抗高血压的功能性食品的制作方法

专利名称：抗高血压的功能性食品的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有生物活性的卵蛋白水解物(hydrolysate)，制备活性蛋白水解物的方法以及包括合适量的这些活性蛋白水解物的功能性食品和食品增补剂。作为功能性组分的这些功能性食品、食品增补剂和活性蛋白水解物都特别适合于降低血压，并且可以被预防性地和治疗性地食用。另外，水解物和包括这些水解物的组合物都可以被用于治疗或预防一或多种代谢性疾病和心血管疾病危险因素，例如代谢综合征。
背景技术：
全球范围的心血管疾病对总体的健康状况有着巨大影响，也影响着居民的经济情况和总体经济。在欧盟成员国内(欧洲心脏联盟)，每年都有150万人死于心血管疾病(CVD)。此外，CVD致残造成的寿命损失为近140万年，超过半数(70万年以上)都是因为中风。血压水平和中风及冠心病的危险性之间有着很强的关联，很大比例的欧洲人都有(轻度的)高血压，特殊的老年组甚至有着更高的危险。
高血压通常与大量的危险因素共存。血管紧张素-I转化酶(ACE)抑制剂不仅可以降低血压，还可以正向地影响致动脉粥样硬化背景中的许多其他的方面。现在已经证实了ACE抑制剂在降低心肌梗死和充血性心衰患者的心血管死亡率和发病率方面的益处。甚至血压的轻微下降也能正向地影响死亡率和发病率。最近对CVD危险性本质的分析表明饮食作为根本的、潜在的危险因素应当比以前受到更大的关注(欧洲心脏联盟意见书，1998)。在这个意见书中，建议需要把提供健康饮食提高到CVD预防行动的核心部分。
ACE通过从无活性的血管紧张素I中裂解出C末端的His-Leu生成了具有血管加压活性(包括血管收缩)的血管紧张素II。已知通过抑制ACE的功能可以治疗高血压。存在着大量的具有体内ACE抑制剂活性的化学药物，例如莫西普利、喹那普利、依那普利、赖诺普利、培哚普利、雷米普利、群多普利、和贝那普利。这些药物常常具有副作用，并有着过量服用的危险。另外，它们通常不适合于预防性使用。因此，需要替代性的、天然的ACE抑制物，当血压不高的对象(预防性地)摄入这些抑制物时，它们也是无害的，但是它们能有效地降低(轻度)血压升高的对象的血压。优选地，作为食品增补剂(例如片剂、囊剂等形式)或作为功能性食品(例如饮料、半固体或固体食品形式)摄入这些产品。规律地使用这些食品增补剂或功能性食品预计可以造成卫生保健方面的花费的减少(CVD费用的2％)以及EU中的患CVD的人数减少5％。平均无病寿命似乎也可以延长至少3年。另外，与化学药品相比较，这些产品的生产过程是对环境的影响更小并且生产费用也更少。
已经描述了大量的源白天然来源的抗高血压组合物。EP 1228708描述了具有降低高血压的活性的乳衍生蛋白和肽级分的用途。EP 0583074也描述了具有ACE抑制活性的包括乳衍生的Val-Pro-Pro的肽以及它的发酵食品。WO 01/32905描述了通过乳酸细菌发酵含酪蛋白的原材料而制备抗高血压肽。US 6,514,941涉及高血压肽中富含的酪蛋白水解物。WO 01/85984描述了具有ACE抑制活性和抗高血压活性的乳清蛋白水解物的用途。EP 1094071涉及从鱼肉中获得的用作抗高血压药物的肽。
本发明的目的是提供在体内具有ACE抑制活性和抗高血压活性的新的组合物和功能组分。
一般定义术语“食品”在此指的是适合于人和/或动物食用的液体的、半固体的或固体的食品。因此，所述食品包括饮料。
“功能性食品”指的是包括一或多种活性组分，特别是一或多种本发明的卵蛋白水解物的食品，据此，当有(轻度)高血压的对象食用这些功能性食品时，所述活性组分在体内预防了高血压或血压升高的发生和/或有效地降低了血压。
“食品增补剂“指的是合适于人和/或动物食用的增补剂，其包括合适量的一或多种作为功能性组分的本发明的生物活性的蛋白水解物。增补剂可以是丸剂、囊剂、粉末等形式。
“对象”表示哺乳动物纲的任何成员，包括但不限于人、非人类的灵长类、畜牧动物、家养动物和试验动物。
“食品级”指的是当被人或动物摄入时被认为是无害的组分。食品级组分优选地应当具有GRAS状态。
术语“包括”被解释为用于说明指定组分、步骤或组分的存在，但不排除一或多种其他组分、步骤或组分的存在。因此，包括X区的肽序列可以包括其他的区域，即X区可以被包含于更大的肽区内。
“有效剂量”或“有效量”指的是足以在体内造成治疗或预防效果的剂量。治疗有效剂量是足以在体内(在口服摄入之后)降低血压至少约0.5mmHg、1mmHg、5mmHg、8mmHg、10mmHg、12mmHg、15mmHg、20mmHg、30mmHg、50mmHg或100 mmHg或更多的剂量。重要的是，血压的任何可测量的降低都显著地和有益地影响了心血管疾病发病率和死亡率的结局(见McMahon et al.Lancet 1990，335765-774和Murray andLopez 1997，Lancet 3491498-1504)。通过这种方式可以同时降低收缩期和/或舒张期血压。
“ACE抑制剂”或“ACE抑制活性”在此指的是蛋白水解物在体外和/或在体内显著地抑制了ACE-I(血管紧张素-I转化酶)的能力。IC50值小于等于0.5mg/ml的蛋白水解物被认为是具有显著的体外ACE抑制活性并被认为是(可能)具有显著的体内ACE抑制活性(见Sekiya et al.1994，Science 45513-517)。IC50指的是抑制了50％酶活性的浓度。
“卵”在此优选地指的是鸡蛋，尽管可以也可以使用其他鸟类的卵。
“卵蛋白水解物”在此作为通用术语，其指的是全卵、卵级分(例如卵清(egg white)或蛋黄(egg yolk))或基本上纯化的卵蛋白(特别是卵黄脂磷蛋白(lipovitellin)、卵粘蛋白(ovomucin)、溶菌酶(lysozyme)、卵清蛋白(ovalbumin)和卵转铁蛋白(ovotransferrin))的蛋白水解物(体外制备)。
“未水解的卵蛋白”或“未消化的卵蛋白”在此作为通用术语，其指的是还没有在体外被水解的全卵、卵级分(例如卵清或卵黄)或基本上纯化的卵蛋白(特别是卵黄脂磷蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶、卵清蛋白和卵转铁蛋白)。
“代谢综合征”指的是多种彼此相关的临床疾病，包括肥胖症、胰岛素抵抗和高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、高血压和血脂异常(高甘油三脂和低HDL胆固醇水平)，如在Moller and Kaufman(Annual Rev.ofMedicine Vol 56，45-62)中所述的那样。
“生物标记物”指的是血压相关性疾病或综合征(或综合征的单个组分)的指示物。例如，人CRP(C反应蛋白)(一种应激相关蛋白)的血液水平是CVD危险因素的生物标记物。CRP的降低是心血管疾病例如中风和心肌梗死发生率降低的指示；CRP水平的提高是血管系统炎症的指示，所述炎症影响着血压和CVD危险性；其他生物标记物是葡萄糖负荷之后释放出的胰岛素量(提示胰岛素抵抗)和尿液中的所分泌的蛋白的量。
“总胆固醇”指的是LDL-和HDL-胆固醇。
“体外消化模拟”在此指的是卵蛋白水解物或未水解卵蛋白与对象胃肠道内的酶例如胃蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶的温育，以及依次和依时相地模拟体内消化的生理过程。
肽或蛋白的“活性片段”指的是比全长蛋白或蛋白变体(通过酶水解或体内合成获得的变体)更短的蛋白组分，其具有ACE抑制活性。
术语“基本上相同的”、“基本上相同性”或“本质上相似的”或“本质上相似性”表示当例如用利用默认参数的程序GAP或BESTFIT最优化地比对两种肽或两种核苷酸序列时，它们至少共享在其他地方所定义的特定百分比的序列相同性。GAP利用Needleman和Wunsch总体比对算法在其全部长度上比对两种序列，使得匹配的数目最大化以及缺口的数目最小化。通常使用GAP默认参数，缺口生成补偿＝50(核苷酸)/8(蛋白质)以及缺口延伸补偿＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，所用的默认积分矩阵是nesgapdna以及对于蛋白质，默认积分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。
利用计算机程序例如GCG Wisconsin软件包(10.3版)(来自AccelrysInc.，9685 Scranton Road，San Diego，CA 92121-3752 USA)或公共软件Emboss for Windows(目前版本2.7.1-07)可以确定出序列比对以及序列相同性百分比的积分。同样地，通过搜索数据库例如FASTA、BLAST等可以确定出相似性或相同性百分比。
另外，当用不定冠词“一个”或“一种”引用元件时，并不排除存在超过一个或一种元件的可能性，除非上下文清楚地要求此处有且仅有一个或一种元件。不定冠词“一个”或“一种”因此通常表示“至少一个或一种”。
此外，当引用核苷酸或氨基酸“序列”时，要明白这指的是生理分子即具有核酸或氨基酸序列的核酸分子或蛋白分子。
发明的详细描述惊奇地发现，卵蛋白水解物特别是卵清蛋白水解物在体外检测中具有显著的ACE抑制活性，并在鼠体内表现出显著的抗高血压活性。
最初用硅片(in silico)分析(利用对蛋白进行定量积分和分级的专用自制软件(proprietary in house software))鉴定鸡蛋中的靶蛋白，其包括具有ACE抑制活性的肽，并因此很有可能能够在体内抗高血压。选择策略是计算出超过含有已知ACE抑制肽的参考蛋白β-酪蛋白的积分。根据总的定量积分和分级，鉴定出5种靶蛋白，其都包括ACE抑制肽，当进行酶水解时，其可以在体内发挥出抗高血压活性，并且在酶水解之后任选地富集了活性肽卵黄脂磷蛋白(见例如SEQ ID NO1、2、7和8)，一种在卵黄中发现的蛋白；卵粘蛋白(见例如SEQ ID NO6和9)、溶菌酶(见例如SEQ ID NO4)、卵清蛋白(见例如SEQ ID NO8)和卵转铁蛋白(见例如SEQ ID NO5)(所有四种都是在卵清中发现的蛋白)。
为了分析卵清和/或卵黄蛋白是否以及如何可以被用于生产具有显著ACE抑制活性的水解物，进行了如在实施例中进一步描述的大量实验。
本发明的一个实施方式是提供了用于生成具有ACE抑制活性和抗高血压活性的卵蛋白水解物。方法包括步骤1.提供液体溶液，优选地是水溶液，其包括一或多种靶蛋白；2.任选地将溶液加热到约90℃约5到20分钟，优选地是15分钟，以便将蛋白变性和/或灭活(可能存在的)蛋白酶抑制剂；3.将pH值调整到使得所要使用的水解酶具有活性的pH值，优选地是所用水解酶的最佳pH值；4.当组合物已经达到适合于所用水解酶的水解温度(优选地是水解活性的最佳温度)时，加入合适量的水解酶，优选地加入相当于总靶蛋白级分的约2％的水解酶(w/w)；5.温育溶液至少约3个小时，同时搅拌；6.任选地加入附加量的酶(2％w/w)以及再温育溶液约2到3小时，同时搅拌；7.任选地用例如热处理(例如90℃下处理15分钟)灭活酶。
也提供了用上面方法获得的水解物，以及包括合适量的这种水解物的组合物，优选地是食品或食品增补剂组合物。
溶液可以被浓缩或冻干(例如低压冻干)并室温下储存，用于进一步的用途(例如体外ACE抑制检测)、用于肽富集(见下)或进一步的肽纯化或用于生产包括有效量的水解物的食品增补剂或食品。
与全水解物的活性相比较，发现有些时候用离心去除固体组分可以造成可溶性级分的ACE抑制活性增加1.5到2倍。任选地，可以分离并使用可溶性级分。通过例如在4,500g下离心约15分钟或者等效的条件都可以去除固体级分。也可以通过过滤或其他分离技术去除固体级分。对于其他的靶蛋白，固体级分的去除可以造成可溶性级分的ACE抑制活性的降低，这是不利的。对于这些靶蛋白，固体级分被优选地保留于或重新添加到产品内或者被用作活性食品或食品增补剂成分(的一部分)。
要明白水解方法中的一些步骤可以被修饰，且不改变所形成的水解物的性质。例如，用例如约4到5或5到6个小时的单一酶温育步骤可以取代温育步骤5和6。本领域熟练人员将能容易采用上面的水解方案进行优化应用。优选地在水中而不是在缓冲液中进行水解，特别是对于用于人和/或动物消费的大规模生产，因为大量的盐是不受欢迎的。对于水解，通常需要优化所用酶的量、pH值、温度和温育时间。在实施例中提供了合适水解方案的实例。
步骤1中的液体溶液的蛋白组分可以选自下面的一或多种蛋白(新鲜)全卵、分离的蛋白、分离的蛋黄、卵粉末、卵清粉末、卵黄粉末、卵清蛋白、溶菌酶、卵转铁蛋白、卵粘蛋白和/或卵黄脂磷蛋白的基本上纯化的全蛋白组合物。合适靶蛋白来源的实例是商品化可获得的蛋白组合物或卵级分组合物例如卵清粉末。例如可以从Belovo获得(100％纯蛋白)溶菌酶，可以从Sigma-Aldrich(81.3％纯蛋白)或从Belovo(89.5％蛋白)获得卵转铁蛋白，可以从Belovo获得卵粘蛋白，可以从Worthington(75.7％蛋白)或从Interchema(70.8％蛋白)获得卵清蛋白，可以从NIVE(31.6％蛋白)获得卵黄以及可以从NIVE(79.7％蛋白)获得卵清。显而易见的是，可以使用其他的商品化来源或者可以用已知的纯化方法从卵或卵级分中纯化出一或多种靶蛋白。利用如本领域已知的重组DNA技术也可以生成蛋白例如卵黄脂磷蛋白、溶菌酶、卵转铁蛋白、卵粘蛋白和卵清蛋白。例如，利用化学合成可以原位合成或者可以在重组宿主细胞中克隆并表达任一SEQ ID NO1-10(或其变体)的蛋白片段或全长蛋白。因此，可以预见到通过例如适当的食用产卵动物或甚至通过转基因动物可以将富含卵黄脂磷蛋白、溶菌酶、卵转铁蛋白、卵粘蛋白和卵靶蛋白(或这些蛋白的变体或其片段)中的一或多种蛋白的全卵、卵黄、或卵清作为原材料。
SEQ ID NO1-10的靶蛋白的“变体”包括与SEQ ID NO1-10的那些蛋白基本上相似的蛋白，例如具有包括与SEQ ID NO1-10的任一序列有着至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸的蛋白。可以原位合成，从天然来源中分离或克隆出或者在硅片上鉴定出这些变体。
在本发明的一个实施方式中，用作蛋白来源的卵是不新鲜的，可以在例如室温、4℃下或以粉末的形式储存更长的时间。发现非新鲜的卵来源不会负性地影响ACE抑制活性。这对于水解物生成过程是有好处的，因为例如在使用之前不需要冷冻卵。在室温下或在约4℃和室温之间的温度下储存卵或卵级分至少6周且不丢失活性是有可能的。
或者，可以从卵中提取出靶蛋白，随后将其纯化。例如，利用已知的方法可以分离出卵清级分，利用阳离子和阴离子交换层析法、凝胶渗透层析法、亲和层析法以及本领域已知的其他方法都可以纯化出特异的靶蛋白。例如用金属螯合层析法可以纯化出卵转铁蛋白，而可以用肝素亲和层析法分离糖蛋白。卵清中的溶菌酶浓度比其他来源的溶菌酶更高(3-4％)。常规用于溶菌酶纯化的方法是阳离子交换层析法。溶菌酶在pH值为9时与阳离子交换剂结合，这可以在搅拌罐反应器或在层析柱中进行。在用盐洗脱出吸附颗粒之后，溶菌酶对于食品应用是足够纯的。为了获得适用于药物应用的高纯度的溶菌酶，需要pH4下的阴离子交换层析进行进一步的纯化。这种纯化方法的优点是不改变原材料(卵清)，该方法容易大规模应用，对于食品应用，只需要一个吸收过程并且保留了生物活性。因此，在一个实施方式中，用阳离子交换层析法纯化溶菌酶。对于任一靶蛋白的进一步纯化，可以采用例如膜超滤和透析过滤的步骤。
适用于水解的酶理论上可以是任一食品级的蛋白酶或各种来源的蛋白酶混合物，所述来源例如是植物、动物或微生物例如真菌或细菌。例如，Newlase F包括源自雪白根霉(Rhizopus niveus)的酸性蛋白酶，Promod 184P包括菠萝的蛋白酶，Promod 258P包括番木瓜的蛋白酶(番木瓜蛋白酶)和曲霉菌属的蛋白酶和肽酶。胃蛋白酶389P包括来自猪胃粘膜的动物酸性蛋白酶，Alcalase包括地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformi)蛋白酶混合物，其中主要的酶是内蛋白酶。
发现特异蛋白-蛋白酶组合释放出了生物活性肽，生成了具有ACE抑制活性的水解物。表1提供了用于制备蛋白水解物的优选酶，以及所述酶应用的最佳条件。
表1用于水解物生成的酶

