专利名称：定向增殖并表达白介素12的人树突状细胞肿瘤免疫治疗制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种肿瘤免疫治疗制剂及其制备方法，更具体地，本发明涉及定向增殖的并表达白介素12的人树突状细胞肿瘤免疫治疗制剂及其制备方法。本发明还涉及一种新的白介素12(IL-12)的p40亚基基因，该基因来自中国人。
树突状细胞(DC)是新近被认识的最有效的抗原呈递细胞，在其进行抗原的提呈过程中，因其表面表达的淋巴细胞共刺激分子以及分泌的细胞因子，调控着T、B淋巴细胞的分化及功能的发挥，被认为是进行抗原应答的天然佐剂。近年来的研究发现，DC在其早期非成熟阶段，能有效地吞噬其周围环境中的抗原性物质，随后加工处理成抗原性的多肽，呈递给T细胞而激活Th细胞的免疫应答。近年来的免疫学研究还证明，DC也能够通过吞噬外源性的抗原物质，转运到细胞MHC-I类分子的加工途径中，激活机体的CTL反应。由此可以看出DC可作为肿瘤疫苗的佐剂具有较广阔的应用前景。1979年Katz(Nature282234)直至今日的Frank(Nature Med.4,328-332(1998))等人均采用抗CD34的抗体从骨髓或外周血中分离纯化得到多能造血干细胞，用以培养得到足够量的DC。但是采用抗CD34的抗体的方法存在异种抗原的刺激问题。
机体的CD8+CTL细胞通过识别肿瘤特异性抗原肽而产生的对肿瘤细胞的特异性细胞毒作用是机体发挥抗肿瘤免疫功能的有效作用因素。然而，特异性CTL的产生依赖于CD4+T淋巴细胞主要是Th1细胞及其所分泌的细胞因子，影响机体Th1细胞分泌的细胞因子主要是IL-12。IL-12是由p40和p35两个亚单位所组成的异二聚体。体外试验发现，IL-12能够促进Th1细胞的分化和特异性CTL的产生，增强特异性CTL和非特异性NK细胞的细胞毒活性，诱导具有重要抗肿瘤效应的细胞因子IFN-γ的产生等作用。在动物试验中发现，IL-12能够使肿瘤的发生过程延缓，乃至使已发生的肿瘤消失，是目前所发现的最有效的抗肿瘤免疫的细胞因子。然而，人体的临床试验发现IL-12具有明显的毒性作用，如发热、转氨酶升高、白细胞减少以及产生对肺动脉的毒性等。因此探讨IL-12的局部应用是目前各国学者研究的重点之一，国外有学者报导，采用IL-12进行自身肿瘤细胞(黑色素瘤)的基因修饰，以此作为肿瘤疫苗用于肿瘤的治疗，收到了一定的疗效。然而，IL-12主要的免疫生物学功能是在抗原的提呈局部影响着免疫细胞的分化与发育。在抗原提呈的局部，抗原提呈细胞(APCs)通过局部所分泌的IL-12能促进Th1细胞的发育与分化，从而有利于特异性CTL的发育与产生。然而，APCs在抗原递呈的过程中自然分泌的IL-12不能有效地拮抗IL-4的作用，致使Th1的发育受到阻碍。动物实验研究表明，在用IL-12基因修饰树突状细胞(DC)后，其负载肿瘤细胞的酸性洗脱抗原对小鼠的保护作用明显高于单纯的DC所负载肿瘤细胞的酸性洗脱抗原，认为IL-12具有很好的免疫佐剂效应，能加强DC细胞递呈抗原的功能。
为实现上述目的，必须在实验中解决以下几个问题首先克隆中国人自己的IL-12基因，并构建能进行基因转染的IL-12基因表达载体。其次，获得足够量的人DC细胞。第三，具有成熟的能够高效将外源性的基因引入到DC中的可靠方法。本发明人基于于上述研究设想，通过不断努力，终于完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供定向增殖的并表达白介素12的人树突状细胞肿瘤免疫治疗制剂及其制备方法。
本发明的再一目的是提供一种新的来自中国人的IL-12的p40亚基基因。
