Mycer永生化肝细胞的制作方法

专利名称：Mycer永生化肝细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及可放大规模以用于临床和商业用途的有条件地永生化的肝细胞。
背景技术：
肝脏负责对体内的药物和毒物的解毒作用。肝脏中最常见的细胞类型是肝细胞；每个肝细胞都能执行整个器官所需要的功能。由于药物在肝脏中代谢，通常在肝组织中进行药物候选物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性测试(ADME/Tox)以得到其体内的潜在毒性。
传统的ADME/Tox测试在新药开发的后期进行，但是不能通过毒性测试的新药的数目大约占30％。因此人们非常希望能够开发出可应用于药物开发早期的高通量ADME/Tox筛选，由此节省时间和金钱。
许多体外的ADME/Tox研究都关注于肝脏中主要的代谢酶细胞色素P450家族的酶类，同时对于P-糖蛋白的研究和CaCo-2细胞系的吸收研究也很常见。
已有一些生物分析系统被用于评价细胞色素P450酶的各种亚型，但是它们都有一个主要的缺点，就是它们都不能预计体内毒性。现有分析的主要缺点是一次仅能研究数目很有限的一些肝脏酶，限制了分析和肝脏本身的环境之间的相似性1，2。
人类肝细胞是最接近人类肝脏的体外模型。在ADME/Tox研究中经常使用原代肝细胞培养，此时它们表达“正常的”肝细胞表型。但是，这些细胞的效力较低，并且标志物的表达在批次间差异较大。胎儿肝细胞在被解离和铺于培养基中的时候在合适的培养条件下增殖很快，但是胎儿肝细胞中许多酶的表达水平又与成人不同。例如，cyp3A4是一种主要的代谢酶，它在胎儿肝细胞中的表达水平就比在成人肝细胞中低得多3。成人肝细胞在培养中也是有问题的。由于成人肝细胞增殖能力较差，所以在体外条件下即使用生长因子来刺激也很难使它们的增殖超过一次4。
原代肝细胞中存在的问题使人们开发了肝细胞细胞系。现在已有一些可用的人类肝细胞细胞系，它们中的一些来源于成人肝脏，一些来源于胎儿肝脏，它们可能经过用病毒进行的永生化处理或未经永生化处理而仅仅是简单培养5，6。然而，由于包括细胞色素P450在内的许多肝细胞标志物在细胞培养中的表达量急剧下降或者完全不表达，所以没有一种细胞系表达“正常的”人类肝细胞表型7。有七类肝细胞的mRNA标志物，表1列出了这七类标志物及每一类的实例。
表1用于表型评价的肝脏mRNA标志物


通过向培养基中加入例如3-甲基胆蒽和制瘤素M8，9的物质，可能可以诱导和上调一些肝脏标志物的表达。但是，目前通过向培养基中加入物质或改变培养条件，还不能够将全部或大部分的肝细胞酶上调至“正常的”水平10。也可以从包括大鼠和灵长类动物的其他物种获得一些肝细胞系11，12，但是这些细胞系也有标志物表达较低的问题，另外还会有物种间差异的问题。
因此，需要一种表现正常肝脏功能和表达正常肝细胞标志物的人类肝细胞细胞系。这种细胞系可以用于研究大多数I期和II期药物代谢酶和研究细胞与细胞的接触，它应是一种无限细胞系、可用于高通量系统、能得到重复性高的结果、没有种间差异、应该性价比较高1。

发明内容
本发明的基础是构建一种有条件地永生化的肝细胞，它在细胞培养基中存在4-羟基他莫昔芬(4-OHT)的条件下为永生化的，但在不存在4-OHT的条件下表达正常的肝细胞标志物。由一种c-myc/雌激素受体融合蛋白负责使肝细胞具有有条件地永生化的特征。
根据本发明的第一方面，提供一种含有以单多肽链形式表达的融合蛋白的哺乳动物肝细胞，所述融合蛋白包括myc家族的癌蛋白和雌激素受体或它们的功能片段。
根据本发明的第二方面，提供一种使肝细胞有条件地永生化的方法，包括如下步骤(i)在肝细胞中以单多肽链的形式表达一种融合蛋白，所述融合蛋白包括myc家族的癌蛋白和雌激素受体或它们的功能片段；以及(ii)将步骤(i)所得的肝细胞与雌激素受体的配体相接触，由此有条件地永生化所述肝细胞。
根据本发明的肝细胞在潜在药物的体外测试中尤其是ADME/Tox测试中特别有用。
根据本发明的第三方面，提供一种在体外评价用作药物的化合物的适用性的方法，包括如下步骤(i)将潜在药物化合物与含有以单多肽链形式表达的融合蛋白的肝细胞相接触，所述融合蛋白包括myc家族的癌蛋白和雌激素受体或它们的功能片段；(ii)测量该肝细胞的反应，由此确定所述化合物对该肝细胞的影响并评价该化合物用作药物的适用性。优选地，该肝细胞可通过从培养基中除去例如4-羟基他莫昔芬(4-OHT)等的雌激素受体配体而停止生长，而且该肝细胞应发育为完全分化的表型。
本发明的另一方面为该肝细胞作为药物的用途和该肝细胞在制备用于治疗肝脏疾病的药物中的用途。本发明的又另一方面是根据本发明的肝细胞在肝脏辅助设备(LAD)中的用途。
具体实施例方式
本发明鉴定了在肝细胞中myc/雌激素受体融合蛋白的表达可以使肝细胞有条件地永生化。当肝细胞在存在雌激素受体配体的条件下培养时，它是永生化的。从肝细胞中除去该配体就去掉了细胞的永生能力，细胞则显示“正常的”特征，并可望从肝脏原位肝细胞中表达肝细胞的标志物。
本文所使用的术语“肝细胞”指的是可由肝脏获得的任何上皮细胞，它可以实行由肝脏进行的一种或多种功能。来源于任何物种的肝细胞都在本发明的范围之内，然而优选的肝细胞为哺乳动物的肝细胞，最优选地为人的肝细胞。可以使用胎儿或成人的肝细胞，也可以使用在体外由前体细胞分化而来的肝细胞，例如由胚胎干细胞或多能干细胞分化而来的肝细胞(参见US 6506574)。
根据本发明的肝细胞保留了“正常的”肝细胞的特征性标志物。有七类肝细胞的mRNA标志物，表1列出了这七类标志物及每一类的实例。在本专利申请详述的研究中，将这些标志物种的五种用来表征人类胎儿肝脏的克隆，它们分别为清蛋白、甲胎蛋白、细胞角蛋白-18、cyp 3A4和cyp3A7。
本文中使用的术语“永生”指的是有能力进行扩展增殖的细胞。本发明的肝细胞当在存在例如4-OHT的雌激素受体配体的条件下生长时是“永生的”。正如本领域技术人员所理解的那样，由一个细胞或一个细胞群落在体外扩展成的细胞培养物被称为“细胞系”。它与原代细胞不同，原代细胞仅能分裂有限的次数，通常少于10-20次分裂，然后细胞就会衰老并最终死亡。本文中使用的术语“有条件地永生”指的是细胞在某一特定的生长条件下为分裂中的未成熟细胞，而在其他条件下为完全成熟的细胞。根据本发明，负责永生化细胞的环境条件为雌激素受体配体的存在。
可以持续的永生并可被雌激素受体配体永生化的肝细胞的特征是该肝细胞中存在myc/雌激素受体融合蛋白。不希望拘囿于理论，似乎该配体(例如4-OHT)激活了雌激素受体。雌激素受体的激活使癌蛋白myc二聚体化并被转运至细胞核内，在核内它起转录因子的作用，启动允许增殖发生的基因的表达。在没有配体时，含有myc癌蛋白的融合蛋白仍然被表达，但是它停留在细胞质中，而不会发生进一步的增殖。因此可向培养基中加入配体以使肝细胞增殖(永生化)，还可以除去配体以使细胞表现为正常的非增殖肝细胞。
本发明的肝细胞由于myc/雌激素受体融合蛋白的表达而有条件地永生。本文中使用的术语“融合蛋白”指包括天然状态下分开表达的两种蛋白或肽序列的重组蛋白，它以单多肽链的形式表达。
融合蛋白可包括任何myc蛋白和任何雌激素受体或这些蛋白的任何片段，只要这些片段分别保留了被雌激素受体配体激活的能力和激活转录导致细胞增殖的能力即可。优选地，myc蛋白为c-myc。优选地，雌激素受体被突变，使它与17β-雌二醇的高亲和结合受阻而不影响它对配体4-OHT的高亲和结合。这种突变可为缺失、置换或插入一个或多个氨基酸残基。在一个优选的实施方案中融合蛋白由人类c-myc基因与小鼠雌激素受体相融合而组成。更优选地，融合蛋白含有如本文中SEQID NO.2所定义的氨基酸序列。如前所述，SEQ ID NO.2的任何同系物或功能性片段都在本发明的范围之内。
