例如阿尔茨海默氏病。
已经发现本发明的细胞保持高度的稳定性以及在非允许温度下不能无限增殖。
这是一个令人惊讶的和重要的发现，正如预期的那样，它是在现有技术的基础上，为了使细胞维持永生化，通过重构端粒末端转移酶活性而完成的。然而，看来虽然编码端粒末端转移酶基因是组成型的，但是端粒末端转移酶并不起着保持永生性的作用。条件性的保留和稳定性的增加，使本发明的细胞适合经过连续的传代而获得供移植使用的细胞系。
附图描述以下附图用于阐述本发明。
图1是含有hTERT和编码SV40大T抗原的温度敏感癌基因的多核苷酸结构的示意图；和图2是备选结构的示意图，其中hTERT和癌基因的顺序与
图1的结构有所不同。
发明描述本发明公开了制备适合移植疗法的细胞的方法，直到移植的时候，该细胞都可以无限增殖。
该细胞内需要存在条件性诱导癌基因。在此使用的术语“条件性诱导”是与癌基因有关的，即它的表达在确定的情况下可以被调节。癌基因将会在所谓的允许条件被满足的时候表达。举例来说，一些癌基因是温度敏感的，只有在环境温度低于某一个确定值时才会表达。在本发明的一个实施方案中，所使用的癌基因是非DNA结合的、温度敏感的、SV-40大T抗原基因的突变体(U19tsA58)。合适的备选基因也是已知的并包括多瘤病毒T抗原癌基因。
细胞也需要编码至少端粒末端转移酶复合物的催化亚基的外源性多核苷酸。在此使用的术语“外源性”在它的正常上下文中指的是被导入细胞的多核苷酸，并与自然存在的内源性多核苷酸相区别。端粒末端转移酶复合物的催化亚基是一个具有逆转录酶活性的酶，在本领域广为人知。人亚单位公开在GB-A-2317891中。
癌基因和编码端粒末端转移酶的多核苷酸可以被包含在重组DNA或逆转录病毒载体或结构中，以转导/感染细胞。这两个成分可以被引入同一个载体，或每个成分也可以分别包含在单独的载体内。本发明的载体或结构可能进一步包含合适的启动子区域以起始DNA转录，以及可用来识别那些被转化/感染的细胞的选择性标记。表达的调节可以用技术人员所熟知的方法来完成。举例来说，可以使用长末端重复(LTR)启动子进行调节。备选启动子对技术人员而言也是很明确的。举例来说，使用巨细胞病毒(CMV)启动子进行调节可能是有效的。CMV启动子是一个很强的启动子，当所用的细胞是神经细胞，例如神经上皮干细胞时，它可以作为优选启动子。
将合适的结构导入细胞的方法也是技术人员所熟知的。
任何哺乳动物细胞都可能用于本发明中。
举例来说，所选用的细胞可能是内皮细胞，并可以被用于腿部，心和其他的器官的血管再生成。优选的细胞是人的体细胞，例如人的上皮干细胞，它能够分化成特殊的细胞类型。特别优选细胞是人的神经上皮干细胞，它可用于神经移植，修补细胞损失或损伤，并且纠正行为或心理上的缺陷。备选细胞也可以是分化了的细胞，例如胰岛的β细胞。另外的备选细胞可能包括但不限于可来自内分泌腺的细胞、视网膜细胞、耳蜗细胞、肝细胞、成骨细胞和破骨细胞、成肌细胞和角质形成细胞。
癌基因和端粒末端转移酶优选在培养早期、通常是在最初10次细胞分裂以内被引入细胞内。癌基因和端粒末端转移酶导入细胞的顺序并不是本方法成功与否的关键，虽然优选将端粒末端转移酶首先导入。这是因为已惊讶地发现首先导入端粒末端转移酶能更好地保证形成二倍体细胞系。
被转导或感染的细胞可以在本领域技术人员所熟知的条件下培养。优选在非加压条件下培养该细胞。基于传统的培养技术，技术人员将会对每个特别的细胞类型提供合适的培养条件，。
本发明将会参照附图在下列实施例中作进一步描述。这些实施例展示的是被温度敏感癌基因和端粒末端转移酶复合物的催化亚基所转导的合适的人类细胞，当培养的细胞被传代到合适的培养基中时，它可能保持稳定性。