根据本发明的一个方面，本发明涉及一种含有装载并表达白介素12的人树突状细胞的肿瘤免疫治疗制剂，所述的IL-12的p40亚基基因是本发明人所克隆的新基因，其具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。本发明的肿瘤免疫治疗制剂的制备方法包括如下步骤1)用人干细胞刺激因子(SCF)包被固相载体培养板；2)获得抗凝人外周血中的单个核细胞，并制成所述细胞的悬液；3)将所述细胞悬液加到步骤1)的培养板的孔中，于37℃、5％CO2中孵育细胞1-2小时；4)洗涤细胞，然后加入含SCF20ng/ml、Flt-3L50ng/ml和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)100ng/ml的培养基刺激粘壁的细胞48-50小时；5)用含IL-12基因的载体转染步骤4)得到的细胞；6)采用Flt-3L，SCF，GM-CSF，白介素-4(IL-4)，肿瘤坏死因子(TNFα)定向扩增培养步骤5)中所处理的细胞，由此获得表达IL-12的树突状细胞，获得肿瘤免疫治疗制剂。
在本发明的一个实施方案中，采用新生儿脐带血作为步骤2)中人外周血的来源。
本发明还涉及一种新的IL-12的p40亚基基因，其具有SEQ IDNO1的核苷酸序列。本发明的基因是从中国人脐带血DC中克隆得到，序列分析发现所述的基因第210位密码子有独特的结构为GCC(Ala)，并且第239和291位密码子与已报道的NKSFp40序列(WolfSF等，J.Immunol 1991，1463074)不同，而与CLMF序列相同(SternAS等，PNAS USA 1990，876808)，另外，所述序列中用黑体下划线所示三个密码子的组成反映了中国人的IL-12p40的结构特征。
与现有技术相比，本发明具有如下的优点(1)通过固相SCF纯化造血干细胞后进行DC的定向扩增培养，可获得足够量的具有较高纯度的可适用于临床治疗的DC。采用固相SCF分离纯化多能造血干细胞，其独到之处在于SCF不仅仅纯化浓缩了干细胞，并且在纯化的同时给予增殖刺激，以提供基因转导的机会。同样重要的是，此方法消除了抗CD34抗体所带来的异种抗原的刺激问题。(2)本发明的从中国人脐带血DC中所克隆的IL-12p40基因具有独特的结构特征，用此基因片段与现有的p35基因片段所构建的hIL-12双亚基共表达载体在转导细胞后可表达出既具有IL-12生物学活性又具有IL-12免疫化学特征的蛋白。(3)本发明方法中采用DOTAP脂质体转染技术可实现IL-12的高效转导，这种IL-12转导的DC能够显著性地增强淋巴细胞的识别功能，使DC的抗原提呈能力显著提高，从而有效地诱导出抗原特异性的CTL细胞，并使其活性增加。这些结果均预示着本发明的用IL-12转导的DC作为肿瘤免疫治疗制剂可以有效应用于临床。
根据本发明方法，为获得足够数量的人DC，本发明人采用预先将SCF包被吸附于一固相载体即塑料培养板上，从而纯化C-kit阳性的造血干细胞。采用CD34抗体染色随后进行FACS分析表明，用本发明方法所获得的CD34阳性细胞在90％以上。在获得上述造血干细胞的基础上，通过SCF、GM-CSF、IL-4和TNF-α定向扩增培养。结果发现增殖培养后的DC数量比起始CD34+细胞数增加近20倍。表型检测可发现，采用本发明方法所培养的DC表面具有丰富的HLA-I、HLA-II类分子，并用较多的共刺激分子CD80、CD86的表达，T、B淋巴细胞的标志CD3、CD19均阴性。功能分析发现，其对同种异体淋巴细胞具有较强的刺激能力。上述结果表明，从纯化的CD34+、C-Kit+细胞基数出发，加入rhSCF、rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α进行DC的定向培养，可以获得较大量的有较高纯度的对同种异体淋巴细胞具有较强刺激功能的DC细胞。