如本文所述，术语“同系物”指两种或多种生物多聚体之间的相似性或同一性，所述生物多聚体包括DNA、RNA和蛋白质序列。序列同一性的概念为本领域所熟知，指的是两个序列之间同一性的程度。相似性的概念也同样为本领域所熟知，在考虑两个序列之间的相像程度时要包括对结构和功能影响不大的两个序列之间的保守性差异。例如谷氨酸可被天冬氨酸置换而对蛋白质结构或功能影响不大，这两个残基就是“相似的”。相反地，天冬氨酸残基与苯丙氨酸残基之间就没有相似性。本发明范围内包括的同系物必须与本文定义的小鼠雌激素受体和人类c-myc序列具有高度的相似性。同一性和相似性可通过任何熟知的算法进行计算，所述算法例如Needleman-Wunsch、Smith-Waterman、BLAST或FASTA。同源性可在核酸水平或氨基酸水平上测定。优选地，本发明范围内的同系物应在核酸水平或氨基酸水平上具有至少50％、更优选地至少60％、再更优选地大于70％、最优选地大于80％、例如90％的同源性，所述同源性是使用BLAST程序在默认条件下计算的。
本发明的肝细胞表达c-myc/雌激素受体融合蛋白。编码该融合蛋白的多核苷酸分子在本文中被称为“融合多核苷酸”，它可以以任何形式存在于肝细胞中，例如为以质粒形式存在于肝细胞中或整合至宿主的基因组中。
优选地，通过将融合多核苷酸引入至肝细胞基因组中而使得肝细胞有条件地永生化。将异源多核苷酸整合至宿主基因组中的方法为本领域所熟知，可以使用任何合适的方法。优选地，使用反转录病毒感染来将融合多核苷酸整合至肝细胞基因组。用于将遗传物质整合至外源基因组中的反转录病毒载体为本领域所熟知，可以使用任何这样的载体。优选地，载体为兼向性反转录病毒，最优选地，载体为pLNCX(BD BiosciencesClontech)。
可在任何合适的产生病毒的细胞中将载体与融合多核苷酸装配在一起。优选地，病毒由来源于TEFLY病毒生产细胞系的Fly-CO42细胞产生。
pLNCX载体含有驱动新霉素抗性基因的LTR启动子。在筛选过程中在培养基中使用新霉素(也被称为遗传霉素和G418)以使得仅有表达新霉素抗性基因的细胞存活下来。可在未感染的靶细胞上进行新霉素的滴定以确认消除未感染细胞所需要的浓度。可以使用任何抗生素抗性基因来帮助筛选感染细胞，但是抗生素抗性并不是必须的。
可以使用任何启动子来启动融合多核苷酸的表达。优选地，该启动子与启动任何抗生素抗性基因的表达的启动子不相同。优选地，用cmv启动子来驱动融合多核苷酸的表达。
合适的融合多核苷酸的实例为本文的SEQ ID NO.1所定义的c-mycERTam，它包括与小鼠雌激素受体相融合的人类c-myc基因，该小鼠雌激素受体被突变以消除它与17β-雌二醇的高亲和结合但不影响它对合成药物4-OHT的高亲和结合。可在蛋白质中产生这种功能改变的对多核苷酸的任何突变，包括插入、置换和缺失，都在本发明的范围之内。优选地，突变为点突变。在一个优选的实施方案中，通过引入点突变将681位氨基酸的野生型甘氨酸变为精氨酸。c-mycERTam的同系物和功能性片段也在本发明的范围内。
对本领域技术人员显而易见的是，为将反转录病毒载体整合至肝细胞基因组中，肝细胞应处于增值过程中。为使整合最大化，应在肝细胞高速增值时加入病毒13。为研究增殖速度，优选的对增殖标志物Ki67进行染色，Ki67是一种在细胞周期的G1后期、S期、M期和G2期表达但在GO期不表达的核蛋白14。为进一步提高感染的成功率，可在感染过程中向培养基中加入例如溴化己二甲铵(也被称为聚凝胺)的促进剂。它在高浓度时对一些细胞有毒性，但是它已经成功地用于对人类胎儿肝细胞的感染15-17。
当对根据本发明的肝细胞进行研究时，优选地在任何研究之前除去所有的4-OHT，这是因为4-OHT可产生对细胞色素p450酶CYP3A4的抑制作用，还可能与其他化学物质反应。
根据本发明的肝细胞的用途包括涉及例如药物或毒物的化学物质对肝脏细胞的影响的体外评估的任何方法，包括但不限于内生物和外源物的代谢研究、肝脏毒性和肝癌引发性(hepatocarcinogenicity)的研究、肝脏相关的人类限制性疾病例如肝炎或疟疾的研究和心血管研究。
该细胞专门可用于ADME/Tox测试中，以检测药物候选物是否适用于体内，具体而言是评估药物候选物对肝细胞(以及肝脏)的影响并测定其毒性。如本领域技术人员所理解的那样，在ADME/Tox测试中使用了多种技术。这些技术通常包括在体外使肝细胞与潜在的药物化合物相接触和测量肝细胞的反应。这种反应可以以各种方式测量，包括但不限于测量生长和增殖速度、表达特性和酶活性分析。可以进行潜在药物化合物的滴定，以评估是否存在这样一种剂量使得该化合物在该剂量时对肝细胞有毒性。基于这类测试的结果确定该化合物用作药物的适用性。
在一个优选的实施方案中，培养条件可使完全分化的代谢表达标志物的长期表达最优化。这类培养方法为本领域已知，包括三维培养聚集和胶原夹心培养，这在例如Richert et al.，(2002)28中有述。
特别地，可以预计该细胞可用于高通量筛选。
适用的高通量筛选分析公开于下列文献Waring et al.，(2001)21、Barton et al.，(2002)22、Hamadeh et al.，(2002)23、de Longuevilleet al.，(2003)24、Adam et al.，(2001)25、Seow et al.，(2001)26和Anderson(1991)27，上述每一篇文献的内容都以援引的方式纳入本文。
在根据本发明的肝细胞中使用4-OHT作为增殖信号的优点在于这种合成化学物质在正常人体中并不存在，这使得根据本发明的肝细胞可被用作药物。具体而言，肝细胞可在移植疗法中被用于治疗性细胞系18。已经认识到肝细胞移植是治疗肝脏疾病的一种选择，将健康的肝细胞移植到患病的或被损坏的肝脏中可以替代被疾病损坏的细胞。细胞移植看起来优于器官移植。任何损害肝功能的疾病都可以通过移植根据本发明的肝细胞来治疗，所述疾病包括但不限于癌症、肝硬化、所有类型的肝炎和由于药物或乙醇过量导致的损害。涉及肝细胞的兽医治疗也在本发明的范围之内。
根据本发明的肝细胞也可以用于肝脏辅助设备(LAD)中，肝脏辅助设备也称为生物人工肝脏设备。LAD可以在例如急性肝功能衰竭时执行肝脏的功能。LAD可以置于体外而进行透析作用，或者可被移植至患者体内。LAD的主要用途是在患者急性肝功能衰竭后立刻对患者进行支持，但是也可以在移植后用于支持患者直至移植的肝脏完全发挥功能。LAD通常包括至少一个装有代谢活性肝细胞的容器。然后患者的血液与肝细胞相接触，肝细胞就像肝脏那样对血液进行处理。
通过下面的非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例1材料和方法除另外指明的之外，所有化学物质均购自Sigma公司。
组织培养所有的细胞均在Millennium培养箱(Jencon)中在37℃、5％CO2的条件下生长。细胞在常规基础上培养，每周更换三次培养基。当达到90％会合度时进行传代。