在这些所测试的酶中，发现下面的食品级蛋白酶(或蛋白酶混合物)是特别合适的Newlase F、Promod 258P、Alcalase、PEM(蛋白裂解酶混合物)、PTN(Pancreatic Trypsin Novo)和Protex 6L。要明白可以使用其他的内-和外-蛋白酶(或混合物)。本领域熟练人员通过制备所述的水解物以及用在其他地方所述的体外检测法测试ACE抑制活性可以确定出适用性。
无意于限制本发明的范围，但认为由于外蛋白酶活性释放出相当高比例的单个氨基酸的酶是不太合适的，而释放出相当高比例的二肽和/或三肽(由于内-和外-蛋白酶活性或者仅仅是内蛋白酶活性)的酶是最合适的。酶适当地释放出少于约10％的游离氨基酸，优选地少于约8％、7％、6％或5％。优选地，所用的酶释放出相当高比例的二肽和/或三肽，例如至少超过10％、15％、20％、30％、40％、50％或更多。
本发明的蛋白水解物因此优选地包括高比例的靶蛋白的二肽和/或三肽，优选地包括至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。在一个实施方式中，因此更长链和更高分子量的肽例如具有4、5、6、7、8或更多个氨基酸的肽优选地只有相当小的量(优选地小于10％的总靶蛋白级分)或者不存在。
在一个实施方式中，通过靶蛋白衍生的二肽和/或三肽(以及肽链长度在蛋白级分中的分布)和/或靶肽的分子量分布因此可以表征出本发明的水解物。例如，水解物可以包括至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的小于0.5kD的靶肽。实施例13显示了靶蛋白水解物的分子量分布、水解程度以及水解物活性之间的相关性。优选的分子量分布因此是如实施例13所示的，以及包括例如约70∶10∶20、45∶21∶34、70∶16∶14、98∶1∶1、99∶1∶0、85∶10∶5、90∶1∶9、92∶4∶4和53∶17∶30(表示具有分子量＜0.5kD的片段0.5和1.0kD之间的片段＞1kD的片段的百分比)。小于0.5kD的片段对应于小于4到5个氨基酸的片段，而约0.5-1.0kD的片段对应于4到9个氨基酸以及超过1kD的片段对应于超过9个氨基酸的肽片段。因此，任一靶蛋白例如包括SEQ ID NO1-10的氨基酸序列的蛋白或其变体可以被水解生成包括这些连续氨基酸链的肽。优选地，靶蛋白的水解程度至少是约15％、20％，更优选地至少是30％或更高。因此，在一个实施方式中，本发明包含包括多种片段的组合物，所述片段选自SEQ ID NO1-10或其变体中任一的2个连续氨基酸、3、4、5、6、7、8、9个连续氨基酸的一或多种。
水解物的分子量分布因此可以包括例如40-70％小于0.5kD的靶肽以及30-50％的0.5和1kD之间的肽等。用本领域已知的方法例如SDS-PAGE分析、HPLC分析、MALDI-TOF(如Kaufmann，J.Biotechn 1995，41155-175和Soeryapranata et al.2002，J.Food Sci.67534-538所述的基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱法)、HP-GPC(如Terheggen-Lagro et al.BMC Pediatrics 2002，210所述的高相凝胶渗透层析法)以及Edman降解(Siemensma et al.Trends Food Sci Technology 1993，416-21)可以确定出水解物的分子量分布、肽链长分布以及最大肽分子量，也见于实施例13。靶蛋白的最大分子肽量优选地小于10kD，更优选地小于5kD，更优选地小于4kD、3kD、2kD、1kD、0.5kD或小于约0.3kD。
在一个具体的实施方式中，短肽例如二肽和三肽的比例得以富集，据此所形成的水解物的ACE抑制活性增加了至少1.5倍、2倍、优选地增加了3倍或更多。通过将包括靶蛋白衍生肽的水解物过滤通过一个或多个膜滤器(例如超滤或纳米过滤滤器)可以实现生物活性肽的富集，优选地使用了具有分子量阈值为0.3kD、0.5kD、1kD、2kD、3kD、4kD、5kD到10kD的膜滤器，更优选地使用从2kD到5kD的膜滤器。在此提供了富集了氨基酸长度约为2、3、4和/或5个的短的、低分子量的肽以及具有强化的ACE抑制活性的靶蛋白水解物。优选地使用尺寸阈值为2到3kD的富集。例如，在富集短肽之后，显示出增加了包括卵转铁蛋白肽的水解物以及包括溶菌酶肽的水解物的ACE抑制活性(见实施例)。这些富集的水解物优选地包括提高了的体内抗高血压活性。另外，更小的量对于每日应用都是有效的，这使得能制备更小体积的食品增补剂或食品。
也可以用膜过滤去除水解物中可能存在的以及可能影响肽活性的不需要的杂质。
本发明也涉及通过用靶蛋白和/或酶的组合(混合物)生产生物活性的蛋白水解物，任选地随后富集低分子量肽例如二肽和/或三肽。
或者，利用化学合成方法可以重新生成类似本发明的蛋白水解物产品的组合物。具体地，通过组合化学可以生成二肽和三肽文库，据此形成二肽和三肽的所有可能的组合。从该组合或二肽和三肽文库中可以生成具有与上述水解物对血压的活性基本上相同的活性的混合物。
下面的靶蛋白-酶组合生成了0.5mg/ml水解物的ACE抑制值为约50％、55％、60％、65％、70％、80％或更高的水解物(详细内容见实施例)。
靶蛋白- 酶溶菌酶- Alcalase溶菌酶- Protex 6L溶菌酶- PEM溶菌酶- PTN卵粘蛋白 - PEM卵粘蛋白 - Alcalase卵粘蛋白 - Protex 6L卵粘蛋白 - PTN卵转铁蛋白- Newlase F卵转铁蛋白- Promod 258P卵转铁蛋白- PTN卵转铁蛋白- PEM卵转铁蛋白- Protex 6L卵转铁蛋白- Promod 258P卵黄 - Alcalase
卵黄 - Protex L6卵黄 - PEM卵黄 - Newlase F卵清 - Alcalase卵清 - Promod 258P10种最有活性的水解物的列表生成了如下的ACE抑制活性(体外检测)的分级(从最大活性到较小活性)1.卵转铁蛋白-Newlase F；卵转铁蛋白-PTN2.卵粘蛋白-Alcalase；卵转铁蛋白-PEM；溶菌酶-PEM3.卵黄-Protex L6；卵清蛋白-Promod 258P；卵转铁蛋白-Promod258P；溶菌酶-Alcalase；溶菌酶-Protex 6L。
对于商业化目的，适合于大规模生产例如500、1000、超过1000升的未加工原材料和/或蛋白水解物的生产方法是所需领域的熟练人员的常规试验的内容。
因此提供了如上所述生成的以及任选地进一步富集的和/或纯化的，具有显著的ACE抑制活性和显著的体内抗高血压活性的卵蛋白水解物。也提供了包括合适量的本发明的水解物的组合物，特别是食品和/或食品增补剂组合物，见下。
在另一个实施方式中，提供了未水解的卵蛋白或部分水解的卵蛋白及其用途，以及包括有效量的至少一种未水解的卵蛋白的食品增补剂和食品，具体地是至少一种选自全卵、全卵黄、全卵清、卵转铁蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶和/或卵清蛋白的未水解的卵蛋白。惊讶地发现(用消化模拟)人体和/或动物对象的胃肠道内的蛋白酶的水解作用对于从靶蛋白中释放出生物活性肽是有效的。体外水解因此本身就不是一个必需的步骤，不过其是优选的，以便将体内作用的变异最小化，所述体内作用的变异可以来自于对象(一个对象可能比另一个对象具有更高的消化酶量和/或活性)之间的变异和/或来自于食品组成和构造的变异(造成了在不同消化道空间中的停留时间的变异)。
当将水解的卵蛋白用于制备食品增补剂或食品时，优选地是水解物的活性在体内不被修饰，或者至少是基本上不被修饰或者不被负性方式(降低活性)地修饰。通过体外消化模拟检测法可以测试水解物是否是被“完全水解的”，意思是随后与胃肠道酶的接触对水解物的生物活性没有影响。在该检测中，水解物与胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶一起温育，并比较起始水解物的ACE抑制活性与经胃蛋白酶/胰蛋白酶/糜蛋白酶处理后的水解物的ACE抑制活性(更多的细节见实施例)。消化模拟(和体内消化)优选地不改变水解物或包括水解物的食品增补剂或食品的ACE抑制活性。
还提供了包括有效量的至少一种本发明的水解物和/或有效量的至少一种未水解卵蛋白(或部分水解的卵蛋白)的食品增补剂和食品。显著的ACE抑制活性被定义为0.5mg/ml蛋白水解物(或更少)能抑制约50％(或更多)的ACE活性，例如用体外检测法检测。用于确定ACE抑制活性的体外检测法是已知的(见例如Matsui et al.1992，Biosc.Biotech.Biochem 56，517-518)，并在实施例中有所描述。已知的ACE抑制剂被恰当地用作参照物，例如卡托普利。显著的抗高血压活性在此被定义为水解物在体内降低血压的能力，例如可以在试验动物例如SHR(自发性高血压鼠)或者人体试验中进行测定，其中在口服摄入后的规律间隔内测定(舒张期和/或)收缩期血压(SPB)。对照鼠可以是正常血压的鼠例如Wistar鼠或WKY。用于测定动物模型血压的方法在本领域是已知的，例如遥感测定法和袖带法(见Van Vliet et al.2000，J Pharmacol ToxicolMethods.44(2)361-73)。遥感设备和袖带血压分析仪都是商品化可获得的。
如本领域已知的，可以制备包括至少一种本发明的水解物和/或至少一种本发明的未水解卵蛋白的食品增补剂和食品。食品增补剂例如可以是任何储存形式的形式例如片剂、丸剂、粉末囊剂、凝胶、胶囊等。对象的摄入方式优选地是口服摄入。食品可以是饮料形式(例如100ml瓶、150ml溶液)、固体或半固体食品例如点心、甜点、调料、全麦面包等。食品优选地是规律(优选地每日)食用的食品，例如主食(例如面包、面条、软饮、乳制品例如奶酪、酸奶、发酵乳制品、牛奶、黄油等)。因此可以将生物活性组分添加到食品原料内或者可以在食品的生产过程中将生物活性组分整合到食品内。因此，在此包括任何已有的包括本发明的水解物的食品或食品增补剂产品。
在一个优选的实施方式中，食品是饮料，优选地是基于果汁或蔬菜汁的饮料，尽管也可以包括基于牛奶的饮料。可以制备出每日剂量体积为50ml、100ml、150ml、200ml或更多的饮料。要明白食品增补剂或食品还可以包括其他的食品级组分，例如但不限于调味剂、维生素、矿物质、稳定剂、乳化剂、其他生物活性组分、食品原料/营养物例如蛋白质、碳水化合物和/或脂类组分等等。可以在食品/食品增补剂的正常生产过程中的任一阶段加入卵蛋白水解物或未水解卵蛋白。
食品/增补剂也可以包括其他无活性的组分和载体例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物例如羧甲基纤维素(CMC)、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石粉、碳酸镁等。它也可以包括水、电解质、必需和非必需氨基酸、微量元素、矿物质、纤维、增甜剂、调味剂、着色剂、乳化剂和稳定剂(例如大豆卵磷脂、柠檬酸、甘油单酯或甘油二酯的酯类)、防腐剂、结合剂、芳香剂等。
需要添加的有效剂量依赖于多种因素例如对象(例如人或动物)、剂量形式(每日、一日数次、每周)和产品组成和/或构造。蛋白水解物或未水解蛋白的每日有效剂量的范围是在约50mg/kg体重到100mg/kg、500mg/kg到1000mg/kg体重之间、或更高。但是，对于高度活性的水解物，约10mg/kg/天或更少的量可能是有效的。利用常规试验确定出有效剂量是在本领域熟练人员的能力范围之内。在一个实施方式中，提供了包括10g、20g、30g、40g或更高剂量的水解物的食品或食品增补剂。这些组合物适合于每日摄入。
对于丸剂或胶囊形式的食品增补剂，可以添加涂层，其能改变生物活性肽在体内释放的位置和/或时间。缓释剂型在本领域是已知的。
在规律(优选地每日)地摄入有效剂量之后，本发明的功能性食品和食品增补剂优选地降低血压。根据剂量形式和摄入，在数周例如3、4、5、6或7周之后，将看到对血压的作用。
这些功能性食品或食品增补剂可以被标记为具有降低血压的作用以及可以被已经被诊断患有轻度升高的血压或高血压的对象摄入作为治疗手段。成人的正常血压约为120mmHg(收缩期)/80mmHg(舒张期)。升高的或高的血压可以被分成不同的水平，例如临界(120-160/90-94)、轻度(140-160/95-104)、中度(140-180/105-114)和重度(160+/115+)。本发明的食品和增补剂特别适合于治疗临界、轻度和中度组。它们可以被单独摄入或者与化学药物(其剂量可以减少)或其他降低血压产品一起被联合摄入。
或者，产品可以被具有发生血压升高/高血压危险的对象或任一健康对象预防性地摄入。在有血压升高的人体中，口服摄入本发明的组合物之后的血压(mmHg)的任何下降都能显著有利地影响发病率和死亡率。在口服摄入本发明的食品增补剂或组合物之后，舒张期血压降低仅1mmHg(或更少)、5mmHg、8mmHg、10mmHg、12mmHg、15mmHg、20mmHg、30mmHg、40mmHg或更多在此都被包含在本发明的范围之内。本发明还包括(附加地或同样地)收缩期血压被降低了如在上面所示的相同数量。
在另一个实施方式中，本发明的水解物或包括合适量的一或多种水解物的组合物被用于治疗或预防代谢综合征(或者代谢综合征的一或多种单个组分)、用于降低总胆固醇和/或LDL-胆固醇，用于降低血CRP水平，用于治疗或预防胰岛素抵抗(即糖尿病；2型糖尿病或非胰岛素依赖性糖尿病或葡萄糖耐受不良)，和/或降低总尿蛋白水平。因此，可以在规律摄入包括本发明的一或多种水解物的组合物之后测定生物标记物，以及可以确定水解物对生物标记物的作用。水解物因此可以被用于调控一或多种生物标记物，并据此具有有益的健康作用。在此包括了利用本发明的水解物调控生物标记物的方法。
优选地，在规律摄入水解物之后(例如摄入合适量1周、2周或3周之后)，总血胆固醇水平和/或LDL胆固醇水平降低了至少10mg/L、15mg/L、25mg/L、30mg/L或更多。
可以用常规试验确定出合适的量。
血CRP水平优选地被降低了0.3mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L或更多。尿蛋白水平优选地被降低了2％、5％、10％或更多。
要明白在此包括以上内容的任何组合。因此，摄入本发明的水解物可以适用于降低收缩期和舒张期血压、总胆固醇和LDL胆固醇、CRP水平等。
要明白，用其他的方法例如细菌或其他微生物(酵母、其他真菌)的发酵、化学合成或在转基因宿主细胞或宿主有机体中的表达也都可以生成包括本发明的抗高血压肽的水解物。例如，编码活性肽的DNA序列可以与合适的启动子(优选地是强启动子)可操纵地连接并在植物细胞、组织或器官和/或转基因植物中表达。也可以设计出包括可以在单一启动子下表达的编码一些活性肽的序列串的DNA序列。所述肽可以被间隔序列分开，例如编码能被蛋白酶识别并降解的氨基酸序列，使得随后可以通过酶水解释放出活性肽。
SEQ ID NO 1VIT2_CHICK氨基酸序列SEQ ID NO 2VIT2_CHICK氨基酸序列SEQ ID NO 3APV1_CHICK氨基酸序列SEQ ID NO 4LYC_CHICK氨基酸序列SEQ ID NO 5TRFE CHICK氨基酸序列
SEQ ID NO 6Q98UI9氨基酸序列SEQ ID NO 7VIT1_CHICK氨基酸序列SEQ ID NO 8OVAL_CHICK氨基酸序列SEQ ID NO 9Q98UI9氨基酸序列SEQ ID NO 10VIT1_CHICK氨基酸序列以下非限制性实施例举例说明了本发明的产品和方法。
实施例实施例1硅片分析1.1方法为所有已知的ACE抑制肽建立了含有序列数据和定量活性数据(IC50值)的内部的肽数据库。针对第二个包括所有鸡/卵蛋白的数据库分析了这个数据库。在分析过程中，去除了信号序列以及不是全长成熟肽的肽。用程序计算出积分，其反映了在靶蛋白序列中所存在的肽具有ACE抑制活性的可能性。
1.2结果根据活性预测并结合肽的长度(短肽长度优先)得到了下面的结果。


