镶嵌传染性腔上囊病病毒疫苗的制作方法

专利名称：镶嵌传染性腔上囊病病毒疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及传染性腔上囊病病毒(IBDV)疫苗。
传染性腔上囊病(IBD)，一种幼鸡的传染性疾病，是在1957年首先在美国特拉华州Gumboro识别的，并由Cosgrove正式报道(Cosgrove，1962；Lasher和Shane，1994)。因此这种疾病通常称为Gumboro。在第一次报道IBD之后不久，在世界范围内家禽中识别了这种疾病(Lasher和Shane，1994)。IBD是一种由分类为双RNA病毒的病毒(IBDV)引起的疾病(Dobos等，1979)。有两种不同的IBDV血清型血清型I和血清型II(Jackwood等，1982；McFerran等，1980)。属于血清型I的分离株对鸡而言是高致病性的。血清型II分离株，主要是从火鸡中收集的，还未报道在鸡中诱导临床迹象并被认为是非致病性的(apathogenic)(Ismail等，1988)。传染性腔上囊病或Gumboro对幼鸡而言是一种高度传染性疾病，并可导致家禽业中的重大损失。在患有急性感染的禽类中，腔上囊中的淋巴细胞被破坏，导致B细胞依赖型免疫缺陷。这导致对由其它方面无害因子导致的疾病的易感性提高。Gumboro的病理学方面的主要作用是通过囊行使的，其是病毒的靶器官。
IBDV感染开始是通过白色或水性便，厌食，消沉，战栗，虚弱和死亡等症状识别的。临床IBD通常见于3或8周龄的禽类中。疾病的病程在禽群中接近10天。死亡率通常为0-30％。野外报道推测来亨鸡比broiler型小鸡对IBDV更易感。亚临床IBD是较后识别的，并通常认为比临床疾病在商业家禽中导致更严重的问题。这种疾病通常见于3周龄以下的禽类中。这一早期感染导致腔上囊的B淋巴细胞损耗。禽类是无免疫性的，且不能充分应答免疫接种或野外感染。在易感的小鸡中，由IBDV导致的损害可在暴露于存在病毒的环境后2-3天内见到。开始，囊水肿性及出血性膨胀(暴露后3天)，然后表现为萎缩(7-10天)。IBD病毒对一些B淋巴细胞是致细胞病变的。最高浓度的这些特异性B淋巴细胞是在囊中发现的。IBD野生病毒对B淋巴细胞的破坏可导致这些细胞在二级淋巴组织中不完全性种植。由于B淋巴细胞损耗，存活的禽类在其所剩的生存期间是无免疫应答的。
IBDV在世界范围内发现，且IBDV特异性抗体已经在南极企鹅中发现(Gardner等，1997)。临床IBD的流行与亚临床IBD的流行相比相对较低。IBDV对一般的消毒剂非常有抗性，且已经在较小的粉虫，螨虫，和蚊虫中发现。尽管作了消灭的尝试，这些事实仍与在农场再现IBD问题的野外实验相关。IBDV感染产生抗IBD的强抗体应答，其能中和病毒。可能是接种的结果，血清型I抗原性变体分离株在美国特拉华州区域分离。这些分离株已经示出在少如感染后3天导致囊萎缩而无囊炎症。尽管其抗原性发生变化，但这些抗原性变体未形成独特的血清型。在抗原性变体IBDV在美国分离之后，欧洲国家的家禽业遭遇了由极烈性血清型IIBDV(vvIBDV)所致的IBD爆发(Berg等，1991；Chettle等，1989；Kouwenhoven和Van den Bos，1995)。这些极烈性的野外分离株在面对通常产生保护性的高水平的母体抗体时，仍能存活。这些vvIBDV在疾病爆发期间导致更严重的临床迹象，且目前在全球均有发现(例如欧洲，日本，以色列和亚洲)。
IBDV属于双RNA病毒科，该科包括分离自鸡的传染性腔上囊病病毒(IBDV)，分离自鱼的传染性胰腺坏死病毒(IPNV)，分离自果蝇的果蝇X病毒(DXV)，及均分离自双壳类软体动物的Tellina病毒和牡蛎病毒(OV)(Dobos等，1979)。双RNA病毒具有dsRNA基因组，其分为两个基因组节段(A和B节段)。A节段(3.3kDa)含有两个部分重叠的开放读框(ORFs)。第一个是最小的ORF，其编码非结构性病毒蛋白5(VP5，17kDa)。第二个ORF编码一个多蛋白(1012个氨基酸，110kDa)，其是自动催化裂解的。这些裂解位点的准确位置还未知。从体外翻译的IBDV RNA的SDS-Page分析得知，多蛋白迅速裂解为3个蛋白pVP2(48kDa)，VP4(29kDa)，和VP3(33kDa)。在体外病毒成熟期间，pVP2加工为VP2(38kDa)，或许是由于宿主细胞编码的蛋白酶对pVP2进行位点特异性切割所致(Kibenge等，1997)。VP2和VP3是组成病毒体的单壳的两个蛋白。B节段(2.9kbp)含有一个编码91kDa VP1蛋白的大ORF。这个蛋白质含有一个共有RNA依赖性RNA聚合酶基序(Bruenn，1991)。另外，已报道此蛋白与基因组RNA节段的5’末端连接(病毒蛋白基因组连接的，VPg)。经典抗原性变体或极烈性起源的大量IBDV的内部部分的核苷酸序列已经确定，并保存在一些数据库如GenBank中。另外Mundt和Muller(Mundt和Muller，1995)已经确定一些IBDV分离株(CU-1，CU-1M，P-2和23/82)的5’和3’末端，并通过组合内部和末端序列，Mundt和Muller确立了血清型IA节段(3261bp)和B节段(2827bp)的完整核苷酸序列。这提供了通过了解IBDV基因组的完整dsRNA序列，及使用已知产生感染性拷贝病毒几种方法之一，产生IBDV血清型I的感染性(重组的)拷贝(rIBDV)的方法(见例如Boyer等，病毒学198415-426，1994)，Mundt和Vakharia确实从cDNA中产生了感染性rIBDV血清型I(Mundt和Vakharia，1996)。由T7启动子引导的血清型IIBDV的全长cDNA，因此用作T7 RNA聚合酶的模板，使用Weiland和Dreher所述的方法(Weiland和Dreher，1989)。在其5’末端含有帽结构的在体外产生的mRNA，通过脂质体形成(Lipofectin，GibcoBRL)随后转染至真核细胞中。在37℃在CO2温箱中温育36小时后，转染的细胞的上清中包含感染性rIBDV(Mundt和Vakharia，1996；(WO98/09646))。另外，Lim等将两种氨基酸突变体(D279N和A284T)导入vvIBDV分离株HK46的cDNA中(Lim等，1999)。这些突变体最可能基于Yamaguchi等的数据(Yamaguchi等，1996)，其示出这些特异性突变体在两个独立的实验中发现，其中极烈性IBDV分离株通过在原代CEF细胞上适应和生长丧失其极烈性。Lim等获得一种rIBDV分离株，其具有CEF培养物适应的分离株即rIBDV分离株的表型，所述分离株能在vvIBDV非允许细胞如CEF细胞中增殖，即能感染，繁殖及释放以进一步复制。值得注意的是，Lim等用HK46分离株的未修饰的cDNA不能产生感染性vvIBDV分离株(Lim等，1999)。另外，尽管IBDV的cDNA可用于产生感染性IBDV，但仍未阐明准确的复制机制。现有数据支持双RNA病毒的半保守性基因组复制模式(Bernard，1980；Mertens等，1982)。
IBDV变体不时在野外被检测到或在实验室的细胞培养物中产生(Muller，1987)，它们是IBDV的血清型I和II毒株的遗传重排列，因为它们含有衍生自一个血清型的一个基因组节段，和衍生自另一个血清型的另一个基因组节段。这种节段重排列的毒株(srIBDV)(也称为嵌合IBDV)，不仅是天然发生的，最近已经由Vahkaria和Mundt从cDNA中产生(WO98/09646)。用减毒的野外分离株接种一直是良好的，直至1985年开始在美国特拉华州发现抗原性衍生物(分离株Del A，D，G和E)(Snyder，1990)。这些野外分离株缺少重要的病毒中和表位。此表位的变化特征在于丧失病毒中和单克隆抗体(Mab)B69的结合(Snyder等，1988a)。通过用经典IBDV疫苗接种诱导的抗体表现为对这些抗原性IBDV变体的保护性较差。随后生产基于抗原性IBDV变体的灭活的疫苗，并发现其有效保护抗IBDV的这些抗原性变体。在特拉华变体之后，分离了另一种抗原性变体IBDV。此变体得自美国Delmarva区，并称为GLS变体。此GLS变体特征在于没有针对病毒中和Mab B69和R63的表位(Snyder等，1988b)。在鉴别这些抗原性变体之后，在美国通过使用一组9个抗IBDV的Mabs进行大规模调查。此调查产生一个另外的抗原性变体DS326变体。此抗原性变体特征在于除了Mabs B69和R63之外，也没有Mab179和BK44的表位(Snyder，1990)。在美国和世界的其它国家没有关于抗原性变体的进一步报道。还不清楚这是否由于不存在新的变体IBDV分离株，或由于缺乏大规模调查或没有具有识别能力的单克隆抗体，新的抗原性变体还未检测到所致。
编码Del，GLS和DS326抗原性变体IBDV分离株的部分A节段的多蛋白的核苷酸序列已经确定(Vakharia等，1994)。大多数氨基酸变化在VP2蛋白的特异性区域中发现，此区因此称为高变区。另外发现能诱导中和抗体的表位是依赖于构象的，并在高变区中成簇。此区域由具有高疏水指数的结构域(pVP2的224-314位氨基酸，相当于多蛋白的224-314位氨基酸)组成，该结构域两侧为两个小亲水区域，每个小亲水区跨越大约14个氨基酸(Vakharia等，1994；Heine等，1991)。在疏水区和亲水区内的氨基酸取代可参与这些分离株的抗原性变体的特性。
在美国由于IBDV分离株的抗原性变体导致问题之后，欧洲的家禽业受到极烈性IBDV(vvIBDV)分离株的影响(Berg等，1991；Chettle等，1989)。此vvIBDV分离株在疾病流行期间导致更严重的临床迹象，且能突破保护性抗经典IBDV分离株的抗体水平。与经典IBDV分离株有区别的vvIBDV的分子决定簇还不十分清楚。然而已知细胞培养物适应的极烈性IBDV分离株，与未适应的亲代分离株相比，其致病性明显降低(Yamaguchi等，1996)。CEF适应性和丧失极烈性表型之间的相关性，似乎是由于适应的病毒的靶细胞嗜性变化所致。细胞嗜性的这种变化可以是由于细胞培养物适应的极烈性IBDV分离株的囊细胞受体结合能力丧失所致。另一种可能是细胞培养物适应的极烈性IBDV分离株能感染非囊细胞，导致原始靶细胞(囊细胞)中IBDV大量缩减。从公布的结果中(Yamagauchi等，1996)，很清楚基于细胞培养物适应的极烈性分离株的cDNA的重组IBDV(rIBDV)从未产生符合如下需要的疫苗，该疫苗需能在高水平母体抗体下幸免并诱导足够高的免疫应答。
目前还未阐述仅识别vvIBDV分离株的特异性抗体(Eterradossi等，(1997))。缺少区别的抗体使直接诊断存在难度。最受关注的是对比经典分离株的VP2高变区和极烈性分离株的高变区之间的序列。对vvIBDV分离株UK661的序列分析示出，在VP2蛋白的高变区内只存在3个独特的(即在非vvIBDV分离株未发现的)氨基酸取代。在pVP2蛋白的其余部分内有一个氨基酸取代，同时在多蛋白的VP4编码部分内有5个独特的氨基酸突变，在VP3编码部分有6个独特的氨基酸突变。(Brown和Skinner，1996)。编码VP5蛋白的UK661分离株A节段的较小ORF，含有2个独特的氨基酸取代。在由此vvIBDV分离株的B节段编码的VP1蛋白中，发现另外16个独特的氨基酸取代。vvIBDV的毒性表型可以被每个发现的氨基酸取代影响，甚至在A或B节段的编码或非编码部分内的(沉默型)核苷酸取代也可以导致与经典或抗原性变体分离株相比，vvIBDV分离株的表型改变。vvIBDV分离株(OKYM)在含胚卵上的连续传代导致衍生的分离株(OKYMT)出现，其能在鸡胚成纤维(CEF)细胞上生长，并已经丧失其极毒力。据报道这种适应性是在基因组的多蛋白编码部分中有7个核苷酸取代所导致的。在A或B节段的剩余部分(例如非翻译区，VP1编码区，和VP5编码区)中是否存在另外的核苷酸取代还未确定(Yamaguchi等，1996)。报道的核苷酸取代产生5个氨基酸取代。这些氨基酸取代中有三个位于VP2高变区的疏水部分(I256T，D279N，A284T)，一个位于VP2高变区下游的亲水部分(S315F)，一个位于VP3内(A805T)(Yamaguchi等，1996)。在一独立的实验中，Yamaguchi等发现vvIBDV分离株TKSM适应成为TKSM也导致A284T和D279N取代。在这些分析中相关的A284T取代在CEF细胞上完全适应，并丧失毒力。D279N取代在两种CEF适应的vvIBDV分离株(OKYMT和TKSMT)中均存在，及对在CEF细胞上生长和丧失毒力也具有潜在的重要性。另一方面，非CEF适应的经典IBDV分离株GBF-1在279位具有天冬酰胺，在284位具有丙氨酸，并且不能在CEF细胞上生长，因此D279N的单一取代不能使其丧失毒力及在CEF细胞上生长。VP2中的氨基酸变化显然能使修饰的IBDV在不具有野生型IBDV的受体的细胞上增殖。具有野生型受体的细胞如囊细胞对经典和vvIBDV分离株易感。最近研究表明A284T和D279N氨基酸取代组合确实足以将非CEF适应的极烈性IBDV分离株转变为CEF适应的分离株。Lim等将这两个氨基酸取代导入vvIBDV分离株HK46的A节段cDNA(Lim等，1999)。在转染此cDNA后，Lim等获得一种具有CEF培养适应的分离株表型的rIBDV分离株，即此rIBDV分离株在CEF细胞中能感染及繁殖。此rIBDV分离株在鸡中的毒力没有测定。值得注意的是，Lim等用HK46分离株的未修饰的cDNA不能产生重组感染性vvIBDV分离株(Lim等，1999)。
抗IBD免疫接种的目的是预防临床和亚临床IBD，及经济学的各个方面。针对IBD的有效接种可分为以下类别在broiler，种禽和蛋禽中保护囊发育。
在broiler，种禽和蛋禽中预防临床疾病。
种禽引发和加强。
为使IBDV的免疫抑制作用最小化，必须将幼鸡进行保护。对极幼鸡进行保护可通过将足够高水平的母体抗体经过种鸡传递至其子代。对极幼鸡自身进行接种可能会不成功，因为接种后的保护在3-5天之间出现。而当缺乏抗IBDV的母体抗体的禽类暴露于病原性IBDV野毒株时，在24-48小时内将发生损害。
通常对种禽的早期接种是作为引发。在大多数情况下，此单次接种被认为是不够的。加强通常指在产卵发生之前最后施用的IBDV接种。由此提高母鸡体内的循环抗体及因此提高子代中的母体抗体。灭活的(油乳状液疫苗)和活疫苗(IBDV)均已经用于此目的。在较老的禽类中使用活疫苗将使抗体增加；然而，通常可见抗体效价有较大变异。这些变异导致早至孵化后几天至孵化后21天的子代变得对野外攻击易感。使用灭活的IBDV疫苗提供更高的抗体效价，并降低属于同种群的禽类的抗体效价之间的变异。中和IBD所需的母体抗体的水平随野外毒株的侵袭力和致病性而变化。在实践中，如果存在极烈性IBDV分离株，需要较高水平的母体抗体(见表1关于野外分离株毒力和疫苗强度总结)。就有效接种而言，必需避免母体抗体的干扰以诱导良好的免疫应答。临床IBD在3-6周龄典型可见。因为被动保护下降，必须刺激小鸡的免疫应答。活性接种的时间可通过种禽或小鸡在接近3.5天的抗体的效价和半衰期加以评估(De Wit和Van Loon，1998；Kouwenhoven和Van den Bos，1995)。母体抗体的水平在群体中趋于变化。此变异可以是种禽母鸡的抗体水平变异的结果。来自几种种禽群体(例如不同年龄的种禽组合；用活疫苗和油乳化疫苗接种的种禽)的子代混合，导致属于同种群小鸡之间的IBDV抗体水平发生变异。如果在平均母体抗体效价中的变异系数(CV)太宽，可推荐接种两次(间隔10天)，或用热疫苗早期接种(在存在高抗原性压力的情况下)。
在群体中抗IBDV的抗体的平均效价将随时间而下降(图1)。平均抗体效价降低，导致免疫缺口(immunity gap)发生。如果免疫缺口尽可能短及尽可能早，最短在孵化后2周，则可获得最佳结果。在4周龄活性接种后应至少有足够的免疫性，因为许多处理是从该时间点开始在室内进行的，此时有导入野生病毒的危险。因此农场主喜欢在2周或更早接种。中度疫苗通常不能突破在孵化后2周的小鸡的平均抗体效价下(图1)。如果平均母体抗体效价存在高度变异，可用中度疫苗有效接种一些小鸡，否则不能。为解决这些问题，使用热(hot)疫苗。使用热疫苗的一个缺点是具有低至中等母体抗体效价的鸡的囊将被(部分)破坏。
目前有许多IBDV疫苗可供应。接种策略的重要方面是病毒在面对母体抗体(疫苗的侵袭力)和抗原性内容物谱(包括抗原性变体)时能复制。根据疫苗病毒在面对母体抗体时的复制能力，可将活疫苗主要分为3组轻度，中度，和中度加或热疫苗(见表1)。IBD的初始疫苗衍生自经典IBD分离株。这些疫苗是中等致病性IBDV毒株，在含胚卵中传代数较低。这些疫苗通常用于种禽计划中，以诱导高水平的循环抗体。然而，当将其给予具有中等或低水平的母体抗体的幼禽时，这些疫苗可导致广泛的囊萎缩，引起免疫抑制。随后开发了轻度疫苗用于这些幼禽中。在组织培养系统中进行传统的IBDV的减毒。传统的，减毒疫苗株是通过经连续传代将IBDV毒株适应鸡成胚(CEF)细胞或其它适当细胞或细胞系而产生的。这些疫苗即使用于无母体抗体的禽类中也不是免疫抑制性的。然而中等和高度水平的抗体易于中和它们。随着种禽计划(包括使用佐剂，灭活的疫苗)的发展，在子代中产生了较高水平的母体抗体。这降低了这些轻度疫苗的效力。
中等强度的疫苗克服了轻度疫苗的不足之处。一些中度疫苗是通过在鸡细胞培养基上克隆野外分离株产生的。中等强度的疫苗能在具有中等水平母体抗体的禽类中建立免疫性。这些疫苗将导致无母体抗体的禽类中一些囊萎缩，但认为不是免疫抑制性的。
热(强)或中度加疫苗是在vvIBDV第一次爆发后产生的。这些vvIBDV分离株可比在该时市售的疫苗突破更高水平的母体免疫性。在具有vvIBDV高度感染压力的情况下，用中度疫苗接种起效太晚。热疫苗由在含胚卵中低至中等传代的vvIBDV毒株或用vvIBDV分离株感染的鸡的囊产生的IBDV组成。在通常用于产生疫苗的细胞上适应vvIBDV的尝试失败了，因为这些细胞对vvIBDV是非允许细胞，或当适应所述细胞时，vvIBDV丧失其极烈性，使其不能用于热或中度加疫苗。热或中度加疫苗需要能在比中度疫苗更早年龄克服母体免疫性，但在群体中更广泛传播。如果中度加和热疫苗用于具有中等至高水平母体抗体的鸡中，对囊没有阴性副作用(Kouwenhoven和Van den Bos，1995)。如果这些疫苗用于具有低至中等水平母体免疫性的鸡中，导致囊中淋巴细胞损耗，并发现周围血中B细胞严重损耗(Ducatelle等，1995)。尽管已经观测到囊功能恢复，但这些疫苗应慎用。
活疫苗必须以这样一种方式给予，其中病毒优选到达囊，在此迅速繁殖并诱导免疫应答。应用活疫苗的可能途径包括饮用水，喷雾，皮下和卵内(in ovo)。灭活的IBD疫苗用于broiler种禽。它们的应用途径在与活疫苗相同方式中有一些不同。它们的效力依赖于其含有的抗原谱。可注射的油乳液制品可皮下或肌内注射给予。
用整体质量控制方案包括血清学持续监测野外情况，可以是持续适应预防性接种方法以改变流行病学条件的有利手段。持续探究流行病学条件可预见重大流行病的发生(Ducatelle等，1995)。然而，诊断实验室难以用有意义的确定数据监测IBD。血清学是重要的，但当从商购的broiler群体中监测的所有鸡具有高水平的相同循环抗体谱时，其可能令人困惑。监测broiler的IBD情况的野外评价是高度主观的难以区别在接种后获得的抗体效价和通过IBDV野外感染诱导的抗体效价。如果可以区别对野外病毒和IBDV接种之间的IBDV抗体应答，则可能具有“早期警报”系统，且如果需要则启动IBDV根除计划。只有当已知对所用IBDV疫苗和IBDV野外分离株的抗体应答的差异时，才可作出关于IBDV的(亚)临床迹象是否是由于接种活IBDV或IBDV野外分离株所致的结果和推断。
本发明提供了感染性重组传染性腔上囊病病毒(rIBDV)，其基本上不能在非衍生自囊细胞的细胞中或其它包含野生型IBDV受体的细胞(非囊细胞)中生长。囊是一个淋巴器官，主要包含与免疫系统相关的细胞。尤其的，其包含有时是T细胞型但主要是B细胞型淋巴细胞或淋巴细胞前体细胞，或其衍生的细胞，其与单核细胞或单核细胞衍生的细胞如巨噬细胞密切相关，并与小结树突细胞和呈递抗原细胞也密切相关。特别地，本发明提供了rIBDV，其基本上不能在以上未列出的囊细胞或其衍生的细胞中生长，如树突细胞，单核细胞，淋巴细胞或其衍生的细胞。本发明提供了一种保留重要特性的rIBDV，即与普通减毒的IBDV毒株相比，其在非囊细胞或其它通常用于增殖IBDV减毒毒株的细胞中不能生长只微弱生长，所述非囊细胞如熟知的CEF，QM5或VERO细胞。特别地，本发明提供了一种基本上在非B细胞衍生的细胞中不能生长的rIBDV。基本不能生长在本文是指所述分离株不能或很少能感染，繁殖或被释放以进一步复制。在本发明之前没有这种rIBDV分离株，以前的所有分离株已知在非囊细胞衍生的细胞如CEF细胞中生长(WO98/09646；Lim等，1999)，从而例如丧失那些极烈性特征，此极烈性是在设计面对上述问题的疫苗毒株中必需保留的。
在一优选的实施方案中，本发明提供了感染性rIBDV，其保留了极烈性传染性腔上囊病病毒(vvIBDV)的提供抗vvIBDV的保护性所需的极烈性特征的至少一部分。特别地，所提供的vvIBDV基本不能在非囊细胞衍生的细胞中生长。特别地，如详细论述中所例证的，本发明提供一种rIBDV，其基本上不能在CEF细胞，VERO细胞或QM5细胞中生长，当然除了这些CEF，VERO，QM5或相关细胞具有复制经典或极烈性IBDV所需的必需手段(如衍生自囊细胞的转基因受体或复制系统，或支持IBDV在非淋巴细胞中增殖的B淋巴细胞其它特性，如果这种特性存在于这种非B淋巴细胞中)。