培养基在组织培养过程中使用了八种培养基。人类胎儿肝脏细胞和克隆在所有这些培养基上培养。将这些培养基使用1升的过滤单元(Nalgene)进行过滤灭菌，并在使用前预热至37℃。这八种培养基分别被称为培养基A、B、C、D、E、F、G和H，分别具有下列的组成培养基A无精氨酸Williams E标准培养基(Gibco)，2.2g/L的碳酸氢钠、10％的透析胎牛血清(dFBS)(Gibco 26400-044)、2mM的L-谷氨酰胺、100nM的胰岛素、100 IU/ml的青霉素-链霉素(Gibco)、0.4mM的L-鸟氨酸、5.5μM的氢化可的松、20ng/ml的表皮生长因子(EGF)。
培养基BDulbecco改进eagle培养基(DMEM)，10％的胎牛血清(FBS)(HyClone)、50mg/ml的艮他霉素、2mM的L-谷氨酸、20ng/ml的EGF。
培养基CWilliams E标准培养基(Gibco)∶DMEM(1∶1)，1∶50的不含维生素A的B27添加混合物(50×)(Gibco)、10％的FBS、2mM的L-谷氨酰胺、100IU/ml的青霉素-链霉素、5.5μM的氢化可的松、100nM的胰岛素、10mM的烟酰胺、20ng/ml的EGF、10ng/ml的肝细胞生长因子(HGF)(Peprotech)。
培养基DWilliams E标准培养基(Gibco)∶DMEM(1∶1)，10％的FBS、2mM的L-谷氨酰胺、100 IU/ml的青霉素-链霉素。
培养基EWilliams E标准培养基(Gibco)∶DMEM(1∶1)，4％的FBS、2mM的L-谷氨酰胺、100IU/ml的青霉素-链霉素。
培养基FDMEM F12，0.03％的人血清清蛋白、100mg/ml的人类转铁蛋白、16.2mg/ml的腐胺盐酸盐(putrescine dihydrochlorid)、5mg/ml的重组人胰岛素、60ng/ml的孕酮、2mM的L-谷氨酰胺、40ng/ml的亚硒酸钠(硒)、10单位/ml的肝素钠、40ng/ml的皮质酮、50mg/ml的艮他霉素、10mM的烟酰胺、20ng/ml的EGF、10ng/ml的HGF。
培养基GWilliams E标准培养基(Gibco)∶DMEM(1∶1)，1∶50的不含维生素A的B27添加混合物(50×)(Gibco)、10％的FBS、2mM的L-谷氨酰胺、100IU/ml的青霉素-链霉素、5.5μM的氢化可的松、100nM的胰岛素。
培养基HDMEM，10％的FBS、100nM的胰岛素、5.5μM的氢化可的松、100IU/ml的青霉素-链霉素。
包被使用经过包被和未经包被的组织培养塑料板。将牛皮1型胶原用无菌瓶装水(Fresenius Kabi)稀释作为包被液，按6μg/cm2的浓度加入进行包被。最后在使用前将塑料板用PBS洗涤。
肝脏在终止妊娠后获得人类胎儿肝脏。在研究开始前获得了本地NHS伦理委员会的批准。
解离收到在湿冰上的RPMI培养基中保存而运到的人类胎儿肝脏。将肝脏用+4℃、pH7.2的无钙离子HEPES液(Gibco)洗涤2次，用+4℃、pH7.2、无钙离子、含有0.5mM的乙二醇-双(b-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)的HEPES液洗涤1次。将肝脏用解剖刀切碎并置于37℃的酶溶液中20分钟，所述酶溶液为含有0.05％的胶原酶A(Roche)、0.005％的DNA酶I(Roche)、0.0125％的透明质酸酶(hylaronidase)和0.025％的分散酶II的无钙离子的Hank’s平衡盐溶液，并在溶液中添加5mM的氯化钙。将解离的肝脏用无菌尼龙筛过滤并收集于+4℃的培养基B中。为除去一些较小的血细胞和其他细胞，将细胞在50g条件下离心3次，每次弃去上清液。用血细胞计数器进行细胞计数和存活率计数。一些细胞可用免疫磁性分离法进一步纯化。将细胞铺于早先用胶原包被过的组织培养塑料板上，用培养基B培养4小时使其贴壁。然后将细胞用37℃的不含氯化钙和氯化镁、pH7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)(Gibco)洗涤一次，以除去碎片和未贴壁的细胞，然后加入培养基A。
免疫磁性分离免疫磁性分离是作为从解离的肝脏中筛选肝细胞和成肝细胞的正向筛选步骤和作为用于除去非上皮细胞的进一步纯化步骤而进行的。将大约107个来自解离的肝脏的细胞加入到装有450μl PBS和50μl抗HEA-125(人类上皮抗原)小鼠单克隆IgG1抗体(Progen 61004)的falcon管中，37℃培养30分钟。抗HEA-125抗体识别上皮细胞表面的糖蛋白，抗体可标记包括肝细胞和成肝细胞在内的大多数种类的上皮细胞，但似乎不标记非上皮组织19。然后将管在500g条件下离心2分钟以沉淀细胞，弃去上清液以除去未结合的抗体。将细胞重悬于500μl+4℃的PBS和10μl的已用绵羊抗小鼠IgG抗体包被的M-450磁珠中(Dynal)，在+4℃培养30分钟使得磁珠附着到被抗HEA-125抗体标记的细胞上。向falcon管中加入4.5ml PBS并将管置于磁铁上(polyATtract system 1000，Promega)+4℃放置3分钟。小心地弃去上清液以除去未附着到磁珠上的细胞。这一步骤重复3次。最后将细胞重悬于培养基B中并铺于被胶原预包被的组织培养塑料板上。
传代每次传代细胞或将细胞从瓶中移出时都用37℃的PBS洗涤瓶子一次。然后加入37℃的1×胰蛋白酶和乙二胺四乙酸的混合液(BioWhittaker)，10分钟后细胞从塑料上脱离。将等体积的培养基加至胰蛋白酶和乙二胺四乙酸的混合液中以中和胰蛋白酶，在falcon管中以500g离心细胞5分钟。吸出上清液，在1ml培养基中重悬细胞，并在血细胞计数器上进行细胞计数。将细胞按1∶3的比例在新的瓶中传代。
冷冻/解冻在冷冻细胞时，在可冷冻(cryo-safe)管(Nunc)中用900μl培养基和100μl的cryosure-二甲亚砜(DMSO)(Quest biomedical)重悬细胞沉淀。将细胞在“Mister Frosty”深低温保藏冰箱(Nalgene)中以-80℃放置24小时，其中温度的下降大约为5℃/分钟。在24小时后将细胞移至液氮中长期保存。在解冻细胞时，将细胞从液氮中取出置于37℃水浴中直至解冻，然后将细胞与10ml的37℃培养基混合，并以500g离心细胞5分钟。弃去上清液，并在新鲜培养基中通过轻轻抽吸重悬沉淀，铺于新的瓶中。
收获病毒将源于Fly-C042克隆的产生病毒的细胞在几个T-175瓶中培养至会合。所用的培养基为DMEM glutamax(Gibco)，添加10％的FBS、2mM的L-谷氨酰胺和100IU/ml的青霉素-链霉素。当细胞会合时将瓶用PBS洗涤三遍，向产生病毒的细胞中加入培养基A，每个T175瓶中加18ml，培养8小时。收获培养基并用0.45μm的滤器(Sartorius)过滤并按每个falcon管5ml培养基分成等份，在液氮中快速冷冻并储存于-80℃。
感染在人类胎儿肝脏解离3天后吸出培养基，将细胞用PBS洗涤一次，加入含有病毒和8μg/ml溴化己二甲胺的解冻的培养基，培养8小时。在感染8小时后加入普通的培养基，然后在第二天重复感染一次。感染在10cm培养皿中进行，细胞密度的范围为200细胞/皿至100％会合。在第二轮感染后将细胞传代至不同的培养基中，放置2天后开始筛选。在感染后向所有培养基中都加入100nM的4-OHT。
筛选使用新霉素以除去全部或多数的未感染细胞而保留感染的细胞，为确定新霉素的使用浓度进行了新霉素的滴定。将从未暴露于永生化病毒的来源于解离肝脏的人类胎儿肝脏细胞铺于6孔板上，并使其暴露于浓度范围为0-900μg/ml的新霉素，培养12天，同时设三个平行样本。按100、500和2000细胞/孔的细胞密度铺板，将细胞放置2天后加入新霉素。使用TMS-F显微镜(Nikon)通过观察研究细胞的生长和增殖。基于新霉素滴定的结果，对暴露于永生化病毒的肝脏细胞使用浓度为250μg/ml的新霉素，培养2周。