随后，采用DOTAP脂质体转染技术，使IL-12双亚基共表达载体有效地转导了人DC的前体细胞，转导后通过rhFlt-3L、rhSCF、rhGM-CSF、rhIL4和TNF-α的体外定向培养后，可发育成具有特征性DC形态的细胞。经IL-12p70抗体染色后FACS分析表明50％以上的DC能够表达IL-12，细胞分泌上清中IL-12的产量可达到400-600pg/ml/106，其局部水平相当于IL-12全身注射的毒性耐受剂量。表型分析表明转导细胞表面具有丰富的MHC-I、II类分子和CD80、CD86分子的表达，CD3、CD19均阴性，CD14分子阳性细胞数少于10％。与未转导DC相比无明显差异。同种异体混合淋巴细胞培养观察到，IL-12转导的DC对同种异体淋巴细胞的刺激水平明显高于相同数量的未转导DC细胞。通过筛选HLA-A201型个体，利用DC负载能够与HLA-A201分子相结合的多肽p53264-272及能够与HLA-II类分子相结合的多肽HBcAg50-69进行自身混合淋巴细胞培养，发现转导了IL-12的DC在负载多肽p53264-272后其对自体淋巴细胞的刺激指数高于未转导的DC，并且，当加入HLA-II类分子限制的Th细胞的抗原表位多肽HBcAg50-69后，其刺激指数高于不加此表位者。收集这些多肽所诱导的淋巴细胞作为效应细胞，利用T2细胞负载p53264-272多肽作为靶细胞，检测TNF-β的释放，结果发现，IL-12转染的DC所诱导的CTL与T2作用后释放的TNF-β水平高于未转染DC。
以下将通过附图和实施例详细描述本发明，其中
图1示出IL-12双基因表达载体pL35P40SN的构建。
图2示出用本发明方法进行的人树突状细胞体外增殖的倍数，图中A为开始培养时，B为7-10天DC的平均增殖倍数，C为最高增殖特例。
图3示出对体外增殖的DC的表型检测结果，其中图3a和3b为培养细胞用抗I类分子HLA A、B、C及II类分子HLA-DR抗体进行荧光标记后的FACS分析结果；图3c和3d为培养细胞用抗辅助刺激分子CD80和CD86抗体进行荧光标记后的FACS分析结果；图3e、3f、3g为培养细胞用抗T细胞标志CD3、B细胞标志CD19和单核巨噬细胞标志CD14进行荧光标记后的FACS分析结果。
实施例1新的IL-12 p40基因的克隆及IL-12双基因共表达载体的构建本实施例是从北京地区人脐带血DC中克隆了一个新的IL-12 p40基因，构建了IL-12双基因共表达载体，在肝癌细胞株中表达出了具有生物学及免疫学活性的人IL-12。
1·材料和方法1.1菌株与载体大肠杆菌DH5α及表达载体pcDNA3.1(5.4kb)购自Invitrogen。逆转录病毒载体pLXPXSN(6.4kb)为一双基因表达载体，由NIH的Richard Morgan惠赠。
1.2克隆质粒p35NKSF14-1-1由ATCC提供。NotI/SalI酶切1.3kb片段包含IL-12 p35的完整编码基因。
1.3引物设计与合成根据文献报道的序列，共设计4条引物用于克隆IL-12p40cDNA，其中590435’-GCCCAGAGCAAGATGTG-3’(2-18)，590445’-GTCTATTCCGTTGTGTC-3′(1077-1061)为p40的外套引物。556845′-CAGAGCAAGATGTGTCAC-3′(5-22)，556855′-TGGTCAGAACCTAACTG-3′(1011-994)为p40的内套引物。上述引物均在计算机上进行复检，委托CyberSyn公司合成。
1.4主要试剂IFN-γ，抗IL-12p70特异性单抗MAB611(IL-12捕捉抗体)，MAB219(IL-12中和抗体)BAF 219(生物素标记的羊抗人IL-12p70免疫血清)均购自R&D公司。LPS购自Sigma；限制性内切酶及其它酶类为华美公司和Promega的产品；TA克隆试剂盒为Invitrogen产品。