另外，本发明提供了一种rIBDV，其中VP2蛋白的氨基酸序列在第279位氨基酸不是天冬酰胺，但例如为极烈性毒株所特有的氨基酸，如在279氨基酸位具有天冬氨酸。本发明提供的这种rIBDV毒株保留了vvIBDV极烈性的至少一部分，以及本发明还包括一种rIBDV，其中VP2蛋白的氨基酸序列在第284位不是苏氨酸，但例如为极烈性毒株所特有的氨基酸，如在第284位是丙氨酸。
在一优选的实施方案中，本发明提供了一种rIBDV，其中VP2蛋白的氨基酸序列至少包含vvIBDV分离株中发现的279-289，优选229-314，更优选214-328位氨基酸的一段序列，如表8所示。
本发明还提供了一种获得感染性重组拷贝传染性腔上囊病病毒(rIBDV)的方法，此rIBDV在非囊细胞衍生的细胞中基本不能生长或具有极烈性传染性腔上囊病病毒(vvIBDV)的至少一部分极烈性，该方法包括用核酸如cDNA或RNA转染至少一个第一种细胞，所述核酸包含至少一部分衍生自vvIBDV的IBDV基因组，将所述第一种细胞在培养基中温育，从所述转染的第一种细胞中或所述培养基中回收rIBDV，将所述回收的rIBDV在至少一个第二种细胞中增殖，所述第二种细胞是所述vvIBDV的允许细胞。衍生自所述重组病毒的疫苗也是本发明的一部分。包含经化学或物理灭活的重组病毒或其一部分的疫苗也是本发明的一部分。
初始产生的重组极烈性IBDV的减毒衍生物也是本发明的一部分。这种病毒可以通过已知方法减毒，包括连续传代，除去特异性核酸序列，或通过定点诱变。本领域已知适于家禽疫苗的生理可接受载体，不需再进一步阐述。疫苗中也可包含本领域已知其它添加剂如佐剂和稳定剂等。优选地，佐剂如氢氧化铝，磷酸铝，植物和动物油等，以足以增强对IBDV的免疫应答的量与疫苗一起投药。本发明的疫苗也可含有各种稳定剂。可使用任何适当的稳定剂，包括碳水化合物如山梨糖醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，糊精，葡萄糖；蛋白质如白蛋白或酪蛋白；和缓冲液如碱金属磷酸盐等。当通过冷冻干燥制备干态疫苗制品时，使用稳定剂是特别有利的。疫苗可通过任何已知接种家禽的方法施用，包括鼻内，眼部，注射，在饮用水中，在食物中，接触等方法施用。优选地，疫苗是通过大量施用方法施用的，如in ovo接种，通过将疫苗置于饮用水中，或通过喷雾于动物的周围环境中。当通过注射施用时，疫苗优选经非肠道施用。将本发明的疫苗施用于家禽以在孵化之前或之后的任何时候预防IBD。家禽包括但非限于小鸡，公鸡，母鸡，broilers，roasters，种鸡，产蛋鸡，火鸡和鸭。适当的药物载体例如是稀释剂，本领域已知惰性的药物载体。优选地，载体或稀释剂是与通过大量施用方法施用的疫苗兼容的制剂。然而，载体或稀释剂也可以是与其它施用方法兼容的，如注射，滴眼液，滴鼻剂等。
如上所述，需要一种IBDV疫苗，其具有抗野外IBDV感染的保护作用，优选抗极烈性IBDV(vvIBDV)。现已清楚衍生自减毒经典毒株而不是极烈性毒株的疫苗不具备充分的保护作用。然而如上所述，本领域技术人员首先会将vvIBDV毒株在细胞或细胞系如VERO，CEF或QM5上简单适应或培养，以从vvIBDV毒株中获得疫苗毒株，但这会降低其极烈性表型，这样预期不会有充分的保护作用。因此，需要一种疫苗毒株，其至少部分保留了极烈或热特性，以提供充分的保护作用，然而，相矛盾的是，这种所需的疫苗毒株很可能在被认为获得所述疫苗所需的适当的细胞上不能充分或实际增殖，所述细胞如非囊细胞衍生的VERO，CEF或QM5细胞。在一优选的实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述第一种细胞是非囊细胞衍生的细胞，即是所述vvIBDV的非允许细胞，优选地其中所述第一种细胞另外具有辅助病毒或其衍生的病毒蛋白(本文使用T7聚合酶)。借助于包含适当选择的辅助病毒例如表达独特的IBDV或双RNA病毒蛋白的辅助病毒的这种细胞，或表达所述IBDV或双RNA病毒蛋白的细胞(也称为互补细胞)，目前也可产生缺陷或缺损的rIBDV。
本发明还提供了一种产生感染性IBDV的方法，通过将衍生自极烈性IBDV(vvIBDV)分离株的cDNA序列，与衍生自血清型I经典减毒IBDV分离株、血清型IIBDV的抗原性变体、或血清型IIIBDV分离株的cDNA序列组合，其中保留极烈性IBDV的至少一部分极烈性的所述的感染性拷贝重组IBDV，至少保留了在vvIBDV非允许细胞如QM5或CEF细胞上不能实质增殖的能力。
优选地，本发明提供的方法提供了一种包含IBDV基因组的疫苗，其中衍生自vvIBDV的A节段和/或B节段部分，与衍生自减毒的IBDV如减毒的血清型I或IIIBDV的A和/或B节段部分组合使用。这种rIBDV在本文也称为镶嵌(mosaic)IBDV(mIBDV)。在此我们示出(镶嵌)vvIBDV可从cDNA中产生，其是通过转染不易感细胞随后在易感细胞上扩增cDNA衍生的rIBDV进行。此方法提供了一种从vvIBDV分离株的克隆的全长cDNA中产生vvIBDV的方法(见表5和表6)。在用vvIBDV的cDNA转染QM5细胞后，产生的vvIBDV病毒在vvIBDV允许细胞上发生增殖是重要的。这些允许细胞例如是囊细胞衍生的细胞，如在鸡胚细胞，鸡胚或幼鸡中的原始囊细胞。使用本文所述方法，我们例如用衍生自极烈性D698IBDV分离株的cDNA产生了重组D6948(rD6948)。此rD6948分离株与亲代D6948分离株具有相同毒力(表6)。
优选地，本发明提供了一种方法，其中第二种允许细胞是原始囊细胞，从而使所需的疫苗病毒开始增殖。如上所述，需要一种疫苗，其能在早期突破幼鸡的母体免疫性。所需的疫苗应优选在接种的幼鸡中能诱导高水平的保护作用，并应因此其免疫原性与极烈性病毒相同，或几乎相同。
本发明还提供了一种工程化重组镶嵌IBDV(mIBDV)疫苗的方法，该疫苗具有一或多个所需表型，即i)能突破幼鸡中高水平母体抗体并是高免疫原性的，ii)与野生型极烈性IBDV分离株相比致病性降低。在一实施方案中，本发明提供了一种包含rIBDV的感染性镶嵌IBDV(mIBDV)，其中至少一个基因组节段包含衍生自至少两个不同双RNA病毒分离株的核酸，优选地，其中至少一个所述分离株是vvIBDV，特征在于其在vvIBDV非允许细胞如VERO，QM5或CEF细胞上不能充分增殖，和/或特征在于在vvIBDV允许细胞如原始囊细胞上能充分增殖。例如，本发明提供了mIBDV，其由衍生自经典减毒分离株(如CEF94)的部分基因组，和衍生自vvIBDV分离株(如D6948)的部分基因组组成。在衍生自极烈性IBDV分离株(D6948)的感染性cDNA的基础上制备的并组合衍生自细胞培养物适应的血清型I经典IBDV分离株(CEF94)的已知部分cDNA的重组镶嵌IBDV(mIBDV)产生一种mIBDV分离株，其与在非B淋巴细胞衍生的细胞上基本不复制的野生型vvIBDV相比致病性降低。
另外，引起或不引起氨基酸突变的特异性核苷酸取代，或IBDV基因组的特异部分缺失，同样导致产生的mIBDV的表型改变。例如，用D6948的cDNA的相应区域置换CEF-94 cDNA的pVP2编码区，产生质粒pHB36-vvVP2。此质粒随后组合pHB-34Z转染入FPT7(Britton等，1996)感染的QM5细胞中。接着将这些转染的QM5细胞的上清移至新鲜QM5细胞中。在使用IBDV的VP3蛋白的特异性抗体的IPMA中，这些QM5细胞无一呈阳性反应。另一方面，用转染的细胞的上清覆盖后的原始囊细胞，在相同IPMA中呈阳性反应。能进入允许细胞如QM5细胞的功能特征明显位于A节段的pVP2编码区内。本发明提供了一种产生重组vvIBDV(如rD6948)的方法，该重组vvIBDV具有在野生型vvIBDV(在此为D6948)中发现的pVP2序列。目前pVP2序列已经阐述的所有极烈性分离株在第284氨基酸位还具有丙氨酸，其不能或略微能在CEF细胞上增殖(见表7和8)。另一方面，当在第284位存在苏氨酸时，可在CEF细胞上增殖，但这与丧失极烈性表型相关(见表7和8)。在此我们阐述了一种产生感染性重组IBDV(rIBDV)的方法，该rIBDV具有野生型IBDV分离株的核苷酸序列，包括第284位的丙氨酸密码子，其不能在CEF细胞上增殖。另外，在我们的rD6948分离株中，在第279位存在天冬氨酸代替通常在可在CEF细胞上增殖的无毒的IBDV分离株中发现的天冬酰胺(表7和8)。rD6948是一种极烈性rIBDV，其不能在CEF细胞上生长(表5)，并诱导与野生型极烈性D6948分离株所诱导的相似的临床迹象和死亡率(表6)。与D6948，rD6948和srIBDV-DACB分离株(也具有衍生自vvIBDV的功能性VP2蛋白，见表6)相反，尽管mIBDV分离株(mCEF94-vvVP2)在9天时间内不引起任何死亡率，或体重减轻，但其在感染9天后所引起的腔上囊重量减轻与野生型极烈性D6948分离株相同。
在另一实施方案中，本发明提供了镶嵌IBDV，其中至少一种所述的分离株是血清型II IBDV。这种mIBDV，优选也缺失至少一个特异于血清型I IBDV的优势免疫表位，其是(r)D6948衍生的疫苗病毒如mD6948-s2VP3C1，其还具有衍生自vvIBDV的功能性VP2蛋白，使得可以用标记疫苗接种。用IBDV标记疫苗接种及随后用相应的诊断试验测试，可区分由疫苗诱导的和由IBDV野外分离株感染诱导的抗体。此mIBDV可与属于血清型I或II的所有其它已知野生型IBDV分离株区分，例如通过使用特异性单克隆抗体。从血清型I和II cDNA中产生mIBDV提供了这样一种mIBDV标记疫苗，其诱导鸡体内血清学应答，该应答可与由IBDV野外毒株诱导的血清学应答区分。本发明提供的缺失至少一个优势免疫表位，优选血清型I表位的标记疫苗，能通过诊断性血清学试验区分接种的和感染的动物。这种mIBDV标记疫苗优选基于vvIBDV，及含有源自经典血清型I或血清型IIIBDV的特异性序列。这种mIBDV标记疫苗具有一或多种以下特性i)尽管有高水平的母体抗体存在，其诱导抗vvIBDV野外病毒的保护性免疫应答。ii)与基于野生型vvIBDV的疫苗相比，其致病性降低。iii)其例如缺失至少一个血清型I特异性抗原，使得能从所有血清型I IBDV分离株中血清学区分mIBDV标记疫苗。
本发明还提供了一种生产或产生抗IBDV的特异性抗原性变体的特制疫苗的方法，其通过在mIBDV疫苗病毒中掺入特异性氨基酸变化而进行。根据组成，这些镶嵌的IBD病毒(mIBDV)具有不同的表型和不同的抗原性。在一个病毒蛋白中的一个特异性突变可对IBDV存活性有深刻影响。我们发现在导致在VP4中单氨基酸突变(V582A)的单核苷酸取代的情况中就是这样。当存在此特殊的核苷酸取代时，没有rIBDV可从cDNA中拯救。不仅是在VP4自身编码区内的突变，而且在切割位点(pVP2-VP4和VP4-VP3)区域中的突变或缺失，可对rIBDV的复制有负面影响。在其它病毒蛋白中的突变，或者甚至一完整病毒蛋白(即VP5)缺失，也影响复制和或毒性。通过在CEF适应的D78 IBDV分离株的cDNA中导入突变，已经构建了两组去除VP5的rIBDV分离株(Mundt等，1997；Yao等，1998)。明显的，VP5蛋白是一种非结构蛋白，也是一种非必需蛋白质。Yao等报道了失活VP5的ORF(用终止密码子代替起始密码子)，产生感染性rIBDV(rD78NS，其与rD78相比在体外生长至略较低效价)，而Mundt等报道了失活VP5的ORF(用精氨酸密码子置换起始密码子)产生rIBDV(IBDV/VP5-)，其在体外能生长至与亲代分离株相同效价。另外Yao等报道了rD78NS在细胞培养物中胞毒性和细胞程序死亡作用降低，及与亲代分离株(体内)相比复制延迟(体外)，且在感染的鸡中不能诱导任何病理损害或疾病临床迹象。
mIBDV cDNA中的突变或缺失产生一种具有所需表型的mIBDV，即基于极烈性分离株，但复制能力降低，因此致病原性降低的mIBDV。将来自血清型II的细胞培养适应的IBDV分离株(TY89)的cDNA序列导入镶嵌病毒中，给我们提供了另一种产生标记mIBDV疫苗的机会，该疫苗可与野生型血清型I IBDV区分，例如通过使用特异性单克隆抗体。这种mIBDV可用于诱导抗体谱。其不同于由IBDV野外分离株诱导的抗体谱。这使得可以进行血清学试验以确定IBDV抗体是否是接种活mIBDV或用IBDV野外分离株感染的结果。例如，mCEF94-s2VP3C病毒被血清型II特异性VP3抗体(Mab T75)识别，其也可以由血清型I特异性VP2抗体(Mab1.4)识别。另一方面，此特定rIBDV不被血清型I特异性VP3抗体(MabB10)识别。在mCEF94-s2VP3C和rCEF94的复制之间没有明显不同，表明VP3C末端部分的交换不引起在QM5细胞中复制能力有主要变化，另一方面，当完整的VP3编码区被交换时，我们观测到所得病毒(mCEF94-s2VP3)的复制能力严重降低。另一方面，mCEF94-s2VP3N与Mab C3(VP3，血清型I)不反应，而其与Mab B10(VP3，血清型I)充分反应，及与Mab T75(VP3，血清型II)只部分反应。此镶嵌IBDV在CEF细胞上的复制与rCEF94相比降低。从基于衍生自血清型I(CEF94)和血清型II(TY89)的cDNA产生的mIBDV中，清楚的是基于VP3的血清学标记已经鉴别。用血清学I的(部分)VP3的cDNA置换血清学II的相应部分，导致在一个mIBDV分离株中独特的IBDV抗原组合。基于此抗原组合的一个mIBDV分离株可用作IBDV标记疫苗。
将TY89(血清型II)的VP3的C末端部分导入D6948的cDNA中，产生镶嵌IBDV(mD6948-s2VP3C1)，其与D6948或rD6948相比毒性降低(无死亡率，无体重降低)(表6)。此mIBDV，或更多或更少毒性的可比分离株，在用作IBDV标记疫苗方面也是有利的，可预防极烈性IBDV野外分离株的感染。
另外，本发明提供了用位点特异性诱变技术，在mIBDV完整基因组内导入任何所需的核苷酸突变的方法。使用这种方法，可适应mIBDV疫苗以进行进一步抗原性改变，这通过将在IBDV野外分离株的抗原性变体中发现的任何突变包括进来而进行。另外，本发明可用属于另一属的双RNA病毒(例如DXV，IPNV，OV，TV)的相应部分交换部分IBDV基因组序列。另外，本发明提供了新的镶嵌双RNA(mBima)病毒，其具有新的特性产生新的IBDV或其它双RNA病毒的重组疫苗。使用其它双RNA病毒(例如DXV，IPNV，OV或TV)的cDNA也产生新的IBDV疫苗。在此方法中，一或多个IBDV优势免疫表位或中和表位用另一种双RNA病毒蛋白的相应部分交换。
当然，本发明还提供了一种生产本发明rIBDV的方法，所述载体包含衍生自另一种病毒或(微)生物的异源核酸序列，从而rIBDV或mIBDV用作载体。例如，本发明提供了一种产生IBDV感染性拷贝的方法，其表达一或多个来自其它病原的抗原，并可用于接种以抗多种疾病。这种IBDV感染性拷贝例如包含编码得自病原体的异源蛋白的异源cDNA，例如得自家禽病原体。本发明还提供了一种产生IBDV的条件致死缺失突变体的方法，其可用作自身限制性非传染性(载体)疫苗。这种IBDV缺失突变体不能表达IBDV蛋白，其通过其它方法补充丢失的蛋白而表型互补。
在详细描述部分进一步解释了本发明，而无限制之意。
详细描述材料和方法病毒和细胞
IBDV分离株CEF 94是PV1的衍生物(Petek等，1973)。在1973年在我们的实验室得到PV1分离株后，我们通过重复传代(＞25次)将此分离株适应原始鸡胚成纤维(CEF)细胞或囊细胞。极烈性IBDV分离株D6948最初是在1989年由家禽健康服务机构(Doorn，荷兰)分离的，其通过在含胚卵中经5次传代和在SPF来亨鸡中接着进行1次传代纯化。IBDV血清型II分离株TY89(McFerran等，1980)通过在CEF细胞上限量传代，保存在我们的实验室中。扩增IBDV的CEF适应的分离株(CEF94和TY89)，是通过将新鲜制备的鸡胚成纤维细胞(CEF)在组织培养瓶中生长直至接近铺满而进行的。将此细胞培养物用CEF94或TY89感染(moi＝0.1)，并在37℃在5％CO2的温箱中培养48小时。将培养物上清在6000g离心15分钟(沉淀碎片)，将上清移至干净的试管中并接着在33000g离心3小时。将病毒沉淀再悬浮于PBS中(1％起始培养体积)。在我们的实验室中，将极烈性IBDV分离株D6948增殖，通过在21天龄的鸡中，以每只鸡经滴鼻剂或滴眼剂接种200 ELD50(卵死亡剂量)进行。从感染3天后的鸡中收集腔上囊，并加入两体积的胰蛋白 磷酸盐缓冲液。将此混合物在Sorval Omnimixer中均质(3×10秒，最大速度)，并接着离心澄清(6000g，10分钟)。将上清移至干净试管中，用氟利昂提取3次，用氯仿提取1次。将病毒制品贮存在-70℃直至进一步使用。QM5细胞(Antin和Ordahl，1991)得自R.Duncan实验室(Dalhouse大学，Halifax，Nova Scotia，加拿大)，并用QT35培养基(Fort Dodge)在CO2温箱(37℃)中维持。分离病毒dsRNA基因组dsRNA纯化自IBDV颗粒，是通过用蛋白酶K(Amresco，1.0mg/ml)，在存在0.5％SDS的情况下，在50℃在2小时期间内消化病毒蛋白而得的。将病毒dsRNA通过苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)提取(两次)，并用乙醇(2.5v)/NaCl(0.1v，5M，pH4.8)或用2M氯化锂(Diaz-Ruiz和Kaper，1978)沉淀。将RNA溶解于DEPC处理的水(10％初始体积)中，并贮存于-20℃直至进一步使用。在琼脂糖凝胶上检测病毒RNA的完整性和纯度。快速扩增cDNA末端测定CEF94分离株的所有基因组RNA链(A和B节段的编码链和非编码链)的5’末端。每次测定我们使用2ug基因组dsRNA和10pmol链和节段特异性引物，总体积为12ul。在95℃温育5分钟后，将此混合物移至冰上，并加入4ul Superscript II第一链合成缓冲液(Gibco/BRL)，2ul的100mM DTT和2ul的dNTP’s(各10mM)。将此混合物在52℃温育2分钟，之后加入1ul逆转录酶(SuperscriptII，Gibco/BRL)，并在52℃持续温育1小时。将逆转录酶通过加入1ul的0.5M EDTA灭活。基因组dsRNA通过加入2ul的6M NaOH及在65℃温育30分钟而破坏。为进行中和，加入2ul的6M乙酸，通过用Qiaex DNA提取试剂盒(Qiagen)回收cDNA，并最后溶解于6ul水中。在锚连接反应中，我们使用2.5ul的cDNA制备物，4pmol锚，5ul T4连接缓冲液和0.5ul T4 DNA连接酶(New EnglandBiolabs)。在室温温育16小时，将反应物贮存在-20℃。为扩增连接于锚的单链cDNA，我们使用与锚引物组合的嵌套引物。根据以下条件进行PCR10pmol每种特异性引物，10pmol锚引物，4.5或5.5mM MgCl2，1*Taq缓冲液(Perkin Elmer)，50uM每种dNTP，3单位Taq聚合酶(Perkin/Elmer)，和4ul RNA连接混合物作模板，总体积50ul。将扩增在92℃(45秒)，57或65℃(45秒)，和72℃(90秒)温度水平循环35次。将所得PCR产物经琼脂糖凝胶纯化并用EcoRI和XbaI消化，并与预先用相同限制酶消化的pUC18载体连接(T4 DNA连接酶，Pharmacia)。所得质粒在大肠杆菌中扩增，并通过用M13F和M13R引物进行核苷酸序列分析。产生A和B节段全长单链cDNA为产生CEF94和D6948的A和B节段的全长单链cDNA，我们在逆转录反应中，使用一种特异于编码链3’末端的引物，以开始合成cDNA。我们用1ug基因组RNA和2.5pmol的ANC1(A节段特异性引物，表2)或BNC1(B节段特异性引物，表2)作模板，总体积为10ul。在98℃温育2分钟后，将此混合物立即移至冰上，并加入含有2*Superscript II第一链合成缓冲液(Gibco/BRL)，20mMDTT，2mM每种dNTP和100单位Superscript II(Gibco/BRL)的10ulRT混合物。在阴性对照反应中，不加入Superscript II酶。将所有试管在50℃温育30分钟，之后加入0.5单位的RNase H，并在37℃持续温育15分钟。在每个试管中加入水(80ul)，通过苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)提取，及用标准乙醇(2.5v)/NaAc沉淀方法沉淀。将所得沉淀溶解于20ul水中并贮存于-20℃。用基于PCR的方法扩增全长cDNA将A和B节段的全长单链cDNA经PCR扩增。杂交于A节段(T7AC0，表2)和B节段(T7BC1，表2)的非编码链3’末端的引物，均具有含有T7启动子序列和一个EcoRI位点的24nt的非杂交5’延伸。杂交于A节段(ANC0，表2)和B节段(BNC1，表2)的编码链5’末端的引物精确匹配。我们使用5ul上述RT反应物作模板，在存在1*Expand HiGH Fidelity缓冲液，50uM每种dNTP，0.2pmol每种引物，1.5单位Expand High Fidelity酶，和2.0mM MgCl2(A节段)或4.0mM MgCl2(B节段)的情况下进行PCR。