专利名称：用α－葡糖苷酶活性来检测无乳链球菌的方法
技术领域：
本发明涉及检测和鉴定无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)的领域。更具体地，本发明涉及α-葡糖苷酶酶促底物用于检测和鉴定无乳链球菌的用途。
链球菌属(Streptococcus)包括在自然界中、在人和动物的皮肤和粘膜上十分普遍的许多物种，并且是造成复性感染的原因。它们是普遍存在的细菌，其在外界环境(土壤、空气、水)中以游离状态存在，在人和动物中以腐生状态或共生状态存在。对于A、C、G和H群链球菌和唾液链球菌(Streptococcus salivarius)，它们位于鼻咽内，D群粪链球菌位于肠内，以及B群链球菌位于阴道腔内。它们的致病作用十分不同，并且取决于所牵涉的菌种和它们在生物体中的位置。
链球菌是革兰氏阳性球菌，直径0.5-1μm，表现为聚集成小链的形式，并且是静止的。它们为过氧化氢酶阴性，具有发酵代谢，它们任选为厌氧性的并且对温度(最佳生长温度为37℃)变化和pH(最佳pH为7)变化敏感。
无乳链球菌(或链球菌B)被认为在牛科动物中是引起乳腺炎的主要传染剂之一。在人中，它基本上是女性生殖道(阴道)的腐生物，但是其也存在于鼻咽中和肠中，特别是存在于直肠中。在成人中，菌株建群(colonisation)常常保持无症状，但是无乳链球菌可以是引起败血病、肺炎、脑膜炎、关节炎、尿路感染和深度化脓的原因。在孕妇或分娩后的妇女中，感染可以导致子宫内膜炎和不育。
在新生儿中，污染发生在子宫内或更普遍地是发生在分娩时，这是由于吸入羊水或阴道分泌物。早期感染常常从分娩后就发生或在生活的最初几小时内发生。早产、膜破裂和母亲阴道内强的菌株建群促进早期感染。这种类型的感染的死亡率十分高(＞50％)。晚期感染通常表现为脑膜炎(婴儿脑膜炎)和关节炎。
特别是由于其患病率(在法国为10％，即至少75000位孕妇/年)以及由于其在足月分娩时引起的后果，这已成为公众健康问题，因而建议在妊娠期结束时进行关于携带无乳链球菌的系统筛选，理想地是在闭经的34和38周(妊娠的35-37周)之间进行。
选择性培养基和/或使得能够指导诊断的培养基可商业获得。然而，这些培养基具有缺点，即它们本身不足以用于诊断无乳链球菌并且必需进行补充的测试，例如证明存在兰斯菲尔德氏的B群抗原(主要存在鼠李糖的多糖)，和马尿酸的水解(马尿酸液体培养基)。
最常使用的选择性培养基是Todd-Hewitt液体培养基，其为用于在孕妇中搜寻B群链球菌的富集液体培养基。这种液体培养基含有抑制伴生菌丛中的大多数革兰氏阴性微生物的不同抗生素，例如萘啶酸(acide nalixidique)和庆大霉素，或萘啶酸、多粘菌素和结晶紫。
在富集步骤之后，必须将所述补充了抗生素的Todd-Hewitt液体培养基移种至用于搜寻链球菌的培养基上(参见CDC(Center forDisease Control)的建议，MMWR(Morbidity and Mortality WeeklyReport)，August 16，2002，Vol.51，No.RR-11)。
Lim培养基是Todd-Hewitt液体培养基的变体，它含有1％的酵母提取物、萘啶酸和粘菌素。
也可以使用含有5％血液的Columbia琼脂，其使得能够特别是证明无乳链球菌的β-溶血特性。然而，这种特性不总是明显的菌落周围的溶血环可能是窄的，更确切地这是α-溶血，或甚至是γ-溶血的表象。相反地，如果在无乳链球菌菌落附近存在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌落，那么该特性就会变得清楚(Camp-Factor)。
这些选择性培养基的缺点是它们必须补充进行生物化学测试和/或免疫学测试。
目前，唯一可商业获得的、随时可用的、使得能够直接从直肠-阴道取样物分离和鉴定无乳链球菌的选择性培养基是Granada培养基(Biolys SA)。这种培养基具有促进由无乳链球菌菌株产生类胡萝卜素色素的特性，该色素的产生是由于在该培养基中存在可溶性淀粉、 蛋白胨No.3、葡萄糖、丙酮酸钠、硫酸镁、甲氨蝶呤、粘菌素、结晶紫、琼脂、马血清、无水Na2HPO4、甲硝唑、MOPS(吗啉代丙烷磺酸)半-钠盐和蒸馏水并且在厌氧条件下孵育。因而，这种培养基具有这样的缺点，即直接检测无乳链球菌是在厌氧条件下进行的，这不易于实施。而且，不可获得含有一种或多种酶促底物的检测培养基。