1.5逆转录(RT)和巢式PCR进行IL-12p40基因扩增与克隆培养来自北京地区的人成熟脐血DC，加入IFN-γ刺激16-18小时，LPS刺激4小时，一步法提取细胞总RNA。采用PE公司的GeneAmp RNAPCR试剂盒，逆转录成IL-12p40 cDNA第一条链，所用引物为59044，然后巢式PCR扩增IL-12p40链。第一次PCR所用引物为59043和59044，第二次PCR所用引物为55684和55685。第二次PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳证实在相应位置上出现明显的条带后，将此新鲜产物插入到TA克隆载体pCRTM2.1中，具体操作按说明书进行。因p40基因内存在一个EcoRI酶切位点，故在小量提取质粒DNA后采用EcoRI酶切鉴定。然后用PCR确定方向。
1.6p40克隆质粒的序列分析采用Promega公司Wizard试剂盒小量提取质粒DNA，委托北京赛因思公司采用T7 Promoter和M13Reverse primer引物在ABI 377自动序列分析仪进行正反两个方向的序列分析。
1.7p35和p40基因表达载体的构建从p35质粒和p40质粒上酶切获得p35和p40的编码基因，分别克隆到pcDNA3.1表达载体上，构建成p35和p40基因表达载体pC35，pC40。经鉴定后提取质粒DNA，PEG纯化后用于细胞转染。
1.8IL-12双基因表达载体pL35P40SN的构建见图1及说明。
1.9IL-12在人肝癌细胞中的表达采用GIBCO/BRL的Lipofectin进行细胞转染，操作按说明书进行。表达pL35P40SN经PEG纯化后转染人肝癌细胞株7701。转染72h后收集上清，加G418筛选。在有明显克隆形成后，撤去G418。数天后收集培养细胞上清，进行IL-12的生物及免疫活性的检测。
1.10IL-12生物活性的检测IL-12特异性捕捉抗体MAB6115ug/ml稀释于碳酸盐/碳酸氢盐(pH9.5)缓冲液中，100ul/孔加入到Falcon96孔培养板中室温下过夜；PBS洗涤后，加入1％BSA-PBS 200ul/孔，37℃1h，洗涤后加入标准IL-12及待测样品。部分细胞上清先与MAB219抗体37℃作用30m后加入。室温下放置3小时，洗涤后加入经PHA刺激的淋巴母细胞，37℃，5％CO2继续培养24h，加入3H-TdR后继续培养18h，收集细胞，计数同位素掺入量。
1.11Western blot经MAB611浓缩的转导细胞上清及未经浓缩转导细胞裂解物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到硝酸纤维素膜上。用生物素标记的羊抗人IL-12免疫血清(BAF219)作为第一抗体，按ABC法显色。2.结果2.1北京地区人脐带血DC IL-12p40cDNA的克隆采用IFN-γ和LPS对细胞诱导后获得高丰度IL-12 p40 mRNA，经IL-12p40外套下游特异性引物59044逆转录合成其cDNA第一条链，然后进行巢式PCR。第二次PCR后在略大于1000bp位置上出现高亮度条带。
2.2IL-12p40克隆的序列分析对两个经鉴定有正确插入的p40cDNA克隆分别进行正反两个方向的序列分析，结果完全一致，所述序列见SEQ ID NO1。将所得序列与NKSF(Accession#M65290)和CLMF(Accession#M65272)进行比较，结果发现我们所克隆的p40基因有一完整读码框架，其绝大部分与上述序列一致，但在第210位密码子上存在着独特结构，是GCC(Ala)而非GTC(Val)。此外，在239和239密码子子也各有异同。将此质粒命名为phDCp40。