在A节段扩增的情况中(A程序)，扩增在94℃(15秒)，58℃(15秒)和72℃(5分钟)温度条件下循环35次，在B节段扩增的情况中(B程序)，扩增在94℃(15秒)，54℃(15秒)和72℃(5分钟)温度条件下循环35次，使用Biometra T3热循环仪。在1.0％琼脂糖凝胶上检测PCR产物的产量。克隆和分析产生的PCR片段将从基因组dsRNA中经3次独立的反应产生的全长PCR片段，通过用Qiaex凝胶纯化试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中分离，并根据生产者指导连接在pGEM-Teasy(Promega)载体中。将连接的质粒用于转化大肠杆菌DH5-α细胞，将该细胞接着在氨苄青霉素(100ug/ml)选择下，在存在IPTG(0.8mg/培养皿)和Bluo-gal(0.8mg/培养皿)的情况下生长。制备白色菌落的质粒DNA，并通过限制酶消化和琼脂糖凝胶分离进行分析。将克隆的cDNA的核苷酸序列通过用ABI310自动测序仪和A和B节段特异性引物测定。测定CEF94的两个节段和D6948的两个节段的共有核苷酸序列(图2)，并推导开放读框的相应氨基酸序列(图3)。通过使用两个独立克隆的cDNA，我们恢复了在A节段克隆中存在的一个氨基酸突变(V542A)，产生pHB-36W，在D6948的A节段克隆中的一个氨基酸突变(P677L)，产生pHB-60，及在D6948的B节段中的一个氨基酸突变(Q291X)，产生pHB-55。在CEF94的B节段cDNA克隆(pHB-34Z)中不存在氨基酸突变。导入丁型肝炎病毒核酶通过用限制酶XbaI和SmaI消化转录载体2.0(Pattnaik等，1992)将丁型肝炎病毒核酶首先导入大肠杆菌高拷贝数质粒pUC-18中。将含有丁型肝炎病毒核酶和T7 RNA聚合酶终止子的所得236bp的片段，连接于预先用XbaI和SmaI消化的pUC18中，产生pUC-Ribo。将含有CEF94和D6948的A和B节段的质粒在全长PCR中用作模板，使用上述条件和特异于A节段(T7AC0和ANC0)和B节段(T7BC1和BNC1)的引物。将PCR片段经琼脂糖凝胶(Qiaex)纯化，用T4 DNA聚合酶平端化，接着用EcoRI消化。将所得DNA片段直接克隆入pUC-Ribo载体中，该载体预先用SmaI和EcoRI消化。将所得质粒在体外转录一翻译反应中用作模板(TnT-T7Quick，Promega)。当pHB-36A(CEF94的A节段)或pHB-60(D6948的A节段)用作模板时，翻译产物的SDS-PAGE分析的放射自显影图显示3个主要条带pVP2(48-49kDa)，VP3(32-33kDa)，和VP4(28-29kDa)。当质粒pHB-34Z(CEF94的B节段)或pHB-55(D6948的B节段)用作模板时，发现一个主要条带(VP1(91kDa))(数据未示出)。导入遗传标记为区别产生自野生型病毒或克隆的cDNA的感染性病毒，我们在IBDV-A分离株的A节段的3’-UTR中导入遗传标记。突变pHB-36A的两个核苷酸(C3172T和T3173A)，从而导入一个单一的KpnI限制位点(GGTAAC)。这些突变通过Higuchi(1990)所述方法导入。将所得PCR片段的一个383bp的片段，通过使用两个单一的限制位点(BglII和BlpI)，连接于全长A节段克隆(pHB-36A)中(快速连接试剂盒，Boehringer Mannheim)。将所得质粒在大肠杆菌中扩增。在此全长CEF94 A节段克隆中存在遗传标记，这可从序列分析和用限制酶KpnI消化证实(数据未示出)。当在体外转录/翻译反应中用pHB-36A或pHB-36W作为模板时，在所得蛋白质模式中未观测到不同(数据未示出)。构建镶嵌A节段cDNA我们构建了含有镶嵌IBDV A节段的质粒，其由一个分离株(CEF94)的部分cDNA和另一个分离株(D6948)的部分cDNA组成。为构建这些质粒，我们已经用适当的IBDV特异性或选择性引物扩增了cDNA的特异部分。随后将D6948的cDNA的扩增的PCR片段用于置换质粒pHB-36W中的相应部分，使用限制内切酶和T4DNA连接酶进行(快速DNA连接，Boehringher Mannheim)。
为构建pHB36-vvVP2(交换pVP2编码部分，表4)，我们用IBDV特异性引物产生嵌合PCR-VP2D片段(2256bp，见图5a)。此PCR片段的内部部分用于交换pHB-36W的相应部分，使用限制酶EcoRI和SacII的单一位点。为构建质粒pHB36-vvVP3(表4)，我们使用IBDV特异性引物产生嵌合PCR-VP3c片段(2154bp，见图5b)。此PCR片段的内部部分用于交换pHB-36W的相应部分，使用限制酶EagI和KpnI的单一位点(遗传标记位点)。
为构建质粒pHB36-vvVP4(表4)，我们使用IBDV特异性引物产生嵌合PCR-VP4d片段(2154bp，见图5c)。此PCR片段的内部部分用于交换pHB-36W的相应部分，使用限制酶EagI和DraIII的单一位点(遗传标记位点)。
通过确定核苷酸序列对质粒pHB36-vvVP2，-vvVP3，和-vvVP4进行部分分析，以证实在所述操作期间未导入非有意的突变。导入血清学标记为获得血清型IIIBDV分离株A节段的cDNA，我们通过使用ANC1引物，如上述产生了TY89的单链cDNA。接着将VP3蛋白的编码区在PCR中进行3次独立扩增，使用2ml RT材料，1*Taq缓冲液，50uM每种dNTP，两个IBDV血清型II特异性引物(每个0.2pmol)，1.5单位酶，和3.0mM MgCl2，反应体积0.1ml。扩增在94℃(15秒)，52℃(15秒)和72℃(1分钟)的温度条件下循环35次。将所得956bp的片段克隆入pGEM-TEasy载体中，并确定共有的核苷酸序列(图2a)。分离的质粒中有一个含有TY89 VP3共有序列(pSV-VP3-TY89，图4)，并用作模板以产生一个893bp的PCR片段(见图5d)。接着通过使用在质粒pSV-VP3-TY89和pHB36W-vvVP3中人工导入的KpnI(nt3175)和SacII(nt1760)限制位点将此PCR片段用于置换质粒pHB36W-vvVP3的相应部分。所得质粒(pHB36-vvVP3，见图5d)编码CEF94多蛋白N末端的722个氨基酸和TY89多蛋白C末端的290个氨基酸。所述交换通过核苷酸序列分析证实。
使用相同方法交换VP3蛋白编码序列的C末端部分。我们使用天然存在于TY89和CEF94的A节段cDNA中的ScaI(nt2799)位点，而非人工导入的SacII位点，组合人工导入的KpnI位点(nt3172)。所得质粒(pHB36-s2VP3C，表4)编码一种多蛋白，该多蛋白由CEF94多蛋白N末端的890个氨基酸，和TY89多蛋白C末端的122个氨基酸组成。
为构建质粒pHB36-s2VP3N(见表4)，我们将质粒pHB36-s2VP3的ScaI(nt2799)-KpnI(nt3172)部分，用质粒pHB-36W的相应部分置换。使用特异限制性内切酶ScaI和KpnI，及T4连接酶。质粒pHB36-s2VP3N的核苷酸序列通过序列分析证实。
为将IBDV分离株TY89的VP3蛋白的C末端编码部分导入分离株D6948的cDNA中，我们将质粒pHB-60的一部分(nt1760-nt3260)用质粒pHB36-s2VP3C的相应部分交换。将质粒pHB36-s2VP3C用限制酶SacII和XbaI消化，并通过Qiaex凝胶提取试剂盒(Qiaex)从琼脂糖凝胶中回收1735bp片段。将此DNA片段连接于4440bp的pHB-60的载体片段中，该载体预先用相同的限制酶消化。所得质粒(pHB60-s2VP3C1，表4)含有衍生自IBDV分离株D6948(nt1-1760)，CEF94(ntl760-2799和nt3175-3260)和TY89(nt2799-3175)的cDNA。转染QM5细胞将在60mm平皿中生长至80％铺满的QM5细胞，用Foml Pox T7(FPT7)(Britton等，1996)感染1小时，之后进行转染。FPT7感染的QM5细胞接着用5ml QT-35培养基冲洗一次，及用2ml新鲜Optimem1(Gibco/BRL)在15分钟内温育2次。同时，将DNA(2.0-4.0ug)在补加25ul LipofectAMINE(Gibco/BRL)的0.5ml Optimem1中温育，并在室温至少保持30分钟。将冲洗的QM5细胞用4mlOptimem 1覆盖，加入DNA/LipofectAMINE转染混合物，并将细胞在5.0％CO2温箱中在37℃贮存18小时。在转染QM5细胞后检测重组的IBDV将转染的QM5细胞在转染后用PBS冲洗一次。自转染的QM5细胞中回收感染性重组IBDV(rIBDV)，通过将它们用4ml QT-35培养基覆盖，并在37℃(5.0％CO2)温育24小时而得，所述QT-35培养基补加了5％小牛血清和2％抗生素混合物(1000U/ml青霉素，1000ug/ml链霉素，20ug/ml两性霉素B，500ug/ml多粘菌素B，和10mg/ml卡那霉素)。将上清通过200mM滤膜(Acrodisc)过滤以除去FPT7病毒，接着贮存在-70℃或直接用于定量rIBDV。至少含有来自vvIBDV分离株D6948的pVP2的重组镶嵌IBDV(mIBDV)，不能再感染QM5细胞(见表5)。因此，将含有D6948 pVP2编码cDNA的转染实验的上清，通过尿囊绒膜(CAM)途径用于感染11天龄含胚卵。为确定感染性IBDV的存在情况，在感染5天后收集胚，用Sorval Omnimixer均质(3×10秒，最大速度)，并在IBDV蛋白质特异性ELISA中分析IBDV蛋白的存在情况。重组镶嵌IBDV(mIBDV)的血清学鉴别将不同的单克隆抗体用于检测含有部分TY89 VP3或完整TY89VP3的重组镶嵌IBDV(mIBDV)。将mIBDV用于感染QM5或原始囊细胞，并分别在37℃或39℃在5％CO2温箱中温育24小时(QM5细胞)或48小时(原始囊细胞)。接着将感染的细胞固定，通过用单克隆抗体进行免疫过氧化物酶单层分析(IPMA)，所述单克隆抗体特异于血清型IIBDV的VP2(Mab1.4)，或特异于血清型II的VP3(Mab T75)，或特异于血清型I的VP3(Mab B-10或C-3)rIBDV在SPF幼鸡中的毒力为评价产生的rIBDV，srIBDV和mIBDV分离株的毒力程度，我们用这些病毒接种了12组(10个21天龄SPF鸡)。每只鸡通过滴鼻剂和滴眼剂给予1000 ELD50的IBDV，阴性对照组只给予PBS。监测动物的临床迹象，每天除去死亡的鸡。在感染9天后，将阴性对照组的所有鸡和其中发生死亡的组中所有存活的鸡放血(5ml)，并进行安死术以进行尸检。在其它的组中，在感染后第9天对6只鸡放血(5ml)并尸检，而另外4只在感染后第15天放血(5ml)并尸检。对在感染后第9天进行安死术的所有鸡确定其腔上囊重和体重。结果确定5’末端的核苷酸序列一个小组已经报道了IBDV的分节段dsRNA基因组的5’和3’末端序列(Mundt和Muller，1995)。为核实IBDV基因组的末端序列，及能产生单一IBDV分离株的准确cDNA序列，我们用RACE(cDNA末端快速扩增)方法(Frohman等，1988)，确定了CEF94(这是一种适应鸡胚成纤维(CEF)细胞的经典IBDV分离株)的两个基因组节段的编码链和非编码链的5’末端序列。RACE分析是以双份重复对CEF94基因组的4个5’末端的每一个进行分析。所得序列数据(表3)示出编码链的5’末端长度在所有情况中均相同。另外我们发现核苷酸序列是相同的，除了最后的核苷酸在少数克隆中有变化。这与非编码链的5’末端的序列数据相反，非编码链的5’末端序列长度显著变化。我们还发现最后的核苷酸，尽管优选是胞嘧啶，在一些克隆中是变化的，与我们在编码链的5’末端中发现的相类似。CEF94的A节段编码链的3’末端核苷酸的共有序列，与Mundt和Muller(Mundt和Muller，1995)报道的核苷酸序列不同，即是胞嘧啶而非胸腺嘧啶。产生含有全长IBDV cDNA的质粒使用5’末端的序列数据，我们通过RT-PCR，克隆了经典分离株CEF94的A节段和B节段的完整的编码和非编码cDNA序列。使用相同方法和相同引物，我们还产生了非CEF适应的极烈性IBDV分离株D6948的A节段和B节段的完整的编码和非编码cDNA序列。对这两种分离株的全部基因组的核苷酸序列独立测定3次。此序列信息使我们能产生IBDV分离株CEF94和D6948的A节段和B节段的共有核苷酸序列(图2A)。禽痘病毒T7聚合酶表达系统先前已经阐述了一种用衍生自CEF适应的IBDV分离株的cDNA的体外合成的mRNA产生感染性IBDV病毒的系统(Mundt和Vakharia，1996)。此系统基于从T7启动子在体外进行失控转录，该启动子是经人工导入在A和B节段cDNA序列之前。此RNA接着转染入VERO细胞中，之后从这些细胞中可收获感染性IBDV病毒。此系统的一个缺点是在体外产生的RNA在其5’末端要含有3’-G-ppp5’-(帽序列)，才能将导入的RNA翻译成病毒蛋白，并因此复制病毒RNA。因为在5’末端要存在帽结构，因此体外产生高品质的mRNA效率低且昂贵。另外，转染的RNA的表达水平通常较低，因为RNA的半衰期较短所致。为解决在体外产生加帽的RNA及其低水平表达的缺点，我们尝试用体内基础的T7表达系统(禽痘病毒T7聚合酶表达系统，(Britton等，1996))，从含有全长IBDV cDNA的质粒中产生病毒RNA。用禽痘病毒感染的细胞产生感染性IBDV为能从具有真末端序列的克隆的cDNA中产生IBDV，我们将顺式作用丁型肝炎病毒(HDV)核酶(Chowrira等，1994)导入A和B节段cDNA序列的下游(图4)。另外，我们在CEF94的A节段的3’未翻译区中导入另外一个修饰。通过交换2个核苷酸，我们在此cDNA中导入了一个单一的KpnI内切酶限制位点。导入此单一限制位点能使我们区别野生型IBDV和产生自克隆的cDNA的感染性IBDV病毒(遗传标记的rIBDV)。与预期一致，此质粒在体外转录-翻译反应中，与没有遗传标记的A节段克隆产生同样的病毒蛋白(数据未示出)。
如在材料与方法章节所述，将质粒pHB-36W(A节段CEF94)，pHB-60(A节段D6948)，pHB-34Z(B节段CEF94)，和pHB-55(B节段D6948)，各自用于转染FPT7感染的QM5细胞。为分析转染的QM5细胞是否表达IBDV蛋白，在转染24小时后进行IPMA。在此分析中我们使用多克隆抗血清，该抗血清抗VP3(pHB-36W和pHB-60转染)或VP1(pHB-34Z和pHB-55转染)。在用pHB-36W或pHB-60转染后，大约10-50％的QM5细胞表达VP3(数据未示出)。当使用B节段编码质粒时(pHB-34Z或pHB-55)，我们发现相同百分率(10-50％)的细胞表达VP1(数据未示出)。接着，我们将含有A和B节段cDNA的质粒组合共转染入FPT7感染的QM5细胞中。为在转染的QM5细胞的上清中筛选感染性重组IBDV(rIBDV)，我们在18小时后将部分上清(10％体积)移至新鲜QM5细胞或原始囊细胞上。当A节段质粒与B节段质粒组合用于转染QM5细胞时，我们只能检测到rIBDV。当用D6948(rD6948)的A节段(pHB-60)和B节段(pHB-55)转染的细胞上清移至QM5细胞上时，不能检测到rIBDV。然而，当将pHB-60和pHB-55的共转染上清移至原始囊细胞或含胚卵上时，我们能示出在原始囊细胞中(48小时后)和含胚卵(5天后)中存在感染性IBDV(rD6948)。在第一次传代中存在rIBDV是通过用IPMA(QM5细胞或原始囊细胞)，或IBDV特异性ELISA(含胚卵)确定的。将产生的rCEF94和rD6948分离株在10天龄SPF含胚卵中扩增，并接着用于感染21天龄的SPF鸡(每种IBDV分离株感染10只鸡)。动物实验的所得数据示出(表6)，由rD6948所致的死亡率，体重，腔上囊重，和腔上囊重-体重比值，与亲代极烈性D6948分离株所致相同。在尸检中，rD6948所致的囊的总损害与亲代D6948所致的同样严重(数据未示出)。从此鸡实验中，认为rD6948保留了极烈性IBDV分离株的性质，实际是一种极烈性rIBDV。检测遗传标记收集rCEF94感染的QM5细胞的上清，并通过离心分离IBDV，如材料章节所述。提取dsRNA基因组，并通过使用逆转录酶将A节段特异性引物用于产生单链cDNA。接着将此cDNA通过PCR扩增。将产生的PCR片段克隆入高拷贝数大肠杆菌质粒(pGEM-Teasy，Promega)中，并用KpnI消化或用于核苷酸序列确定。在两个分析中证实rCEF94中存在遗传标记鉴别VP4中致死氨基酸突变与共有CEF94 A节段序列相比，质粒pHB-36(A节段CEF94，表4)在1875位具有单一核苷酸取代(胸腺嘧啶代替胞嘧啶)(图2A)。此核苷酸取代导致在多蛋白582位由缬氨酸代替由共有序列编码的丙氨酸(V582A，图3A)。由于此氨基酸突变存在于病毒蛋白酶(VP4)中，我们接着检测此蛋白酶是否仍然能从多蛋白中自动催化性释出病毒蛋白(pVP2，VP3，和VP4)。当质粒pHB-36在存在35S标记的甲硫氨酸时在偶联的体外转录/翻译反应中用作模板时，我们发现多蛋白剪接延迟(数据未示出)。除了在正常剪接的多蛋白中发现的病毒蛋白(pVP2，VP3和VP4)之外，我们发现中间体剪接的产物(60kDaVP4+VP3)，和未剪接的多蛋白(数据未示出)。尽管pHB-36克隆的病毒蛋白酶(VP4)能从多蛋白中释放结构病毒蛋白(pVP2和VP3)，但当使用如上所述基于FPT7的转染方法时，此克隆不产生rIBDV。快速自动催化裂解多蛋白明显是产生感染性rIBDV所需的。我们预期改变自动催化裂解多蛋白的速率和特异性的VP4内的其它突变，对产生的rIBDV的存活性也具有负面作用。裂解位点区域(pVP2-VP4，和VP4-VP3)内的另外突变也可对rIBDV的复制有负面作用。通过现代分子生物学方法导入极烈性IBDV cDNA中的任何突变，可使我们产生存活性降低及可用作活的或灭活的IBDV疫苗的rIBDV。产生节段重排列IBDV当将QM5转染的细胞上清移至新鲜QM5细胞上时，CEF94 A节段cDNA(pHB-36W)组合D6948 B节段cDNA(pHB-55)转染产生节段重排列的IBDV(srIBDV-CADB)。(表5)。当组合使用D6948 A节段cDNA(pHB-60)和CEF94 B节段cDNA(pHB-34Z)时，在QM5细胞上无感染性srIBDV(srIBDV-DACB)可检测到(表5)。然而，当使用原始囊细胞分析感染性IBDV的存在情况时，在这两种情况中(srIBDV-CADB和srIBDV-DACB)，在温育24小时后发现感染的细胞。在原始囊细胞群之外，只有淋巴细胞被srIBDV-DACB感染，而在srIBDV-CADB情况中，淋巴细胞和成纤维细胞均被感染。srIBDV-DACB分离株与D6948诱导的临床迹象相同，而srIBDV-CADB分离株与CEF94的毒力相当(表6)。构建镶嵌IBDV通过使用上述的现代分子生物学技术，我们产生了镶嵌重组IBDV(mIBDV)，其具有衍生自CEF94的部分cDNA，和衍生自D6948(vvIBDV)或TY89(血清型II IBDV分离株)的部分cDNA。当转染的细胞上清移至正常条件下对非CEF适应的vvIBDV敏感的细胞(即原始囊细胞或含胚卵)上时，CEF94的pVP2蛋白编码序列用D6948的相应部分置换，产生病毒(mCEF94-vvVP2)(表5)。在第一次传代中用QM5细胞作受体，将CEF94的VP3或VP4蛋白编码序列用D6948的相应部分置换，产生mIBDV(分别为mCEF-vvVP3和mCEF-vvVP4)。
将CEF94的完整VP3 cDNA(290个氨基酸)，用TY89 cDNA的相应部分置换，产生一种编码一种多蛋白的质粒，该多蛋白由衍生自CEF94的pVP2和VP4及衍生自TY89的VP3组成。当将此质粒(pHB36-s2VP3)用于体外转录-翻译反应时，存在所有期望的蛋白质，pVP2，VP4和VP3(数据未示出)。将此质粒组合含有CEF94的B节段cDNA的质粒(pHB-34)转染时，产生镶嵌IBDV(mCEF94-s2VP3)。特异于血清型I VP3的两种单克隆抗体(Mab B10和C3)，不能识别此mCEF94-s2VP3，而特异于血清型II VP3的一个抗体(Mab T75)识别此镶嵌病毒(表5)。如所期望的，mCEF94-s2VP3也由抗CEF94分离株的VP2的血清型I特异性中和单克隆抗体(Mab1.4)识别。在mCEF94-s2VP3的情况中，在转染18小时后在QM5细胞上确定的TCID50与rCEF94相比较低(3logs)。另外我们发现在24小时后，只有单一的QM5细胞被mCEF94-s2VP3感染。这与在感染24小时后在QM5细胞上CEF94和rCEF94的噬斑形成表型相反。为产生与rCEF94具有相同复制和噬斑形成特性但抗原性与其不同的mIBDV，我们接着只将CEF94的VP3的N末端部分(168个氨基酸)或C末端部分(122个氨基酸)，用TY89的相应部分交换。当这些镶嵌A节段质粒(pHB36-s2VP3N或pHB36-s2VP3C)与pHB-34Z(CEF94 B节段)组合转染时，我们获得镶嵌IBDV(mCEF94-s2VP3N，或mCEF94-s2VP3C)，其在QM5细胞中的复制能力与rCEF94 IBDV的复制能力相同(mCEF94-s2VP3C)或略低(mCEF94-s2VP3N)(数据未示出)。