完全出乎意料，本申请人已证实，有可能利用酶促底物，特别是α-葡糖苷酶酶促底物，来特异性检测和鉴定无乳链球菌。
这是因为，令人惊奇地，所述酶促底物不仅被无乳链球菌利用，从而使得它们能被揭示，例如当用生色酶促底物时培养基中菌落的着色产生改变，而在反应培养基中着色没有扩散因而保持集中在菌落处，但是这些分子对这些细菌的生长没有任何有害的影响。
因而，本发明的主题是用于特异性检测和鉴定无乳链球菌的方法，其特征在于，使用含有至少一种α-葡糖苷酶酶促底物的反应培养基。
适于本发明目的的α-葡糖苷酶酶促底物是使得能够证明这样的酶促活性的本领域技术人员已知的任何底物。这样的底物可以例如为生色的或产生荧光的，并例如描述于Rice P.等人，(2000).A rapidbiochemical test to aid identification of Mycoplasma mycoidessubsp.mycoides small colony(SC)strains.Lett.Appl.Microbiol.170-74这篇文章中，或描述于BIOSYNTH的目录，Substrates and Reagents或www.biosynth.com中，或描述于GLYCOSYNTH的目录，enzyme substrates catalogue或www.glycosynth.co.uk中。
作为实例，可以提及基于吲哚酚衍生物的底物、基于伞形酮衍生物的底物和基于萘酚衍生物的底物。
根据本发明的一个优选实施方案，适于本发明目的的酶促底物是基于吲哚酚衍生物的底物。
这样的吲哚酚衍生物的实例包括3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷的衍生物，优选这些化合物的卤代衍生物。
作为3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷的卤代衍生物的实例，可提及6-溴-3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷、6-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-α-D-吡喃葡糖苷，最后一个化合物是特别优选的。
在本发明方法中使用的反应培养基由于存在所述的酶促底物因而是检测反应培养基。
这种反应培养基或者可以仅用作揭示培养基，或者可以用作培养和揭示培养基。在第一种情况下，微生物的培养在接种前进行，在第二种情况下，所述的反应培养基还构成了培养培养基。
所述的反应培养基可以是固体、半固体或液体。术语“固体或半固体培养基”意在表示，例如胶化的培养基。
琼脂是微生物学中用于培养微生物的常规固体培养基，但是也可以使用明胶或琼脂糖。有一些制剂可商业获得，例如Columbia琼脂、Trypcase-soja琼脂、Mac Conkey琼脂、Sabouraud琼脂，或更一般地，在Handbook of Microbiological Media(CRC出版社)中描述的那些。
反应培养基中琼脂的量是2-40g/l。对于固体培养基，琼脂的量优选为9-25g/l，更优选12-14g/l。对于半固体培养基，琼脂的量优选为2-6g/l。
本发明的酶促底物可在广的pH范围内使用，特别是在pH5.5至10。
在所述反应培养基中酶促底物的浓度为10至2000mg/l，优选为50至500mg/l，更优选为100至400mg/l，这构成了本发明的优选实施方案。
当然，根据选取的底物，本领域技术人员将在该范围内确定培养基中酶促底物的浓度。因而，在所使用的酶促底物是5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-α-D-吡喃葡糖苷的情况下，优选采用130至300mg/l的浓度。
可用于本发明目的的反应培养基还可以包含用于改善本发明方法的特异性和灵敏度的其他成分。
所述反应培养基还可以含有用于抑制或限制不希望的菌株(例如假阳性菌株，如假丝酵母(Candida)或腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus))生长的抑制剂的混合物，而不改变所述培养基的检测灵敏度。
在这方面，所述反应混合物可以含有抗生素的混合物。将抗生素加入至反应培养基中尤其使得能够赢得时间，因为无乳链球菌的鉴定是直接进行的。
