人血树突状细胞永生化技术的制作方法

专利名称：人血树突状细胞永生化技术的制作方法
技术领域：
生物医药技术三背景技术：
树突状细胞分离技术、造血干细胞分类技术
发明内容
树突状细胞(dendritic cells，DC)是生物体内免疫系统中负责抗原递呈的细胞，是机体对免疫原产生免疫应答的重要功能细胞之一。DC广泛存在于血液、淋巴、肝脾及皮肤等组织。DC能激活功能性淋巴细胞，诱导产生细胞介导的细胞毒作用，提高机体的细胞免疫水平。特别是它能显著提高弱抗原和自身抗原诱导的特异性反应，因而在抗肿瘤和抗病毒免疫中发挥重要作用。
DC为终末期细胞，增殖能力有限，难于在体外大量扩增繁殖。人的外周血和脐带血是分离和培养DC的主要来源。常规的方法是从外周血和脐带血中分离出造血干细胞或多能干细胞，然后用各种细胞因子，如干细胞因子(SCF)、粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素4(IL-4)等扩增并诱导干细胞分化成DC。但此法能获得的DC数量有限。需要反复分离，成本较高，满足不了实际的需求。人血DC永生化技术的目的就是通过癌基因转化DC，使DC细胞永生化，在体外大量易扩增繁殖，满足抗肿瘤、抗病毒等免疫治疗的需要。
与常规的从人血中分类和扩增DC的方法相比，本技术采用癌基因(C-myc、H-ras等)转化DC，使DC永生化，便于DC的扩增和保存，克服了DC不能大量扩增的缺陷。一旦获得了这种永生化DC，则不需要反复从血液中分离树突状细胞，降低了培养成本、省时省力，更重要是为规模化培养与增殖DC以及医药产业化奠定了基础。具体实施例方式首先用单克隆抗体—磁珠分离系统(MACS)从健康人外周血或脐带血中分离并纯化CD34阳性的造血干细胞，然后用多种细胞因子(SCF、GM-SCF、TNF-α、IL-4等)适当组合诱导CD34细胞增殖并分离为DC，同时用癌基因(C-myc、H-ras等)采用电穿孔方法转染DC并培养转染细胞，采用有限稀释法使培养细胞克隆化，最后用血液DC的标志性分子(CD1α、HLA-DR、B7-1等)进行鉴定，并采用流式细胞术分离永生化DC。
权利要求
1.一种使人血树突状细胞永生化的技术，其特点是将造血干细胞用常规方法刺激扩增分化为树突状细胞的同时，用c-myc和H-ras癌基因转染培养细胞使树突状细胞永生化。
2.用上述方法使非人血液来源的树突状细胞永生化。
全文摘要
树突状细胞(DC)是专职的抗原递呈细胞，能显著增强弱抗原和自身抗原诱导产生的特异性免疫反应。人血树突状细胞永生化技术是以从外周血或脐带血中分离造血干细胞和树突状细胞技术为基础。用单克隆抗体—磁珠分离系统(MACS)分离获得造血干细胞后，用细胞因子(SCF、GM－CSF、TNF－α、IL－4等)刺激造血干细胞扩增分化为树突状细胞，同时用C－myc和H－ras癌基因转染培养细胞使树突状细胞永生化，最后用标志性分子鉴定并克隆化永生化树突状细胞。本技术克服了树突状细胞来源有限，不能在体外大量增殖的不足，通过使树突状细胞永生化，可以在体外大量扩增和培养，为高效疫苗的产业化奠定了基础。
文档编号C12N5/08GK1408850SQ0114051
公开日2003年4月9日 申请日期2001年9月18日 优先权日2001年9月18日
发明者王虹 申请人:王虹