接着我们在QM5感染的细胞上，用IPMA检测一些单克隆抗体对mCEF94-s2VP3N和mCEF94-s2VP3C病毒的识别情况(表5)。特异于血清型II的VP3的Mab T75也识别mCEF94-s2VP3C，而识别mCEF94-s2VP3N的能力略低。特异于血清型I的VP3的Mab B10，不识别rCEF94-s2VP3C，但其仍识别mCEF94-s2VP3N。另一种与mCEF94-s2VP3感染的细胞不反应的Mab(C3)，与mCEF94-s2VP3C感染的细胞反应，尽管此反应与用rCEF94感染的QM5细胞反应相比降低(表5)。识别VP2的血清型I特异性中和抗体Mab1.4如所期望的识别mCEF94-s2VP3N和mCEF94-s2VP3C。
血清型II VP3的C末端部分(122个氨基酸)的编码序列也用于置换D6948的cDNA相应部分。在交换期间，我们用CEF94的相应序列置换了一些D6948 cDNA序列(编码VP4的C末端部分，和VP3的N末端部分和3’-UTR)(见图5g)。将所得质粒(pHB60-s2VP3C1)与pHB-55(B节段D6948)一起，转染入FPT7感染的QM5细胞中。在24小时后收集这些转染的QM5细胞的上清，并移至含胚卵和原始囊细胞中。通过使用单克隆抗体，我们能在原始囊衍生的细胞单层中检测到感染的细胞(见表5)。mD6948-s2VP3C1和mCEF94-s2VP3C与单克隆抗体的反应模式相同。分离株mD6948-s2VP3C1(1000 ELD50/鸡)也用于感染10只SPF鸡(21天龄)，以评价其毒力。与D6948，rD6948和srIBDV-DACB分离株相反，此mIBDV分离株在9天期间不引起任何死亡率(表6)。然而，此mIBDV严重损害囊，此组的腔上囊重-体重比值与在接受D6948或rD6948的组中发现的相同。这表明mD6948-s2VP3C1在腔上囊中仍然能复制和诱导细胞程序死亡。
实施例1传染性腔上囊病病毒(IBDV)是一种商购鸡群中发生的最严重的和广泛传播的传染性疾病的致病因子。IBDV导致腔上囊中淋巴细胞损耗，诱导免疫抑制，发病，或甚至急性死亡。因为通用的活IBDV疫苗是衍生自野外分离株，在野外分离株和活疫苗之间不能进行血清学区分。近年来针对IBDV研制的反向遗传技术使人们可产生遗传修饰的IBDV，其生物学和抗原性性质可改变。在此，我们阐述了拯救镶嵌血清型I IBDV的方法，其中多蛋白编码区部分由血清型II毒株的相应区域部分置换。一种含有血清型II VP3的C末端部分的镶嵌病毒，与未修饰的血清型I病毒相比示出子代病毒的释放略延迟，而在感染25小时后的最大病毒效价相同。由于血清型特异性表位存在于VP3的C末端部分，我们能将此拯救的病毒与血清型I和II IBDV毒株区分。这些发现可有希望使用嵌合VP3研制IBDV标记疫苗。
传染性腔上囊病病毒(IBDV)，双RNA病毒科的一个成员，是鸡的高度传染性疾病的致病因子。这种疾病也已知根据发生地称为Gumboro，在该地报道了IBDV的第一次爆发(Cosgrove，1962)。双链RNA(dsRNA)基因组可分为两个节段(Dobos等，1979)，其包装在衣壳中，由两个病毒蛋白组成(VP2和VP3)。所得单壳裸病毒颗粒直径为60nm，二十面体对称(T＝13)(Bottcher等，1997)。
最大的dsRNA节段(A节段，3260bp)含有两个部分重叠的开放读框(ORF)。首先，最小的ORF编码非结构性病毒蛋白VP5(145-149个氨基酸，17kDa)。第二个ORF编码一种多蛋白(1012个氨基酸，110kDa)，其通过VP4的自动催化活性，迅速裂解为三个蛋白pVP2(48kDa)，VP4(29kDa)和VP3(33kDa)，在体内(Dobos等，1979)和体外(Hudson等，1986)均可进行。在病毒成熟期间，pVP2进一步加工为VP2(41-38kDa)，可能通过宿主细胞编码的蛋白酶位点特异性裂解pVP2而得(Kibenge等，1997)。B节段(2827bp)含有一个大ORF，编码VP1(877-881个氨基酸，91kDa)。此RNA依赖型RNA聚合酶也是结构性蛋白，因为它是在病毒颗粒内发现的，其作为游离蛋白，也共价连接于基因组RNA链的5’末端(基因组连接的蛋白，VPg)(Dobos，1993；Spies和Muller，1990)。
已经阐述了两种不同血清型的IBDV(血清型I和血清型II)(McFerran等，1980)。野生型血清型I IBVD毒株对腔上囊中的发育淋巴细胞具有特异的嗜性。血清型I病毒亚分为经典毒株，抗原性变体毒株和极烈性毒株。抗原性变体IBDV毒株只在美国有报道(自1985年(Snyder，1990))，并发现具有不同致病性表型。这些抗原性变体呈现在VP2蛋白的特异性区域(高变区)中具有单氨基酸改变，这可能与表型的不同有关。自1988年，已经阐述了毒力增强的欧洲IBDV分离株(极烈性IBDV，vvIBDV)，而抗原性结构与经典分离株相同(Chettle，Stuart，和Wyeth，1989)。尽管在经典和极烈性IBDV毒株之间的大多数核苷酸差异发现在B节段，但我们近来示出与vvIBDV毒株毒力增强相关的决定簇位于A节段。
与血清型I毒株不同，野生型血清型II毒株对B淋巴细胞没有特异性嗜性。血清型II毒株天然地能在不同组织中复制，甚至能在细胞系上繁殖。血清型II毒株通常回收自火鸡，其对火鸡(Jackwood等，1984)或鸡(Ismail，Saif，和Moorhead，1988)没有致病性。依赖构象的中和表位在血清型I和II毒株的衣壳蛋白VP2的高变区内发现。除了VP2，病毒颗粒含有另一种丰富的衣壳表位VP3。尽管在接种和感染后均发现抗线性VP3表位的快速免疫应答，但此蛋白质不含有病毒中和表位(Fahey，IJ，和Bagust，1985)。现已示出血清型I和II毒株的VP3中存在的一些表位由相同的单克隆抗体识别(组特异性表位)，而其它VP3表位是血清型特异性的(Mahardika和Becht，1995；Oppling，Muller，和Brecht，1991；Reddy，Silim，和Ratcliffe，1992)。
区分活的血清型I IBDV疫苗和在野外爆发期间收集的野外分离株，是困难及艰苦的，因为需确定分离株的遗传结构。通常对A节段dsRNA进行RT-PCR，随后进行序列分析(Eterradossi等，1999)或RFLP(Jackwood和Sommer，1999)。在探索通过血清学实验可易于从IBDV野外分离株中区分IBDV疫苗的研究中，我们设计改变血清型I IBDV毒株的抗原性结构。在最近几年中关于从克隆的cDNA中拯救IBDV的一些报道已经公布(Boot等，1999；Lim等，1999；Mundt和Vakharia，1996)。使用我们的反向遗传系统，我们已示出能从衍生自不同毒株(即经典适应的和极烈性毒株)的dsRNA的A节段的cDNA克隆中产生病毒。在此报道中，我们阐述了拯救镶嵌IBDV的方法，其中血清型I毒株(CEF94)的VP3(部分)被血清型II毒株(TY89)的相应部分置换。另外，通过使用一系列血清型特异性单克隆抗体，我们示出能从血清型I和II IBDV毒株中区分两个拯救的镶嵌IBDV。方法病毒，细胞和抗体经典IBDV血清型I毒株CEF94是一种已经在细胞培养物上适应生长的PV1的衍生物。(Boot等，1999；Petek，D’Aprile和Cancellotti，1973)。IBDV毒株TY89是原型血清型II IBDV毒株(McFerran等，1980)，并可在细胞系上自然生长。含有T7聚合酶基因的重组禽痘病毒(FPV-T7)(Britton等，1996)得自M.Skinner实验室(Compton实验室，Berks，United Kingdom)。将对TY89和CEF94和对FPV-T7易感的QM5细胞，在37℃在CO2(5％)温箱中，生长于补加5％小牛血清(FCS)和2％抗生素溶液ABII(1000U/ml青霉素，1000mg/ml链霉素，20mg/ml两性霉素B，500mg/ml多粘菌素B，和10mg/ml卡那霉素)的QT35培养基上。抗VP3/4的多克隆抗血清是通过用纯化的蛋白质注射兔而产生的，纯化的蛋白质源自用含有CEF94多蛋白的722-1018位氨基酸的表达质粒转化的细菌。单克隆抗体IV，VII(Mahardika和Becht，1995)，和I/G4(Oppling，Muller，和Brecht，1991)由Leipzing大学(德国)Dr.Muller惠赠。Mab17/80(Azad等，1986)由Fort Dodge(CastleHill，澳大利亚)的Dr.Lehrbach惠赠。单克隆抗体1.4，9.7和9.8是在我们的实验室中通过标准方法，和用纯化的血清型I(CEF94)IBDV作抗原制备的。
产生和克隆IBDVcDNA序列先前已经阐述了产生基于pUC19的含有CEF94的两个基因组dsRNA节段的全长cDNA的质粒。在这些质粒中的cDNA位于T7启动子序列之前，后接反原基因组丁型肝炎病毒核酶(Been，Perrotta，和Rosenstein，1992)和T7终止子序列。通过在TY89的dsDNA上进行RT-PCR而克隆血清型II毒株TY89的完整VP3编码部分。用引物ANC1(GGGGACCCGCGAACGG)进行逆转录。用引物RTAM(AATTGGTGTCCACACCTG)和RTAP(ATACAGGACCTAACTGGG)，和35次扩增循环(退火温度52℃，Taq聚合酶)，进行3次独立的PCR。将所得片段(956bp)分别克隆入pGEM-T Easy载体(Promega)中。核苷酸序列是用特异性引物在循环测序反应(BigDye终止子试剂盒，PE应用生物系统)和ABI310 DNA测序仪(PE应用生物系统)中，在两个链上进行确定的。确定TY89的VP3 cDNA的共有核苷酸序列，并推导氨基酸序列(图6)。克隆pSV-VP3-TY89(1)含有共有序列，并用于产生镶嵌A节段cDNA克隆(如下)。
构建镶嵌A节段质粒pHB36-s2VP3为在CEF94的全长A节段克隆中，用TY89的VP3置换CEF94的VP3，我们通过PCR扩增TY89 VP3编码部分，使用引物HY3P(AACGTTTTCCTCACAATCCgCGgGACTGGG，非杂交核苷酸以小写字母示出)，退火温度58℃，Pwo聚合酶，30次循环。将此PCR片段(893bp)用SacI(2316)和KpnI(nt3172)消化，产生一个856bp的片段，该片段经过琼脂糖凝胶纯化(Qiaex凝胶提取试剂盒，Qiagen)。将此片段随后用于置换质粒pHB36-vvVP3的相应部分，所述质粒已经用SacII(nt2316)和KpnI(nt3172)消化。在将该PCR片段连接于载体中之后(快速连接试剂盒，Roche分子生物化学公司)，用此混合物转化大肠杆菌DH5α细胞。对得自一些独立的菌落的质粒进行分析，并选择通过测序分析确定具有所述序列的一个质粒(pHB36-s2VP3，见图7)。
构建镶嵌VP3 cDNA为置换血清型IVP3的N末端部分，我们使用上述相同PCR(pHB36-s2VP3)，只是这次使用pHB-36W(A节段CEF94)作模板，产生编码CEF94的VP3序列的PCR片段。将此PCR片段用ScaI(nt2799)和KpnI(nt3172)消化，产生一个373bp的片段。将经琼脂糖凝胶纯化的该片段随后用于置换已用ScaI(nt2799)和KpnI(nt3172)部分消化的pHB36-s2VP3的相应部分，产生pHB36-s2VP3N(见表9)。
为置换血清型IVP3的C末端部分，我们使用与产生pHB36-s2VP3N相同的方法，只是这次在PCR中使用TY89 cDNA作模板，及使用pHB-36W作373bpPCR片段的受体，产生pHB36-s2VP3C(见表9)。
蛋白质分析为进行Western印迹，我们从感染的QM5细胞中通过前述差异离心方法纯化CEF94和TY89 IBDV(Boot等，1999)。将病毒蛋白在12％SDS-PAGE凝胶中分离，并印迹于硝酸纤维素上(ProteanBA85，Schleicher和Schuell)。为检测VP3，我们使用ECL检测方法(Amersham)，使用一种VP3特异性单克隆抗体，及用过氧化氢酶缀合的兔抗小鼠血清(Dako)作为第二抗体。
为进行体外转录和翻译，我们在存在35S-甲硫氨酸的2.5mlTnT-T7Quick反应(Promega)中，使用含有全长A或B节段的环形质粒(0.4ug)(见图7)。将所得病毒蛋白直接分离或在SDS-PAGE凝胶(12％)中免疫沉淀后分离，并通过放射自显影检测。为免疫沉淀在体外产生的蛋白质，我们使用多克隆(PaVP3/4)或单克隆抗体，所述单克隆抗体抗血清型IIBDV(Mab IVSI)或血清型II(MabVIISII)的VP3。在所有温育和冲洗步骤期间使用RIPA缓冲液(Sambrook，Fritrsch，和Maniatis，1989)。通过加入蛋白A琼脂糖CL-4B(AmershamParmacia，Sweden)，及进行3次冲洗步骤，从混合物中纯化抗原-抗体复合物。
感染和转染QM5细胞将QM5细胞在35mm培养皿中生长至80％铺满，并用FPV-T7感染(moi.＝3)。在1小时之后，将细胞用3ml的QT-35培养基冲洗两次，并用3ml Optimem 1(Gibco/BRL)覆盖。同时，将DNA(1.0ug)与12.5ul LipofectAMINE(Gibco/BRL)在250ul Optimem 1中混合，并在室温下保持至少30分钟。接着将QM5细胞用2ml新鲜Optimem 1覆盖，并加入DNA/LipofectAMINE混合物。在温育过夜后(18小时，在37℃在5.0％CO2中)，将转染的单层用PBS漂洗一次，加入新鲜的QM5培养基(补加5％FCS和2％ABII)，并将平板在37℃进一步温育(5.0％CO2)。在温育24小时后，将平板冻/融一次，将上清用200nm滤膜过滤(Acrodisc，GelmanSciences)以除去禽痘病毒(FPV-T7)和细胞碎片。将澄清的上清贮存在-70℃或直接用于检测rIBDV，通过用部分澄清的转染上清接种接近铺满单层的QM5细胞进行检测。在24或48小时后，在免疫过氧化物酶单层分析(IPMA)中，使用多克隆VP3/4或单克隆VP3特异性抗体作为第一抗体，辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔或抗小鼠抗体作为第二抗体，显示IBDV特异性蛋白质。
最大效价和单步生长曲线为确定最大病毒效价，我们使用初始拯救的病毒感染新鲜QM5细胞。将细胞在完全培养基(37℃，5.0％CO2)中温育5天(或直至可见完全CPE)，冻-融1次，及通过200nm滤膜(Acrodisc)过滤。将此步骤重复3次(3次连续传代)。确定在最后过滤后IBDV的数量(TCID50)，通过用10倍稀释的IBDV样品感染含有接近铺满的QM5细胞的96孔组织培养平板而进行确定。将此96孔平板温育48小时，并通过IPMA检测其中存在IBDV抗原的孔。
为对比mCEF94-s2VP3C与未修饰的血清型I IBDV的复制能力，我们确定了rCEF94和mCEF94-s2VP3C的单步生长曲线。将QM5细胞(2×106)在60mm细胞培养皿中生长过夜(16小时)。接着除去此培养基，并用1ml含有IBDV(TCID50＝7.0)的PBS覆盖细胞。在1小时后，除去上清，将细胞用8ml PBS漂洗4次，加入5ml完全培养基。在不同时间点(在感染后1小时，5小时，10小时，15小时，25小时和50小时)，从上清中取样品并贮存于-20℃。在IPMA中确定每个样品的病毒效价(TCID50)(如上述)。进行两次(mCEF94-s2VP3C)或三次(rCEF94)非依赖型生长曲线，并确定在每个时间点效价之间的标准差。结果克隆和分析血清型II毒株的VP3编码区为构建含有血清型II的VP3蛋白的血清型I重组IBDV病毒，我们克隆了血清型II毒株的相应cDNA。首先，我们尝试克隆TY89的全长A和B节段cDNA，TY89是原型血清型II IBDV毒株(McFerran等，1980)。为产生这些cDNA，我们使用用于克隆血清型I毒株的A节段的全长RT-PCR方法。尽管我们在克隆TY89的全长B节段cDNA中重复成功(数据未示出)，但用此方法不能获得A节段的全长cDNA。因此，我们只扩增TY89 A节段的VP3编码部分。通过3次独立实验获得一个含有TY89的VP3的RT-PCR片段，并将其克隆入pGEM-T Easy载体中。确定此部分TY89基因组的共有序列，并将推导的氨基酸序列与CEF94的相应序列对比，CEF94是一种细胞培养适应的血清型I毒株(图6)。编码TY89 VP3的cDNA接着用于产生镶嵌A节段cDNA质粒，其编码TY89的完整VP3(pHB36-s2VP3)或N末端部分(101个氨基酸，pHB36-s2VP3N)，或C末端部分(155个氨基酸，pHB36-s2VP3C)，(图7)。
在证实所得质粒具有正确的序列后，将它们在体外转录/翻译反应中用作模板，随后进行SDS-PAGE和放射自显影分析(图8a)。在所有情况中均存在通过多蛋白自动催化裂解产生的三个蛋白，pVP2，VP3和VP4。发现衍生自质粒pHB36-s2VP3和pHB36-s2VP3N的VP3蛋白在SDS-PAGE中的位置，比衍生自pHB-36W和pHB36-s2VP3C的VP3蛋白的位置高。在Western印迹分析中，也发现在得自纯化的CEF94和TY89病毒的病毒VP3之间，在SDS-PAGE期间的迁移不同(图8b)。这表明在来自镶嵌全长A节段质粒的VP3的迁移中所观测的不同不是实验假象，是由于VP3的N末端部分中氨基酸不同所致。
在pHB-36W-s2VP3和pHB36W-s2VP3N的病毒蛋白酶(VP4)中存在3个氨基酸变化(图6)，这是由于假设的多蛋白的裂解位点(Hudson等，1986)似乎不是如最近示出的真正裂解位点(Sanchez和Rodriguez，1999)。这些不同在SDS-PAGE分析中不明显改变VP4的迁移行为，因为发现此VP4与血清型I VP4的位置相同(图8a)。
在VP3上定位血清型特异性表位由非中和抗体识别的优势免疫表位位于VP3上。一些研究人员已经报道这些表位中至少一个是血清型特异性的(Mahardika和Becht，1995；Oppling，Muller，和Brecht，1991；Reddy，Silim，和Ratcliffe，1992)。为定位血清型特异性表位的位置，及确定其区分拯救自镶嵌A节段cDNA的病毒的用途，我们对体外翻译的和35S-Met标记的VP3蛋白进行了放射免疫沉淀(RIP)，在RIP中使用多克隆(PaVP3/4)或单克隆(Mab IVSI或Mab VIISII)抗体，我们通过SDS-PAGE，随后通过放射自显影分析沉淀的蛋白(图8c)。如由高水平的同源性所预期的，衍生自血清型I和II的VP3通过多克隆PaVP3/4血清沉淀。然而，单克隆抗体IVSI只沉淀含有血清型IVP3的C末端部分的VP3，而Mab VIISII只沉淀含有血清型II VP3的C末端部分的VP3。这些结果表明血清型特异性表位存在于VP3的C末端的155个氨基酸中。
拯救镶嵌IBDV将全长镶嵌A节段cDNA质粒用于拯救镶嵌IBDV(mIBDV)，通过将这些质粒和一个含有CEF94的B节段cDNA的质粒(pHB-52，(Boot等，1999))，共转染入QM5细胞中进行。为通过使用T7启动子指导病毒DNA合成，我们用携带T7聚合酶基因的重组禽痘病毒在转染之前感染QM5细胞(FPV-T7，moi＝3)。在转染24小时后在IPMA中测试多蛋白的表达，并发现在所有使用的A节段质粒中此表达均相似(大约30％的细胞表达的IBDV抗原，数据未示出)。将转染的QM5细胞的澄清上清，使用新鲜的QM5细胞用于确定IBDV效价。尽管在转染后病毒蛋白的表达水平相似，所得TCID50有较大不同(表10)。回收具有血清型II VP3的C末端部分的镶嵌病毒与回收野生型的效率相同(平均TCID50＝4.8及5.1)。然而，从质粒pHB36-s2VP3中回收镶嵌病毒的效率与未修饰的rCEF94(平均TCID50＝5.1)相比明显降低(平均TCID50＝1.1)。从质粒pHB36-s2VP3N(平均TCID50＝3.1)中拯救镶嵌病毒发现同样结果，在拯救后其效价大约比未修饰的rCEF94低100倍(表10)。
复制镶嵌IBDV为确定交换多蛋白的一部分对复制的作用，我们确定了在3次连续传代后每个病毒的最大效价。尽管在VP4中含有3个氨基酸变化并组合血清型II VP3的镶嵌病毒在3次连续传代后示出病毒效价提高，但所得TCID50的最大值(6.0)比未修饰的rCEF94和含有血清型II VP3的C末端部分的镶嵌病毒大约低10倍(表10)。为评价用相同效率拯救的rCEF94和mCEF94-s2VP3C在细胞培养中是否具有相同复制动力学，我们用QM5细胞对这两个病毒进行单步生长曲线。尽管在感染后(p.i.)25小时所得最大效价是相同的，但在mCEF94-s2VP3C中的病毒释放比在未修饰的rCEF94中延迟(图9)。在用未修饰的rCEF94感染后第一个病毒释放是在感染后10小时，而在此时间点用mCEF94-s2VP3C感染未发现有病毒释放。
