专利名称：2－羟基－4－取代吡啶的制造方法
技术领域：
本发明关于利用微生物由4-取代吡啶制造对应的2-羟基-4-取代吡啶的方法。2-羟基-4-取代吡啶可作为包括医药中间体在内的各种精细化学品的中间体使用，是产业上有用的化合物。
背景技术：
已知有多种方法通过化学合成制造2-羟基-4-取代吡啶。例如，作为2-羟基异烟酸或其前体物质2-卤代异烟酸的制造方法，已知有，(i)使异烟酸和氟气在水温下反应后，再以盐酸水解，从而得到2-羟基异烟酸的方法(美国专利4968803号公报专利文献1)，或(ii)使异烟酸-N-氧化物与氧氯化磷和五氯化磷以环流的方式反应，得到2-氯异烟酸的方法(特公平6-37472号公报专利文献2)。
作为2-羟基-4-氰基吡啶的制造方法，已知有，(iii)使4-氰基吡啶-N-氧和三氟醋酸酐于110℃反应7天，从而得到4-氰基-2-吡啶酮的方法(Nucleosides & Nucleotides，3(4)，369-388，(1984)非专利文献1)。
作为2-羟基-4-甲基吡啶的制造方法，已知有，(iv)使4-甲基吡啶和乙酰次氟酸盐(acetyl hypofluoride)于-10℃反应，得到2-乙酰氧基-4-甲基吡啶后，再水解得到4-甲基-2-吡啶酮的方法(Journal of theAmerican Chemical Society，109，3789-3790，(1987)非专利文献2)。
2-羟基异烟酰胺的制造方法仍未知。此外，2-羟基-4-吡啶醛肟是文献未曾记载的新的化合物。
然而，上述制造方法(i)～(iv)中，方法(i)不仅需要小心操作卤素气体，而且反应还需要特殊装置。此外，方法(ii)～(iv)都需要特殊试剂，并且温度条件苛刻，工序也多而繁杂，因而很难说是工业方法。像这样，利用化学合成的方法，由于工序多，并且还要使用操作时需小心的原料，因此不是实用的方法。
另一方面，利用微生物学方法制造2-羟基-4-取代吡啶的方法，至今尚未报道。作为具有将异烟酸转换为2-羟基异烟酸的酶活性的微生物，已知有，八叠球菌(Sarcina sp.)(Indian Journal of Biochemistry& Biophysics，15，12月份，492-493，(1978)非专利文献3)，和分枝杆菌(Mycobacterium sp.)(Journal of General Microbiology，137，1073-1080，(1991)非专利文献4)，然而，所述非专利文献3和非专利文献4都是旨在阐明微生物代谢途径的报道，而未将生产代谢中间体2-羟基异烟酸作为其目的。因而，从微生物的酶生产能力和2-羟基异烟酸的蓄积量考虑，若开展2-羟基异烟酸的工业化生产，上述方法都不满足作为利用微生物的方法的条件。
专利文献1美国专利4968803号公报专利文献2特公平6-37472号公报非专利文献1Nucleosides & Nucleotides，3(4)，369-388，(1984)非专利文献2Journal of the American Chemical Society，109，3789-3790，(1987)非专利文献3Indian Journal of Biochemistry & Biophysics，15，12月份，492-493，(1978)非专利文献4Journal of General Microbiology，137，1073-1080，(1991)。
发明内容