免疫细胞化学使用免疫细胞化学对细胞进行早期评估。虽然不可能量化表达水平，但是使用免疫细胞化学方法的好处是，仅需要很少的细胞就能观察在细胞群中有多少细胞表达了特异的标志物，还可以观察是否有些细胞的表达水平比其他细胞高。这对于选择将哪些细胞和细胞系用于进行下一步研究以及放弃哪些细胞/细胞系的过程是有很大价值的。
根据Sigma公司的说明书，抗清蛋白抗体与牛血清清蛋白没有交叉反应活性，交叉反应活性在培养基中可能导致与FBS的非特异性结合。抗成纤维细胞抗体与脯氨酰-4-羟化酶的b亚基和二硫异构酶(disulphideisomerase)反应。使用了2种肝细胞瘤细胞系HepG2和HuH7来优化染色，并在肝细胞标志物的实验中用作阳性对照，将人脑细胞系CTX-08用作阴性对照。所有染色实验都在多孔板上进行并使用下列步骤。吸出培养基并将细胞用PBS洗涤一次，并在含4％多聚甲醛的PBS中在室温(RT)下固定15分钟。吸出4％多聚甲醛，将细胞用PBS洗涤三次。对于ck-18、成纤维细胞和Ki67的染色，细胞在含0.1％tritonx-100的PBS中透化20分钟。对于清蛋白和AFP染色，细胞在冰冻的甲醇中透化5分钟。然后将细胞用PBS洗涤一次，并在含10％的正常山羊血清(NGS)(Vector)的PBS中封闭30分钟。加入用含1％NGS的PBS稀释的一抗，室温放置1小时，但是对Ki-67例外，其条件是放置2小时。将各孔用PBS洗涤3次，每次5分钟，然后加入用PBS稀释的二抗，室温放置1小时。二抗被～488nm的波长激发，发出～525nm的光(绿光)。在培养1小时后，将各孔用PBS洗涤3次，每次5分钟，加入用PBS以1∶25000稀释的烟酸己可碱(染色DNA的化学物质)并在室温下放置2分钟。烟酸己可碱被～350nm的波长激发，发出～425nm的光(蓝光)。最后将各孔用PBS洗涤3次，每次5分钟，并将其保留在最后一次的洗涤液中。对于抗c-myc的染色，如前所述对细胞进行固定、封闭和用triton x-100透化。加入一抗后放置过夜，加入二抗后放置1.5小时。使用Leica DMRA荧光显微镜和C4742-95数码相机(Hamamatsu)和Hamamatsu图像PRO计算机软件进行所有分析。
总RNA提取使用RNeasy mini kit(Qiagen 74104)进行总RNA提取。每次提取使用最多为5×106个细胞的细胞沉淀。用含10μl/ml2-巯基乙醇的350μl的RLT缓冲液破坏细胞，将样品在20号注射器中通过10次使其均匀化。将无水乙醇(Joseph Mills有限公司)稀释至70％，并向样品中加入350μl，并用滴管将其混合。将样品转移至RNeasy mini柱上，并以8000g旋转15秒。加入350μl RW1洗涤缓冲液，并以8000g离心15秒。向RNeasy mini柱膜上加入用70μl RDD缓冲液(Qiagen)稀释的10μl无RNA酶的DNA酶1(Qiagen 79254)，放置15分钟。加入350μl RW1洗涤缓冲液，并以8000g离心15秒，加入500μl的RPE缓冲液，将样品以8000g离心15秒，再加入500μl的RPE缓冲液，将样品以8000g离心2分钟。最后在柱上加入50μl无RNA酶的水，以8000g离心1分钟。用无RNA酶的管收集50μl含RNA的水，并用GeneQuant pro分光光度计(Amersham pharmaceutical biotech AB)检验其纯度和数量。将样品储存于-80℃。
制备cDNA为了制备cDNA，将提取的总RNA在冰上解冻，并取出50ng与下述成分在无DNA酶/RNA酶的管中在冰上混合0.25μl的RNasin RNA酶抑制剂10.000u(Promega N2115)、0.067μl的3μg/μl的随机引物(Invitrogen 48190-011)、2μl的10×缓冲液RT、2μl的dNTP混合物(每种为5mM)、1μl的Sensiscript RT和无RNA酶的水(全部来自Quiagen试剂盒205213)，混合后终体积为20μl。将管置于37℃水浴中60分钟，转移至93℃热击5分钟，并迅速在冰上冷却。将cDNA储存于-20℃冰箱中。
c-myc-ER的PCR使用titanium taq PCR试剂盒(Clontech laboratories)进行c-myc-ER的PCR，所使用的引物见表2。PCR反应条件为标准条件。使用的PCR仪为GeneAmp PCR system 2700。在分析时，将15μl的PCR产物与5μl的6×上样染色缓冲液(MBI R0611)混合上样至凝胶。还加入了6μl的含有3μg DNA的100bp DNA分子量标记(MBI SM0241)。凝胶为2％的琼脂糖凝胶，由TAE缓冲液(Invitrogen 15558-034)、2％的琼脂糖和267μg/ml的溴化乙锭组成。使用E835电泳电源(Consort)和HU13电泳槽(Jencons)进行电泳，最后用Flour-Smultimager(Biorad)进行扫描并用Quantity One(Biorad)软件进行分析。
表2 c-myc-ER构建体的扩增中所使用的引物对。

TaqMan在96孔光学反应板(AB Applied biosystems)上进行标准的TaqMan步骤。所使用的所有探针和引物均来自MWG-Biotech AG公司，并且所有探针都用3’TAMRA和5’FAM标记，参见表3。所有的反应板均用光学粘性封膜(AB Applied biosystems)密封。在装到TaqMan仪(ABI prism7000序列检测系统)上之前，将TaqMan板在500g离心1分钟。最后TaqMan所得结果用ABI prism 7000 SDS软件进行分析。
表3 TaqMan所用的引物和探针

端粒末端转移酶分析来源于克隆20，p2的细胞在T25瓶中用含有0、100nM、1μM和10μM 4-OHT的培养基培养一周。将细胞置于培养物中2个月。将来自于相同肝脏的未感染肝细胞也用于分析。这些细胞在培养物中放置3周。根据Telo TAGGG端粒末端转移酶PCR ELISAPLUS(Roche)的说明书进行分析。使用GENios(Tecan)板读数器分析结果。由于一些荧光值对于板读数器的光谱过高，因此对实验方法做了一些改变，仅用最终体积的1/3进行荧光测量。
结果人类原代胎儿肝脏细胞的结果解离的人类胎儿肝脏和细胞在96孔板中培养一天后，对肝细胞标志物清蛋白和ck-18进行染色。几乎有所的细胞都对清蛋白和ck-18的染色呈现出阳性结果，表明肝脏的解离是成功的，并且在早期培养物中的大多数细胞都是肝细胞或类肝细胞。在细胞铺板和对一些细胞固定和染色之前，进行了对表达能被HEA-125抗体识别的上皮表面抗原的细胞的富集。HEA-125阳性细胞也对清蛋白呈阳性。通过对Ki67的染色，进行了对培养物中不同天数时人类胎儿肝细胞增殖速度的评估。在不同的4天中，对随机区域内的Ki67阳性细胞和总细胞数进行了计数。Ki67染色的结果显示在第一周中在无精氨酸Williams培养基中细胞增殖很快，但在更长的时间后增殖速度下降，这与胎儿肝脏细胞不能在无精氨酸Williams培养基中长时间存活的观察结果是一致的。这说明在感染发生后细胞增殖很快，并且大多数细胞为肝细胞或类肝细胞。无精氨酸培养基抑制了成纤维细胞和其他非实质肝脏细胞的增殖，使得肝细胞被转基因成功地感染。为筛选感染的大群细胞，按照材料和方法中所述的，对未感染的人类胎儿肝脏细胞进行了新霉素滴定。将细胞在新霉素浓度范围为0-900μg/ml的培养基中暴露12天，在6孔板中同时设三个平行样。再用250μg/ml的浓度进行两周筛选，肝细胞仍然存活。所有转基因的PCR结果均为阳性，在筛选中大多数未感染细胞死亡。