在用镶嵌CEF94病毒感染后检测抗原在拯救镶嵌IBDV后，我们通过使用一系列VP3特异性单克隆抗体评定区分这些IBDV的可能性。将新鲜QM5细胞用拯救的病毒rCEF94，mCEF94-s2VP3，mCEF94-s2VP3N，mCEF94-s2VP3C感染，在感染后48小时通过使用IBDV特异性单克隆抗体检测病毒抗原。当使用血清型I特异性中和VP2抗体(1.4或9.8，见表11)，或非中和非血清型特异性VP3抗体(9.7或17/80，见表11)时，将源自所有四种不同的拯救病毒的病毒抗原在感染的QM5细胞中检测。另一方面，血清型特异性的VP3单克隆抗体与4种拯救的病毒不同地反应。血清型I特异性抗体(IVSI或I/G4SI，见图10)只与rCEF94和mCEF94-s2VP3N反应，而血清型II特异性抗体(VIISII，见图10)只与mCEF94-s2VP3和mCEF94-s2VP3C反应。当在RIP中对在体外合成的IBDV蛋白进行测试(图8c)，和通过IPMA对感染的QM5单层细胞进行测试时，所用的单克隆抗体的反应模式是相同的。
用所谓的缺失(或标记)疫苗接种已经示出是控制和根除一些动物的病毒性疾病的有利手段(Oirschot，1999)。这些疫苗是基于缺失非必需的结构蛋白的活(减毒的)毒株可血清学区分接种的和野外病毒感染的动物。血清学区分用活IBDV疫苗毒株接种的鸡和用野生型IBDV野外分离株感染的鸡目前是不可能的，因为所有活的IBDV疫苗直接衍生自IBDV野外分离株，或从IBDV野外分离株中经连续传代后产生的。IBDV是一种没有包膜的病毒，只含有均是必需的3个结构蛋白(VP1，VP2和VP3)。因为剔除IBDV的结构蛋白之一是不可行的，我们使用另一种方法导入血清学标记。代替缺失病毒蛋白的是，我们将部分结构蛋白用血清型II蛋白的相应部分交换。
一些IBDV血清型特异性性质，如中和表位和受体识别位于VP2的高变区内。在VP2的血清型特异性性质中的这一差异，通过VP2内存在的高变区的一级序列的差异而反映。两个血清型的VP2高变区之间的相同性仅为67％，而VP2的剩余部分的相同性为93％。其它病毒蛋白也具有90％以上的相同性(VP1＝99％，VP3＝95％，VP4＝92％)，除了VP5的相同性仅为80％。病毒蛋白3，与VP2类似，是病毒衣壳的一种主要成分。基于VP3具有碱性C末端尾，其能与包装的dsRNA相互作用，因此已经有VP3组成了病毒颗粒的内部部分的提示(Bottcher等，1997)。此假设由VP2而非VP3参与受体识别得以进一步支持，这意味着至少一部分VP2需存在于病毒颗粒的表面。另外，中和抗体只通过VP2而非VP3激发，这也表明VP2暴露于表面。由于已知VP3没有血清型特异性性质，及至少一种线性的血清型特异性非中和表位存在于此蛋白质中(见导论章节)，使(部分)VP3的交换在我们看来是研制IBDV标记疫苗的最有前途的途径。
首先，将TY89的VP3编码cDNA通过RT-PCR克隆，并确定其核苷酸序列(见图6中推导的TY89的氨基酸序列)。随后将此cDNA用于产生镶嵌全长A节段cDNA质粒(见图7)。在体外转录/翻译组合反应中，在存在35S标记的甲硫氨酸的情况下，分析这些全长质粒产生病毒蛋白的情况。VP4自动催化性裂解多蛋白不受VP3(部分)交换的影响。在质粒pHB36-s2VP3和pHB36-s2VP3N中的多蛋白VP4-VP3裂解位点之前的血清型IVP4的3个氨基酸交换，也不影响自动催化性。另一方面，源自血清型I或血清型II cDNA的体外合成的VP3，在SDS-PAGE中的迁移明显不同，(见图8a)。尽管这些蛋白质的预计大小是相似的(28.8kDa)，但发现纯化的TY89和CEF94的VP3电泳迁移率存在同样的差异(图8b)。其它人也注意到，在衍生自血清型I和II IBDV的VP3之间迁移率也存在相同差异(Oppling，Muller，和Brecht，1991；；Reddy，Silim，和Ratcliffe，1992)。另外，我们在纯化的CEF94和TY89的Western印迹分析中，观测到两个VP3条带(VP3a和VP3b)(图8b)。还不清楚这两个VP3条带是否均代表功能蛋白，或较小的条带(VP3b)是否是较大条带(VP3a)的特异降解产物。我们观测到扩增的CEF94的细胞培养物中存在两个VP3条带，先前Fahey等(Fahey，Emy和Crooks，1989)在澳大利亚IBDV分离株002/73中观测到相似结果，针对IPNV也已经报道了存在两个VP3条带(Dobos，1977)。
在体外对由全长的A节段编码的病毒蛋白定性后，我们接着使用这些质粒拯救镶嵌IBDV。将编码野生型血清型I多蛋白的质粒(pHB-36W)，和编码嵌合多蛋白的3个质粒(pHB36-s2VP3，pHB36-s2VP3N和pHB36-s2VP3C)，均与血清型IB节段质粒(pHB-52)共转染。我们发现用全长镶嵌A节段质粒的所有转染均导致感染性IBDV出现。然而携带完整血清型II VP3或其N末端部分并在VP4中有3个氨基酸突变镶嵌病毒的拯救效价，低于未修饰的rCEF94或含有血清型II VP3的C末端部分的mCEF94的拯救效价。拯救效率的差异与在3次连续传代后获得的最大TCID50值相关(表10)。只在VP3 N末端部分中导入5个氨基酸差异，或组合在VP4中导入3个氨基酸差异，可明显降低复制效率。基于多蛋白裂解不受VP4中氨基酸改变的影响，及血清型II VP3在SDS-PAGE分析中的不同表现，我们认为所观测的mCEF94-s2VP3和pHB36-s2VP3N的复制效率降低主要是由于VP3的N末端部分的不同折叠所致。
第一个关于潜在的IBDV标记疫苗病毒的报道涉及的是减毒的细胞培养适应的rD78疫苗株的一种VP5剔除突变体(Mundt，Kollner，和Kretzschmar，1997；Yao，Goodwin，和Vakharia，1998)。尽管去掉VP5的rIBDV产生良好的血清学标记，但其作为疫苗的效力还未证实。去掉VP5的rIBDV的复制在体外和体内均受到严重影响。Mundt等，(Mundt，Kollner，和Kretzschmar，1997)报道了去掉VP5的rD78其病毒释放明显降低(在p.i.24小时后，在单步生长曲线中，效价降低＞200倍)，而Yao等(Yao，Goodwin，和Vakharia，1998)报道了与未修饰的rD78相比，CEF细胞的病毒产量明显降低，及存活率更高(在p.i.8天后，多步生长曲线)。尽管mCEF94-s2VP3C的病毒释放轻度延迟(图9)，在细胞培养物中的复制比VP5剔除的突变体的复制所受到的影响更小。发现mCEF94-s2VP3C病毒复制与未修饰的血清型I毒株几乎一样有效，可将此病毒与血清型I和II野生型野外分离株区分，因此使用血清型II VP3的C末端部分是研制IBDV标记疫苗的极具前途的途径。实施例2交换VP3的C末端部分产生减毒的极烈性IBDV疫苗株，其在鸡体内诱导独特的血清学应答在此实施例中，我们阐述了将编码极烈性IBDV分离株(D6948)的VP3的C末端部分的cDNA，用血清型II(TY89)的cDNA的相应部分置换。在转染QM5细胞及将转染上清在原始囊细胞或含胚卵中传代后，可拯救含有血清型II C末端部分的VP3的重组病毒。用这种修饰的vvIBDV(mD6948-s2VP3C3)感染SPF鸡，示出与未修饰的极烈性IBDV相比，其毒力明显降低。正如所期望的，我们发现血清型I了IBDV毒株的独特囊嗜性不受导入血清型II VP3 C末端部分的影响。使18天龄的broiler型小鸡口服mD6948-s2VP3C3示出，尽管存在低，中等，或高水平的母体产生的中和IBDV抗体，但此病毒能感染鸡。
另外我们示出用修饰的病毒攻击鸡产生的抗体应答，通过使用竞争性ELISA实验可与未修饰的病毒产生的应答区分。由于修饰的极烈性D6948分离株具有明显降低的毒力，及可将用mD6948-s2VP3C3感染的鸡与用野生型(极烈性)IBDV野外病毒感染的鸡区分，因此此镶嵌IBDV分离株是IBDV标记疫苗的一个有价值的候选者。导论传染性腔上囊病病毒(IBDV)是鸡群中一种高度传染性疾病(Gumboro病)的致病因子(Cosgrove，1962)。IBDV是双RNA科病毒的一个成员，具有分为两个节段的双链RNA(dsRNA)(Dobos等，1979)。最大的dsRNA(A节段，大约3260bp)含有两个部分重叠的开放读框(ORF)。第一个最小的ORF编码非结构病毒蛋白5(VP5，145-149个氨基酸，17kDa)。第二个ORF编码一个多蛋白(1012的氨基酸，110kDa)，该多蛋白可自动催化裂解产生病毒蛋白pVP2(也称为VPX，48kDa)，VP4(29kDa)，和VP3(33kDa)。在体内病毒成熟期间，pVP2被加工为VP2(41-38kDa)，可能是由于通过宿主细胞编码的蛋白酶对pVP2进行位点特异性裂解而得。较小的B节段(大约2827kDa)含有一个大ORF，编码VP1(877-881个氨基酸，91kDa)。病毒蛋白1是RNA依赖型RNA聚合酶，共价连于基因组RNA节段的5’末端(病毒蛋白基因组连接的，VPg)(Dobos，1993)。在多蛋白(VP2-VP4-VP3)的体内表达中，已经产生病毒类颗粒构型，由VP2和VP3组成，与成熟毒粒具有相同直径(60nm)。这表明游离VP1和病毒dsRNA均不是形成病毒衣壳所必需的(Fernandez-Arias等，1998)。
已经阐述了两个不同血清型的IBDV(血清型I和II)(McFerran等，1980)。致病性野生型血清型I IBDV分离株，对腔上囊中的淋巴细胞有特异嗜性。血清型I分离株基本分为经典型，抗原性变体，和极烈性分离株。抗原性变体IBDV分离株在VP2蛋白的特异区域(高变区)中有一个氨基酸改变，导致蛋白质抗原性部分改变(Snyder，1990)。首先在欧洲分离的极烈性IBDV分离株与经典毒株具有相同的抗原性结构，但毒力增强(Chettle，Stuart，和Wyeth，1989)。vvIBDV和经典IBDV分离株的病毒蛋白之间氨基酸的不同分散在所有病毒蛋白之中，尽管其中大多数发现在VP2的高变区内(Brown和Skinner，1996)。VP2中的特异突变使细胞嗜性(Mundt，1999)和减毒(Yamaguchi等，1996c)均发生变化。尽管VP2是毒力的关键因子，我们最近示出VP2不是极烈性表型的唯一决定簇。
与血清型I分离株不同，野生型血清型II分离株不具有特异性B淋巴细胞嗜性。血清型II分离株天然能在禽类不同组织中复制，且甚至能在细胞系上增殖。血清型II分离株通常可回收自火鸡，且对火鸡(Jackwood等，1984)和鸡(Ismail，Saif，和Moorhead，1988)均没有致病性。血清型I和II分离株的构象依赖型中和病毒表位在衣壳蛋白VP2上存在。另一种丰富的病毒衣壳蛋白(VP3)不含有中和病毒表位，尽管在接种和感染后均发现抗线性VP3表位的快速免疫应答(Fahey，IJ，和Bagust，1985)。VP3的血清型特异性和非血清型特异性表位均已经阐述(Mahardika和Becht，1995；Oppling，Muller，和Brecht，1991；Yamaguchi等，1996a)。
生产IBDV疫苗的常规方式是将野生型病毒在鸡胚或用原代鸡胚细胞培养的细胞，或源自禽或哺乳动物的细胞系中适应性增殖。野生型IBDV的适应性通常与毒力降低(减毒)相关(Yamaguchi等，1996b；Yehuda等，1999)。区分所用的活IBDV疫苗和在野外爆发期间回收的野外IBDV分离株通常较困难及费力，因为需确定IBDV分离株的遗传结构。在探求可易于从IBDV野外分离株中区分的IBDV疫苗中，我们最近将减毒的IBDV(CEF94)分离株的完整VP3蛋白或其N或C末端部分，用血清型II(TY89)分离株的相应部分置换。对拯救的重组血清型I IBDV进行分析示出，含有血清型II VP3的C末端部分的病毒，当在细胞培养物中增殖时，病毒释放略降低，而最终效价与未修饰的血清型I IBDV相同。其中全部VP3或其N末端部分被置换的镶嵌病毒，与未修饰的CEF94相比产量降低(最终效价低10倍)，表明复制中的干扰更严重。材料和方法病毒，细胞和抗体经典IBDV分离株CEF94是PV1的衍生物(意大利，1973(Petek，D’Aprile，和Cancellotti，1973))，其能在非B淋巴细胞上复制(Boot等，1999)。D6948毒株是一种极烈性野外分离株(家禽健康服务机构，荷兰，1989)，其只能在B淋巴细胞上生长。含有T7聚合酶基因(Britton等，1996)的重组禽痘病毒(FP-T7)是由M.Skinner惠赠的(Compton实验室，Berks，United Kingdom)。QM5细胞(一种鹌鹑细胞系(Antin和Ordahl，1991)通过使用补加5％胎牛血清(FCS)和2％抗生素溶液的QT35培养基(QT35FA培养基)(Gibco-BRL)维持。原始囊细胞分离自14天龄SPF胚，并维持在补加15％FCS，0.125％乳白蛋白水解产物，和1000U/ml青霉素和1mg/ml链霉素的Eagle’s改进的极限必需基本培养基(EMEM)中。VP3特异性单克隆抗体B10A，IV，VII(Mahardika和Becht，1995)和I/G34(Oppling，Muller，和Brecht，1991)是由Dr.Muller惠赠的(Leipzing大学，德国)，而VP3单克隆抗体9.7是在我们的实验室中制备的。
构建嵌合VP3 cDNA；先前已经阐述了杂种CEF94和TY89质粒的构建。为构建质粒pHB60-s2VP3N，我们产生了5个不同的PCR片段。在所有PCR中，在20次反应循环中我们使用Pwo聚合酶。PCR-1N是使用pHB-60作模板及引物AC3(GGTAGCCACATGTGACAG)和HY3MR(CCAGTCCCGC GGATTGTGAGG)，在56℃产生的，产生一个1614bp的片段(nt731-2346)。PCR-2N是用pHB36-s2VPN作模板及引物HY3P(AACGTTTTCCTCACAATCCGCGGGACTGGG)和M13F-17(GTAAAACGACGGCCAGT)，在56℃产生的，产生一个1251bp的片段(nt2318-3566)。PCR-3N是用凝胶纯化的PCR-1N和PCR-2N片段作模板及引物AC4(ACCCAGCCAA TCACATCC)和AGTM(GAGACTCCCAGGTACCTCACTC)，在54℃产生的，产生一个2151bp的片段(nt1057-3208)，接着将其用ScaI消化，产生PCR-3sN(nt2799)。PCR-4N是用pHB-60作模板及引物AC9(CTCAAAGAAGATGGAGACC)和M13F-24(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)，在54℃产生的，产生一个869bp的片段(nt 2727-3593)。PCR-5是用凝胶纯化的PCR-3sN和PCR-4片段作模板及引物AC5(AAGGCCTTCATGGAGGTGGCCG)和M13F-17(GTAAAACGACGGCCAGT)，在54℃产生的，产生一个2143bp的片段(nt 1423-3566)，接着将其用XhoI和XbaI消化，产生1889bp的PCR-5xxN片段(nt 1606-3495)。接着将PCR-5xxN片段用于置换pHB-60的相应部分，使用快速DNA连接试剂盒，及转化大肠杆菌细胞。确定选择的质粒克隆pHB60-s2VP3N的DNA序列(ntl600-3325)，并表现为具有图1所示的镶嵌D6948-TY89 cDNA序列。
为构建pHB60-s2VP3C3，我们首先使用单一的SacII(1670)和XbaI(3495)位点，将一个1735bp的pHB36-s2VP3C片段移至pHB-60中，产生pHB60-s2VP3C1。接着将CEF94的3’UTR区用D6948的相应cDNA序列置换。使用引物AGTP(CTTGAGTGAGGTACCTGGGAG)和M13F-17(GTAAAACGAC GGCCAGT)，用pHB-60作模板，杂交温度52℃，Pwo聚合酶，和20次反应循环，产生一个PCR片段(385bp，nt3184-3566)。将此PCR片段纯化，用KpnI和XbaI消化。将所得片段(315bp，nt3198-3519)经凝胶纯化，并用于置换pHB60-s2VP3Cl(用KpnI和XbaI消化)的相应部分，使用快速连接和转化大肠杆菌细胞，产生pHB60-s2VP3C2。接着，使用引物AC5(AAGGCCTTCA TGGAGGTGGC CG)和vvVP3CM(GAGAAAATTT CGCATCCGATG)，用pHB-60作模板，杂交温度54℃，Pwo聚合酶，和20次反应循环，产生一个PCR片段(1187bp，nt1423-2607)。将此PCR片段纯化(高纯度PCR纯化，Boehringer Mannheim)，用SacII(nt1760)和ApoI(nt2576)消化。将所得816bp的片段用于置换pHB60-s2VP3C2(用ApoI(nt2576部分消化)和SacII(nt1760)消化)的相应部分，使用快速连接和转化大肠杆菌细胞，产生pHB60-s2VP3C3。确定选择的质粒克隆pHB60-s2VP3C3的DNA序列(nt1600-3275)，表现为具有图1所示的镶嵌D6948-TY89 cDNA序列。
感染和转化QM5细胞将QM5细胞在35mm培养皿(M-6，9.6cm2/孔)中生长至80％铺满，并用禽痘病毒-T7(FP-T7)(Britton等，1996)或修饰的Vaccinia Ankara(MVA-T7)(Wyatt，Moss，和Rozenblatt，1995)感染，感染复数(m.o.i.)为3。在1小时后，将细胞用3ml QT-35培养基冲洗两次，并用3ml Optimeml(Gibco/BRL)覆盖。同时，将DNA(1.0mg)与12.5ml LipofectAMINE(Gibco/BRL)在250ml Optimeml中混合，并在室温下保持至少30分钟。接着将QM5细胞用2ml新鲜Optimeml覆盖，并加入DNA/LipofectAMINE混合物。在37℃温箱中(5.0％CO2)转染过夜(18小时)。将转染的单层细胞用PBS漂洗一次，加入新鲜QM5FA培养基(2.5ml)，并将平板在37℃温箱中(5.0％CO2)进一步温育。温育24小时后，将平板冻/融一次，并将上清通过孔径为200nm的滤膜(Acrodisc，GelmanSciences)过滤，以除去禽痘病毒和细胞碎片。将澄清的上清贮存于-70℃，或直接用于进一步分析。
检测感染性rIBDV在转染后，通过用澄清的转染上清的10倍稀释液接种接近铺满的QM5细胞单层，检测细胞培养适应的rIBDV。在24小时后，在免疫过氧化物酶单层分析(IPMA)(Boot等，1999)中观测IBDV特异性蛋白。将不能在QM5细胞上复制的拯救的IBDV(如rD6948)，用于接种单层原始囊细胞，该细胞已经在体外在39℃在CO2(5％)温箱中的35mm组织培养皿(10cm2)中生长24小时。感染的B淋巴细胞中的IBDV特异性蛋白，在48小时后用Mab9.7在IPMA中检测，Mab9.7是非血清型特异性VP3抗体。
rIBDV在SPF幼鸡中的毒力拯救的IBDV分离株的毒力在SPF蛋鸡型鸡中评价。首先将IBDV分离株在含胚卵上增殖，通过将转染实验中的QM5细胞上清经尿囊绒膜途径接种于11天龄的含胚卵中进行。在温育5天后回收胚(死或活的)，在Sorval Omni混合器中均质(3×10秒，最大速度)，接着通过离心澄清(6000g，10分钟)，并将等分贮存于-70℃。这些样品的病毒效价(50％胚致死剂量ELD50)用11天龄含胚卵确定。将(21天龄)鸡群分室隔离，并经滴鼻和滴眼接种在PBS中的1000 ELD50，或只接种PBS(阴性对照组)。每天监测动物的临床迹象，及除去死亡的鸡并进行尸检。在实验1中，将大部分存活的鸡放血(5ml)，并在感染后(p.i.)9天进行安死术以进行尸检，同时将一些鸡直至感染后15天放血并进行安死术(见表13)。在实验2中，将所有存活的鸡在感染后13天放血并进行安死术以进行尸检。确定所有进行安死术的鸡的腔上囊重和体重，并用100 TCID50的CEF94和铺满的QM5单层细胞确定血清中病毒中和抗体效价。将在尸检中取自腔上囊的样品在10％中性缓冲的福尔马林中固定以进行组织学分析，并也将样品在液氮中瞬时冷冻，并保藏在-70℃以进行免疫组织化学分析(实验1)。
组织病理学和免疫组织化学分析将福尔马林固定的囊样品脱水，包埋在固体石蜡中，切片并用苏木精-嗜红(HE)染色。用显微镜分析囊确定组织病理学囊损害评分(HBLS)。根据Bayyari等(1996)所述以1-5等级确定HBLS1＝正常囊；2＝离散或部分滤泡损害；3＝50％或少于50％滤泡损害；4＝50-70％滤泡损害；5＝75-100％滤泡损害。将冷冻的囊样品在低温保持器上切成8um厚度并在玻片(Superfiost)上进行免疫组织学分析。将切片用丙酮固定10分钟，在空气中干燥并贮存于-20℃直至使用。如述进行免疫过氧化物酶染色(Pol，Gielkens，和Van Oirschot，1989)。简而言之，将切片中的内源性过氧化物酶用0.01％H2O2消除。非特异性反应通过0.2％牛血清白蛋白阻断。将Mab B10A或IVSI用作一级抗体，而将缀合于过氧化物酶(Dako)的山羊抗兔或兔抗小鼠抗体用作二级抗体，二氨基联苯胺(DAB)用作底物。