发明要解决的问题为开发可利用4-取代吡啶转化为对应的2-羟基-4-取代吡啶的工业化制造方法，本发明人进行了大量锐意探讨，其结果是，发现存在具有由4-取代吡啶大量生产和蓄积对应的2-羟基-4-取代吡啶的能力的微生物，发现通过利用该微生物，由4-取代吡啶制造对应的2-羟基-4-取代吡啶，能够提供可工业利用的方法。
本发明就是基于这样的见解。
解决问题的手段因此，本发明涉及通式(2)表示的2-羟基-4-取代吡啶的制造方法，[化2]
(式中，R表示甲基、羧基、氨基甲酰基、羟基亚氨基甲基甲基(hydroxyiminomethyl)或氰基。)其特征在于，使具有在通式(1)表示的4-取代吡啶的2位导入羟基的能力的微生物或其处理物作用于上述通式(1)所表示的4-取代吡啶。
(式中，R表示甲基、羧基、氨基甲酰基、羟基亚氨基甲基甲基或氰基。)在本发明方法的优选实施方式中，上述微生物是属于代尔夫特菌属(Delftia)或食酸菌属(Acidovorax)的微生物。
在本发明方法的更优选的实施方式中，尤其上述微生物是代尔夫特菌(Delftia species)YGK-A649(FERM BP-10389)、代尔夫特菌(Delftia species)YGK-C217(FERM BP-10388)或食酸菌(Acidovoraxspecies)YGK-A854(FERM BP-10387)。
此外，本发明还涉及选自代尔夫特菌YGK-A649(FERM BP-10389)、代尔夫特菌YGK-C217(FERM BP-10388)或食酸菌YGK-A854(FERM BP-10387)的微生物。
进而，本发明还关于以式(3)表示的新的2-羟基-4-吡啶醛肟。
发明效果根据本发明方法，可在通常的温度和压力条件下，以安全且单一工序由4-取代吡啶制造对应的2-羟基-4-取代吡啶，该制造方法也可用于工业化生产。
具体实施例方式
作为本发明方法中用作初始原料的通式(1)表示的4-取代吡啶，可以举出，4-甲基吡啶(别称γ-皮考林(ピコリン))(R＝甲基)、异烟酸(R＝羧基)、异烟酰胺(R＝氨基甲酰基)、4-吡啶醛肟(R＝羟基亚氨基甲基甲基)以及4-氰基吡啶(R＝氰基)。
使用异烟酸作为初始原料时，可使用异烟酸或其盐。作为异烟酸的盐，例如，可以举出碱金属盐(例如，钠盐、钾盐)、碱土类金属盐(例如，镁盐、钙盐)或铵盐。
本发明方法中作为初始原料使用的4-取代吡啶，可使用该4-取代吡啶本身，也可直接使用合成该4-取代吡啶得到的反应液。例如，使用4-吡啶醛肟作为初始原料时，可使用4-吡啶醛肟本身，也可直接使用含有由4-吡啶甲醛合成的4-吡啶醛肟的反应液。
本发明方法使用的微生物，只要是具有由通式(1)表示的4-取代吡啶大量生产和蓄积通式(2)表示的对应的2-羟基-4-取代吡啶的能力的微生物就可以，对其来源没有特殊限定。
具有由通式(1)表示4-取代吡啶大量生产和蓄积通式(2)表示的对应的2-羟基-4-取代吡啶的能力的微生物，例如，优选属于代尔夫特菌属的微生物，或属于食酸菌属的微生物。
进而，作为上述微生物的优选实施方式，具体而言，可举出代尔夫特菌YGK-A649、代尔夫特菌YGK-C217、食酸菌YGK-A854。代尔夫特菌YGK-A649于平成16年(2004年)7月27日、代尔夫特菌YGK-C217和食酸菌YGK-A854于平成16年(2004年)3月18日，在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(地址 日本国茨城县筑波东1丁目1番地1中央第6)进行了国内保藏，自平成17年8月2日起移送国际保藏。国际保藏号(国际保藏号后紧接的内为国内保藏号)分别为FERM BP-10389FERMP-20138、FERM BP-10388FERM P-19740、FERM BP-1038FERMP-19741。