具有最高加权积分的靶蛋白包括具有ACE抑制活性(数量和总活性)的肽，这些蛋白因此是具有ACE抑制性能的水解物的有希望的来源。最有希望的靶蛋白是卵黄脂磷蛋白I和II、溶菌酶、卵转铁蛋白、卵粘蛋白和卵清蛋白。
实施例2本发明的优化方案2.1水解卵蛋白的方案●将蛋白级分(3％)溶解于水中；●搅拌溶液；●将溶液在90℃下温育15分钟(不针对溶菌酶，有凝集)；●在冷却到所需温度之后，将pH值调整到所需的pH值，并加入酶(酶相对于蛋白级分的比值(w/w)为2％)；●温育溶液3个小时，同时搅拌；●加入附加量的酶(2％w/w)；●在搅拌下再温育溶液2到3个小时；●通过在水箱中90℃下温育15分钟灭活酶；●将溶液冻干并在室温下储存。
2.2用于(水解)样品的体外消化模拟的方案●制备4％蛋白(水解物)样品溶液；●将pH值设定为2；●加入10mg/ml胃蛋白酶溶液，加入量的比值为1/250(w/w)；●摇晃下，在水箱中37℃下温育溶液2个小时；●随后，将pH设定为6.5；●加入含有10mg/ml胰蛋白酶和10mg/ml糜蛋白酶的溶液，两种酶的比值都是1/250(w/w)；●摇晃下，在水箱中37℃下温育溶液2.5个小时；●通过在90℃下温育15分钟灭活酶；●将溶液冻干并在室温下储存。
2.3用于在微量板中确定出水解物的ACE抑制活性的方案利用基于分光光度法的检测法可以体外测定出ACE抑制活性。该检测法是依据于经ACE催化从Hip-His-Leu底物中释放出苯甲酰氨基乙酸。
所用溶液●含有300mM NaCl的0.1M硼酸缓冲液(pH值8.3)；● 5mM EDTA.2Na溶液；●含有1M NaCl的0.5M Bicine；●0.25M NaOH；● 50mU/ml ACE；● 50mM 2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)的0.1M Na2HPO4溶液；●含有1mg/ml乳铁蛋白的5mM Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(Hip-His-Leu)的硼酸缓冲液；●蛋白(水解物)溶液(0.500mg/ml、0.167mg/ml、0.055mg/ml、0.019mg/ml)；
●参照溶液，0.5mg/ml卵清/Alcalase溶液。
ACE抑制检测法小型化的温育方案