对人类肝细胞克隆的结果在将细胞以分散的细胞个数铺于组织培养塑料板及筛选之后，获得了人类胎儿肝细胞的克隆。产生了50个以上的克隆。早期传代所得的肝细胞在液氮中冷冻，得到了20个以上的克隆。将一些冷冻管解冻并用于进一步的组织培养，锥虫蓝排除法显示在冷冻/解冻后存活率为70-95％。PCR证实c-myc-ER构建体已经整合至所有被检测的克隆中。所有已进行了对清蛋白染色的克隆(19个克隆)均显示阳性染色结果。对19个克隆进行了AFP染色，但是没有染色为阳性。用TaqMan对8个克隆进行了cyp3A7和cyp3A4表达的分析。在培养85天后，收集来源于这些克隆的细胞沉淀。将结果对人类基因组DNA和内部看家基因GAPDH进行了标准化。在培养85天后，cyp3A7仍存在于所有克隆中。c-myc染色显示，c-myc在被PCR确认的永生化构建体整合的细胞系中表达。端粒末端转移酶表达分析显示了0.5-10μM 4-OHT的条件下培养肝细胞上调了端粒末端转移酶的表达，因此适用于永生化。
实施例2材料和方法除另外指明的以外，所有的化学物质均购自Sigma(Dorset，UK)。
组织培养细胞在37℃、5％CO2的millennium培养箱中生长。每周更换三次培养基，当会合率大约90％时进行细胞传代。
培养基在肝脏组织和克隆的培养中使用了下列种类的培养基。培养基使用1L的过滤单元(Nalgene，NY，USA)进行过滤灭菌，并在使用前预热至37℃。
培养基ADulbecco改良eagle培养基(DMEM)(Invitrogen，Paisley，UK)、10％的胎牛血清(FBS)(Hyclone Perbio Science，UT，USA)、艮他霉素(50mg/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)和表皮生长因子(EGF)(20ng/ml)。
培养基B无精氨酸Williams E标准培养基(Invitrogen，Paisley，UK)∶DMEM(Invitrogen，Paisley，UK)(1∶1)、10％FBS、EGF(20ng/ml)。
培养基CDMEM(+Glutamax)(Invitrogen，Paisley，UK)、10％FBS、1X非必需氨基酸。
培养基DDMEM(+Glutamax)、10％FBS、2mM的L-谷氨酰胺、和青霉素-链霉素(100IU/ml)(Invitrogen，Paisley，UK)。
培养基E无精氨酸Williams E标准培养基、碳酸氢钠(2.2g/l)、经透析的FBS(10％)(Gibco 26400-044)、L-谷氨酰胺(2mM)、胰岛素(100nM)、100IU/ml的青霉素-链霉素、L-鸟氨酸(0.4mM)、氢化可的松(5.5mM)、EGF(20ng/ml)。
胶原包被将肝脏组织和克隆保留在胶原包被的组织培养塑料板上。来自小牛皮的胶原溶液用无菌水稀释至终浓度为8mg/cm2。在用胶原溶液培养至少2小时后，用无菌的hanks平衡盐溶液(HBSS)(Invitrogen，Paisley，UK)洗涤瓶两次。
肝脏来源和处理获得了本地NHS伦理委员会的许可，在中止妊娠后收集人类胎儿肝脏。
收到在湿冰上的RPMI培养基中保存而运到的肝脏组织。将肝脏用+4℃、pH7.2的无钙离子HEPES液(Invitrogen，Paisley，UK)洗涤两次，用+4℃、pH7.2、无钙离子、含有乙二醇-双(2-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)(0.5mM)的HEPES液洗涤一次。将肝脏用解剖刀切碎并置于37℃的酶溶液中20分钟，所述酶溶液为含有0.05％的胶原酶A(Roche，East Sussex，UK)、0.005％的DNA酶I(Roche，East Sussex，UK)、0.0125％的透明质酸酶(hylaronidase)和0.025％的分散酶II(Roche，East Sussex，UK)的无钙离子的HBSS，并在溶液中添加5mM的氯化钙。将解离的肝脏用无菌尼龙筛过滤并收集于+4℃的培养基A中。为除去一些较小的血细胞和其他细胞，将细胞在50g条件下离心3次，每次弃去上清液。用血细胞计数器进行细胞计数和存活率计数。然后将细胞铺于早先包被过的组织培养塑料板上，用培养基A在37℃培养4小时使其贴壁。然后将细胞用37℃的磷酸盐缓冲溶液(PBS)(Invitrogen，Paisley，UK)洗涤一次，以除去碎片和未贴壁的细胞，然后加入培养基B。
传代将细胞用37℃的PBS洗涤一次，为了使细胞从塑料上脱离，加入1×胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(BioWhittaker，ME，USA)，培养10分钟。加入等体积的培养基以中和胰蛋白酶，然后将细胞悬液转移至falcon管中，以500g离心5分钟。除去上清液，在培养基中重悬细胞并用血细胞计数器进行细胞计数。将细胞按每平方厘米8000细胞的密度接种于被胶原包被的塑料板上。
冷冻和解冻细胞为了冷冻细胞，在可冷冻管(Nunc，NY，USA)中用900ml培养基和100ml的cryosure-二甲亚砜(DMSO)(Quest biomedical，WestMidlands，UK)重悬细胞沉淀。将细胞在“Mister Frosty”深低温保藏冰箱(Nalgene，NY，USA)中以-80℃放置24小时，其中温度的下降大约为5℃/分钟。在24小时后将管移至液氮中长期保存。
为了解冻细胞，将选择的管从液氮中取出置于37℃水浴中直至解冻。然后将细胞悬液与10ml培养基混合，并以500g离心细胞5分钟并回收沉淀。将沉淀在新鲜培养基中重悬，进行细胞计数和存活率计数，并将细胞接种于被胶原包被的塑料板上。
收获病毒将来源于Fly-C042克隆的产生病毒的细胞在175cm2瓶中用培养基D培养至会合。当细胞会合时将瓶用PBS洗涤三遍，然后向瓶中加入培养基E(每个175cm2瓶中加18ml)，培养8小时。收获培养基并用0.45mm的滤器(Sartorius，Surrey，UK)过滤并分成5ml的等份，在液氮中快速冷冻并储存于-80℃。
感染和筛选将细胞按200细胞/皿至100％会合的密度范围接种于10cm培养皿中。在人类胎儿肝脏解离3天后将细胞用PBS洗涤一次，加入5ml含有病毒和8mg/ml溴化己二甲胺的培养基，培养8小时。在培养之后加入培养基B培养过夜，并在第二天重复感染一次。感染后在所有培养基中都加入0.1-1.0mM的4-羟基他莫昔芬(OHT)。
在感染两天后将细胞传代至15cm的培养皿中，并按每皿1000细胞的密度接种以准备48小时后的筛选。被成功感染的细胞表达c-mycER构建体，能抵抗新霉素(也被称为遗传霉素和G418)。进行了新霉素的滴定以确定新霉素的正确的使用浓度，以便除去未感染细胞而保留感染的细胞。基于滴定的结果，将细胞暴露含250mg/ml的新霉素的培养基B中，筛选2周。
Cvquant增殖分析使用Cyquant细胞增殖分析(Molecular Probes，Paisley，UK)来评估生长速度。细胞在多孔板上或25cm2的瓶中生长，根据厂商说明书进行实验。