可在本发明方法中使用的代尔夫特菌YGK-A649(国际保藏号FERM BP-10389国内保藏号FERM P-20138)株的菌学性质如下。
1.形态/培养性质(+表示阳性，-表示阴性。)(1)细胞形态杆菌(2)宽0.8μm(3)长1.5～2.0μm(4)孢子形成-(5)运动性+(6)菌落形态边缘全缘、呈隆起状态的透镜状、表面形状光滑、奶油色2.生理学性质(+表示阳性，-表示阴性。)(1)革兰氏染色-(2)各培养温度下的生长37℃+、45℃-(3)过氧化氢酶+(4)氧化酶+(5)酸/气体产生(葡萄糖)-/-(6)O/F试验(葡萄糖)-/-(7)硝酸盐还原+(8)吲哚产生-(9)葡萄糖酸化-(10)精氨酸双水解酶-(11)脲酶-(12)七叶苷水解-(13)明胶水解-(14)β-半乳糖苷酶-
(15)各种化合物的同化性葡萄糖-L-阿拉伯糖-D-甘露糖-D-甘露糖醇+N-乙酰基-D-葡萄糖胺-麦芽糖-葡萄糖酸钾+正癸酸+己二酸+dl-苹果酸+枸橼酸钠-醋酸苯+(16)细胞色素氧化酶+(17)MacConkey琼脂培养基中的生长性+3.化学分类学性质从该菌株提取基因组DNA，分析16S rRNA基因(16S rDNA)的5’末端侧约500个碱基序列。确定的碱基序列示于序列表的SEQ IDNO.1。使用如此得到的该菌株的16S rDNA碱基序列(SEQ IDNO.1)，对照DNA碱基序列数据库(GenBank/DDBJ/EMBL)，进行同源性检索，并制作和亲缘菌群的系统树，其结果是，推定该菌株属于代尔夫特菌属。最接近的标准菌株是食酸代尔夫特菌(Delftiaacidovorans)IAM12409株(Accession No.AB021417)，同源率为99％。
根据以上结果，判定该菌株为代尔夫特菌。由此，本发明也涉及该新菌株。
可在本发明方法中使用的代尔夫特菌YGK-C217(国际保藏号FERM BP-10388国内保藏号FERM P-19740)株的菌学性质如下。
1.形态/培养性质(+表示阳性，-表示阴性。)(1)细胞形态杆菌(2)宽0.8μm(3)长1.5～3.0μm
(4)孢子形成-(5)运动性+(6)菌落形态边缘微波状、呈低凸状、有光泽、奶油色2.生理学性质(+表示阳性，-表示阴性。)(1)革兰氏染色-(2)各培养温度下的生长37℃+、45℃-(3)过氧化氢酶+(4)氧化酶+(5)酸/气体产生(葡萄糖)-/-(6)O/F试验(葡萄糖)-/-(碱产生)(7)硝酸盐还原+(8)吲哚产生-(9)葡萄糖酸化-(10)精氨酸双水解酶-(11)脲酶-(12)七叶苷水解-(13)明胶水解-(14)β-半乳糖苷酶-(15)各种化合物的同化性葡萄糖-L-阿拉伯糖-D-甘露糖-D-甘露糖醇+N-乙酰基-D-葡萄糖胺-麦芽糖-葡萄糖酸钾+正癸酸+己二酸+dl-苹果酸+枸橼酸钠-醋酸苯+(16)细胞色素氧化酶+
3.化学分类学性质从该菌株提取基因组DNA，分析16S rRNA基因(16S rDNA)的5’末端侧约500个碱基序列。确定的碱基序列示于序列表的SEQ IDNO.2。使用如此得到的该菌株的16S rDNA碱基序列(SEQ IDNO.2)，对照DNA碱基序列数据库(GenBank/DDBJ/EMBL)，进行同源性检索，并制作和亲缘菌群的系统树，其结果是，推定该菌株属于代尔夫特菌属。最接近的标准菌株是Delftia tsuruhatensis T7株(Accession No.AB075017)，同源率为99％。