感染具有母体产生的IBDV抗体的broiler幼鸡确定孵化后(p.h)第7天和第15天衍生自种禽的broiler幼鸡的血清中母体产生的抗体的存在情况，该种禽已经用活的或灭活的IBDV疫苗接种。用Idexx的IBDV特异性ELISA(Idexx，Westbrook，美国)，和用病毒中和实验确定IBDV特异性抗体的水平。在病毒中和实验中，我们使用100 TCID50的CEF94和铺满的QM5细胞单层。基于在孵化后15天的Idexx IBDV ELISA结果，我们集合5个不同组的至少14只动物(见表14)，并隔离分室。在孵化后18天，将每只鸡在饲料中口服给予1000 ELD50的mD6948-s2VP3C3。在孵化后22，25，32和42天在每只鸡中取血液样品，并在Idexx IBDV ELISA中和在病毒中和实验中确定每个样品中IBDV抗体水平。将每组5只鸡在孵化后22天取血液样品后进行安死术，所剩的鸡在孵化后42天取血液样品后进行安死术。确定在孵化后41天进行安死术的每只鸡的腔上囊重-体重比值。结果构建和分析嵌合的A节段质粒为确定含有嵌合的A节段dsDNA的IBD病毒的存活性，毒力和抗原性性质，我们产生了一些含有编码杂种多蛋白的全长A节段cDNA的质粒，在基于CEF94 cDNA，并编码(部分)衍生自TY89血清型II分离株的VP3的A节段质粒之后，我们构建了3个嵌合的质粒，它们基于D6948的A节段质粒，D6948是一种极烈性IBDV分离株。这些质粒其中的两个(pHB60-s2VP3C1，pHB60-s2VP3C3，见图11和表12)编码一种多蛋白，该多蛋白中VP3的C末端部分衍生自血清型II，而其它质粒(pHB60-s2VP3N，图11和表12)编码一种多蛋白，其中VP3的N末端部分源自血清型II IBDV。所有编码杂种VP3蛋白的质粒具有一个T7启动子和丁型肝炎病毒核酶。驱动这些质粒转录的T7启动子引导A节段IBDV RNA形成正链，其准确地模拟病毒正链RNA的核苷酸序列。然而在天然病毒RNA和人工产生的的类病毒RNA中存在差异，因为病毒蛋白基因组连接的分子(VP1)，在天然的RNA的5’末端存在，而在人工产生的RNA中不存在。
接着将构建的质粒用于转染QM5细胞，该细胞在转染之前用重组痘病毒(禽痘病毒FP-T7或痘苗MVA-T7)感染，所述病毒在感染后在细胞质中表达T7聚合酶。所得A节段RNA不能复制，因为由B节段编码的RNA依赖型RNA聚合酶(VP1)不存在。在转染后，冲洗细胞，并通过Western印迹分析确定总细胞提取物中(重组)VP3的存在情况(图12)。使用已知与VP3反应(血清型特异性)的4种不同的单克隆抗体。单克隆B10A是一种非血清型特异性单克隆抗体，并与由所有使用的质粒编码的VP3反应。血清型I特异性单克隆抗体IVSI只与那些具有血清型I的C末端部分的VP3反应，而单克隆I/G4SI只识别细胞培养适应的经典血清型I分离株(CEF94)的VP3 C末端部分，而不与极烈性血清型I(D6948)衍生的VP3反应。血清型II特异性单克隆T75SII的识别模式与单克隆IVSI正相反，其只识别那些具有血清型II C末端部分的VP3。
氨基酸序列对比基于Western印迹分析，我们得出结论，即由3个血清型特异性Mab识别的VP3表位是线性的并存在于此蛋白质的C末端部分(850-1012位氨基酸)。对推导的多蛋白VP3部分的氨基酸序列进行的序列对比表明，在两个血清型I分离株CEF94和D6948之间只有两个氨基酸不同(即第981位和1005位氨基酸；见图13)。单克隆I/G4SI只识别CEF94而不识别D6948，显然是由于这些氨基酸差异之一所致。另外，I/G4SI也不能与TY89反应。血清型II和血清型I毒株的VP3之间存在一些不同。因为I/G4SI的表位存在于第981位氨基酸或1005位氨基酸附近(如上)，我们认为在第981或992位的氨基酸不同(见图13)与I/G4SI的反应性的不同相关。
拯救感染性镶嵌IBDV将全长杂种A节段质粒，组合全长B节段质粒(pHB-34Z或pHB-55)转染入FP-T7或MVA-T7感染的QM5细胞中。感染性镶嵌IBDV可在转染后24小时拯救，使用新鲜QM5细胞(对所有mCEF94衍生物而言)或原始囊细胞(对mD6948-s2VP3C1和mD6948-s2VP3C3而言)(表12)。当将质粒pHB60-s2VP3N与质粒pHB-55组合转染时，没有病毒可拯救。这意味着此镶嵌病毒是不可存活的，或我们拯救此病毒的方法没有足够效果。将拯救的病毒和亲代野生型毒株均在含胚卵中扩增，并收获。接着用含胚卵确定每个病毒原种的病毒效价(50％胚致死剂量(ELD50))。
用镶嵌IBDV感染SPF鸡为确定拯救的镶嵌IBDV毒株的毒力，我们用1000 ELD50的野生型或镶嵌病毒毒株接种鸡群，并在存活期间或死亡后确定一些相应参数(表13)。在第一个动物实验中(实验1)，我们观测到死亡率只在接受D6948(野生型或拯救的)接种后的组中在第一个5天期间发生。当用D6948衍生的mD6948-s2VP3C1接种鸡群时，在此实验中没有死亡率发生。这与第二个动物实验(实验2)相反，其中此组(15只)中有一只鸡在接种后5天内死亡。在实验2中，我们发现在用mD6948-s2VP3C3感染后没有死亡率，mD6948-s2VP3C3是D6948的一个衍生物，其比mD6948-s2VP3C1更接近于野生型D6948(见图11和表13)。在进行安死术后确定每只鸡的腔上囊重和体重(表13)。腔上囊重和体重之间的平均比值是SPF鸡由于IBDV感染而导致囊损害的良好指征。细胞培养适应的IBDV毒株(例如CEF94)，其对腔上囊中的发育B淋巴细胞不再具有特异性嗜性，其只使此比值略降低(表13)，而非细胞培养适应的IBDV毒株(例如极烈性D6948，及其衍生物)，其具有特异性囊嗜性，使腔上囊重-体重比值大大降低。将血清型IIVP3的C末端编码部分导入vvIBDV(mD6948-s2VP3C3)基因组中，不改变此比值，这与针对囊的嗜性与VP2的序列相关相一致。尽管极烈性VP2序列存在于mD6948-s2VP3C1中，但发现与野生型或拯救的D6948相比，mD6948-s2VP3C1的腔上囊重-体重比值不同。D6948，CEF94和TY89基因组这一特异性组合在动物实验(实验2)中显然影响病毒复制，及囊损害。
感染的腔上囊的免疫组织化学分析将IBDV(rIBDV或mD6948-s2VP3C1，实验1)感染的鸡的腔上囊切片，用于显示感染后病毒抗原的存在情况。非血清型特异性(B10A)或血清型特异性(IVSI)单克隆抗体用于显示病毒抗原在感染的囊中的分布。使用Mab B10A，我们能检测到在rD6948和mD6948-s2VP3C3感染的鸡的囊中的病毒抗原。当使用Mab BI0A时，在mD6948-s2VP3C3感染的鸡的囊中未检测到病毒抗原，而在rD6948感染的鸡的囊中清楚地检测到病毒抗原(数据未示出)。
感染的囊的组织病理学分析将IBDV感染的鸡的腔上囊的切片(实验2)，在进行安死术后进行检测以确定囊损害程度(组织病理学囊损害评分，HBLS)。根据Bayyari所述(Bayyari等，1996)将囊分为1级正常囊至5级75-100％滤泡损害(见材料与方法章节)。具有CEF94的VP2的所有病毒只导致较小的囊损害(＜2.0)，而具有D6948的VP2的所有病毒导致较严重的囊损害(4.7-5.0)(表13)。基于HBLS，看上去在mD6948-s2VP3C1和mD6948-s2VP3C3感染后囊损害与未修饰的D6948相比几乎相同。然而，仔细检测表明在由不同的基于D6948的病毒导致的囊滤泡的损害之间存在差异。(图14)。D6948和rD6948均完全破坏囊中的滤泡结构，并导致其坏死及胞囊形成。然而mD6948-s2VP3C1和mD6948-s2VP3C3感染的鸡的囊的全部滤泡结构仍存在。在对照的囊(PBS组)中发现mD6948-s2VP3C1感染的囊的一些滤泡具有同样表现，尽管这些滤泡的直径与野生型滤泡相比通常降低(见图14)。我们还发现囊绒毛的长度在(m)D6948感染的鸡中比在模拟感染的鸡中降低。(m)D6948感染的囊中绒毛长度降低与这些囊的重量(和体积)降低相关。
感染具有母体衍生的IBDV抗体的幼鸡在证实mD6948-s2VP3C3与野生型D6948相比毒力降低(减毒)之后，我们确定此病毒在具有母体衍生的IBDV抗体的幼鸡中，是否能感染及诱导IBDV中和抗体(动物实验3)。基于孵化后(p.h.)15天取的血清样品中IBDV特异性抗体水平(IBDV Idexx ELISA)，将至少14只幼鸡分为5组(见表14)。在感染后18天，将每只鸡用mD6948-s2VP3C3(1000 ELD50)感染，并通过ELISA(Idexx，见表14)和通过病毒中和分析(见表15)确定IBDV特异性抗体的水平。通过Idexx ELISA确定的IBDV抗体水平与病毒中和分析确定的病毒中和抗体水平非常一致(表14和表15)。当病毒中和抗体的2log效价低于8.0时，Idexx ELISA给出阴性评分(为0)。
在此动物实验中(实验3)，我们发现mD6948-s2VP3C3能感染不具有(第1组，在感染前3天平均Idexx值为18)，或具有中等水平(第2组，在感染前3天平均Idexx值为361)，或高水平(第5组，在感染前3天平均Idexx值为1283)母体衍生的抗体平均水平的鸡。(表14)。由孵化后42天进行安死术的鸡的计算平均腔上囊重-体重比值(BBR)也清楚在第1，2和5组中的鸡确实已经感染。在第1组(BBR＝0.57，SD＝0.21)，第2组(BBR＝0.69，SD＝0.25)和第5组(BBR＝0.70，SD＝0.16)中，这些数值与未感染的第3组(BBR＝2.22，SD＝0.42)和第4组(BBR＝2.17，SD＝0.68)相比降低。尽管mD6948-s2VP3C3能明显感染具有最高水平母体衍生的抗体的第5组的禽，但不感染具有中等至高水平母体衍生的抗体的第3和第4组(第3组和第4组在感染前3天的平均BDV Idexx值分别为576和899)。显然母体衍生的(中和)抗体水平与mD6948-s2VP3C3感染鸡的能力不密切相关。
极烈性IBDV(vvIBDV)在商业鸡群中的爆发首先在欧洲报道，但现在在世界范围均发现。极烈性IBDV毒株能感染幼鸡，尽管相对高效价的母体衍生的IBDV抗体(MDIA)对经典IBDV分离株的感染有保护性。为预防vvIBDV爆发，当幼鸡仍具有高水平MDIA时，施用基于野生型(vv)IBDV分离株的疫苗(热疫苗)。在具有MDIA高变异系数的鸡群中，在低水平MDIA的鸡中接种热疫苗可导致严重囊损害。另外，将活的野生型vvIBDV作为疫苗导入局部，对动物健康是有害的，因为不能预防传播，及没有区分试验适于区分疫苗和野外病毒。
在此实施例中，我们阐述了极烈性衍生的镶嵌IBDV(mD6948-s2VP3C3)的拯救，其具有的VP3有一部分(C末端的155个氨基酸)基于血清型II TY89毒株的VP3序列。先前我们阐述了基于经典减毒的血清型I毒株CEF94产生和在体外分析镶嵌病毒(mCEF94-s2VP3C)，其与mD6948-s2VP3C3同样具有VP3编码序列的C末端交换(C末端的155个氨基酸)。此病毒的复制表现为略降低，因为我们发现在感染10小时后的QM5单层细胞中没有病毒释放。这与野生型CEF94相反，野生型CEF94表现为在感染后10小时有病毒释放。在感染后25-50小时之间，野生型CEF94和mCEF94-s2VP3C均达到相同的最终IBDV效价(＞107)，表明mCEF94-s2VP3C的复制只受置换的TY89的VP3的C末端155个氨基酸的微弱影响。在此我们示出mD6948-s2VP3C3与野生型D6948相比毒力降低。此结论是基于i)当将其施用于21天龄蛋鸡型SPF鸡时不产生任何死亡率，而野生型D6948在鸡中产生大约50％的死亡率(表13)，ii)在用mD6948-s2VP3C3感染21天龄的SPF鸡后产生的囊损害，与用D6948感染的鸡相比降低(图14)。将血清型II VP3的C末端部分导入血清型I分离株的背景中，在体内和体外均产生小但独特的表型。
在此实施例中，我们进一步示出mD6948-s2VP3C3能感染具有母体衍生的IBDV特异性中和抗体的幼鸡。此特殊的镶嵌病毒感染所有3组种禽型非SPF鸡，这3组鸡在感染前3天的平均Idexx IBDV抗体效价为18(第1组，表14)，361(第2组，表14)或1283(第5组，表14)。在感染后4-7天之间，在属于第1组和第2组的一些动物中IBDV特异性抗体水平明显提高，而这些组中的所有动物在感染后7-14天之间均具有高IBDV特异性抗体水平。在第5组中在感染后14-24天之间发现IBDV特异性抗体效价提高，表明在此组中的感染发生速度比第1和2组慢。第5组的平均IBDV Idexx值(在感染前3天为1283)远远高于第1组(在感染前3天为18)和第2组(在感染前3天为361)。第5组与第1和2组相比，母体衍生的抗体效价水平的不同更可能导致活性(中和)IBDV抗体水平提高缓慢。
将实验2的动物血清用于竞争ELISA中，其中我们使用原核表达的CEF94多蛋白C末端部分290个氨基酸作为包被的抗原。将用D6948和mD6948-s2VP3C1感染的鸡血清用于竞争单克隆抗体IV或I/G4。在1∶500稀释的鸡血清中，我们发现来自用mD6948-s2VP3C1感染的鸡的血清不能竞争Mab IV和I/G4与包被的抗原的相互作用而D6948感染的鸡的血清在此相互作用中可以竞争(图15)。这表明在D6948的cDNA中导入血清型II序列产生的镶嵌病毒诱导独特的抗体应答。使用所述的竞争ELISA，我们能区分用野生型血清型IvvIBDV病毒(毒株D6948)和镶嵌血清型I-II毒株，减毒的vvIBDV病毒(毒株mD6948-s2VP3C1)感染的鸡。尽管I/G4在Western印迹分析中不与衍生自pHB60的VP3反应(图12)，但我们发现由pHB60衍生的病毒(rD6948)诱导的抗体能竞争CEF94抗原。因为镶嵌极烈性D6948分离株(mD6948-s2VP3C3)毒力降低，及此病毒可感染具有低，中或高水平母体衍生的IBDV中和抗体幼鸡，所以此病毒是有效预防vvIBDV爆发的疫苗的一个预备候选者。可区分用此病毒接种的鸡及用野生型(极烈性)病毒感染的鸡的能力，使此镶嵌(vv)IBDV病毒更有利用价值，因为其可用我们所述的竞争ELISA检测及追踪(亚)临床(vv)IBDV感染。此(vv)IBDV标记疫苗也可使Gumboro根除计划成为可能。实施例3许多近年来在世界范围内商业鸡群中爆发的传染性腔上囊病，是由于传染性腔上囊病病毒的极烈性毒株(IBDV)传播所致。与经典IBDV相比，vvIBDV毒性增强的分子决定簇还未知。缺失从其克隆的cDNA中拯救vvIBDV的反向遗传系统，妨碍了鉴别和研究这些决定簇。在此报道中，我们第一次阐述了从其克隆的cDNA中拯救vvIBDV。将含有T7启动子和vvIBDV(D6948)的全长A或B节段cDNA的两个质粒，共转染入表达T7聚合酶的QM5细胞中。在将转染上清在原始囊细胞(在体外)或含胚卵(在体内)但非QM5细胞中传代后，可检测vvIBDV的存在情况。拯救的vvIBDV(rD6948)表现为具有与亲代分离株D6948相同的毒力。节段重排列的IBDV，其中两个基因组节段之一源自经典减毒的IBDV CEF94的cDNA，另一个源自D6948的cDNA，这种IBDV也可用此系统拯救。含有经典减毒的分离株(CEF94)的A节段和极烈性分离株(D6948)的B节段的节段重排列病毒，只是在体外感染15小时后释放。这表明复制略延迟，因为已经发现在感染后10小时CEF94首次释放。在节段重排列后，我们产生和分析了镶嵌IBDV。在这些镶嵌IBDV中，我们将编码病毒蛋白(pVP2，VP3或VP4)之一的CEF94区域置换为D6948的相应区域。对这些mIBDV分离株的分析示出对非B淋巴细胞的嗜性是由病毒衣壳蛋白VP2单独决定的。然而，极烈性表型不是仅由此蛋白质决定的，因为含有vvIBDV的VP2的镶嵌病毒在幼鸡中既不诱导发病率也不诱导死亡率。导论传染性腔上囊病病毒(IBDV)是鸡群中一种高度传染性疾病(Gumboro病(11))的致病因子(Cosgrove，1962)。IBDV是双RNA科的一个成员，具有分为两个节段的双链RNA(dsRNA)(14)。dsRNA基因组被两个病毒蛋白的衣壳覆盖，产生具有二十面体(T＝13)对称(5)的单壳裸病毒颗粒(60nm)。最大的dsRNA(A节段，大约3260bp)含有两个部分重叠的开放读框(ORF)。第一个，最小的ORF编码非结构病毒蛋白5(VP5，+/-145个氨基酸，17kDa，见图16a)。第二个ORF编码一个多蛋白(1012个氨基酸，110kDa，见图1b)，该多蛋白可自动催化裂解产生病毒蛋白pVP2(也称为VPX，48kDa)，VP4(29kDa)，和VP3(33kDa)。在体内病毒成熟期间，pVP2被加工为VP2(41-38kDa)，可能是由于通过宿主细胞编码的蛋白酶(19)对pVP2进行位点特异性裂解而得。VP2和VP3是组成毒粒壳的两种蛋白质。仅已知VP2的中和抗体，这些抗体是构象依赖型的。B节段(大约2827kDa)含有一个大ORF，编码91kDa的VP1蛋白(见图16c)。此蛋白含有RNA依赖型RNA聚合酶的共有基序(8)。另外，已经报道此蛋白质与基因组RNA节段的5’末端连接(病毒蛋白基因组连接的，VPg)(12，29)。
病原性血清型I IBDV分离株基本分为经典型，抗原性变体，和极烈性分离株。抗原性变体IBDV分离株只在美国有报道(自1985年)，并发现在其VP2蛋白的特异区域(高变区)中有一个氨基酸改变，导致不同的病理表型(28)。后来在欧洲(自1988年(9))报道IBDV分离株毒力增强(极烈性IBDV，vvIBDV)，同时与经典毒株具有相同的抗原性结构。发现vvIBDV和经典IBDV分离株的病毒蛋白之间的氨基酸不同是分散在所有病毒蛋白之间的，尽管其中大多数发现在VP2的高变区内(7，24)。目前还未知是否所有或只是少数这些氨基酸突变与vvIBDV分离株毒力增强相关。
野生型IBDV在腔上囊中的发育淋巴细胞中特异性复制。在此复制期间，病毒蛋白诱导细胞程序死亡，引起B淋巴细胞迅速减少(31)。生产IBDV疫苗的常规方式是将野生型病毒在鸡胚或用原始鸡胚细胞成纤维细胞(CEF)，或如鹌鹑衍生的细胞(QT35，QM5或QM7)或哺乳动物细胞(Vero细胞)的细胞系中适应性增殖。经常报道野生型IBDV的适应性与减毒相关(32，34)。适应的IBDV能感染鸡的非B淋巴细胞，导致感染的鸡的囊中B淋巴细胞病毒负荷降低。一些报道阐述了氨基酸突变是野生型IBDV在非B淋巴细胞上增殖期间适应的结果(20，33，34)。另外，已经公布了两项研究，其中用反向遗传系统，在IBDV的VP2区域导入氨基酸突变(20，22)。这些分析示出对在非B淋巴细胞上增殖重要的氨基酸位于VP2的高变区(即在253，279和284位的氨基酸)。还不清楚在基因组其它部分(如VP1(7，34))发现的突变的影响。针对确定定点单一或多个氨基酸突变的影响的研究，由于缺乏可产生极烈性IBDV的反向遗传系统而受到妨碍。在此报道中，我们阐述了这种系统。使用野生型极烈性IBDV分离株(D6948)的全长cDNA，我们成功地拯救了重组D6948(rD6948)。另外，我们拯救了用质粒转染后的镶嵌IBDV，该质粒含有大部分源自减毒的经典分离株(CEF94)的cDNA，和部分源自野生型vvIBDV(D6948)的cDNA。材料和方法病毒，细胞和抗体经典IBDV分离株CEF94是PV1的衍生物，其已经在细胞培养物上适应生长(3，23)。野生型vvIBDV分离株D6948毒株是由荷兰家禽健康服务公司(PHD，Doorn，1989)分离的，并通过在含胚卵中重复有限稀释传代而纯化(5次)。接着在我们的实验室中在SPF鸡中传代两次。含有T7聚合酶基因的重组禽痘病毒(FP-T7)(6)是由M.Skinner惠赠的(Compton实验室，Berks，United Kingdom)。QM5细胞(1)通过在CO2(5％)温箱中在37℃，使用补加5％胎牛血清(FCS)和2％抗生素溶液ABII(1000U/ml青霉素(Yamanouchi)，1mg/ml链霉素(Radiumfarma，意大利)，20mg/ml两性霉素B，500mg/ml多粘菌素B，和10mg/ml卡那霉素)的QT35培养基(Gibco-BRL)维持。原始囊细胞分离自14天龄SPF胚，并维持在补加15％FCS，0.125％乳白蛋白水解产物(Oxiod)，和1000U/ml青霉素(Yamanouchi)和1mg/ml链霉素(Radiumfarma，意大利)的Eagle’s改进的极限必需基本培养基(EMEM)中。多克隆兔抗VP1血清是通过用纯化的重组VP1注射兔产生的(30)。多克隆兔抗IBDV的VP3和VP4的血清是如下产生的使用大肠杆菌表达质粒pQE-30(Qiagen)将含有CEF的A节段cDNA的(nt2297-nt3192(多蛋白的722-1018位氨基酸)的PCR片段融合于6组氨酸标记。将表达的融合蛋白根据使用说明书用Ni-NTA树脂(Qiagen)纯化。将纯化的蛋白质在SDS-PAGE凝胶中分离，并如Hardy所述(16)从凝胶中分离全长融合产物(+/-35kDa)。接着将回收的蛋白质用于免疫兔。在ELISA，放射免疫沉淀，和IPMA分析中证实兔血清(PaVP3/4)的特异性(识别VP4和VP3)和反应性(数据未示出)。