实施例11.乳房小叶间成纤维细胞(HMF)和乳房微脉管内皮(MMVE)细胞的分离在获得接受整形外科手术(乳房复位成形术)的患者的同意后，从其正常的乳房组织中制备乳房小叶间成纤维细胞和乳房微脉管内皮细胞的培养物。小叶间成纤维细胞的培养物按照Atherton等，J.CellSci.，1072931-2939的方法制备，并用补充了10％胎牛血清和抗生素(青霉素/链霉素)的Dulbecco’s改良Eagles培养基(DMEM)维持培养。来自微脉管的内皮细胞是用免疫磁分类法从原代培养物中分离出来的，使用的抗体是抗凝血调节因子的QBEND-40鼠单克隆抗体，基本按照Drake和Lock，Human Reprod.，1992；61156-1159所描述的方法操作。内皮培养物被建立并维持在EGM-2培养基(Biowhittaker)中。
2.体外培养细胞直至衰老细胞制备物作为对照培养以确定衰老点。在EGM-2培养基中，发现细胞的培养寿命在10-16次群体倍增之间。除了粒状的颗粒在细胞质中蓄积之外，衰老的细胞在其他方面与其早期传代副本很相似，区别仅在于它完全丧失了有丝分裂能力。
3. tsA58-U19的转导和达到极期的延长生长。
当细胞处于第6-9次群体倍增期并依然增殖时，用存在于含有新霉素抗性(neo-r)基因的pZIP载体中的SV-40 T抗原基因的双重组突变体tsA58-U19(Almazan和McKay，Brain Res.，1992；579(s)234-245)转导来自不同的单独供体的细胞制备物。用Stamps等，Int.J.Cancer，1994；57(6)865-874描述的无辅助病毒的兼嗜性逆转录病毒包装系统(PA317，克隆8)进行转导。用8μg/ml Polybrene作为辅助剂以增强病毒摄取。
用0.25mg/ml遗传霉素进行选择后，转导频率变动在10-25％之间。在培养温度变为tsA58的允许温度(33.5℃)之后，这些培养物按1∶4的分散比被进一步传代33到56个群体倍增数。在此期间，所有的细胞都保持温度敏感性，在36.5℃和以上的温度都极少生长或不生长。然而最后，所有的生长都停止了，表现为反常有丝分裂和细胞形态的异常，包括细胞大小的异常和核异质，预示极期到来。共有总数不少于108的细胞被传代到极期，没有观察到一例“自发的”永生化。与此相反的是乳房上皮细胞，每当有5×106细胞维持到极期，就会有大约一个u细胞发生永生化。
4. h-TERT转导和保持条件性生长的随后永生化。
使用人类兼嗜性包装系统(TE-FLY)，将来自同一个供体的、被tsT抗原系统转导过的早期传代细胞(MMVE-2)用人类端粒末端转移酶基因催化亚基的全长cDNA拷贝和潮霉素B-抗性基因作进一步的转导，该cDNA拷贝存在于pBabe载体(Morgenstern和Land，核酸研究(NucleicAcidResearch)，1990；183587-3596)中。在此使用了一系列四克隆包装细胞系，它们是在此之前根据转入人类靶细胞系(EJ膀胱癌细胞)的潮霉素抗性的最高效价而选择出来的。每个都一式两份用于在8μg/ml polybrene存在时转导MMVE-2tsT细胞。用25μg/ml潮霉素B选择后可观察到成功的转导。
令人惊讶的是，在长达40多周的时间内，转导后的细胞似乎克服了衰老，并继续在33.5℃增殖，没有任何明显的极期表现或增殖速率的改变。到现在为止，细胞以恒定的比率经历了100次以上的群体倍增，而且似乎达到功能性永生化。
令人惊讶的是，当在33.5、36.5和39.5℃增殖培养细胞以测试其温度敏感性的时候，hTERT转导的MMVE-2tsT细胞象那些仅含有tsT的早期传代细胞一样对温度敏感。和预期相反，在36.5℃只有极少细胞生长，在39.5℃则没有细胞生长，也就是说，细胞达到条件性永生化。所有的培养物都是在包含了多种上皮特异性生长因子以及2％胎牛血清(FCS)的EGM-2培养基中培养的，这些因子包括b-FGF、VEGF、IGF-2和肝素，这样就避免了在次佳或‘加压’生长条件下测试细胞。