根据以上结果，判定该菌株为代尔夫特菌。由此，本发明也涉及该新菌株。
可在本发明方法中使用的食酸菌YGK-A854(国际保藏号FERMBP-1038国内保藏号FERM P-19741)株的菌学性质如下。
1.形态/培养性质(+表示阳性，-表示阴性。)(1)细胞形态杆菌(2)宽0.7～0.8μm(3)长1.5～2.0μm(4)孢子形成-(5)运动性+(6)菌落形态边缘光滑、呈低凸状、有光泽、奶油色2.生理学性质(+表示阳性，-表示阴性。)(1)革兰氏染色-(2)各培养温度下的生长37℃+、45℃-(3)过氧化氢酶+(4)氧化酶+(5)酸/气体产生(葡萄糖)-/-(6)O/F试验(葡萄糖)-/-(7)硝酸盐还原+(8)吲哚产生-(9)葡萄糖酸化-(10)精氨酸双水解酶-(11)脲酶-(12)七叶苷水解-
(13)明胶水解-(14)β-半乳糖苷酶-(15)各种化合物的同化性葡萄糖+L-阿拉伯糖-D-甘露糖-D-甘露糖醇-N-乙酰基-D-葡萄糖胺-麦芽糖-葡萄糖酸钾+正癸酸-己二酸-dl-苹果酸-枸橼酸钠-醋酸苯-(16)细胞色素氧化酶+(17)Tween80水解+3.化学分类学性质从该菌株提取基因组DNA，分析16S rRNA基因(16S rDNA)的5’末端侧约500个碱基序列。确定的碱基序列示于序列表的SEQ IDNO.3。使用如此得到的该菌株的16S rDNA碱基序列(SEQ IDNO.3)，对照DNA碱基序列数据库(GenBank/DDBJ/EMBL)，进行同源性检索，并制作和亲缘菌群的系统树，其结果是，推定该菌株属于食酸菌属。最接近的标准菌株是Acidovorax defluvii BSB411株(Accession No.Y18616)，同源率为99％。
根据以上结果，判定该菌株为食酸菌。由此，本发明也涉及该新菌株。
接下来，针对本发明方法中使用的属于代尔夫特菌属或食酸菌属的微生物的培养方法，尤其是针对根据本发明的新的微生物，即，代尔夫特菌YGK-A649(FERM BP-10389)、代尔夫特菌YGK-C217(FERM BP-10388)、食酸菌YGK-A854(FERM BP-10387)的培养方法，予以说明。
用于培养上述微生物的培养基，通常只要是这些微生物可以生长的培养基就可以，没有特殊限制，可以使用一般的微生物用任意公知培养基。作为培养基的碳源和氮源，可以使用酵母提取物、蛋白胨、肉类提取物和/或氨基酸等。此外，根据需要，还可添加有机酸、微量金属盐、维生素类物质、核酸相关物质和/或无机盐类物质等。
进而，培养时，为最大限度发挥上述微生物所具有的由通式(1)表示的4-取代吡啶生产通式(2)表示的对应的2-羟基-4-取代吡啶的能力，根据需要，还可以在培养基中添加上述4-取代吡啶，进行培养。此时，上述4-取代吡啶的添加量，相对于培养基，为0.01～3.0w/v％，优选为0.3～2.0w/v％。
上述微生物的培养温度，优选为10～37℃，更优选为23～32℃。培养时的培养基的pH值，优选为6.0～10.0，更优选为6.5～9.0。优选在好氧的条件下进行培养，液体培养时，最好予以通气和搅拌。分批培养时，培养时间可优选为10小时～1周，更优选为1～3天。
如上那样，可使上述微生物，尤其是根据本发明的新的微生物的培养菌体在培养基中蓄积。(i)可以将得到的培养液直接用于下述反应，(ii)也可以从培养液回收微生物后用于反应，(iii)还可以将回收得到的微生物的处理物，例如，破碎物、粗酶或精制酶等用于反应。