免疫细胞化学使用免疫细胞化学对细胞系进行早期评估。这种方法不可能进行定量的分析但是它可以对肝脏标志物是否存在提供有用的信息。使用人类肝细胞瘤细胞系HuH7作为肝脏标志物的阳性对照，而使用myc永生化神经干细胞系(197VM)作为阴性对照。
所有染色实验都使用下列步骤在多孔板上进行。吸出培养基并将细胞用PBS洗涤一次，然后用4％多聚甲醛在室温下固定15分钟。然后将细胞用PBS洗涤三次，再用含0.1％triton x-100的PBS中透化15分钟。然后再将细胞用PBS洗涤一次，并在含10％的正常山羊血清(NGS)(Vector Laboratories，CA，USA)的PBS中封闭1小时。加入用1％NGS/PBS稀释的一抗，室温放置1小时。将细胞用PBS洗涤3次，然后是细胞暴露于用1％NGS/PBS稀释的二抗，室温放置1小时。将细胞用PBS洗涤3次，加入染色DNA的染料烟酸己可碱(用PBS以1∶25000稀释)并在室温下放置2分钟。将细胞再用PBS洗涤3次，并将其保留在最后一次的洗涤液中。使用荧光显微镜(Leica DMRA)进行分析。二抗被～488nm的波长激发，并发出～525nm的光(绿光)，而烟酸己可碱被～350nm的波长激发，并发出～425nm的光(蓝光)。
TaqMan在96孔光学反应板(Applied Biosystems，CA，USA)上进行标准的TaqMan步骤。所有探针和引物均来自MWG-Biotech，Ebersberg，Germany(见表3)。所有探针都用3’TAMRA和5’FAM标记。反应板用光学粘性封膜(Applied Biosystems，CA，USA)密封，并在装到TaqMan仪(ABI prism7000序列检测系统)上之前以500g离心1分钟，所得结果用ABI prism7000 SDS软件进行分析。
表4用于TaqMan的引物和探针

结果解离、感染和克隆筛选在妊娠15周时获得组织，按上述方法解离和感染。在2周的筛选之后，选出个别的克隆并扩增。命名为LIV0A07的克隆显示出有希望的特征，将其用于进一步的表征。它在长期培养(传代30次以上)后存活而且未显衰老。
在筛选过程和早期克隆生长过程中一直将组织保持在添加了0.1mM 4-OHT的培养基B中，在克隆传到第三代后将LIV0A07置于添加了0.1mM 4-OHT的培养基C中。
Cvquant增殖分析使用Cyquant细胞增殖分析来评估生长速度，以比较LIV0A07在5天的时间里在0-1.0mM 4-OHT中的生长。
细胞在0和0.1mM的4-OHT中生长时，仅观察到少量的增殖。在进行分析的5天中，在存在0.5和1.0mM的4-OHT的条件下生长的细胞有很大程度的增长，但是1.0mM的4-OHT可能对细胞有轻微的毒性(通过在接种后初期增殖缓慢而观察到)。因此，LIV0A07显示出依赖于4-OHT的生长，培养基中4-OHT的最佳浓度为0.5-1.0mM。
免疫细胞化学阳性对照细胞系HuH7对清蛋白和细胞角蛋白-18(CK-18)呈阳性反应，而197VM细胞对这些标志物呈阴性。
对于含有c-mycER构建体的细胞，加入4-OHT促进增殖，而除去4-OHT则促进细胞的分化而表现成熟表型。LIV0A07对于肝细胞标志物清蛋白和CK-18的染色呈阳性。分化的培养物(在不存在4-OHT的条件下生长48小时)中的染色似乎要稍强一些。
对任何细胞类型使用抗成纤维细胞抗体染色时都没有观察到阳性结果。这种抗体与脯氨酰-4-羟化酶的b亚基和二硫异构酶有交叉反应。
c-mycER的PCR使用引物对c-myc 1585S和M-ER 1131AS进行的c-mycER的PCR证实c-mycER构建体在LIV0A07中表达。
TagMan使用TapMan对LIV0A07的mRNA进行分析，证实细胞色素P4503A4和3A7酶的表达，但在这些条件下它们的表达比在对照细胞系HuH7中所观察到的水平要低。HuH7的水平比LIV0A07中观察到的最高水平还要高大约10倍。
在LIV0A07的分化培养物(在不存在4-OHT的条件下生长72小时)中观察到CYP3A4 mRNA的表达有特别的增加。分化的LIV0A07中的水平大约比未分化的培养物高了15倍，而在来自HuH7细胞的样本中没有观察到4-OHT的效果。
在LIV0A07样本中，CYP3A7的水平并没有像CYP3A4一样显示出有分化诱导的提高，但是这种酶的水平在接种以后并没有随时间下降。在接种后72h检测到最低水平，在接种1周后检测到最高水平。这一结果显示本发明的细胞具有提高的细胞色素P450水平，因此更接近正常的肝细胞。本实施例表明可以从人类肝细胞开发出克隆的、有条件地永生化的、表达肝细胞功能性标志物的细胞系，它可在多次细胞传代(传代30次以上)后存活。还开发了其他具有不同表型特征的细胞系。
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<223>人类c-myc/小鼠雌激素受体的融合体c-mycERTam<400>1gacgatgccc ctcaacgtta gcttcaccaa caggaactat gacctcgact acgactcggt60gcagccgtat ttctactgcg acgaggagga gaacttctac cagcagcagc agcagagcga120gctgcagccc ccggcgccca gcgaggatat ctggaagaaa ttcgagctgc tgcccacccc180gcccctgtcc cctagccgcc gctccgggct ctgctcgccc tcctacgttg cggtcacacc240cttctccctt cggggagaca acgacggcgg tggcgggagc ttctccacgg ccgaccagct300ggagatggtg accgagctgc tgggaggaga catggtgaac cagagtttca tctgcgaccc360ggacgacgag accttcatca aaaacatcat catccaggac tgtatgtgga gcggcttctc420ggccgccgcc aagctcgtct cagagaagct ggcctcctac caggctgcgc gcaaagacag480cggcagcccg aaccccgccc gcggccacag cgtctgctcc acctccagct tgtacctgca540ggatctgagc gccgccgcct cagagtgcat cgacccctcg gtggtcttcc cctaccctct600caacgacagc agctcgccca agtcctgcgc ctcgcaagac tccagcgcct tctctccgtc660ctcggattct ctgctctcct cgacggagtc ctccccgcag ggcagccccg agcccctggt720gctccatgag gagacaccgc ccaccaccag cagcgactct gaggaggaac aagaagatga780ggaagaaatc gatgttgttt ctgtggaaaa gaggcaggct cctggcaaaa ggtcagagtc840tggatcacct tctgctggag gccacagcaa acctcctcac agcccactgg tcctcaagag900gtgccacgtc tccacacatc agcacaacta cgcagcgcct ccctccactc ggaaggacta960tcctgctgcc aagagggtca agttggacag tgtcagagtc ctgagacaga tcagcaacaa1020ccgaaaatgc accagcccca ggtcctcgga caccgaggag aatgtcaaga ggcgaacaca1080