EDTA将ACE变性(100％ACE抑制)向所有孔中加入乳铁蛋白(天然蛋白)以零平衡测试Bicine(缓冲液)，调整所有孔中的pH值到9.1，即TNBS反应的最佳pH值。
ACE抑制的计算％抑制＝(对照-空白2)-(样品-空白1)/(对照-空白2)×1002.4用Alcalase对卵粘蛋白的进一步水解(最优化水解)用TNBS法进行DH测定的方案溶液●0.21M磷酸钠缓冲液(pH值8.2)-0.21M NaH2PO4.H2O(25ml溶液)-0.21M Na2HPO4.2H2O(500ml溶液)-混合溶液，pH值为8.2●0.05％TNBS
-在用铝箔包盖的MQ试管中，稀释TNBS储存液(5％溶液)，并储存在暗处。
●1％SDS溶液●亮氨酸标准液(3mM亮氨酸储存液)-将亮氨酸溶液于1％SDS溶液中。用1％SDS按20x、10x、4x、2x稀释储存液。
●空白-用1％SDS稀释未水解样品，使得蛋白浓度为0.5mg/ml●样品-用1％SDS稀释水解过的样品，使得浓度为0.5mg/ml，双份样品分析●将15μl样品(亮氨酸标准液或样品)吸量到微量板中；测定板(Costar，非结合板)中的每种两倍稀释液●加入45μl 0.21M磷酸钠缓冲液(pH值8.2)●加入45μl 0.05％TNBS。用铝箔包盖板。在50℃加热器中温育板60分钟●在温育之后，加入90μ1 0.1N HCl●测定340nm处的吸光度(微量板酶标仪)水解程度(DH)的计算●制作亮氨酸标准液的校正线。用该校正线将样品的吸光度数值转化成NH2等效物。将校正样品中的mmol NH2-等效物校正为未水解样品中的摩尔当量。
●举例水解生成的NH2＝0.78mM亮氨酸NH2，0.78mM*15(样品体积)*10-6＝1.17*10-5meq。样品的蛋白浓度是0.5mg/ml，所以15μl样品含有7.5μg蛋白。h＝1.17*10-5meq/7.5*10-6＝1.56meq/g。h tot eiwit(数值依赖于蛋白)＝7800meq/kg。％DH＝(1.56/7.8)*100％＝20％。
结果实验13％卵粘蛋白溶液，pH8，60℃，Alcalase