接着，通过上述微生物(尤其是，根据本发明的新微生物)或其处理物，进行由通式(1)表示的4-取代吡啶生成通式(2)表示的对应的2-羟基-4-取代吡啶的反应。该反应，即可用于分批方式，还可用于使用了生物反应器等的连续方式。分批式反应时，可进行几个小时到1周。
上述情况(i)的具体说明如下在含有通过上述方法增殖得到的上述微生物的培养液中，直接添加通式(1)表示的4-取代吡啶，可启动反应，使得通式(2)表示的对应的2-羟基-4-取代吡啶在系统内蓄积。蓄积反应的pH值，优选为pH6.0～10.0，更优选为pH6.0～9.0；反应温度，优选为10～40℃，更优选为10～35℃。上述4-取代吡啶的添加量，相对于培养液，优选为0.1～5.0w/v％，更优选为0.5～3.0w/v％。可以一次性添加4-取代吡啶，在观察到因高浓度的4-取代吡啶造成的反应抑制的情况下，也可分次添加。
对应的2-羟基-4-取代吡啶的蓄积反应，可以在上述微生物充分增殖，转化能力足够强的时间点开始，也可以在上述微生物还未充分增殖的培养初期阶段，在不影响其增殖的浓度范围内，在培养基中添加4-取代吡啶，同时进行微生物的增殖和对应的2-羟基-4-取代吡啶的蓄积反应。
此外，上述情况(ii)时，可以将采用上述方法增殖得到的微生物通过过滤或离心分离，从培养液中回收后，用于蓄积反应。即，可将得到的微生物混悬于含有4-取代吡啶的生理盐水或缓冲液等水性溶剂中，用于反应。反应条件(pH，温度，4-取代吡啶的添加量)和(i)的情况一样。进而，上述情况(iii)时，可将回收的微生物的处理物，例如，破碎物、粗酶或精制酶等，混悬于含有4-取代吡啶的生理盐水或缓冲液等水性溶剂中，用于反应。反应条件和(i)的情况一样。或者也可以将微生物或其处理物以公知方法固定于适当载体，使该固定化物和上述水性溶剂接触，用于反应。
作为用于使用了上述微生物或其处理物的蓄积反应的水性溶剂，可以举出，生理盐水、磷酸钾缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液或硼酸-氢氧化钠缓冲液等。
从如上得到的蓄积反应后的反应液中，根据需要，通过过滤或离心分离等除去微生物后，添加盐酸或硫酸等酸溶液，可沉淀和回收2-羟基-4-取代吡啶。在使用粗酶或精制酶等处理物等的情况等下，可以省略菌体去除操作。此外，还可通过色谱等公知的精制方法，回收2-羟基-4-取代吡啶。
实施例以下显示代表性实施例，对本发明进行具体说明，但这些实施例并不限定本发明的范围。实施例中使用的培养基记载如下。
(1)培养基A为如下培养基脱盐水1.0L中含有酵母提取物1.25g、磷酸氢二钠十二水合物4.3g、磷酸二氢钾4.2g、硫酸铁(II)七水合物0.3g、钼(VI)酸二钠二水合物0.3g、硫酸镁七水合物0.5g和异烟酸5.0g，并通过氢氧化钠水溶液将pH调整到7.0。
(2)培养基B为如下培养基脱盐水1.0中含有酵母提取物1.25g、磷酸氢二钠十二水合物4.3g、磷酸二氢钾4.2g、硫酸铁(II)七水合物0.3g、钼(VI)酸二钠二水合物0.3g、硫酸镁七水合物0.5g、异烟酸5.0g和谷氨酸钠5.0g，并通过氢氧化钠水溶液将pH调整到7.0。
(3)培养基C为如下培养基脱盐水1.0中含有酵母提取物1.25g、海洋生物1.0g、磷酸氢二钠十二水合物4.3g、磷酸二氢钾4.2g、硫酸铁(II)七水合物3.0mg、钼(VI)酸二钠二水合物3.0mg和异烟酸5.0g，并通过氢氧化钠水溶液将pH调整为7.0或9.0。高压釜灭菌后，培养基pH分别为7.0或8.5。