产生全长A和B节段克隆为产生两个IBDV分离株(CEF94和D6948)的A和B节段的全长单链cDNA，我们使用特异于编码链3’末端的引物进行逆转录(4)。接着用特异于编码链和非编码链的3’末端的两个引物，在PCR中扩增全长A节段和B节段cDNA，使用Taq和Pwo酶混合物(Expand，Boehringer Mannheim)(4)。两个与非编码链3’末端杂交的引物含有编码T7启动子的5’延伸(4)。对每个节段进行3次独立RT-PCR反应，将所得PCR片段克隆入pGEM-T载体中(Promega)(A节段)，或克隆入含有反基因组顺式作用丁型肝炎病毒(HDV)核酶(10)和T7聚合酶终止子的pUC19衍生物中(见图17和(3)(B节段))。在循环测序反应(BigDye终止子试剂盒，PE应用生物系统)，和ABI310设备(PE应用生物系统)中，使用序列特异性引物对这两个链进行序列分析。在D6948克隆(pHB-22)的一个A节段中的一个非有无意突变，通过交换来自一独立克隆的一个限制酶片段而恢复(数据未示出)，产生pHB-22R。pHB-22R含有D6948 vvIBDV分离株A节段的共有cDNA序列。通过使用在RT-PCR方法中所用的相同引物进行PCR扩增(4)，我们接着将此全长A节段序列移至基于pUC18的载体中，该载体含有丁型肝炎病毒(HDV)核酶和T7聚合酶终止子(如上)，在此转移期间，在多蛋白(A1817G)的VP4编码部分中导入一个非有意的突变。此突变接着用作从此D6948 A节段质粒中拯救的病毒的遗传标记。CEF94的A节段cDNA克隆(pHB-36W)含有两个核苷酸遗传标记(3172C→T和3173T→A)，从而在A节段的3’UTR中导入一个单一KpnI限制位点GGTAAC(3)。
蛋白质序列对比用于序列对比的氨基酸序列得自GenBank数据库(登记号在括号中表示)。为对比vvIBDV的VP5和多蛋白(A节段)，我们使用分离株D6948(AF240686)，HK46(AF092944)，UK661(X92760)和OKYM(D49707)的预测的氨基酸序列。为对比vvIBDV VP1序列(B节段)，我们使用D6948(AF240687)，HK46(AF092944)，UK661(X92761)，OKYM(D49707)，IL3(AF083093)和IL4(AF083092)的预测的氨基酸序列。
体外转录和翻译将含有T7启动子之后的全长A或B节段的环形质粒(0.4mg)，在存在35S-甲硫氨酸的体外转录-翻译反应(TnT-T7Quick，Promega)中用作模板。所得病毒蛋白在PAGE凝胶(12％)中分离，并通过放射自显影观测。
感染和转染QM5细胞将QM5细胞在35mm培养皿(M-6，9.6cm2/孔)中生长至80％铺满，并用禽痘病毒T7(FPV-T7，m.o.i.＝3)感染。在1小时后，将细胞用3ml QT35培养基冲洗两次，并用3ml Optimen 1(Gibco/BRL)覆盖。同时，将DNA(1.0mg)与12.5mlLipofectAMINE(Gibco/BRL)在250ml Optimem 1中混合，并在室温保持至少30分钟。接着将QM5细胞用2ml新鲜Optimeml覆盖，并加入DNA/LipofectAMINE混合物。在37℃温箱(5.0％CO2)转染过夜(18小时)。将转染的单层细胞用PBS漂洗一次，加入新鲜QM5培养基(补加5％FCS和2％ABII)，将平板在37℃温箱(5.0％CO2)中进一步温育。在温育24小时后，将平板冻/融一次，并将上清通过200nm滤膜(Acrodisc，GelmanSciences)过滤，以除去禽痘病毒(FP-T7)和细胞碎片。将澄清的上清在-70℃贮存或直接用于进一步分析。
检测感染性rIBDV在转染后，通过用部分澄清的转染上清接种接近铺满单层的QM5细胞，检测感染性rIBDV。在24小时后，在免疫过氧化物酶单层分析(IPMA)(3)中观测IBDV特异性蛋白。将不能在QM5细胞上复制的拯救的IBDV(如rD6948)，也用于接种单层原始囊细胞，该细胞已经在体外在39℃在CO2(5％)温箱中的35mm组织培养皿(10cm2)中生长24小时。感染的B淋巴细胞中的IBDV特异性蛋白，在48小时后在IPMA中检测。
单步IBDV生长曲线为确定rCEF94和srIBDV-CADB分离株的复制能力(见表16)，我们确定了单步生长曲线。将QM5细胞(2×106)在60mm细胞培养皿上生长过夜(16小时)。接着将培养基除去，用1ml含有IBDV(TCID50＝107.0；m.o.i.＝5)的培养基覆盖细胞。在1小时后，除去培养基，将细胞用PBS冲洗3次，加入5ml新鲜培养基。在不同时间点从培养基中取样品(感染后5h，10h，15h和25h)，并贮存于-20℃。通过用10倍稀释的IBDV样品感染含有接近铺满的QM5细胞的96孔组织培育平板，确定每个样品中IBDV数量(TCID50)。将此96孔平板温育48小时，通过IPMA检测IBDV的感染中心(IBDV-抗原阳性区域)(见检测感染性rIBDV)。
构建镶嵌A节段质粒pHB36-vvVP2为将CEF94多蛋白的pVP2部分的编码序列用D6948多蛋白的相应部分置换，我们产生了3个PCR片段(即VP2a，VP2b，和VP2c，见图21)。PCR片段VP2a(189bp)是用pHB-36W作模板，使用引物M13R(TCACACAGGAAACAGCTATGAC)和ATG3(CATCGCTGCGATCGTTTGTCTGATCTCTAC)产生的。PCR片段VP2b(761bp)是用pHB-36W作模板，使用引物(ATCCGGGCCCTAAGGAGG)和ANC4(GCCAAGTCGGTGTGCAG)产生的。PCR片段VP2c(1418bp)是用pHB-22R作模板，使用引物HY0P(TATCATTGATGGTCAGTAGAG)和HY2M(CACCGGCACAGCTATCC)产生的。将这3个PCR片段用Qiaex凝胶提取试剂盒(Qiagen，德国)经琼脂糖凝胶纯化，并在融合PCR中用作模板(每个片段50ng)，使用引物T7EcoRI(GGAATTCTAATACGACTCACTATAGG)和ANC4。接着将此PCR片段(2256bp)用EcoRI和SacII消化(产生一个1806bp的片段)，经琼脂糖凝胶纯化(Qiaex凝胶提取试剂盒，Qiagen)，并连接于已经用相同限制酶消化的pHB-36W中，然后用于转化大肠杆菌DH5α细胞。对一些质粒进行分析，选择一个具有所需序列的质粒(pHB36-vvVP2)。
构建镶嵌A节段质粒pHB36-WVP3为将CEF94多蛋白的VP3部分的编码序列用D6948多蛋白的相应部分置换，我们产生了2个PCR片段。PCR片段VP3a(1622bp)是用pHB-36W作模板，使用引物AC3(GGTAGCCACATGTGACAG)和HY3M(CCAGTCcCGcGGATTGTGAGG)产生的。PCR片段VP3b(1252bp)是用pHB-22R作模板，使用引物HY3P(AACGTTTTCCTCACAATCCgCGgGACTGGGG)和M13F(GTAAAACGACGGCCAGT)产生的。将这2个PCR片段经琼脂糖凝胶纯化，并在融合PCR中用作模板(每个片段50ng)，使用引物AC4(ACCCAGCCAATCACATCC)和AGTM(GAGACTCCCAGGtaCCTCACT)。接着将此PCR片段(2154bp)用EagI和KpnI消化(产生一个1857bp的片段)，并如pHB36-vvVP2相同方式用于交换pHB-36W的相应部分，产生pHB36-vvVP3。
构建镶嵌A节段质粒pHB36-vvVP4为将CEF94多蛋白的VP4部分的编码序列用D6948多蛋白的相应部分置换，我们产生了3个PCR片段。PCR片段VP4a(796bp)是用pHB-36W作模板，使用引物AC3和HY4M(CCGGCACAGCTATCCT)产生的。PCR片段VP4b(644bp)是用pHB-36W作模板，使用引物HY3P和ANC2(CTGCCTGTCCTGGAGCC)产生的。PCR片段VP4c(864bp)是用pHB-22R作模板，使用引物HY4P(ACATAATCCGGGCCATAAGG)和HY3M产生的。将这3个PCR片段经琼脂糖凝胶纯化，并在融合PCR中用作模板(每个片段50ng)，使用引物AC4和ANC3(CGATGGGCGTTCGGGTC)。接着将此PCR片段(2154bp)用EagI和DraIII消化(产生一个1189bp的片段)，并如pHB36-vvVP2相同方式用于交换pHB-36W的相应部分，产生pHB36-vvVP4。
rIBDV在SPF幼鸡中的毒力在SPF蛋鸡型鸡中评价拯救的rIBDV，srIBDV和mIBDV分离株的毒力(见表16)，将IBDV分离株首先在含胚卵中增殖，通过尿囊绒膜途径将转染实验中的QM5细胞上清接种于11天龄的含胚卵中。在温育5天后回收胚(死或活的)，在Sorval Omni混合器中均质(3×10秒，最大速度)，接着通过离心澄清(6000g，10分钟)，并将等分贮存于-70℃。在这些样品中的病毒效价(50％胚致死剂量ELD50)用11天龄含胚卵确定。在毒力试验中，将9组鸡(21天龄)经滴鼻和滴眼接种在PBS中的1000ELD50IBDV。另外一组10只鸡只接种PBS(阴性对照组)。将鸡群分室隔离。每天监测动物的临床迹象，及除去死亡的鸡并进行尸检。在感染后9天，将所有阴性对照组的鸡和其中发生死亡率的组中所有剩余的鸡在感染后(p.i.)9天放血(5ml)，并进行安死术以进行尸检。在其它组中，将6只鸡在感染后9天放血(5ml)并进行安死术以进行尸检，剩余4只在感染后15天放血(5ml)并进行安死术以进行尸检。确定所有在感染后9天进行安死术的鸡的腔上囊重和体重。腔上囊重/体重比值是通过单向方差分析及各组因子而分析的。在分析之前先将比值转化为对数形式。基于Fisher的LSD方法成对对比各组(用合并方差估计进行成对对比试验)。在第9天和第15天尸检时，将取自腔上囊的样品固定于10％中缓冲的福尔马林中以进行组织学分析。将囊样品在液氮中瞬时冷冻，并保藏在-70℃以进行免疫组织化学分析。用传染性腔上囊病抗体检测试剂盒(Idexx，Westbrook，美国)确定在安死术之前所取的血清中的IBDV抗体效价。
组织病理学和免疫组织化学分析将福尔马林固定的囊样品脱水，包埋在固体石蜡中，切片并用苏木精-曙红(HE)染色。用显微镜分析囊确定组织病理学囊损害评分(HBLS)。根据(2)所述以1-5等级确定HBLS1＝正常囊；2＝离散或部分滤泡损害；3＝50％或少于50％滤泡损害；4＝50-70％滤泡损害；5＝75-100％滤泡损害。将冷冻的囊样品在低温保持器上切成8um厚度并在玻片(Superfrost)上进行免疫组织学分析。将切片用丙酮固定10分钟，在空气中干燥并贮存于-20℃直至使用。如述(25)进行免疫过氧化物酶染色。简而言之，将切片中的内源性过氧化物酶用0.01％H2O2消除。非特异性反应通过0.2％牛血清白蛋白阻断。将1∶100稀释的PaVP3/4用作一级抗体，而将1∶100稀释的缀合于过氧化物酶(Dako)的山羊抗兔抗体用作二级抗体，二氨基联苯胺(DAB)用作底物。
检测遗传标记将源自其中在动物试验期间发生死亡率的组的鸡的囊均质，并用QiaAmp组织试剂盒(Qiagen，德国)提取病毒dsRNA。将此dsRNA通过标准乙醇沉淀浓缩，接着在逆转录反应中用作模板，使用引物ANC1(GGGGACCCGCGAACG)。在此模板上进行PCR(用Taq聚合酶)，使用引物AC3和ANC5(CCCATCTGGAGCATATCC)，并在94℃(15s)，55℃(15s)，和72℃(15s)进行35次循环。所得PCR产物(1266bp)经凝胶纯化(Qiaex凝胶提取试剂盒，Qiagen)，并用作序列分析的模板，使用引物AC6(TTCACCTGGGGTACTCCG)。结果克隆vvIBDV的全长cDNA为研究与vvIBDV分离株的极烈性表型相关的分子决定簇，我们对极烈性IBDV分离株D6948的全长A和B节段分别单独克隆并测序3次。D6948 A节段的cDNA(3260bp)与经典减毒的CEF94 IBDV分离株的序列有122位核苷酸不同(数据未示出)。这些核苷酸不同导致推定的D6948的VP5的N末端延伸4个氨基酸(MLSL)，及在两个VP5蛋白之间有5个另外的氨基酸不同(图16a)。另外，在两个多蛋白之间存在18个氨基酸不同，其中11个位于多蛋白的pVP2部分，5个位于VP4部分，2个位于VP3部分(图16b)。在两个B节段(2827bp)之间，我们发现288个核苷酸不同(数据未示出)，导致在两个VP1之间有17个氨基酸不同(图16c)，VP1是在B节段上编码的唯一蛋白质。
通过组合不同的全长cDNA克隆的序列，我们构建了含有D6948的A和B节段的共有cDNA序列的质粒。接着将A和B节段cDNA，包括人工导入的T7启动子序列，移至基于pUC19的含有顺式作用丁型肝炎病毒核酶载体中(10)，产生pHB-60(A节段)和pHB-55(B节段)(表16，和图17)。这些基于pUC-19的转录质粒是使用重组的表达T7聚合酶的辅助病毒(禽痘病毒)(6)从克隆的cDNA中拯救rIBDV的基础。我们先前已经使用此体内T7表达系统，从细胞培养适应的经典IBDV分离株CEF94的克隆的cDNA中拯救了感染性IBDV(3)。
体外转录/翻译将vvIBDV分离株的A和B节段cDNA克隆在体外转录/翻译反应(TnT-T7Quick，Promega)中用作模板。这些cDNA的蛋白质产物在SDS-PAGE分析中表现为与经典减毒的CEF94cDNA质粒的蛋白质产物相同(即在A节段情况为pVP2，VP3和VP4，在B节段情况为VP1)(图18A和18B)。发现D6948的pVP2比CEF94的pVP2的位置略高。质粒pHB-60(D6948 A节段)在第1817位具有单核苷酸取代(A1817G)，其得自基于PCR的克隆方法。此突变导致VP4中保守的氨基酸突变(I563V)。由于此突变不影响多蛋白的加工(图18A，和未公布的结果)，我们接着用此突变作标记，以从此D6948 A节段质粒中拯救病毒。
转染QM5细胞将含有CEF94或D6948的A和B节段cDNA的质粒用于共转染QM5细胞。源自A或B节段的病毒蛋白的瞬时表达，通过使用特异于VP3/4(A节段)或VP1(B节段)的抗体，在免疫过氧化物酶单层分析(IPMA)的所有测试情况中均观测到(数据未示出)。为确定源自克隆的cDNA的感染性IBDV的产生(后文称为拯救的IBDV；rIBDV)，我们将部分上清移至新鲜单层QM5细胞上(第一次传代)，并在24小时后在IPMA中分析这些细胞中病毒蛋白的表达。此分析示出在处理的QM5细胞中不能检测到感染性rIBDV，所述QM5是用vvIBDV分离株D6948的A和B节段质粒的共转染上清处理的(见图19)。相反，感染性rIBDV存在于用含有减毒的CEF94分离株的A和B节段的质粒共转染上清处理的QM5细胞中(图19)。用D6948的A节段质粒和CEF94的B节段质粒共转染，不产生感染性节段重排列的IBDV(srIBDV-DACB，表16)。然而，交互组合srIBDV-CADB(表16)产生感染性节段重排列的IBDV(图19)。野生型IBDV分离株如D6948不能在成纤维细胞如QM5细胞上生长(见导论章节)。因此我们通过将转染的QM5细胞的上清移至已在体外生长24小时的原始囊细胞中，确定源自克隆的cDNA的感染性rD6948的存在情况。与只能感染单层中存在的淋巴细胞的野生型D6948相似(数据未示出)，在用转染上清温育2天后我们能在一些淋巴细胞中检测到rD6948(图19，下面一组)。用CEF94的A和B节段cDNA转染上清温育原始囊细胞示出，不仅淋巴细胞而且成纤维细胞也被感染，导致在温育48小时内细胞单层破坏。用D6948的A节段cDNA和CEF94的B节段cDNA转染的上清中存在的病毒只能感染淋巴细胞，在48小时后未观测到单层破坏。与rD6948相似，srIBDV-DACB显然不能感染成纤维细胞。另外，发现成纤维细胞被源自CEF94的A节段cDNA和D6948的B节段cDNA的转染的病毒感染，尽管单层细胞表现为在48小时后与rCEF94相比破坏较轻(图19)。
单步生长曲线为确定拯救的rCEF94和srIBDV-CADB在QM5细胞是否与野生型CEF94具有相同复制性质，我们对每种这些病毒进行单步生长曲线(三份)。将QM5细胞在1小时期间用IBDV感染(m.o.i.＝5)，之后将细胞冲洗3次并在完全培养基中温育。在不同时间点取感染的QM5培养物的部分上清。在每个样品中确定IBDV的数量(TCID50)(图20)。在野生型CEF94和rCEF94中，在感染后10小时均发现感染性IBDV释放，而仅在感染后15小时发现srIBDV-CADB首次释放。野生型CEF94，rCEF94和拯救的含有CEF94的A节段的节段重排列IBDV的最终效价(感染后24小时)相同。
构建镶嵌A节段质粒为分析与分离株D6948的极烈性表型相关的病毒决定簇，我们构建了3个不同的含有全长镶嵌IBDV A节段cDNA的质粒。使用基于PCR的方法(见图21)，我们构建了DNA片段，其中间部分由源自D6948的cDNA组成(即pVP2，VP3，或VP4编码部分)，而两侧的cDNA源自CEF94。不同cDNA之间的过渡部分位于多蛋白的pVP2-VP4和VP4-VP3之间的推定的裂解位点(即分别在453和723氨基酸之后(18)，见图16B)。接着使用特异性限制性内切酶将嵌合PCR片段用于置换质粒pHB-36W中CEF94 A节段cDNA的相应部分。对称为pHB36-vvVP2，pHB36-vvVP3和pHB36-vvVP4的产生的质粒的交换部分进行测序，并将含有所述嵌合cDNA序列的质粒用于体外转录/翻译，并通过SDS-PAGE分析病毒蛋白的产生(图18C)。在由这些嵌合cDNA A节段编码的多蛋白中没有观测到自动催化裂解的明显不同。
从A节段cDNA中拯救IBDV将质粒pHB36-vvVP2，pHB36-vvVP3和pHB36-vvVP4，与CEF94的B节段cDNA(pHB-34Z)一起用于转染QM5细胞。通过将等分的转染上清移至新鲜的单层QM5细胞中，分析感染性IBDV(后文称为mIBDV，见表16)的存在情况。在温育1天后，将细胞固定并使用一种IBDV特异性抗体分析(IPMA)，测试mIBDV的存在情况。当使用pHB36-vvVP2质粒的上清时，在QM5单层细胞中未检测到mIBDV，而在pHB36-vvVP3，pHB36-vvVP4的情况中，明显可见mIBDV(图22)。我们在单层QM5细胞中未检测到mCEF94-vvVP2这一事实，可能是rCEF94和mCEF94-vvVP2之间细胞嗜性不同所致。为检测这种可能性，我们将用pHB36-vvVP2转染的部分上清移至单层原始囊细胞上。在2天后，我们可以示出在一些B淋巴细胞中存在mCEF94-vvVP2病毒(图22，下面一组)。显然的，mCEF94-vvVP2与D6948，rD6948和srIBDV-DACB具有相同细胞嗜性，因为其只能在B淋巴细胞上生长，而不能在成纤维细胞上生长。
动物实验为对比rIBDV，srIBDV和mIBDV分离株与亲代分离株的毒力，我们将21天龄的SPF鸡(每个病毒10只鸡)经滴鼻和滴眼途径接种1000 ELD50每种病毒。临床迹象只在给予D6948，rD6948和srIBDV-DACB的组中发生(数据未示出)。在这些组中，死亡率为3/10(D6948)，5/10(rD6948)，和2/10(srIBDV-DACB)(表17)。在其它组中既未发现死亡也未发现发病。在感染后9天，将其中发生死亡的组中所有剩余的鸡(D6948(n＝7)，rD6948(n＝5)和srIBDV-DACB(n＝8))，和所有对照组的鸡，放血并尸检。在剩余的组中，将6只鸡放血及尸检，而剩余4只在感染后15天放血及尸检以确定IBDV抗体水平。在其中发生死亡的组中腔上囊重/体重的比值非常低(＜2.0)。Fisher的LDS实验示出D6948，rD6948，srIBDV-DACB和mCEF94-vvVP2的腔上囊重/体重比值，与对照组和给予其它病毒的实验组的比值相比明显降低(P＜0.01)。通过用mCEF94-vvVP2接种可清楚了解腔上囊重/体重比值降低与死亡率不总是相关。尽管腔上囊重/体重比值明显降低(＜2.0)，但在此组中未发病(数据未示出)和死亡(表17)。mCEF94-vvVP3和mCEF94-vvVP4分离株既不诱导死亡或发病也不诱导粘液重/体重比值明显降低。只有在那些腔上囊重/体重比值严重降低的组中，我们发现所有的鸡在感染后9天均具有抗IBDV的抗体，而在不发生死亡的组中一些鸡不具有IBDV抗体(表17)。所有在感染后15天检测的鸡均具有IBDV抗体，除了给予野生型CEF94病毒的3只鸡(检测4只)之外(数据未示出)。
检测遗传标记收集其中发生死亡的组中一些鸡的囊(D6948，rD6948，和srIBDV-DACB)。衍生自均质的囊的病毒RNA，在RT-PCR中用作模板(见材料和方法章节)。将跨越A节段的709-1975nt的所得PCR片段用于进行核苷酸序列确定。衍生自用rD6948和srIBDV-DACB接种的组的PCR片段含有遗传标记(A1817G)，其存在于A节段cDNA质粒中(pHB-60)(数据未示出)。源自用野生型D6948感染的囊的dsRNA的PCR片段，不含有此遗传标记(数据未示出)。
已经公布了一些研究，其中得自非B淋巴细胞培养适应的(极)烈性IBDV分离株的氨基酸变化已经作图(20，22，33)。迄今为止所述的反向遗传IBDV系统(3，20，22)，只能从源自适应的(即能在非B淋巴细胞上生长的)IBDV分离株的克隆的cDNA中拯救IBDV。由于这一限制，在拯救的具有原始B淋巴细胞嗜性的IBDV中没有诱变研究可进行。为克服此限制，我们修改了从克隆的cDNA中拯救IBDV的方法。
使用原始囊细胞探索拯救vvIBDV的可能性。因此我们首先用含有A和B节段cDNA的质粒转染原始囊细胞。我们发现囊的B淋巴细胞转染是非常无效的。细胞非常易碎，且分离和维持这些B淋巴细胞是非常费力的。
另外，与B淋巴细胞一起分离自囊的成纤维细胞在体外迅速生长，与淋巴细胞相反。此生长速率的不同在温育42小时后产生一个主要由非B淋巴细胞组成的单层，此时间点是使用禽痘病毒T7体内表达系统进行转染所需的时间。