注意在第一个小时期间没有发生最优化水解。
实验23％卵粘蛋白溶液/Alcalase水解物，pH8，60℃，Alcalase

实验33％卵粘蛋白溶液/Alcalase水解物(DH 23.9、IC50＝0.21mg/ml)，pH8，60℃，Alcalase

用于动物研究的卵粘蛋白/Alcalase水解物对卵粘蛋白/Alcaiase水解物的进一步水解的概述●6g水解物(卵粘蛋白/Alcalase水解物，5个小时)●60℃，pH值8●120μl Alcalase●3个小时之后，120μl额外的Alcalase●3个小时之后，120μl额外的Alcalase●30分钟之后，终止反应(90℃下15分钟)●冻干总的水解时间(5+6.5)＝11.5个小时ACE活性IC50＝0.23mg/ml样品已经被用于实施例8.2.4.1。
实施例3初始卵蛋白水解实验(在方案优化之前)对于水解实验，已经使用了10种商品化获得的酶以及9种蛋白样品。下面的酶已经被用于水解实验(刮号内给出了最佳的pH值、温度和缓冲液)●Newlase F(pH3、T50、甲酸缓冲液)●胃蛋白酶389P(pH3、T50、甲酸缓冲液)●Promod 258P(pH5.5、T45、乙酸缓冲液)●Promod 184P(pH6、T50、Bis-Tris缓冲液)●Flavourzyme(pH7、T50、磷酸缓冲液)●Alcalase(pH8、T60、Tris缓冲液)●PEM(pH8、T50、Tris缓冲液)●PTN(pH8、T50、Tris缓冲液)●Corolase PP(pH8、T50、Tris缓冲液)●Protex 6L(pH8、T60、Tris缓冲液)
使用下面商品的靶蛋白组合物(刮号内给出了产家和说明)●溶菌酶(Belovo、100％蛋白)●卵转铁蛋白(Sigma、Aldrich、81.3％蛋白)●卵粘蛋白(Belovo、72.3％蛋白)●卵粘蛋白(Worthington、75.7％蛋白)●卵黄(NIVE、31.6％蛋白)●卵清1101(NIVE、79.7％蛋白)●卵清102(NIVE、77.2％蛋白)●卵清蛋白(Interchema、70.8％蛋白)●卵转铁蛋白(Belovo、89.5％蛋白)根据Kjeldahl(Kjeldahl系数为6.25)确定出蛋白百分比。
在最佳的pH和温度下，在缓冲液中进行初始水解实验。方案为●将蛋白级分(100mg蛋白)溶解于3.3ml缓冲液中；●涡旋溶液；●在t＝0时，取出样品(300μ1)并储存于-20℃冰箱内；●将溶液在90℃水箱中温育15分钟(同时摇晃)。因为有凝集物的形成，对溶菌酶不进行该步骤；●在冷却到所需温度之后，加入酶(1.8mg或1.8μl；相对于蛋白级分加入2％酶)；●在混合之后，涡旋试管；●在用磁棒搅拌的同时，温育溶液3个小时，期间涡旋溶液；●通过在水箱中90℃下温育15分钟灭活酶(摇晃)；●确定出pH值，将溶液冻干并储存于4℃。
在对所有的靶蛋白-酶组合进行初始筛选之后(结果没有显示)，再分析最有希望的样品(即IC50小于0.5mg/ml的样品)。在下面的表中给出了作为蛋白浓度的函数的ACE抑制结果(使用浓度为6ng/ml的卡托普利)。
卵清蛋白

卵转铁蛋白

溶菌酶

卵粘蛋白

卵黄

卵清1101

卵清1102

在下面的表中显示出了对上面所示结果的分析。对靶蛋白-酶组合的ACE抑制活性、抑制的可重复性以及外观(这也是对水解物可以被操作的便利性的测定值)进行计分。
在浓度为0.5mg/ml时具有超过50％ACE抑制的蛋白-酶组合

#外观；s＝溶液；p＝颗粒；m＝乳状；a＝凝集；ts＝浑浊溶液1ACE抑制＞60％为++；50-60％之间为+
2最高和最低值之间的差异＜10％为+；10-20％之间为0；＞20％为-3溶解性溶液为++；浑浊溶液为+；乳状液为+；颗粒为0；凝集为0上面表中的任何靶蛋白(特别是与所示的酶或具有等价活性的酶的组合)都适用于制备具有降低血压活性的靶蛋白水解物和食品增补剂/食品(包括合适量的这些水解物)。
对于蛋白在缓冲液中的水解之后的体外ACE抑制活性，根据积分将下面的蛋白-酶组合进行分级。为此，将每种靶蛋白酶组合的每个方面的积分进行累加并得到了下面的分级最佳的10种靶蛋白-酶组合

对在最佳组合组中所出现的蛋白和酶数目的分析得出了下面的分布

某些酶显示出其不能有效地从靶蛋白中释放出生物活性肽，例如胃蛋白酶、Promodl84P、Flavourzyme和CorolasePP。值得注意的是，CorolasePP和Flavourzyme都是能生成非常多的游离氨基酸(11.5-13.0％)的酶，因为它们的外蛋白酶(exoprotease)活性。在这些水解物中，形成了游离氨基酸而不是短肽，造成了低浓度的ACE抑制肽。并非是对本发明的范围的限制，提出了释放出比二肽和三肽的量相对更多的量的游离氨基酸的酶是不太适合的。Promod258P也是内蛋白酶和外蛋白酶的混合物，已知其能生成相当多的游离氨基酸(9.3％)，它是一种令人满意的用于生成ACE抑制性水解物的酶。
实施例4水中的水解以及水解方案的优化考虑到不希望使用缓冲液的商品化应用，在水中进行水解。如果不是明确必要的情况，消费产物不应当含有附加的盐成分，因此用水取代每种酶的最佳缓冲液条件。在反应过程中，通过加入NaOH或HCl调整溶液的pH值。
也进一步优化了酶与靶蛋白的温育时间。最初的水解方案与上面缓冲液中的方案相同，但是在3个小时之后，用附加量的酶(量为2％w/w)进一步地水解蛋白。每个小时取得样品。使用ACE抑制检测法测试级分，结果显示于下面的表内。