《实施例1在使用了代尔夫特菌YGK-A649的培养液中进行的2-羟基异烟酸的蓄积反应》将100mL培养基A装入500mL容积的三角瓶中，于121℃高压釜灭菌20分钟。在该三角瓶内，接种1铂环的生长于营养琼脂培养基的代尔夫特菌YGK-A649(FERM BP-10389)的菌体，27℃振荡培养24小时。
另外，将1L培养基B装入可进行搅拌、通气、温度和pH调整的2L容积的发酵罐中，于121℃高压釜灭菌20分钟后，在该发酵罐中添加上述培养基A的24小时培养液10mL，一边搅拌和通气，一边于27℃和pH7.0培养22小时。
随后，酌情断续添加pH为6.7的异烟酸，使得培养液中的异烟酸浓度保持在0.5～1.0w/v％，进行2-羟基异烟酸的蓄积反应。在培养的第77小时，蓄积不再增加，停止反应并在下述条件下对培养液的离心上清进行HPLC分析，其结果是，2-羟基异烟酸的蓄积量为91.6g(0.66mol)。相对于上述培养基A和培养基B中所含的异烟酸以及上述蓄积反应中添加的异烟酸的总量126.1g(1.02mol)而言，2-羟基异烟酸的摩尔转化率为64.3％。
将上述得到的培养液(以定量值计，含有2-羟基异烟酸91.6g)，离心分离去除菌体后，加入盐酸酸解，并用活性炭去除杂质，得到白色结晶。得到的结晶，干重为81.5g，HPLC分析的面积比为100％。得到的化合物通过HPLC-MS、NMR和IR分析，确定为2-羟基异烟酸。
HPLC的分析条件柱Develosil RPAQUEOUS 4.6×250mm、移动相0.5v/v％甲醇(添加85％磷酸，将pH调整到2.5)、流速1mL/分、柱温25℃、检测波长210nm、保持时间异烟酸＝4.1分、2-羟基异烟酸＝16.9分、2，6-二羟基异烟酸(别称柠嗪酸)＝18.6分。
《实施例2分离菌株的2-羟基异烟酸生成活性》将10mL培养基C装入25mL容积的试管中，于121℃高压釜灭菌20分钟。在该试管内，分别接种1铂环的生长于营养琼脂培养基的代尔夫特菌YGK-A649(FERM BP-10389)、代尔夫特菌YGK-C217(FERM BP-10388)或食酸菌YGK-A854(FERM BP-10387)的菌体，27℃振荡培养25小时。对于代尔夫特菌YGK-A649，培养基C高压釜灭菌后的pH为7.0，对于其它菌株，则为8.5。
培养结束后，对培养液离心上清所含的目的物，即，2-羟基异烟酸，和副产物，即，2，6-二羟基异烟酸定量，求得2-羟基异烟酸相对于培养液中含有的异烟酸的摩尔转化率(％)。此外，将2-羟基异烟酸的摩尔生长量作为a，2，6-二羟基异烟酸的摩尔生长量作为b，由下述计算式求得2-羟基异烟酸的纯度P(％)。
P＝a/(a+b)×100进而，将培养液1mL离心分离，收集菌体，在得到的菌体中添加含有0.5w/v％异烟酸的0.1M磷酸钾缓冲液(调整到pH7.0)0.5mL，混悬。将其于30℃振荡30分钟，进行反应。将生成的2-羟基异烟酸和2，6-二羟基异烟酸由HPLC定量，将2-羟基异烟酸蓄积量1μmol/min作为1个单位(U)，求出每升培养液中的2-羟基异烟酸蓄积活性(U/L肉汤培养基)以下，作为静息菌体活性(U/L肉汤培养基)。此外，和上述一样，求出静息菌体反应中的2-羟基异烟酸的纯度(％)。结果示于表1。表中的2HINA表示2-羟基异烟酸。
表1