2.3IL-12的表达及其生物学活性鉴定对人肝癌细胞株7701分别进行了pC35，pC40，pC35+pC40的转染，细胞转染后72h收集其上清进行生物学活性的鉴定。结果见表1。单独的pC35或pC40基因转染细胞后均不能产生有功能的IL-12，即使将表达产物的上清预先混合后仍不能产生有功能的IL-12。pC35和pC40基因只有在等量共转染时才能测出有功能的IL-12，其对淋巴母细胞的刺激水平与2.5ng/ml的参照IL-12相当。我们又进一步构建了IL-12的双亚基共表达载体pL35P40SN(见图1)，用其转染肝癌细胞并经G418选择后，上清中的表达产物对淋巴母细胞的刺激能力显著超过12.5ng/ml参照IL-12的效应。在与抗IL-12的中和性单克隆抗体(MAB219)作用后，其活性大大减弱。表1转染细胞上清对PHA活化的淋巴母细胞的增殖作用IL-123H-TdR 掺入用于转染的3H-TdR(ng/ml) (×103) 质粒 掺入(×103)0 26.30±0.60 pCDNA3 25.48±0.100.132.56±0.16 pC3526.39±0.190.537.44±0.25 pC4025.63±0.222.539.23±0.52 pC35+pC40 39.83±0.4412.5 42.51±0.16 pL35P40SN 53.47±0.32pLXPXSN 28.43±0.222.4IL-12的免疫学鉴定对经免疫浓缩的转导细胞上清及未经浓缩的细胞裂解物进行Western blot分析，结果在70KD处可见有特异性蛋白条带。浓缩上清产物加入2-巯基乙醇后，此70KD的条带消失。实施例2人脐带血树突状细胞的体外定向增殖A、方法细胞因子rhSCF、rhGM-CSF、rhFlt-3L、rhIL-4，抗人HLA-ABC、HLA-DR、CD3、CD14、CD19、CD80、CD86均为DAKO公司产品。rhTNF-α为北方同正公司产品。部分rhGM-CSF由军事医学科学院沈倍奋教授赠送。
将rhSCF溶解入0.1M pH 8.5的Na2HPO4溶液中使其终浓度达到25ng/ml，取0.5ml置于35mm2的六孔培养板中(Costar)，湿盒中放置，4℃过夜，一周内使用。无菌收集肝素抗凝的新生儿脐带血约30-40ml，加入等量含青霉素500U/ml，链霉素500ug/ml的PBS稀释，并加入EDTA使其终浓度达到0.02％(W/V)。然后通过淋巴细胞分离液分离其血中的单个核细胞，用含有2％胎牛血清(FBS)的Hanks’液洗涤三次后，加入含12％FBS、10％HepG2细胞培养上清及100u/ml的青霉素、100ug/ml的链霉素、40ng/ml的二性霉素的1640完全培养液充分悬浮细胞、调整细胞浓度达到5×106/ml，每孔1.5ml加入到上述SCF预包被的细胞培养板的各孔中。在37℃C，5％CO2中孵育1-2h，粘壁细胞用温热的含5％FBS的Hanks’液轻柔洗涤三次，使粘壁不牢的细胞洗去。然后，加入上述完全培养液，并在其中加入rhSCF-20ng/ml、rhFlt-3L 50ng/ml、rhGM-CSF100ng/ml，第六天撤掉rhSCF和rhFlt-3L，追加IL-4 50ng/ml。第九天追加TNF-α100u/ml。在上述培养过程中，每隔2-3天进行对半换液。第12-14天收获悬浮细胞进行表型鉴定及功能测定。
流式细胞仪进行细胞表型分析收集上述经过与SCF包被板作用后并经洗涤后的粘壁细胞、新分离的人脐带血单个核细胞进行CD34染色，测定其阳性细胞的比值。收获12-14天的培养细胞，进行HLA-ABC、HLA-DR、CD3、CD14、CD19、CD80、CD86的间接免疫荧光染色，在流式细胞仪上进行其表型分析。
同种异体混合淋巴细胞培养反应淋巴细胞为正常人外周血PBMC，其HLA配型与待测DC的HLA配型完全不一致。刺激细胞为培养14天的DC。实验共设4组，每组刺激细胞与反应细胞之比分别为1∶10，1∶100，1∶1000和1∶10000。混匀后放置于37℃培养，4天后加入3H-TdR 0.5uci/孔，继续培养16-18h，最后收集于玻璃纤维素滤纸上，进行β计数。B、结果下表2列举了5个样品细胞增殖过程，数值分别为1毫升脐带血培养所得DC细胞数表2