适于本发明目的的抗生素的实例包括氨曲南和两性霉素B。这些抗生素可从ICN、Squibb或Sigma商业获得。
因而，根据本发明的一个实施方案，在特异性检测和鉴定无乳链球菌的方法中使用的反应培养基还含有氨曲南和两性霉素B的混合物。
在所述反应培养基中的每种抗生素的量根据所涉及的抗生素而不同，并很容易由本领域技术人员确定。
因而，例如，氨曲南的浓度可以为0.01至0.08g/l，以及两性霉素B的浓度可以为0.002至0.006g/l。
优选的这些抗生素的混合物含有0.064g/l的氨曲南和0.004g/l的两性霉素B。
用于本发明方法中的所述反应培养基还可以包含至少一种其他底物，所述底物对与通过α-葡糖苷酶底物检测的酶促活性不同的酶促活性具有特异性。所述其他底物的酶促水解产生可检测的信号，该信号不同于通过α-葡糖苷酶底物检测的信号，例如，不同的有色产物或荧光产物，以便使得能够以提高证明的特异性的方式来证明，例如检测和/或鉴定和/或定量无乳链球菌。
关于另一特异性的底物，可以提及β-纤维二糖糖苷酶的底物、β-葡糖苷酶的底物、β-氨基葡糖苷酶的底物和本领域技术人员已知的使得能够消除假阳性的任何其他酶促底物。
根据一个优选的实施方案，所述反应培养基还包含至少一种用于不同酶促活性的其他底物，所述的其他底物优选选自β-纤维二糖糖苷酶的底物和β-氨基葡糖苷酶的底物。
β-纤维二糖糖苷酶的底物如6-氯-3-吲哚基-β-D-纤维二糖糖苷的使用使得能够消除假阳性物种，例如粪肠球菌(Enteroccocusfaecalis)、单核细胞增生李斯忒氏菌(Listeria monocytogenes)和阴沟肠杆菌(Enterobacter claocae)，而没有降低检测无乳链球菌的α-葡糖苷酶活性的灵敏度。
氨基葡糖苷酶的底物如6-氯-3-吲哚基-β-N-乙酰基-氨基葡糖苷或5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-N-乙酰基-氨基葡糖苷的使用使得能够消除对粪肠球菌、屎肠球菌(Enteroccocus faecium)和阴沟肠杆菌的检测。
其他特异性酶促底物的浓度一般为0.01至2g/l。本领域技术人员将能够根据所使用的底物容易地确定这样的浓度。
当使用6-氯-3-吲哚基-β-D-纤维二糖糖苷或6-氯-3-吲哚基-β-N-乙酰基-氨基葡糖苷时，其在培养基中的浓度优选为0.4g/l。
所述反应培养基还可以包含组合的一种或多种要素，例如氨基酸、蛋白胨、碳水化合物、核苷酸、矿物质、维生素、表面活性剂、缓冲剂、磷酸盐、铵盐、钠盐、金属盐。培养基的实例描述于本申请人的专利申请EP656421和WO99/09207中。
本发明方法的实施可以根据以下步骤来进行a)用全部或部分样品接种如上所定义的反应培养基，b)孵育所述接种过的培养基，c)揭示单独存在至少一种α-葡糖苷酶活性，或者与至少一种不同于α-葡糖苷酶活性的其他酶促活性相组合地存在至少一种α-葡糖苷酶活性，这构成了本发明的另一主题。
所述的接种和孵育步骤是本领域技术人员所周知的。
例如，孵育温度可以是37℃。关于孵育气氛，优选为有氧环境。
所述的揭示过程是通过显现着色的变化并用肉眼观察来进行的，所述的着色在反应培养基中没有扩散并因而集中在菌落处。在揭示荧光的情况下，使用本领域技术人员已知的荧光读取设备。
待分析的生物样品是可能含有无乳链球菌的任何临床样品，例如阴道取样物、尿取样物或对其进行分析可以帮助临床医生作出诊断的任何其他样品。
借助于下述实施例可以更清楚地理解本发明，所述的实施例是以举例说明而非限制性的方式给出的。
实施例1使用α-葡糖苷酶的酶促底物来检测无乳链球菌1.1反应培养基的制备反应培养基通过混合心-脑提取物(4.84g/l；Solabia)、肉浸液(1.96g/l；Solabia)、biothione(1g/l；Solabia)、biotrypcase(7.2g/l；Solabia)、碳酸钠(0.3g/l；VWR)、丙酮酸钠(2g/l；Fluka)、HEPBS缓冲剂(0.4g/l；Sigma)、乳清蛋白蛋白胨(2g/l；DMV)、葡萄糖(1g/l；Merck)、美洲琼脂(2g/l；Sobigel)和欧洲琼脂(12g/l；Roko)而制备。