《实施例3使用代尔夫特菌YGK-A649的静息菌体，进行的2-羟基-4-取代吡啶的蓄积反应》采用和实施例1一样的方法，培养代尔夫特菌YGK-A649(FERMBP-10389)后，离心分离培养液200mL，收集菌体，得到静息菌体。在其中添加含有表2所示的4-取代吡啶0.5w/v％的0.1M磷酸钾缓冲液(调整到pH7.0)100mL，混悬。将该混悬液装入可进行搅拌、通气、温度和pH调整的100mL容积的反应槽中，一边搅拌和通气，一边在27℃和pH7.0的条件下反应。
反应44小时后，对2-羟基-4-取代吡啶予以定量。反应生成物通过HPLC、HPLC-MS检测予以确认。结果示于表2。
在含有以4-吡啶醛肟作为反应底物得到的2-羟基-4-吡啶醛肟0.27g的溶液中，添加异丙醇100mL，搅拌30分钟后，过滤去除固态成分。在滤液中添加水100mL后，减压浓缩，除去异丙醇，析出结晶。通过将析出的结晶过滤，得到粗结晶0.20g。将得到的结晶以水洗净后，过滤获得0.15g的2-羟基-4-吡啶醛肟(分离收率53％)白色结晶。通过IR、质子NMR和MS检测对结构予以鉴定。
IR(KBr，cm-1)3180，3070，2920，1660，1520，1430，1330，1300，1250，1000，900，870，800，7701H-NMR(二甲基亚砜，ppm)11.78(1H，s)，11.48(1H，s)，7.95(1H，s)，7.29(1H，d)，6.40(1H，s)，6.40(1H，d)MS(MH+)139《实施例4使用各静息菌体，进行的2-羟基-4-取代吡啶的蓄积反应》采用和实施例1一样的方法，培养代尔夫特菌YGK-A649(FERMBP-10389)、代尔夫特菌YGK-C217(FERM BP-10388)或食酸菌YGK-A854(FERM BP-10387)后，将培养液10mL离心分离，收集菌体，得到静息菌体。在该静息菌体中，添加含有表3所示的4-取代吡啶0.5w/v％的0.1M硼酸-氢氧化钠缓冲液(调整到pH7.0)2mL，混悬。将该混悬液装入15mL容积的容器中，一边搅拌，一边在27℃和pH7.0的条件下反应。反应44小时后，定量2-羟基-4-取代吡啶。结果示于表3。
《实施例5使用YGK-A649的静息菌体，进行的2-羟基-4-吡啶醛肟的蓄积反应》将盐酸羟胺1.3g溶解于离子交换水5g，65℃加热，滴下4-吡啶甲醛2g。65℃反应30分钟，得到含有4-吡啶醛肟2.2g的反应液。得到的4-吡啶醛肟通过HPLC予以确认。接着，将反应液冷却到30℃，再用饱和碳酸氢钠水溶液中和到pH等于6。在该中和液中添加600mL的0.1M磷酸钾缓冲液(调整到pH7.0)，再添加代尔夫特菌YGK-A649(FERM BP-10389)静息菌体，混悬，上述静息菌体是采用和实施例1一样的方法培养代尔夫特菌YGK-A649(FERM BP-10389)后，通过离心分离培养液1000mL收集菌体得到的。将该混悬液装入可进行搅拌、通气、温度和pH调整的2000mL容积的反应槽中，一边搅拌和通气，一边在20℃和pH7～8的条件下反应。反应108小时后，得到2-羟基-4-吡啶醛肟，反应收率为87％。将得到的2-羟基-4-吡啶醛肟通过IR、质子NMR和MS检测，显示实施例3所记载仪器分析数值，从而确认结构。
产业上的可利用性本发明方法，可利用微生物由4-取代吡啶制造对应的2-羟基-4-取代吡啶，由于该制造方法具有工业可利用性，因而，可有效提供2-羟基-4-取代吡啶，作为以医药和农药中间体为首的各种精细化学品的中间体使用。
以上依照特定的实施方式对本发明进行了说明，对本领域技术人员而言，显而易见的变形或改良，也包含在本发明范围内。
序列表<110>Yuki Gosei Kogyo Co.，Ltd.