>细胞经7-10天的培养，细胞增殖达到顶峰，平均增殖约20倍，最高特例可达158倍(见图2)。人脐带血中富含造血干细胞，用人的leukopak可达到上述同样的目的。人树突状细胞的表型检测对经GM-CSF、SCF和rIL-4诱导扩增的树突样细胞进行表型分析，结果显示，这些细胞几乎不表达T细胞标志CD3、B细胞标志CD19和单核细胞标志CD14(图3e、3f、3g)。说明这是一个非T非B以及非单核巨噬细胞的独立细胞群体。图3a和图3b显示，此细胞表达丰富的HLA-I类和II类分子，共刺激分子CD80和CD86也高度表达(图3c、3d)。实施例3含有装载并表达IL-12的人树突状细胞的肿瘤免疫治疗制剂的制备A、方法1.载体人IL-12双亚基共表达载体pL35P40SN，如实施例1所述构建。
2·细胞174CEMT2细胞株由美国NCI赠送。此细胞的TAP基因异常，抗原加工功能缺失，表面仅表达低水平的HLA-A201分子。当用与HLA-A201分子有亲和性的多肽处理时，可诱导A201分子的高水平表达。
3·抗原性多肽p53264-272(CD8+T细胞表位，能够与HLA-A201分子进行结合)由美国NCI赠送，HBcAg50-69(CD4+T细胞表位)由潍坊医学院赠送。
4·主要试剂细胞因子SCF、GM-CSF、Flt-3L、IL-4，抗人IL-12p70单克隆抗体MAB611、MAB219均为R&D产品。抗人HLA-ABC、HLA-DR、CD3、CD14、CD19、CD80、CD86均为DAKO公司产品。TGF-β检测试剂为R&D产品。TNF-α为北方同正公司产品。
5·树突状细胞的转染及培养25ng/ml SCF溶于0.1M pH9.0Na2HPO3中，每孔0.5ml加入到6孔细胞培养板中，4℃过夜。经淋巴细胞分离液分离的新生儿脐带血(产后12h内)单个核细胞(PBMC)加入到上述细胞培养板中，37℃孵育1-2h，粘壁细胞加入Flt-3L、GM-CSF、SCF刺激48-50h，进行脂质体介导的基因转染，试剂DOTAP为德国BM公司产品。转染试剂与DNA之比比为4∶1，转染过程中常规加入细胞因子。第一次转染共进行6-8h，此后于培养的第5、第8天再转染两次，每次2-3h。转染终止后加入含Flt-3L，干细胞刺激因子，粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子，白介素—4，肿瘤坏死因子-α的培养基继续培养。于培养后的12-14天收集细胞进行细胞因子的表达检测及功能测定。
6·同种异体混合淋巴细胞培养反应淋巴细胞为正常人外周血PBMC，其HLA配型与待测DC的HLA配型完全不一致。刺激细胞为常规培养14天的DC和转染IL-12的DC。实验共设4组，每组刺激细胞与反应细胞之比分别为1∶10，1∶100，1∶1000和1∶10000。混匀后放置于37℃培养，4天后加入3H-TdR 0.5uci/孔，继续培养16-18h，最后收集于玻璃纤维素滤纸上，进行β计数。
7·多肽特异性CTL的体外诱导从预先经PCR-SSP进行HLA-A2型及亚型分析所确定的脐带血中分离PBMC，按前述方法进行转染及培养。去除前体细胞的PBMC用含有10％DMSO的冻存液冻存待用。培养7天的DC及经过IL-12基因转染的DC经TNF-α诱导24h后，收集并用不含有血清的培养液洗涤，悬浮于AIM-V中，置于24孔板中，加入多肽，每种多肽的终浓度为50ug/ml。37℃孵育2h，此种细胞作为诱导特异性CTL的刺激细胞。另瓶培养的冻存复苏PBMC经洗涤后加入到上述刺激细胞孔中，于37℃CO2孵箱中孵育24h后加入等体积的含有20U IL-2的AIM-V培养液培养7-8天后，按上述方法重复刺激一次。由此所获得的增殖细胞作为肽特异性的CTL细胞。
8·CTL活性的检测174CEM T2细胞株于检测的前一天换液，收集细胞用不含血清的培养液洗涤，按前述方法进行肽的结合，作为CTL的靶细胞。上述经过多肽诱导的细胞作为效应细胞，两者共同培养36h，收集细胞培养的上清，检测其TNF-β分泌的能力。