在121℃下高压灭菌15分钟后，以0.1g/l的比率加入如下所示的α-葡糖苷酶酶促底物；然后在50℃的水浴中冷却●6-溴-3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷(RedA-α-Glu；Inalco)，●6-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷(Rose-α-Glu；Inalco)，●5-溴-6-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷(Magenta-α-Glu；Glycosynth)，●5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷(X-α-Glu；Biosynth)和，●5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-α-D-吡喃葡糖苷(GreenA-α-Glu；Inalco)。
然后将所述培养基倾入培养皿中以用于后面用细菌菌株进行接种。
1.2微生物菌株的接种将悬浮于生理盐水中的八株源自本申请人的保藏的无乳链球菌菌株进行接种以便在每个培养基上产生分离的菌落。然后将所述培养皿在37℃下孵育48小时。在孵育18、24和多于40小时后肉眼检查形成的菌落。记录这些菌落的着色、生长以及该着色的强度。
1.3结果结果在下表1中给出，并如此表示-生长(C)，用mm标明大小，-着色的强度(I)，基于0-4的任意标度，0相应于没有活性和4相应于存在十分强的着色，-颜色(Co)，T＝青绿色，R＝粉红色或红色，V＝绿色，Mg＝品红色，-根据以小时表示的孵育时间(T)。
表1中所显示的结果证明，链球菌B可以通过用α-葡糖苷酶酶促底物在孵育至少18小时后来进行检测。
实施例2α-葡糖苷酶酶促底物的浓度的改变重复上述的操作方案，除了使酶促底物的浓度发生变化之外。
下面的表2给出了随着底物浓度变化时检测到的菌株(当I≥0.6时认为是阳性的)的数目。
表2
该表证明，200或300mg/l的浓度提供了好的检测。
实施例3使用α-葡糖苷酶的底物和用于不同酶促活性的底物用GreenA-α-Glu重复实施例1中描述的操作方案，除了使用133mg/l的这种底物之外，以及除了在高压灭菌后，向所述培养基中加入0.047g/l的氨曲南(ICN)、0.004g/l的两性霉素B(Squibb)和以下成分之外培养基1对照培养基，其相应于经如上所述进行修饰的具有GreenA-α-Glu的实施例1的培养基，培养基2400mg/l的6-氯-3-吲哚基-β-D-纤维二糖糖苷(Rose-β-纤维二糖糖苷)，
培养基3400mg/l的6-氯-3-吲哚基-β-N-乙酰基氨基葡糖苷(Rose-β-NAGlu)和0.5g/l的N-乙酰基氨基葡糖苷。
结果在如下表3中给出，其中C、Go和T如上定义，在Co列中，V＝绿色，G＝灰色，Mv＝淡紫色，Mg＝品红色，B＝蓝色，Vi＝紫色以及R＝粉红色。
所述菌株全部来源于本申请人的保藏。
表3
该表证明第二种酶促底物的使用使得能够提高检测的特异性，然而却没有降低检测链球菌B的灵敏度，和证明可以在孵育24小时后，将链球菌B与最通常以相关联的方式遇到的最近菌种区分开来。
实施例4用根据本发明的含有α-葡糖苷酶底物的培养基和商业获得的培养基来检测无乳链球菌的灵敏度的比较对于该灵敏度研究，使用了根据本发明的培养基，所述培养基如上面实施例中的描述进行制备，但是含有0.130g/l的GreenA-α-Glu、0.250g/l的Roseβ-D-纤维二糖糖苷、0.064g/l的氨曲南和0.004g/l的两性霉素B(Milieuα-Glu)。
作为用于比较的培养基，使用Granada培养基(ref 10077，BIOLYS，France)(Milieu Granada)。
接种69株微生物，其中包括14株无乳链球菌，并且让其在37℃下孵育直至24小时并在超过这个时间后让其处于环境温度下。如上所述对菌落进行显色。根据供应商(bioMérieux，France)的建议使用Slidex Strepto Kit通过凝集试验对具有链球菌B的特征的可疑菌落(即显现出绿色的菌落)进行确认。非特征性的菌落(即不显现绿色的菌落)或者具有特征性着色但是在凝集试验中产生阴性反应的菌落(假阳性菌株)通过Galerie ID 32 Strep(bioMérieux，France)进行鉴定。