<120>2-羟基-4-取代吡啶的制造方法<130>YGK-742<150>JP 2004-270800<151>2004-09-17<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>520<212>DNA<213>代尔夫特菌(Delftia sp.)<400>1tggagagttt gatcctggct cagattgaac gctggcggca tgccttacac atgcaagtcg 60aacggtaaca ggtcttcgga cgctgacgag tggcgaacgg gtgagtaata catcggaacg 120tgcccagtcg tgggggataa ctactcgaaa gagtagctaa taccgcatac gatctgagga 180tgaaagcggg ggaccttcgg gcctcgcgcg attggagcgg ccgatggcag attaggtagt 240tggtgggata aaagcttacc aagccgacga tctgtagctg gtctgagagg acgaccagcc 300acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aattttggac 360aatgggcgaa agcctgatcc agcaatgccg cgtgcaggat gaaggccttc gggttgtaaa 420ctgcttttgt acggaacgaa aaagcttctc ctaatacgag aggcccatga cggtaccgta 480agaataagca ccggctaact acgtgccagc agccgcggta520<210>2<211>520<212>DNA<213>代尔夫特菌
<400>2tggagagttt gatcctggct cagattgaac gctggcggca tgccttacac atgcaagtcg 60aacggtaaca ggtcttcgga cgctgacgag tggcgaacgg gtgagtaata catcggaacg 120tgcccagtcg tgggggataa ctactcgaaa gagtagctaa taccgcatac ratctgagga 180tgaaagcggg ggaccttcgg gcctcgcgcg attggagcgg ccgatggcag attaggtagt 240tggtgggata aaagcttacc aagccgacga tctgtagctg gtctgagagg acgaccagcc 300acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aattttggac 360aatgggcgaa agcctgatcc agcaatgccg cgtgcaggat gaaggccttc gggttgtaaa 420ctgcttttgt acggaacgaa aaagctcctt ctaatacagg gggcccatga cggtaccgta 480agaataagca ccggctaact acgtgccagc agccgcggta520<210>3<211>520<212>DNA<213>食酸菌(Acidovorax sp.)<400>3tggagagttt gatcctggct cagattgaac gctggcggca tgccttacac atgcaagtcg 60aacggtaaca ggtcttcgga tgctgacgag tggcgaacgg gtgagtaata catcggaacg 120tgcccgatcg tgggggataa cggagcgaaa gctttgctaa taccgcatac gatctacgga 180tgaaagcagg ggaccgcaag gccttgcgcg gacggagcgg ccgatggcag attaggtagt 240tggtgggata aaagcttacc aagccgacga tctgtagctg gtctgagagg acgaccagcc 300acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aattttggac 360aatgggcgaa agcctgatcc agccatgccg cgtgcaggat gaaggccttc gggttgtaaa 420ctgcttttgt acggaacgaa aagactcctt ctaataaagg gggtccatga cggtaccgta 480agaataagca ccggctaact acgtgccagc agccgcggta520
权利要求
1.通式2表示的2-羟基-4-取代吡啶的制造方法，[化2] 式中，R表示甲基、羧基、氨基甲酰基、羟基亚氨基甲基甲基或氰基；其特征在于，使具有在通式1表示的4-取代吡啶的2位导入羟基的能力的微生物或其处理物作用于上述通式1所表示的4-取代吡啶，[化1] 式中，R表示甲基、羧基、氨基甲酰基、羟基亚氨基甲基甲基或氰基。
2.根据权利要求1所记载的2-羟基-4-取代吡啶的制造方法，其中，上述微生物是属于代尔夫特菌属(Delftia)，或食酸菌属(Acidovorax)的微生物。
3.根据权利要求1所记载的2-羟基-4-取代吡啶的制造方法，其中，上述微生物是保藏号分别为FERM BP-10389的代尔夫特菌YGK-A649、保藏号分别为FERM BP-10388代尔夫特菌YGK-C217或保藏号为FERM BP-10387食酸菌YGK-A854。
4.选自保藏号分别为FERM BP-10389的代尔夫特菌YGK-A649、保藏号分别为FERM BP-10388代尔夫特菌YGK-C217或保藏号为FERM BP-10387食酸菌YGK-A854的微生物。
5.以式3表示的2-羟基-4-吡啶醛肟。[式3]
全文摘要
提供制造2－羟基－4－取代吡啶的微生物学方法，和新的微生物以及新的化合物。制造方式是，使微生物或其处理物作用于通式(1)所示的4－取代吡啶，得到对应的2－羟基－4－取代吡啶。新的微生物是代尔夫特菌YGK－A649(FERM BP－10389)、代尔夫特菌YGK－C217(FERMBP－10388)或食酸菌YGK－A854(FERM BP－10387)，新的化合物是2－羟基－4－吡啶醛肟。其中，R为甲基、羧基、氨基甲酰基、羟基亚氨基甲基甲基或氰基。
文档编号C12R1/01GK101048380SQ200580031419
公开日2007年10月3日 申请日期2005年9月16日 优先权日2004年9月17日
发明者佐佐木美江, 松本清一郎 申请人:有机合成药品工业株式会社