已经用阴影显示出作为相关对照的0.5mg/ml蛋白浓度的行。如果该数值的抑制百分比是50％或更高，那么水解物可能具有体内抗高血压活性。
卵清和卵黄样品的最佳水解时间是近5个小时，得到在0.15和0.25mg/ml之间的IC50值。对于纯化蛋白即溶菌酶、卵转铁蛋白和卵粘蛋白，最佳水解时间是4到5个小时之间，以及IC50值(如从表中的数据计算得到的)的范围是在从低于0.1mg/ml(溶菌酶和卵转铁蛋白)到0.3mg/ml(卵粘蛋白)。
实施例5体外消化模拟试验5.1用蛋白-酶组合物进行体外消化模拟试验以研究内在消化系统的可能作用。如果内源性蛋白裂解酶负向地影响了体外优化的水解物的ACE移植活性，应当采用优化方法解决这个问题。因此，使用了下面的方案●制备4％蛋白(水解物)样品溶液●将pH值设定为2●加入10mg/dl胃蛋白酶溶液，其量的比值为1/250(w/w)●摇晃下，在37℃的水箱中温育溶液2个小时●将pH值设定为6.5●分别加入含有10mg/ml的胰蛋白酶和糜蛋白酶的溶液，量的比值为1/250(w/w)●摇晃下，在37℃的水箱中温育溶液2.5个小时●通过在90℃下温育15分钟灭活酶●冻干样品并储存于4℃用6个小时点的水解样品实施该方案。结果(抑制百分比)显示于下面的表内，0.5mg/ml水平的水解酶的行具有阴影背景。


如从0.5mg/ml点看，没有一种靶蛋白-酶组合物的ACE抑制能力在体外消化模拟之后发生了显著的变化。各个时间点的总体结果(包括所有的IC50值)都显示于下面的表内。概括了三个不同的研究1.在缓冲液中水解3个小时后的筛选2.对在水中水解的优化；3.对6小时水解样品的消化模拟。

5.2进行了另一个试验，以研究体外消化模拟对卵黄和卵清靶蛋白的水解物的影响。
D＝体外消化模拟Y+AIc＝卵黄水解物-Alcalase卵黄D＝经消化的(体外模拟)全卵黄Y+AIc D＝卵黄水解物-Alcalase，之后进行消化(体外模拟)EW+AIc＝卵清水解物-Alcalase卵清D＝经消化的(体外模拟)全卵清EW+AIc D＝卵清水解物-Alcalase，之后进行消化(体外模拟)


可以看到，体外消化模拟不会改变水解物的ACE抑制活性。
Lyz+AIc＝溶菌酶水解物-AlcalaseLyz+PEM＝溶菌酶水解物-PEMLyz D＝溶菌酶(没有被预先水解)的体外消化模拟
Lyz+AIc D＝水解物(溶菌酶-Alcalase)，之后进行体外消化模拟OM+AIc＝卵粘蛋白水解物-AlcalaseOM+PTN＝卵粘蛋白水解物-PTNOM D＝卵粘蛋白(没有被预先水解)的体外消化模拟OM+AIc D＝水解物(卵粘蛋白-Alcalase)，之后进行体外消化模拟OT+NF＝卵转铁蛋白水解物-NewlaseFOT+Pr258P＝卵转铁蛋白水解物-Promod258POTD＝卵转铁蛋白(没有被预先水解)的体外消化模拟OT+AIc D＝水解物(卵转铁蛋白-Promod258P)，之后进行体外消化模拟

消化模拟不会负向地或正向地影响所形成的水解物的ACE抑制活性。只有卵转铁蛋白(OT)的水解物正向地增加了ACE抑制活性。
总而言之，体外消化模拟不会正向地或负向地改变卵蛋白水解物的ACE抑制性能。这说明对象体内的消化活动不会改变水解物的ACE抑制。但是，这需要体内证实。
5.3对在体外消化中胃蛋白酶的两种不同温育时间的影响的研究用胃蛋白酶的两种温育时间即30分钟和120分钟(D30和D120)重复体外消化研究，这分别代表了胃内的短暂停留时间和长停留时间。肠道模拟的温育时间没有改变，即仍为150分钟。
另外，在ACE抑制检测法中测试了初始蛋白和蛋白级分(没有被预先水解，也没有被体外消化)，以评价这些蛋白的可能的背景活性。


从上可以得出结论，即初始(未水解的和未消化的)蛋白(列1)不具有ACE抑制活性。
在经胃蛋白酶处理30分钟后的水解物的ACE抑制活性与处理120分钟后的水解物的ACE抑制活性之间没有太多的差异，这说明胃内的停留时间可能不会影响蛋白水解物的性能。
实施例6卵清粉末和新鲜原料的比较本试验的目的是确定卵清粉末是否形成了具有与新鲜卵清原材料不同的抑制活性的水解物。将商品化获得的卵清粉末与新鲜制备的卵清进行比较，并测试了ACE抑制活性，以便比较新鲜度的影响。
检测条件是●试验次数3次●商品化获得的EW1101产品是清除溶菌酶的产品，对于该试验，用3.4％溶菌酶(BeIo vo)进行富集●对照未经胃蛋白酶/糜蛋白酶/胰蛋白酶消化(仅仅用alcalase水解)●D30/D12030’/120’的胃蛋白酶消化，之后用α糜蛋白酶/胰蛋白酶在pH6.5、37℃下消化2.5个小时确定出ACE抑制活性(IC50mg/ml)

结果显示，干的卵清粉末和新鲜卵清都具有显著的ACE抑制活性。
实施例7水解物的可溶性级分和固体级分的活性目的是确定水解物的可溶性级分和不可溶性级分的ACE抑制活性。
至此，用alcalase水解卵清、溶菌酶和卵粘蛋白，并通过离心(15分钟，4,500×g)分级所形成的水解物。分别冻干沉淀物和上清液级分。
根据干重，如下划分沉淀物和上清液级分

确定出ACE抑制活性，并将其与在水解后被直接冻干的全水解物的活性进行比较。

1在每板中都测定卵清样品的标准参照物(2003年9月25日生成的卵清1101/Alcalase，0.5mg/ml溶液)

1未离心在两种情况中(即EW1101和卵粘蛋白)，沉淀物和上清液的分离造成了上清液的ACE抑制活性的增加。但与全部的、未离心的水解物的差异小于2倍。
在所示的条件下，在体外消化模拟之后也能从沉淀物中释放出卵粘蛋白/alcalase水解物的不可溶性级分的主要的ACE抑制活性

如果可能，沉淀物所具有的活性应当被包含于终末食品内。实施例8体内试验8.1首个体内试验8.1.1首次大规模的水解物制备为了获得用于体内试验的大批量的水解物，进行20到25克规模的水解。制备出下面的水解物1.溶菌酶/Alcalase(Lys+Alc)2.溶菌酶/PEM(Lys+PEM)3.卵粘蛋白/Alcalase(OM+Alc)4.卵转铁蛋白/Promod 258P(OT+Pr258P)
5.卵黄/Alcalase(Y+Alc)6.卵清/Alcalase(EW+Alc)测试了这些大规模水解物的ACE抑制活性，其显示非常近似于之前测试的小规模水解物