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<223>人类c-myc/小鼠雌激素受体的融合体c-mycERTam<400>2Met Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr1 5 10 15Asp Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr20 25 30
Gln Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp35 40 45Ile Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser50 55 60Arg Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe65 70 75 80Ser Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala85 90 95Asp Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn100 105 110Gln Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile115 120 125Ile Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu130 135 140Val Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly145 150 155 160Ser Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu165 170 175Tyr Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser180 185 190Val Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys195 200 205Ala Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu210 215 220Ser Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu225 230 235 240His Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln245 250 255Glu Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala260 265 270Pro Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser275 280 285
Lys Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr290 295 300His Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro305310 315 320Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile325 330 335Ser Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu340 345 350Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn355 360 365Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu370 375 380Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr385 390 395 400Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu405 410 415Glu Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu420 425 430Gln Leu Arg Asp Pro Arg Asn Glu Met Gly Ala Ser Gly Asp Met Arg435 440 445Ala Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Ile Lys His Thr Lys Lys Asn450 455 460Ser Pro Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu465 470 475 480Asp Ala Glu Pro Pro Met Ile Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Ser Arg Pro485 490 495Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg500 505 510Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Gly515 520 525
Asp Leu Asn Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu530 535 540Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly545 550 555 560Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys565 570 575Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser580 585 590Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu595 600 605Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser610 615 620Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp625 630 635 640Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr645 650 655Leu Gln Gln Gln His Arg Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser660 665 670His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Arg Met Glu His Leu Tyr Asn Met675 680 685Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu Asp690 695 700Ala His Arg Leu His Ala Pro Ala Ser Arg Met Gly Val Pro Pro Glu705 710 715 720Glu Pro Ser Gln Thr Gln Leu Ala Thr Thr Ser Ser Thr Ser Ala His725 730 735Ser Leu Gln Thr Tyr Tyr Ile Pro Pro Glu Ala Glu Gly Phe Pro Asn740 745 750Thr Ile<210>3<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物寡核苷酸<400>3ctcctggcaa aaggtcagag20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物寡核苷酸<400>4aaggacaagg cagggctatt20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物寡核苷酸<400>5aaaggccccc aaggtagtta20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物寡核苷酸<400>6aaggacaagg cagggctatt20<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针寡核苷酸<400>7acattcaagc agatctccat ggcagca27<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物寡核苷酸<400>8agtttgcaga agtttccaag ttagtg 26<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物寡核苷酸<400>9aggtccgccc tgtcatcag 19<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针寡核苷酸<400>10cggtgccatc ccttgactca acct 24<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物寡核苷酸<400>11tctggtgttc tcaggcacag a 21<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物寡核苷酸<400>12caaccagaaa aacccgttgt tc 22<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针寡核苷酸<400>13ccgtaagtgg agcctgattt ccctaagga 29<210>14<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物寡核苷酸<400>14aaaggctgag tcaagggatg ag 22<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物寡核苷酸<400>15agctttctta aagagcaaac cagaa 25<210>16<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针寡核苷酸<400>16accacagtcc atgccatcac tgcca 25<210>17<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物寡核苷酸<400>17caaggtcatc catgacaact ttg23<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物寡核苷酸
<400>18gggccatcca cagtcttctg20<210>19<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针寡核苷酸<400>19catcactatc ggcaatgagc ggttcc 26<210>20<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物寡核苷酸<400>20gagctatgag ctgcctgac 19<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物寡核苷酸<400>21agtttcatgg atgccacagg a 2权利要求
1.一种哺乳动物肝细胞，包括单多肽形式的融合蛋白，所述融合蛋白包括myc家族的癌蛋白和雌激素受体，或者它们的功能性片段。
2.根据权利要求1的肝细胞，其中所述癌蛋白为c-myc。
3.根据权利要求1或权利要求2的肝细胞，其中所述肝细胞在培养基中。
4.根据前述权利要求任一项的人类肝细胞。
5.根据前述权利要求任一项的肝细胞，包括编码所述融合蛋白的多核苷酸。
6.根据权利要求5的肝细胞，其中所述多核苷酸被整合至基因组中。
7.根据前述权利要求任一项的肝细胞，其中所述融合蛋白包括小鼠的雌激素受体和人类的c-myc蛋白。
8.根据前述权利要求任一项的肝细胞，其中所述雌激素受体含有阻止其与17β-雌二醇高亲和结合的突变。
9.根据前述权利要求任一项的肝细胞，包括具有如SEQ ID No.1所定义序列的多核苷酸。
10.根据前述权利要求任一项的肝细胞，所述肝细胞表达具有体内肝细胞特征的标志物。
11.根据权利要求10的肝细胞，其中所述标志物包括细胞色素P450家族的成员、清蛋白、甲胎蛋白和细胞角蛋白-18。
12.根据前述权利要求任一项的肝细胞，其中所述肝细胞在与雌激素受体的配体相接触时被有条件地永生化。
13.根据权利要求12的肝细胞，其中所述配体为4-羟基他莫昔芬。
14.一种使肝细胞有条件地永生化的方法，包括下述步骤(i)在肝细胞中以单多肽链的形式表达权利要求1、2、7或8的任一项中所定义的融合蛋白；以及(ii)将步骤(i)形成的肝细胞与雌激素受体的配体相接触，由此使肝细胞有条件地永生化。
15.一种在体外评估化合物用作药物的适用性的方法，包括如下步骤(i)将根据权利要求1至13任一项的肝细胞与潜在的药物化合物相接触；以及(ii)测量肝细胞的反应，由此确定化合物对肝细胞的影响并评估该化合物用作药物的适用性。
16.根据权利要求1至13任一项的肝细胞，所述肝细胞用作药物。
17.根据权利要求1至13任一项的肝细胞在制备用于治疗肝脏疾病的药物中的用途。
18.根据权利要求17的用途，其中所述疾病包括癌症、肝硬化和所有类型的肝炎。
19.一种肝脏辅助设备，包括至少一种根据权利要求1至13的肝细胞。
全文摘要
本发明涉及可用于毒理学筛选或治疗的肝细胞细胞系的生产。一种哺乳动物肝细胞，包括单多肽形式的融合蛋白，所述融合蛋白包括c－myc蛋白和雌激素受体，或者它们的功能性片段。
文档编号C12N5/10GK101044236SQ200580031761
公开日2007年9月26日 申请日期2005年9月21日 优先权日2004年9月21日
发明者D·约翰逊, J·辛丹, P·戈尔德法布, A·斯万伯格 申请人:兰诺龙有限公司