9·TNF-β的检测按厂商说明书进行。B、结果1·IL-12表达载体在人脐带血培养细胞中的高效表达采用上述脂质体转染试剂对人脐带血造血前体细胞进行转导，经IL-12抗体染色、流式细胞仪分析细胞内细胞因子的表达情况，R&D的HS IL-12 Immunoassay检测试剂盒测定细胞分泌上清中的IL-12的产量，结果表明50％的脐带血培养细胞中有IL-12的表达，其上清中IL-12的表达量为400-600pg/ml/106。
2·人IL-12转导后的DC表型的分析收集转导的培养了12-14天的细胞，采用间接免疫荧光染色法进行荧光标记染色，洗涤后在流式细胞仪上进行分析。结果发现，细胞表面有丰富的MHC-I、MHC-II类分子的表达，CD3、CD19分子均阴性、CD14分子弱阳性，并且细胞表面有较多的CD80和CD86分子，与未经转导的细胞相比无明显差异。综合分析上述分子的表达情况，并结合其特征性的形态表现，判断上述细胞为DC。
3·IL-12转导后DC对抗原提呈功能的影响同种异体混合淋巴细胞培养是一项重要的反映DC抗原递呈作用的指标。为此，我们比较了IL-12转导细胞与未转导细胞对同种异体混合淋巴细胞的刺激功能。发现IL-12转导的DC具有较强的对同种异体淋巴细胞的的刺激功能，反映了IL-12能够增强DC的抗原提呈功能。
4·IL-12转导的DC对CTL活性的影响筛选HLA-A201阳性的DC细胞，负载上能够与HLA-A201分子相结合的多肽p53264-272进行多肽特异性CTL的诱导，其活性通过检测其TNF-β释放来进行反映，结果发现IL-12转导的DC在负载了p53264-272后所诱导的CTL活性比未转染的DC负载了p53264-272后所诱导的CTL活性有增高。
5·IL-12转导的DC对T细胞发育的影响筛选出HLA-A201型的DC，利用DC负载能够与HLA-A201分子相结合的多肽p53264-272及能够与HLA-II分子相结合的多肽HBcAg50-69进行自身混合淋巴细胞培养，结果发现，转导的DC在负载了p53264-272后其对自体淋巴细胞的刺激水平高于未转导的DC，并且，当加入HLA-II类分子限制的Th细胞的抗原表位后，其刺激指数高与不加此表位者，可见IL-12对Th的发育具有重要的促进作用。
上述结果表明IL-12转导的DC能够显著性地增强淋巴细胞的识别功能，使DC的抗原提呈能力显著提高，从而有效地诱导出抗原特异性的CTL细胞，并使其活性增加。这一结果预示着IL-12转导的DC可以作为肿瘤免疫治疗制剂。序列表SEQ ID NO1的信息序列长度977bp序列类型核酸分子类型cDNA序列描述1 ATG TGT CAC CAG CAG TTG GTC ATC TCT TGG TTT TCC CTG GTT TTT CTG GCA TCT55 CCC CTC GTG GCC ATA TGG GAA CTG AAG AAA GAT GTT TAT GTC GTA GAA TTG GAT109 TGG TAT CCG GAT GCC CCT GGA GAA ATG GTG GTC CTC ACC TGT GAC ACC CCT GAA163 GAA GAT GGT ATC ACC TGG ACC TTG GAC CAG AGC AGT GAG GTC TTA GGC TCT GGC217 AAA ACC CTG ACC ATC CAA GTC AAA GAG TTT GGA GAT GCT GGC CAG TAC ACC TGT271 CAC AAA GGA GGC GAG GTT CTA AGC CAT TCG CTC CTG CTG CTT CAC AAA AAG GAA325 GAT GGA ATT TGG TCC ACT GAT ATT TTA AAG GAC CAG AAA GAA CCC AAA AAT AAG379 ACC