为了确定温度诱导的生长停止变得不可逆转的程度，使用一种克隆发生实验分析了成纤维细胞培养物，其中集落形成率(CE)是在39.5℃经历了生长停止的不同阶段之后、在最佳的情况下(5％氧气，温度33.5℃)测得的。大多数培养物的集落形成率都确实降低了，并且降低程度与其在非允许温度下的时间成比例。例如一个乳房小叶间成纤维细胞培养物在处于39.5℃ 14天之后，集落形成率已经降低到对照值的5％以下，并且绝大多数集落变小和夭折。这个结果表明被转导的细胞的进行性不可逆性，同时表明这是由T抗原的热钝化而不是由非特异性热休克所造成的。
研究人员也通过将培养物进行衰老活化的酸性β-半乳糖苷酶染色，检测了这些细胞到T抗原失活之后是否经历生物化学衰老的。在处于39.5℃ 4-8天之后，所有的成纤维细胞培养物都显示有不同数目的细胞(1-10％)呈阳性，然而与之对应的处于33.5℃的培养物中则没有检测到阳性细胞(＜0.1％)。这与只含有T抗原的乳房小叶间成纤维细胞的极期培养物形成了鲜明的对比，那里有53％的细胞呈阳性。这表明这些永生化的细胞依赖T抗原维持生长，T-抗原的失活会引起细胞生长的不可逆性中止并进入衰老。
研究人员同样也对细胞培养物进行了染色体组型分析，以确定逆转录病毒基因转导的顺序和时间选择是否影响了所产生细胞的染色体状况。在乳房微脉管内皮细胞和乳房小叶间成纤维细胞中都观察到二倍体型或近二倍体型的染色体数(46)，这些细胞都是在早期(就是在最初的10次细胞分裂内)引入两种基因后得到的，首先引入的是hTERT基因。当在早期引入两种基因并且首先引入癌基因时，细胞显示具有双型染色体组型——近二倍体型和近四倍体型。这是一个令人惊讶的发现，而且也表明可以通过选择首先将端粒末端转移酶的催化亚基插入细胞内而更有效地制备二倍体细胞。
总而言之，获得的结果令人惊讶显示包含编码端粒末端转移酶催化亚基的全长基因和温度敏感癌基因的细胞依然保持条件性生长，也就是说细胞在高温条件下不是无限增殖的。
上述的结果显示用温度敏感癌基因和端粒末端转移酶催化亚基分开转导的细胞，与仅含温度敏感癌基因的细胞相比，能展现出经过改善的特性。
虽然分开转导展示出更好的结果，但是构建一个包括癌基因和编码端粒末端转移酶的基因在内的合适载体可能更容易些。
实施例2本实施例展示的是共表达三个基因的合适的表达载体的制备；这三个基因分别是来自SV40早期区非DNA结合的突变体的不耐热T抗原(U19tsA58)；端粒末端转移酶复合物的催化亚基hTERT(cDNA)(Counter等，PNAS，1998；95(25)14723-14728)；以及一个显性的选择性新霉素磷酸转移酶抗性标记(Neo)，它编码对G418(Clontech)的抗性。最终的结构组装在以莫洛尼鼠类白血病病毒(Mo MuLV)为基础的高效价逆转录表达载体pBabe中(Morgenstern和Land，同上)。通过逆转录病毒的生命周期将SV40早期区转入仅制造大T抗原的病毒。所有结构都是通过氨苄青霉素选择在rec-A宿主(MC1061的JS4-rec-A衍生物)中组装的。
共构建了两个版本的载体；结构1该结构结合
图1加以说明。Mo MuLV LTR用来驱动hTERT，而SV40早期启动子用来驱动U19tsA58和Neo。一个内部的核糖体进入位点(IRES)整合在U19tsA58和Neo基因之间(融合到Neo基因的读框内)，诱导经由真核核糖体的翻译再起始。
结构2该结构结合图2加以说明。Mo MuLV LTR用来驱动U19tsA58，而SV40早期启动子用来驱动hTERT和Neo。IRES序列插入在hTERT和Neo之间。
克隆策略每个载体都由三个部分组装而成。pBabe Neo-hTERT载体(hTERT从Whitehead研究所的R.A.Weinberg所提供的pCI-Neo-hTERT中切下)和pBabe-Neo-U19tsA58载体(U19tsA58的插入方向与逆转录病毒转录方向是同义的)被分别用来制备结构1和2的前端。