8.1.2第二个大规模试验进行了另一个大规模试验，以生成用于SHR体内研究的水解物。在下面的表中给出了关于各种批次和样品的ACE抑制活性的概述。重复测试样品。

1参照在每板中都测定卵清样品的标准参照物(2003年9月25日生成的卵清1101/Alcalase，0.5mg/ml溶液)Batch批从上面的表中，清楚地显示出了特殊样品的IC50值的高水平的可重复性，说明水解方案、对水解样品的进一步加工处理以及ACE抑制检测的操作都是标准化的和准确的。
8.2 SHR体内测试和结果为了研究水解物对血压的作用，进行了SHR研究。研究了对血压的初级作用以及对器官损害发生的次级作用。SHR具有约190mmHg的平均动脉血压(MAPB)，其远远高出正常血压。
经饮用水每日口服给SHR鼠喂养水解物。用每日每公斤体重1000mg的水解物治疗52只鼠。测试了四种水解物水解物A溶菌酶-alcalase水解物B卵转铁蛋白-newlase F水解物C卵粘蛋白-alcalase水解物D卵清蛋白-alcalase用两种方法测定血压，即袖带法(在麻醉下或不在麻醉下测定收缩期血压，SBP)以及遥感测定法，其中通过植入的遥感装置每5分钟获得一个血压测定值。对照鼠接受安慰剂。无线电遥感测定技术使得长时间连续地监测无限制动物的动脉血压、心率和体力活动以及它们的心律和它们对治疗的应答成为了可能。
8.2.1袖带法结果经水解物A喂养的麻醉鼠的SBP在第65天从201.7降低到了183.8mmHg，血压下降了约10％。因此，这说明至少水解物A在体内是有效的。对于其它的三种水解物，试验也正在进行中。对于ACE抑制作用，也测定了组织(非血浆)中的ACE活性。
8.2.2遥感测定法溶菌酶-alcalase和卵粘蛋白-alcalase水解物在体内都显示出了显著的血压降低作用。
清醒无限制动物的遥感测定最初，所有TM鼠的SBP每日都随着时间有所增加，与在未治疗SHR鼠中所预期的一样。但是，在开始治疗后5周时，接受水解物A的TM鼠的每日SBP的单个模式开始显示出持续的下降。接受水解物A的TM鼠的SBP的下降最长持续到了开始治疗后7周，之后其变为稳定。在治疗8周之后，经水解物A治疗过的遥感鼠的SBP持续降低了近10％。
8.2.3溶菌酶/alcalase在麻醉SHR中的急性治疗作用这个研究被用于建立溶菌酶/alcalase急性口服治疗对麻醉鼠的血压和血浆ACE活性的作用。
方法大鼠SHR鼠(382-440g)经Harlan，Horst，The Netherlands购自Harlan，Oxon，United Kingdom。
圈养鼠被成组地圈养于中心动物实验室(UMCG，Groningen)，并容许其适应环境1周。
手术在实验当天，将鼠麻醉，行颈动脉置管以便测定血压。除此之外，行颈静脉置管以便容许取血进行血浆ACE活性检测。
方案在时间点t＝0时，利用胃管通过口服鼻饲的方式给鼠施用研究药物。在t＝0鼻饲之前即刻以及在之后的t＝0.5、t＝1、t＝2、t＝3、t＝4、t＝5和t＝6时取血样。在整个6个小时的研究期都记录下血压(每10分钟的平均值)。
研究药物随机给鼠施用溶菌酶/alcalase或溶菌酶(都为1000mg/kg，溶于1ml饮用水)或仅施用水。
结果血压研究药物对血压的作用被计算为单个鼠体内的基线血压变化的百分比。口服施用单个剂量的溶菌酶/alcalase(水解物A)造成了收缩期血压(SBP)的显著的和暂时的下降。SBP的最大下降达到了近35％，其在施用溶菌酶/alcalase后1.5-2个小时达到，并且又维持血压降低近2个小时。之后，在开始后近t＝4小时，SBP再次开始升高，在研究期的终点t＝6小时时，达到了20％的下降。在施用溶菌酶(对照)之后，看到了非常相似的模式，但是SBP的最大下降更小(近15％)。我们也研究了施用水在这些实验中的作用，在施用水之后，SBP也有所下降，但是最大下降小于溶菌酶/alcalase以及轻度地高于仅用溶菌酶(即应答位于两者之间)。但是，施用水所获得的SBP变化模式明显不同于前两者，具体地是更为短暂的，在施用水2到3个小时之后，SBP完全恢复到了基线水平(即100％)。仅用溶菌酶比水可能是溶菌酶/alcalase的更好的对照。
血浆ACE活性施用溶菌酶/alcalase(水解物A)和溶菌酶(对照)之后的血浆ACE活性模式非常接近于在SBP中所看到的模式。即在施用溶菌酶/alcalase后的t＝2到t＝3时，血浆ACE活性最大降低了近30％，之后其开始再次升高，在t＝6小时时达到了基线值的近95％。相反地，施用溶菌酶后的血浆ACE活性的最大抑制近似为10％。
上面的发现清楚地证实了溶菌酶/alcalase对麻醉SHR鼠的急性血压降低的能力；血浆ACE活性的同步降低说明这种血压降低作用是因为对肾素-血管紧张素系统的抑制。因为本研究所包含的鼠的数目是相当少的，以及我们希望优选地在清醒动物中验证这种作用，我们利用TM测定法设计了第三个实验研究(因此，TM法不会象TC那样使得清醒动物很紧张)。
8.2.4溶菌酶/alcalase在清醒SHR中的急性治疗作用进行这个研究以建立用溶菌酶/alcalase的急性口服治疗对清醒SHR的血压和血浆ACE活性的作用。
方法大鼠SHR鼠(388-515g)经Harlan，Horst，The Netherlands购自Harlan，Oxon，United Kingdom，并被成组地圈养在中心动物实验室(UMCG，Groningen)。
无线电遥感测定法SHR鼠(8只)进行手术，以安置遥感测定的血压传感器装置(TM)和用于取血的永久导管。TM被植入到腹腔动脉内，远端到达左侧肾动脉。永久导管被植入到颈静脉内，其另一端经皮下隧道到达鼠的头部，并被固定于其中。然后，单个圈养鼠，并容许恢复2周，之后开始收集无线电遥感测定数据，并持续到整个研究期。
方案然后鼠被分配接受随机的治疗计划3个不同试验日的三个不同时期的单剂量的溶菌酶/alcalase(LHA)、溶菌酶(L)或水(H2O)，期间可以间隔2到3天(冲洗/对照)。将溶菌酶/alcalase和溶菌酶(每种都是1000mg/kg)溶解于水中，并经胃管口服施用(总体积为近1ml溶液)；仅仅给对照鼠施用1ml水。一直都在试验日的早上9点到10点之间进行鼻饲。

取血在口服治疗的当天，鼻饲前近0.5到1.0个小时，将永久导管与外接管相连接，以容许进行取血，且不再进一步地处理鼠。在鼻饲前的即刻(t＝0)、和在其之后的t＝0.5、1、2、3、4、5、和6小时时取出血样。随后，将血样在4℃，1600g下离心10分钟，将其速冻并储存于-80℃下直到检测。
血浆ACE活性用Hip-His-Leu方法确定出血浆组织中的ACE活性，如前所述的那样。简要地，将血浆样品与ACE底物Hippury-His-Leu(12.5nM)在37℃下正好温育10分钟。通过加入280mM NaOH终止底物的转化。此后，加入100μl phtaldialdehyde标记游离的His-Leu。分别在激发波长和发射波长为364和486nm的条件下，测定出所标记的His-Leu荧光的量。包括对照样品，其中在加入底物Hippuryl-His-Leu之前添加了NaOH以终止底物的转化。
对血压数据的分析相关的时间段被大致地认为是试验日的鼻饲前1个小时到之后的10个小时，即从8点到19点。每只鼠都获得了3个试验日的这些时间段，然后利用所有鼠的数据计算出某个特异治疗的平均值。每只鼠也获得了试验日之前和之间的6个非试验(对照)日的相同时间段的数据，然后得出所有鼠的平均值。
结果与H2O相比较，在1个小时内就观察到了LHA降低SBP的现象，并保持了这种降低至少4个小时。也观察到了L降低SBP的现象，尽管这比LHA延迟了1个小时。这个可能是对L的天然消化过程的结果，并且这要求相当高的剂量，这可能说明更少量的LHA与其一样有效。
8.2.4.1卵粘蛋白/alcalase对清醒SHR的急性治疗作用方法大鼠使用上面8.2.4中的遥感测定的鼠，除了一只鼠期间已经自然死亡。在试验日，用或不用卵粘蛋白/alcalase水解物(1000mg/kg)治疗鼠(n＝7)，所述水解物与3ml葡萄糖水(10％)混合，并在早上(近10点)用扁平盘将其呈递给鼠(30分钟)；在对照日，治疗只包括葡萄糖水，对照治疗和积极治疗之间的间隔是2天。
血压数据的分析相关的时间段被大致地认为是试验日的鼻饲前1个小时到之后的8个小时，即从8点到17点。每只鼠都获得了2个试验日的这些时间段，然后利用所有鼠的数据计算出卵粘蛋白治疗或对照治疗的平均值。每只鼠也获得了试验日之前和之间的4个非试验(对照)日的相同时间段的数据，然后得出所有鼠的平均值。
结果有一只SHR鼠的血压数据是极低的，在进一步的分析中排除了这些数据。在试验日，绝大多数鼠都在10分钟内食用了3ml葡萄糖水。饮用葡萄糖水都伴有收缩期血压的增高，即这与在上面研究中的经胃管摄取后所观察到的现象相似，尽管葡萄糖摄入后的SBP增加的程度(近似10mmHg)比经胃管口服摄入后的SBP增加的程度(近似25mmHg)更低。对此，当没有给予治疗时，在对照日中没有观察到这种作用。与仅仅给予葡萄糖水的对照治疗相比较，含有卵粘蛋白/alcalase水解物的葡萄糖水的活性治疗造成了SBP的更快的和更显著的下降。卵粘蛋白/alcalase水解物在摄入后1个小时得到了最大下降(近15mmHg)，因此，这与在上面研究中的清醒鼠中所观察到的时间段非常相似。
实施例9经膜过滤富集水解物为了研究是否可以实现对小肽的富集以及这所造成的ACE抑制活性的增加，用膜过滤(利用口径为2kD和10kD的Polyethersulfon超滤膜)分级两种水解的卵清蛋白(卵转铁蛋白和溶菌酶)。
在Amicon测定单元中，polyethersulfon超滤膜被用作为扁平膜。体积为15ml的5％蛋白水解物溶液被浓缩成了5ml(15％)，并加入5ml水。再次将溶液浓缩成5ml(洗涤步骤)。再重复洗涤步骤2次。合并初始过滤的渗透液以及洗涤步骤的渗透液，并冻干。将冻干的渗透液储存于4℃，并测试其ACE抑制活性。
如下设定本试验-两种水解物卵转铁蛋白/promod258和溶菌酶/alcalase-两种膜一种的口径为2kD，另一种的口径为10kD-在分级之后，不用或用体外消化模拟处理各种样品(原料、渗透液、和残留物)，其中与胃蛋白酶温育(模拟胃内的水解)的时间长短不等，在0到120分钟之间。
-在pH值2，37℃进行胃蛋白酶温育。
-在pH值6.5、37℃下与胰蛋白酶/α糜蛋白酶的温育2.5个小时。
在冻干样品之后，确定出各级分的IC50(mg/ml)值