TTT CTA AGA TGC GAG GCC AAG AAT TAT TCT GGA CGT TTC ACC TGC TGG TGG433 CTG ACG ACA ATC AGT ACT GAT TTG ACA TTC AGT GTC AAA AGC AGC AGA GGC TCT487 TCT GAC CCC CAA GGG GTG ACG TGC GGA GCT GCT ACA CTC TCT GCA GAG AGA GTC541 AGA GGG GAC AAC AAG GAG TAT GAG TAC TCA GTG GAG TGC CAG GAG GAC AGT GCC595 TGC CCA GCT GCT GAGGAGAGT CTG CCC ATT GAG GCC ATG GTG GAT GCC GTT CAC649 AAG CTC AAG TAT GAA AAC TAC ACC AGC AGC TTC TTC ATC AGG GAC ATC ATC AAA703 CCT GAC CCA CCCAAGAAC TTG CAG CTG AAG CCA TTA AAG AAT TCT CGG CAG GTG757 GAG GTC AGC TGG GAG TAC CCT GAC ACC TGG AGT ACT CCA CAT TCC TAC TTC TCC811 CTG ACA TTC TGC GTT CAG GTC CAG GGC AAG AGC AAG AGA GAA AAG AAA GAT AGA865 GTC TTCACGGAC AAG ACC TCA GCC ACG GTC ATC TGC CGC AAA AAT GCC AGC ATT919 AGC GTG CGG GCC CAG GAC CGC TAC TAT AGC TCA TCT TGG AGC GAA TGG GCA TCT963 GTG CCC TGC AGT TAG
权利要求
1.一种肿瘤免疫治疗制剂，其包括装载并表达白介素-12的人树突状细胞，其中编码所述的白介素-12的p40亚基的基因具有SEQID NO1所示序列。
2.制备权利要求1的肿瘤免疫治疗制剂的方法，包括如下步骤1)用人干细胞刺激因子包被固相载体培养板；2)获得抗凝的人外周血单个核细胞，并制成所述细胞的悬液；3)将所述细胞悬液加到步骤1)的培养板内，于37℃、5％CO2中孵育细胞1-2小时；4)洗涤细胞，加入含干细胞因子、Flt-3L和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的培养基刺激粘壁的细胞48小时，5)用含白介素-12基因的载体转染步骤4)得到的细胞，6)采用含Flt-3L，干细胞刺激因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，白介素-4，肿瘤坏死因子-α的培养基定向扩增步骤5)所转染的细胞，获得数量可达到107以上水平的表达白介素-12的树突状细胞，作为肿瘤免疫治疗制剂。
3.权利要求2的方法，其中步骤5)中所述的载体中所包含的白介素-12的p40亚基基因具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
4.一种编码白介素-12p40亚基的基因，其具有SEQ ID NO1的序列。
全文摘要
本发明涉及一种肿瘤免疫治疗制剂及其制备方法,更具体地讲,本发明涉及一种定向增殖的并表达具有中国人结构特征的白介素12的人树突状细胞肿瘤免疫治疗制剂及其制备方法。
文档编号C12N15/19GK1260396SQ98125868
公开日2000年7月19日 申请日期1998年12月22日 优先权日1998年12月22日
发明者孙宗堂, 曲春枫, 顾培娣 申请人:中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所