IRES的克隆和融合到Neo基因读框中的操作都是在克隆载体pPolyIII-I(从Mill Hill的D.Kioussis处获得)中完成的。pPolyIII-I是一个非常有用的构建基因序列的载体，因为它含有一个很大的多接头，其中包括许多识别6核苷酸序列的限制性核酸内切酶的位点。第三个组分是从pBabe Puro(带有嘌呤霉素抗性基因的pBabe)载体中克隆出来的。
结构1A.IRESNeo的克隆Neo序列是用PCR方法从pLXSN(Clontech)载体中扩增出来的。为了使结构总长度维持最短，只扩增了Neo编码区域(pLXSN的2066bp-2860bp)。586bp的IRES(脑心肌炎病毒(EMC)RNA 5’非编码区域)是从Novogen公司的pCITE-1载体中得到的。在脑心肌炎病毒的起始区的2918位有一个BalI克隆位点，在pCITE-1的2925位有一个NcoI位点，这两个位点可用来将外源序列按读框插入。
推荐将缺乏自身AUG的外源序列按读框与病毒的2915-2917位AUG融合。然而如果用BalI酶切开，在外源序列AUG后面的第一个密码子的起始处的碱基将会是G。这与Neo基因的序列不相容，该基因在AUG后第一个碱基是A。为了克服这个问题，研究人员设计了用来从pLXSN中扩增Neo序列的5’Neo引物，以重新构造2918和2929位碱基之间的IRES序列。
正向Neo引物(SEQ ID NO.1) 为了将Neo序列的3’端插入pPolyIII-I，研究人员设计了包括一个SalI位点和一个ClaI位点的3’PCR引物(为了从pPolyIII-I克隆到pBabe之内)。
反向Neo引物(SEQIDNO.2) 因此可以用EcoRI和BalI酶将IRES序列从pCITE-1中切下(同裂酶是MlsI、MscI)，并将该序列连接到pPolyIII-I的EcoRI和BalI位点。然后使用前面提到过的正向和反向Neo引物将Neo序列从pLXSN载体中扩增出来，在将它连接到pPolyIII-I-IRES的BalI和SalI位点之前，用SalI酶切开该PCR产物的3’区。
B. U19tsA58的插入用BamHI酶从pZip-U19tsA58(由Ludwig肿瘤研究所的P.Jat提供)中切下U19tsA58，并将其插入pPolyIII-I-IRESNeo的BamHI位点，基因方向与逆转录病毒的转录方向是同义的。
C.最终结构最终结构是由下面三个部分连接而成的(i)U19tsA58-IRES-Neo，它是从pPolyIII-I-U19tsA58-IRESNeo中用SfiI和ClaI酶切下来的；(ii)最终结构的前端部分，它是用SfiI和NotI酶从pBabe-Neo-hTERT载体中切下来的，是左手区所必需的；和(iii)包含pBS ori的片段，它是用ClaI和NotI酶从pBabe-Puro载体中切下来的，是载体的右手侧所必需的。
最终结构如
图1所示。
结构2A. pPolyIII-I-hTERT-IRESNeo为了将hTERT cDNA和IRESNeo克隆进pPolyIII-I，pBabeNeo-hTERT首先由SalI酶消化，它切割的是hTERT的3’端。hTERT的克隆位点是EcoRI(5’)和SalI(3’)，然而hTERT不能克隆到pPolyIII-I的SalI位点，因为这是IRESNeo 3’端的克隆位点。因此，在用EcoRI从pBabe Neo-hTERT中切下该cDNA序列之前，首先要钝化hTERT序列的末端。pPolyIII-I-IRESNeo由EcoRI切开、钝化，再由SalI切下IRESNeo。然后hTERT和IRESNeo被克隆到pPolyIII-I的EcoRI和SalI位点，3’hTERT和5’IRESNeo之间进行钝端连接。