与原料级分比较，渗透液级分的ACE抑制活性最大增加了2倍。对于卵转铁蛋白而言，用10kD膜观察到了这种增加，而对于溶菌酶而言是用2kD膜。
这种实施例表明可以用膜过滤富集生物活性肽，并增加水解物的ACE抑制活性。可以通过富集减少为实现作用所必需规律(例如每日)应用消费的材料的量，以及因为体积的减少使得容易被整合到食品增补剂和功能性食品中。
实施例10卵的储存时间和温度对ACE抑制活性的作用用直接被加工处理的卵(分离出卵清和卵黄，随后用alcalase水解卵清级分)或在4℃或室温下储存6周的卵研究储存时间和温度的影响。
-用alcalase水解a)3个小时或b)5个小时(在3个小时后加入额外的酶)在水解之后，各级分被冻干，粉末级分在室温下储存。在相同的检测法中确定出所有各个级分的ACE抑制活性。进行试验2次。
卵的储存时间和温度对卵清蛋白ACE抑制活性的作用

1室温5个小时的水解比3个小时的水解生成了具有更好的和更高可重复性的活性的水解物。
试验显示，对于卵清蛋白水解物的ACE抑制活性方面的最佳活性，卵可以被直接使用，或者可以在4℃或室温下储存至少6周。
实施例11水解物的苦味为了评价苦味，由三位志愿者感觉地分析水解物。将水解物粉末溶解于水(15-20mg/ml)或水和葡萄糖。

两种水解物是苦的，而另两种没有苦味。通过加入葡萄糖可以轻微地掩盖住卵清-alcalase的苦味。对于大量的水解物，在食品中需要加入调味剂或其它的味道掩盖化合物，例如麦芽糊精、阿斯巴特、菊粉等。味道不会影响鼠食用水解物的欲望。
实施例12食品增补剂和食品片剂或囊剂制备具有下面组成的片剂(或囊剂)-每个片剂含有250mg靶蛋白水解物(约60％的片剂体积)-40％体积包括玉米淀粉(20％)、纤维素(15％)多糖0.5％)、润滑剂和光泽剂(3％)、其它(1.5％)。
实施例13蛋白水解物的分子量分布利用Superdex Peptide PE 7.5/300柱(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)，用凝胶渗透层析法(GPC)测定蛋白水解物的分子量分布(MWD)。该柱具有的MW分离范围为100到7000。然后在含有0.1％TFA的30％乙腈中跑柱，条件与用A&F分析蛋白水解物的条件相同。用已知分子量的标准肽校正柱(见下表)。将标准物和水解物样品都溶解于标准洗脱液中，肽浓度为5mg/ml。在注射(200μl)之前，离心样品去除不可溶性颗粒。在214nm处监视洗脱模式。
标准MwL-亮氨酸131.2L-精氨酸174.2VVYV478.5VVYK507.6VVYR535.6胰岛素链B-氧化酶3,496来自牛肺的抑酶肽6,500来自牛心脏的细胞色素C，V-A型12,327溶菌酶.HCl 14,300没有显示出校正曲线。
蛋白水解物的MWD被表示为具有预定分子量范围的肽级分的百分比(％)小于500Da，500到1000Da之间以及大于1000Da。这与具有以下长度的肽相对应小于4到5个氨基酸、4到9个氨基酸或大于9个氨基酸。
结果

结果显示，在靶蛋白的水解程度和IC50活性之间有着相关性。具体地，至少约20％，更优选的至少约30％的水解程度生成了具有高ACE抑制活性的水解物。
实施例14用能显著降低自发性高血压鼠的血压的卵肽进行的人体体内研究用于人体体内研究的溶菌酶水解物的组成确定出ACE抑制性的溶菌酶/alcalase水解物的组成-90％溶菌酶-1.8％alcalase-5％NaOH-3.2％水-盐酸溶菌酶来自Belovo(Schoterweg 14，8462 TD Rotstergaast)是一种经离子交换层析法纯化出的卵清中的次要蛋白，用SDS-PAGE和HPLC层析法使得其达到99％纯度。
-Alcalase Food Grade van Novozymes，Alcalase 2.4L清亮红褐色液体；酶浓度为2.3AU/升；密度近似为1.18g/ml；Alcalase产自藓样芽胞杆菌的选定菌株；是一种细菌蛋白酶和内肽酶。
-NaOH pellets van Merc在水解过程中用33％溶液将pH值调整至8。
对于3％溶菌酶(100ml)溶液，需要近似500μl 1M NaOH溶液将pH值设定为8(3g溶菌酶需要500μl 1M NaOH＝0.02g NaOH)。在加入酶之后，仍需要添加NaOH以保持pH值为8，因此在终产物中会存在少量的NaOH。
人体研究已经获得了University Medical Center Groningen(UMCG)的METc(医学伦理委员会)对功能性食品在人体中的研究的最终许可。
志愿者(n＝5)在两个不同的试验日接受了含有单一剂量的溶菌酶/alcalase或合适安慰剂的饮料。在摄入前即刻以及之后最晚到6个小时测定血压。除此之外，在摄入前即刻以及在摄入后的特定的时间点取血，进行ACE活性分析。
饮料配方-20g水解物-40g Karvan Cevitan“红色葡萄柚”-60g水90℃下巴斯滕法灭菌20分钟。
Siliker(Ede)微生物学分析为OK。
Karvan Cevitan红色葡萄柚的组成60％未染色的水果；4种添加的维生素；60％的果汁浓缩剂(红色葡萄柚、接骨木果、蔷薇果)，其中54％是红色葡萄柚；其它组分包括糖、葡萄糖-果糖汁、食品酸(柠檬酸)、香料、维生素、防腐剂(山梨酸钾)。
对照饮料同上，但没有水解物。
结果试验包括5位接受水解物的人。2周之后，5位中的3位作为了对照。随诊了6个小时时间段内的平均血压。与对照相比较，血压平均下降约5到6％，显示出了水解物的明显作用。在食用水解物后的1个小时之内也观察到了作用，并在1.5个小时后达到了最大作用。3h和6h(所测定的最后一个时间点)时的平均血压下降与1.5h时的下降相当。对水解物的平均血浆ACE活性的研究显示在食用水解物后的1个小时达到了峰值降低，而在3个小时之后恢复到了起始水平。
人体研究仍在进行中。
权利要求
1.一种食品或食品增补剂，其包括有效量的选自卵粘蛋白、溶菌酶和卵转铁蛋白的蛋白水解物，其特征在于当血压增高的人摄入所述食品或食品增补剂时，所述食品或食品增补剂阻止血压升高或者显著地降低血压。
2.一种食品或食品增补剂，其包括有效量的选自卵清、全卵和卵黄的蛋白水解物，其特征在于当血压增高的人摄入所述食品或食品增补剂时，所述食品或食品增补剂阻止血压升高或者显著地降低血压。
3.通过对卵粘蛋白、溶菌酶和/或卵转铁蛋白进行蛋白水解而获得的酶促蛋白水解物，其特征在于所述水解物具有抗高血压活性。
4.通过对卵清、卵黄和/或全卵进行蛋白水解而获得的酶促蛋白水解物，其特征在于所述水解物具有抗高血压的活性。
5.权利要求3或4的蛋白水解物在制备具有抗高血压活性的食品或食品增补剂中的用途。
6.用于制备具有抗高血压活性的蛋白水解物的方法，其包括步骤(a)提供包括一或多种靶蛋白的液体溶液；(b)任选地加热所述溶液，以变性所述靶蛋白；(c)将所述溶液的pH值调整至适合于所要使用的一或多种酶的pH值；和(d)向所述溶液中加入一或多种水解酶，并在合适的温度下温育溶液一段合适的时间，其特征在于所述靶蛋白选自基本上纯化的溶菌酶、卵粘蛋白、卵清蛋白、卵黄脂磷蛋白和/或卵转铁蛋白。
7.用于制备具有抗高血压活性的蛋白水解物的方法，其包括步骤(a)提供包括一或多种靶蛋白的液体溶液；(b)任选地加热溶液，以变性所述靶蛋白；(c)将所述溶液的pH值调整至适合于所要使用的一或多种酶的pH值；和(d)往所述溶液中加入一或多种水解酶，并在合适的温度下温育溶液一段合适的时间，其特征在于步骤(a)的液体溶液包括全卵、全卵清或全卵黄。
8.权利要求6或7的方法，还包括通过滤膜过滤所述溶液并获得富集活性靶肽的渗透液的步骤(e)。
9.通过权利要求6或7的方法获得的抗高血压的蛋白水解物。
10.权利要求1或2的食品或食品增补剂，其中所述食品或增补剂是液体、固体或半固体的形式。
11.包括权利要求9的水解物的食品或食品增补剂。
全文摘要
本发明提供了新的具有抗高血压性能的蛋白水解物、以及包括这些蛋白水解物的食品和食品增补剂。
文档编号A23L1/29GK101022737SQ200580031756
公开日2007年8月22日 申请日期2005年7月22日 优先权日2004年7月22日
发明者阿尔特·范阿梅龙根, 玛丽亚·约瑟法·凯瑟琳娜·贝伦-托米森, 阿里·范德本特, 扬·亨德里克·别克马, 维克尔特·亨德里克斯·范吉尔斯特, 玛丽亚·亨里埃特·约翰娜·卢内恩, 卡琳·比阿特丽斯·默克, 约斯·内利森, 威廉默斯·约翰内斯·格特鲁迪斯·蒂伦, 克拉斯·阿诺德·托格泰马 申请人:格罗伯斯卵类科学有限公司