对于灵敏度和特异性，结果表示为正确诊断相对于全部测试的％，并且在下面的表4中给出，灵敏度的％相应于在所述培养基上检测的真阳性的数目除以要检测的真阳性的总数目(*100)，特异性的％相应于在所述培养基上检测的真阴性的数目除以要检测的真阴性的总数目(*100)。
表4
在该表中所示的结果证明，使用本发明的方法检测链球菌B的灵敏度得到提高。而且，它们还显示，本发明的检测培养基还具有良好的特异性，所述特异性在接种所述琼脂前进行富集之后而得到提高，其中所述的富集是由于在有或无5％CO2下于35-37℃在Todd-Hewitt液体培养基中传代18-24小时而获得的(参见CDC(Center forDisease Control)的建议，MMWR(Morbidity and Mortality WeeklyReport)，August 16，2002，vol.51，No.RR-11)。
实施例5基于临床样品的所述培养基的使用对于该研究，使用根据本发明的培养基，其如上面在实施例4中所描述的进行制备。
在本研究中使用了总共134个来源于阴道或子宫颈内取样的样品/拭子。
将每个拭子在1ml无菌生理盐水中乳化，并将100μl这种溶液一方面放置在含有5％的马血的Columbia琼脂上，另一方面放置在使用本发明方法的培养基上。此外，将100μl上述溶液用于接种Todd-Hewitt液体培养基。于37℃并在有氧条件下孵育20小时后，用所述的Todd-Hewitt液体培养基接种所述的含血琼脂和本发明的培养基，然后于37℃并在有氧条件下孵育20小时。
根据供应商(bioMérieux，France)的建议使用Slidex StreptoKit通过凝集试验对具有链球菌B的特征的可疑菌落(即显现出绿色的菌落)进行确认。
在134个样品中，112个接种在所述的琼脂培养基上，一方面直接使用在生理盐水中的悬浮液进行接种，另一方面于在Todd-Hewitt液体培养基中进行富集之后进行接种。其余的22个样品仅直接使用在生理盐水中的悬浮液而接种在所述的琼脂培养基上。
结果显示在下述表5中，所述的结果计算为灵敏度和特异性的平均百分数。
表5
该表中的结果显示，该用于临床样品的培养基具有良好的灵敏度(18/20，检测到无乳链球菌)，并且显示，与标准培养基相比较，检测的特异性得到提高(10个假阳性结果，而在含血的Columbia培养基上有24个假阳性结果)，这些结果基本上等同于用实验室的菌株获得的结果。
权利要求
1.用于特异性检测和鉴定无乳链球菌的方法，其特征在于，使用含有至少一种α-葡糖苷酶酶促底物的反应培养基。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酶促底物是基于吲哚酚衍生物的底物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述反应培养基中所述酶促底物的浓度为10至2000mg/l。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应培养基还含有氨曲南和两性霉素B的混合物。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应培养基还含有至少一种用于不同酶促活性的其他底物，所述的其他底物优选选自β-纤维二糖糖苷酶的底物和β-氨基葡糖苷酶的底物。
6. 用于在可能含有无乳链球菌这一物种的细菌的样品中特异性检测和鉴定这种细菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤a)用全部或部分样品接种如权利要求1-5中任一项中所定义的反应培养基，b)孵育所述接种过的培养基，c)揭示单独存在至少一种α-葡糖苷酶活性，或者与至少一种不同于α-葡糖苷酶活性的其他酶促活性相组合地存在至少一种α-葡糖苷酶活性。
全文摘要
本发明涉及使用含有至少一种α－葡糖苷酶酶促底物的反应培养基来特异性检测和鉴定无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的方法。
文档编号C12Q1/34GK101027406SQ200580031157
公开日2007年8月29日 申请日期2005年9月14日 优先权日2004年9月16日
发明者D·罗比雄 申请人:拜奥默里克斯公司