结构2的组装涉及到下列三个部分的连接(i)hTERT-IRESNeo，它是从pPolyIII-I-IRESNeo的SfiI和ClaI位点切下来的；(ii)结构2的左手侧，它是用SfiI和NotI酶消化pBabe-Neo-U19tsA58载体而获得的；和(iii)结构2的右手侧，它是用ClaI和NotI酶消化pBabe-Puro载体而获得的。
最终结构如图2所示。
关于该结构的设计，人们可能更希望由CMV启动子来调节癌基因和hTERT的表达。这可以通过在一个逆转录载体中，使用IRES序列将这两个组分连接起来，插入CMV启动子的下游而实现。
该结构可以用于转导合适的细胞，以制备传代时具有提高了稳定性的条件性永生化细胞。
本发明的重组细胞可以用于治疗方面。给患者使用的制剂的制备方法对技术人员而言是显而易见的。根据当前在以细胞为基础的治疗方面的实践，选择合适的赋形剂、稀释剂等等对技术人员而言同样是很简单的。需要给患者使用的细胞数量将会根据治疗的形式、疾病/损伤的严重程度、以及在整个治疗期间是否需要应用多个剂量而有所改变。然而，根据现行的细胞移植疗法，技术人员可以很容易地决定适当的治疗方案。
序列表<110>ReNeuron LimitedLudwig Institute for Cancer Research<120>细胞的条件性永生化<130>REP06053WO<140>(仍然未知)<141>2000-09-18<150>99307405.3<151>1999-09-17<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>1ccacaaccat gattgaacaa gatg 24<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>2ccgtcgacat cgattcagaa gaactcgtca ag 3权利要求
1.一种哺乳动物细胞，其包含条件性诱导的癌基因和编码端粒末端转移酶复合物的催化亚基的外源性多核苷酸。
2.权利要求1的细胞，其中癌基因和外源性多核苷酸包含在重组载体中。
3.权利要求1或2的细胞，其中癌基因是温度敏感的。
4.任何前述权利要求的细胞，其是人的体细胞。
5.任何前述权利要求的细胞，其是哺乳动物的基质成纤维细胞或哺乳动物的微脉管细胞。
6.权利要求1到4中任意一项的细胞，其是人的干细胞。
7.权利要求6的细胞，其是神经上皮干细胞。
8.任何前述权利要求的细胞，其中癌基因包含SV-40 T抗原基因的温度敏感突变体。
9.权利要求8的细胞，其中突变体是tsA58-U19。
10.一种重组多核苷酸，其编码端粒末端转移酶复合物的催化亚基和条件性诱导的癌基因。
11.权利要求10的多核苷酸，其进一步包含选择性标记基因和启动子区域。
12.使哺乳动物细胞永生化的方法，其包括将条件性诱导癌基因和编码端粒末端转移酶复合物催化亚基的外源性多核苷酸引入正在增殖的细胞中。
13.权利要求12的方法，其中癌基因和外源性多核苷酸是在最初10次细胞分裂期间内被引入细胞内的。
14.权利要求12或13的方法，其中外源性多核苷酸在癌基因之前被导入细胞内。
15.权利要求1到9中任意一项的细胞在药物制造中的应用，其中所述药物用于治疗与细胞损失或损伤有关的疾病。
16.权利要求15的应用，其中所指的细胞是神经上皮干细胞。
全文摘要
一种重组的、或遗传工程的哺乳动物细胞,含有一种条件性诱导癌基因和一种编码端粒末端转移酶复合物的催化亚基的外源性多核苷酸。这种重组细胞可用于治疗,以代替缺失的或损伤的细胞。
文档编号C12N15/12GK1373804SQ00812878
公开日2002年10月9日 申请日期2000年9月18日 优先权日1999年9月17日
发明者P·杰特 申请人:兰诺龙有限公司, 勒德维格癌症研究院