在寻求拯救vvIBDV的更有效的系统中，我们接着修改了从转染的QM5细胞中拯救细胞培养适应的IBDV(CEF94，(3))的方法，即收集转染的QM5细胞(不允许增殖野生型IBDV的细胞)的上清，并将其移至原始囊细胞(含有B淋巴细胞，其是允许增殖野生型IBDV的细胞)的单层中。此方法使我们能从克隆的cDNA(rD6948)中拯救vvIBDV。将拯救的D6948接着随同野生型D6948一起用于动物实验中，以确定其毒力。将鸡(21天龄，SPF)用不同的IBDV分离株感染。对比在感染后9天收集的所有分析的参数(死亡率，腔上囊重/体重比值，组织病理学囊损害评分，免疫组织化学分析，抗体效价(表17)，和发病率(数据未示出))，示出野生型和拯救的D6948的毒力相同。这表明拯救的D6948确实是极烈性的。D6948和rD6948的dsRNA分离自感染的鸡的囊，并用于RT-PCR中，随后进行直接序列测定。由D6948 A节段cDNA质粒编码的多蛋白的VP4部分中的遗传标记，正如所期望的存在于rD6948衍生的dsRNA中(数据未示出)。得自A节段cDNA中的遗传标记的VP4中的单突变(I563V)，不引起rD6948的表型(在体外和在体内)与D6948相比有变化。这是第一篇阐述从克隆的cDNA中拯救野生型vvIBDV分离株的报道。
在已经证实D6948的推导的cDNA序列确实代表真实vvIBDV序列之后，我们将D6948蛋白的推导的氨基酸序列与其它(vv)IBDV分离株的序列相对比。经典减毒的分离株CEF94和vvIBDV分离株D6948的VP5序列之间的明显不同是vvIBDV VP5的N末端具有4个氨基酸延伸(见图16a)。此延伸也预计在两个其它vvIBDV分离株中出现，此区域的序列已经公布(HK46(20)和UK661(7))。所有经典分离株缺失此N末端延伸，而只此区域cDNA序列可知的唯一抗原性变体(GLS)具有同样延伸。在85位的AUG密码子是否确实用作起始密码子以产生极烈性和GLS分离株的VP5还需确定。令人感兴趣的是N末端延伸的VP5是否导致不同表型。在VP5的其它氨基酸差异(图16A)中，在所有已知的vvIBDV VP5序列只发现R49G和W137R(UK661，OKYM(33)，和HK46)。一些报道针对不同起源的IBDV分离株的pVP2序列之间的不同(例如(15))。在253，279，284和330位氨基酸的不同(图16B)主要是CEF94在CEF细胞上适应的结果(20，22，33)。在所有4个vvIBDV分离株(D6948，UK661，OKYM和HK46)与经典和抗原性变体分离株的公布的序列的对比中，剩余的氨基酸不同只有8个是保守的(见黑体表示的氨基酸残基，图16B)。
CEF94的VP1/VPg的ORF的长度比D6948的相同ORF长2个氨基酸。其它研究人员也已经发现VP1/VPg ORF的长度的不均匀性(34)。vvIBDV分离株的所有VP1/VPg表现为具有879个氨基酸，而一些经典分离株的VP1只具有877个氨基酸。CEF94的VP1/VPg的881个氨基酸是迄今为止公布的最大的VP1。另外，我们在CEF94和D6948的VP1/VPg序列之间鉴别了17个氨基酸不同(图16C)。尽管已经发现IBDV的减毒导致VP1序列中氨基酸变化(34)，但没有证实由Yehuda等鉴别的3个变化与减毒直接相关。事实上我们示出含有经典减毒的IBDV分离株的B节段的节段重排列的IBDV(srIBDV-DACB，见表16)，诱导与野生型极烈性IBDV相同的死亡率和组织病理学损害。这表明在适应后在VP1中发现的氨基酸变化与病毒的减毒不相关。17个氨基酸不同中的6个在cDNA序列已经公布的所有vvIBDV分离株中发现(见图16C中黑体所示的氨基酸残基)。
为确定不同分离株的病毒蛋白之间氨基酸差异，我们构建了含有CEF94和D6948的cDNA的质粒。在SDS-PAGE分析中发现由CEF94和D6948编码的pVP2蛋白之间分子量的小差异(图18A)。在SDS-PAGE凝胶分析中也发现由pHB36W和pHB36-vvVP2编码的pVP2蛋白位置的不同(图18C)。由pHB36-vvVP3和pHB36-vvVP4编码的VP4的位置，与由pHB36-36W编码的VP4相比，存在小差异。在CEF94和D6948的两个VP3蛋白之间的第一个氨基酸差异(H751D，图16B)，在所述裂解位点的下游的28个氨基酸处发现(在722位氨基酸之后(18)，见图16B)。如果VP4-VP3的真实裂解位点不在两个碱性氨基酸残基之后，而是在其至少28个以上氨基酸下游，则可解释VP4的分子量的不同。VP4/VP3之间的可变裂解位点已有提出位于736位氨基酸之后(在Tyr-Leu之后(13))，或在752-756区域(A-X-A-A-S，(18))。近来使用定位诱变方法，确实示出位于VP4和VP3之间的裂解位点更可能在755-756氨基酸残基之间(27)。我们观测到抗起自722位的部分多蛋白的多克隆抗体也能与VP4强烈反应，进一步证实真实裂解位点位于722位氨基酸的下游(Boot未公布的数据)。
检测衍生自镶嵌A节段质粒的病毒在QM5细胞和/或原始囊细胞上的生长，并用于攻击SPF鸡。含有D6948的A节段和CEF94的B节段的节段重排列的病毒(srIBDV-DACB，表16)，诱导与野生型和重组D6948相同的临床迹象和损害(表17)。在经典(适应的)和极烈性(非适应的)分离株的VP1/VPg蛋白内发现的不同显然对毒力没有主要影响。交互组合(srIBDV-DACB，表16)在单层原始囊细胞中与rCEF94相比诱导较少的CPE(图19)。我们还发现与CEF94和rCEF94相比，srIBDV-CADB的新病毒颗粒释放延迟(图20)。尽管这些分离株之间体外病毒释放有差异，但我们发现在用SPF鸡进行的体内攻击中没有差异。在感染后9天(表17)和15天(数据未示出)的rCEF94和srIBDV-CADB的IBDV抗体效价是相当的。已有提示血清型I和II分离株的B节段之间的重排列在野外发生(7)。天然发生的节段重排列通常在高度节段化的dsRNA(呼肠孤病毒和轮状病毒，(26))发现。我们未发现IBDV节段的天然重排列的任何系统发生证据。当与经典血清型I分离株和血清型II分离株相比时，所有vvIBDV的VP1蛋白均具有独特的氨基酸变化(图16C，数据未示出)。尽管未证实IBDV重排列在野外呈现，通过共培养属于不同血清型的毒株，Muller已在实验室中成功产生节段重排列的病毒(21)。
将CEF94的pVP2(包括大部分VP5)，VP3或VP4用D6948的相应蛋白质交换，均产生存活的病毒。mCEF94-vvVP3和mCEF94-vvVP4均能在QM5细胞上复制，而mCEF94-vvVP2只能在B淋巴细胞上复制。我们发现mCEF94-vvVP3，mCEF94-vvVP4，CEF94和rCEF94在QM5细胞上的单步生长曲线没有不同(数据未示出)。先前已经示出与在非B淋巴细胞中增殖相关的因子位于VP2上(20，22，32)。在此研究中，我们示出一旦将其人工导入(DNA转染)这些细胞中，野生型vvIBDV能在QM5细胞中复制。因此不能在非B淋巴细胞增殖显然是由于不能识别受体和/或进入细胞所致。对野生型VP2的突变所致的细胞嗜性的这种变化有两种可能解释，1)这些突变导致VP2(构象)变化，产生时在许多细胞上存在的受体的识别(普通IBDV受体)，同时丧失特异性B淋巴细胞受体识别(B淋巴细胞IBDV受体)。与普通IBDV受体和B淋巴细胞IBDV受体相互作用相关的结构域，在此情况中位于VP2的相同区域(例如高变区)。2)这些突变导致VP2(构象)变化，产生普通IBDV受体识别，但仍保持B淋巴细胞IBDV受体识别(通过VP2，VP3，或其组合)。细胞培养适应的IBDV仍然能进入和在B淋巴细胞中复制的现象，可通过普通IBDV受体也在B淋巴细胞上存在加以解释(进入模式1和2)。当B淋巴细胞中没有普通IBDV受体时，进入模式2甚至预测细胞培养适应的分离株通过使用真正的B淋巴细胞受体在B淋巴细胞中复制。
已经发现两种特异性氨基酸突变(天冬氨酸279→天冬酰胺279，丙氨酸284→苏氨酸284)单独或组合第三种突变(谷氨酰胺253→组氨酸253)，可足以改变野生型IBDV毒株的嗜性，将独特的B淋巴细胞嗜性改变为更普通的嗜性(例如VERO，QM7，QM5或CEF细胞)。支持这种论点只公布了一些有限的数据(20，22，33)。具有所有这些适应性突变的IBDV毒株(在253位的组氨酸，在279位的天冬酰胺，在284位的苏氨酸)能在B淋巴细胞上生长，但仍然不能在非B淋巴细胞上生长，也可能是由于在VP2或一种其它病毒蛋白某处另外的特异性氨基酸序列所致。


图1在具有高水平母体抗体的broiler中于0天的抗体效价。
图2aA节段的核苷酸序列图2bB节段的核苷酸序列图3a多蛋白的氨基酸序列图3bVP1的氨基酸序列图3cVP5的氨基酸序列图4质粒5apHB36-vvVP2的构建图5bpHB36-vvVP3的构建图5cpHB36-vvVP4的构建图5dpHB36-s2VP3的构建图5epHB36-s2VP3C的构建图5fpHB36-s2VP3N的构建图5gpHB36-s2VP3C1的构建图6细胞培养适应的血清型I经典毒株CEF94和野生型血清型II毒株TY89的cDNA的VP3编码部分的氨基酸序列的对比。给出CEF94蛋白的序列，而针对TY89只示出了与CEF94序列不同的那些氨基酸。相同的氨基酸用圆点表示。质粒pHB36-s2VP3编码血清型II的全部给定的氨基酸序列(TY89)。用于推导氨基酸序列的A节段cDNA的核苷酸序列已经保藏在GenBank的数据库中A节段CEF94(AF194428，全长)，TY89(xxxxx，部分)。示出了相应cDNA(见图7)中SacII和ScaI位点的位置。
图7含有全长血清型I(CEF94)IBDV A节段cDNA(pHB-36W)，和基于血清型I(CEF94)和血清型II(TY89)IBDV毒株的基因组的镶嵌全长A节段cDNA(pHB36-s2VP3N，pHB36-s2VP3C和pHB36-s2VP3)的质粒的图示。空心框代表基于血清型I cDNA的开放读框，而阴影框代表血清型II cDNA。一些遗传元件如多蛋白的剩余部分，VP5 ORF，T7 RNA聚合酶启动子和终止子序列，及丁型肝炎病毒核酶(HDVR)仅在pHB-36W中示出，但它们也存在于其它质粒的相同位置。
图8IBDV蛋白的SDS-PAGE分析。a)用含有CEF94全长A节段序列(泳道1pHB-36W)或镶嵌全长A节段序列(泳道2pHB36-s2VP3，泳道3pHB36-s2VP3N，或泳道4pHB36-s2VP3C)的质粒，在体外联合进行转录/翻译反应的放射自显影。病毒(前体)蛋白的位置在右侧表示，标记蛋白(14C标记的Amersham Rainbow标记)的位置及其大小(kDa)在左侧表示。b)血清型I(泳道1CEF94)和血清型II(泳道2TY89)的纯化的IBDV的Western印迹分析。VP3蛋白(以箭头表示)是用VP3特异性单克隆抗体观测的。标记蛋白(预染色的Amersham Rainbow标记)的位置及其大小(kDa)在右侧表示。c)免疫沉淀的35C-甲硫氨酸标记的IBDV蛋白的放射自显影。源自pHB-36W(泳道1)，pHB36-s2VP3(泳道2)，pHB36-s2VP3N(泳道3)，或pHB36-s2VP3C(泳道4)的体外合成的病毒蛋白，用抗血清型I VP3和VP4的多克隆抗体(PaVP3/4)，或用特异于血清型I(Mab IVSI)或血清型II(Mab VIISII)的VP3的单克隆抗体免疫沉淀。
图9rCEF94和mCEF94-s2VP3C的单步生长曲线。QM5细胞用IBDV感染(m.o.i.＝5，T＝0h)1小时，冲洗4次，并用新鲜培养基覆盖。样品取自不同时间点的上清，并确定IBDV的数量(TCID50/ml)。误差杆代表标准差。
图10在(m)IBDV感染的QM5细胞中用不同的单克隆抗体检测VP3抗原。QM5细胞的新鲜单层用rCEF94，mCEF94-s2VP3，mCEF94-s2VP3N，或mCEF94-s2VP3C感染，并温育48小时。特异于IBDV的VP3的不同单克隆抗体在IPMA中用于确定与不同的镶嵌病毒的反应性。所有使用单克隆抗体进行的IPMA的结果概括示于表11。
图11含有全长(杂种)A节段cDNA序列的质粒图示。只针对pHB-36W和pHB60绘出了T7启动子序列，丁型肝炎病毒核酶(HDR)，和T7终止子，但其也存在于每个质粒中。空心框表示CEF94cDNA，而黑框表示TY89 cDNA。
图12在用pHB-36W(1)，pHB36-s2VP3(2)，pHB36-s2VP3N(3)，pHB36-s2VP3C(4)，pHB-60(5)，pHB60-s2VP3N(6)，pHB60-s2VP3C1(7)，pHB60-s2VP3C3(8)转染FP-T7感染的QM-5细胞后24小时分离的蛋白质样品的Western印迹分析。将含有等量细胞提取物的4个SDS-PAGE凝胶印迹于硝化纤维上，并用4种指示的Mabs检测VP3。大小标记(Rainbow标记，Amersham)以kDa在左侧表示。
图13对比经典的细胞培养适应的血清型I CEF94毒株，极烈性血清型I D6948毒株和野生型血清型II TY89毒株的VP3的氨基酸序列。给出了CEF94蛋白的序列，而D6948和TY89只给出了与CEF94不同的那些氨基酸。示出了在相应cDNA(见图11)中SacII和ScaI内切酶限制位点的位置。
图14用苏木精-曙红(H&E)染色的福尔马林固定的囊切片。用指示的病毒(右上角所示)感染的21天龄蛋鸡型SPF鸡在感染后13天进行安死术，检测囊。根据Bayyari等(1996)所述确定滤泡结构的总损害，并示于表13。
图15竞争性ELISA的所得数据。包被CEF94 VP3抗原，将用指示的病毒感染的鸡的稀释血清样品(取自感染后13天)与MabIVSI或I/G4SI混合。结合的Mab的数量用缀合过氧化物酶的兔抗小鼠抗体和作为底物的TMB进行确定。
图16野生型vvIBDV分离株D6948和细胞培养适应的经典分离株CEF94的cDNA的不同ORF之间的氨基酸对比。给出了D6948蛋白完整的序列，而对CEF94(在D6948序列之下)只给出了与D6948不同的那些氨基酸。用于推导氨基酸序列的A和B节段的核苷酸序列，可见于GenBank数据库(登记号在括号内表示A节段D6948(AF240686)和CEF94(AF194428)及B节段D6948(AF240687)，和CEF94(AF194429))。A)由A节段的第一个ORF(VP5)编码的氨基酸序列，B)由A节段的第二个ORF(多蛋白)编码的氨基酸序列。多蛋白的VP4(下划线)之前为pVP2，而VP3位于C末端(见图17)。使用在pVP2与VP4之间及VP4之间并由(18)所提示的推定的裂解位点。只是在最近才示出真正的裂解位点更可能位于氨基酸512-513(pVP2-VP4)和755-756(VP4/VP3)之间(27)。C)由B节段编码的单一ORF编码的氨基酸序列(VP1/VPg)。相应氨基酸缺失时用破折号表示。在所有vvIBDV序列中发现的氨基酸变化用黑体表示。据报道参与对非B淋巴细胞的适应的氨基酸残基以斜体表示。
图17含有野生型极烈性IBDV分离株D6948的A节段(pHB-60)和B节段(pHB-55)的全长cDNA序列的质粒的图示。cDNA序列之前为T7启动子序列，后接丁型肝炎病毒核酶(HDR)，和T7终止子。不同的ORF以空心框表示。
图18体外联合转录/翻译反应的SDS-PAGE分析的放射自显影。A)减毒的经典IBDV分离株CEF94(泳道1)和野生型极烈性IBDV分离株D6948(泳道2)的全长A节段质粒。B)CEF94(泳道1)和D6948(泳道2)的全长B节段质粒。C)全长A节段的CEF94(泳道1)和经典减毒IBDV分离株(pHB-36)的全长A节段质粒，其中pVP2(pHB36-vvVP2，泳道2)，VP3(pHB36-vvVP3，泳道3)，或VP4(Phb36-vvVP4，泳道4)已经交换。病毒蛋白的位置在右侧表示。标记蛋白(Rainbow标记，Amersham)的大小在左侧表示。
图19用VP3/4多克隆抗血清检测IBDV。将不同的质粒转染物的上清样品用于感染QM5或原始囊细胞。在感染后，将QM5细胞温育24小时，而原始囊细胞温育48小时。通过进行免疫过氧化物酶单层分析观测IBDV蛋白。
图20CEF94，rCEF94和srIBDV-CADB的单步生长曲线。将QM5细胞用IBDV感染(m.o.i.＝5，T＝0h)1小时，冲洗4次，并用新鲜培养基覆盖。在不同时间点取上清，并确定IBDV数量(TCID50/ml)。在每个时间点的TCID50值是3个独立实验的平均值；误差杆代表标准差。
图21具有源自D6948 cDNA的中间部分(阴影框)，和源自CEF94 cDNA的两侧部分(空心框)的嵌合PCR片段的构建图示。为构建pHB-36-vvVP2，我们首先产生了PCR片段VP2a，VP2b，和VP2c。将这些PCR片段纯化，接着在融合PCR中用作模板，产生PCR片段VP2d(17)。接着将此PCR片段纯化，并通过使用指定的EcoRI和SacII限制位点，用于置换CEF94 A节段cDNA的相应部分。用相同方法使用不同引物产生pHB36-vvVP3和pHB36-vvVP4，以产生PCR片段和不同限制位点以将PCR片段导入全长A节段克隆中(见材料与方法章节和表16)。
图22用VP3/4多克隆抗血清检测镶嵌IBDV。将不同质粒转染物上清的样品用于感染QM5和原始囊细胞。在感染后，将QM5细胞温育24小时，原始囊细胞温育48小时(见图19)。与阴性对照(模拟感染的)相反，阴性对照中没有B淋巴细胞阳性染色(数据未示出)，我们发现在在下面一组示出IPMA中一些染色的B淋巴细胞分散于组织培养皿中。
表1用于在由母体IBDV抗体被动保护的幼鸡中诱导活性保护的活IBDV疫苗的分类

*动物健康服务机构(Deventer，荷兰)使用Idexx Elisa值128(2log7)作为使用活中度疫苗的最大效价，512(2log9)为强疫苗的最大效价。表2在RT-PCR或PCR反应中用于确定序列的引物(寡核苷酸)。不能与野生型IBDV基因组杂交的核苷酸以小写字母表示。示出了特异于血清型II(s2)或极烈性(vv)基因组的引物。

表3相应于IBDV(CEF94)两个基因组节段的编码链的5′和3′末端的核苷酸序列。具体序列之后的数字表示获得每个序列的次数A节段编码链的5′末端A节段非编码链的5′末端的 B节段编码链的5′末端 B节段非编码链的5′末端的互补互补序列序列5′UGAUACGAUC>>>>>>CGGG 3′5′UGAUACGAUG>>>(2x) >>>GGGGGCCA 3′5′AGAUACGAUC>>>>>>CGGGUCCC 3′5′GGAUACGAUG>>>(5x) >>>GGGGGCCU 3′5′GGAUACGAUC>>>(7x)>>>CGGGUCCCU 3′>>>GGGGGCCC 3′(2x)>>>CGGGUCCCC 3′(6x)>>>GGGGGCCCC 3′(2x)>>>CGGGUCCCCCC 3′ >>>GGUGGCCCCC 3′>>>CGGGUCCCCCCU 3′ >>>GGGGGCCCCCC 3′>>>CGGGUCCCCCCC 3′ >>>GGGGGCCCCCG 3′共有5′GGAUACGAUC>>>>>>CGGGUCCCC 3′(nt3260) 5′GGAUACGAUG>>> >>>GGGGGCCCCC 3′(nt2827)表4 所用质粒的描述名称 所基于的质粒 描述pUC18-RibopUC18 含有pTV-2A的SmaI-XbaI片段pHB-36A pUC18-Ribo含有CEF94的A节段的共有cDNA序列(见图2a)pHB-36W pHB-36A 在CEF94 A节段编码cDNA的3′-UTR中有一人工导入的KpnI位点(遗传标记)(图2)pHB-36pHB-36A 含有在多蛋白的VP4部分的一致死氨基酸取代(V582A)pHB-60pUC18-Ribo含有D6948 A节段的共有cDNA序列(见图2a)pHB-34Z pUC18-Ribo含有CEF94 B节段的共有cDNA序列(见图2b)pHB-55pUC18-Ribo含有D6948 B节段的共有cDNA序列(见图2b)pSV-TY89-VP3 pGEM-Teasy含有编码完整VP3的TY89的共有cDNA(A节段，见图2)pHB36-vvVP2 pHB-36W 含有编码完整VP2(453个氨基酸)的D6948 A节段的cDNApHB36-vvVP3 pHB-36W 含有编码完整VP3(289个氨基酸)的D6948 A节段的cDNApHB36-vvVP4 pHB-36W 含有编码完整VP4(270个氨基酸)的D6948 A节段的cDNApHB36-s2VP3 pHB-36W 含有编码完整VP3(289个氨基酸)的TY89 A节段cDNApHB36-s2VP3C pHB-36W 含有编码VP3的C-末端部分(122个氨基酸)的TY89 A节段cDNApHB36-s2VP3N pHB-36W 含有编码VP3的N-末端部分(168个氨基酸)的TY89 A节段cDNApHB60-s2VP3C1 pHB-60含有编码嵌合多蛋白(D6948(1-543AA)、CEF94(544-889AA)和TY89(890-1012AA))的cDNA。5′-UTR衍生自D6948，而3′-UTR衍生自CEF94。在3′-UTR中还存在一单一KpnI位点(遗传标记)表5 所产生的rIBDV3 srIBDV和mIBDV的描述。用抗VP3的多克隆抗血清或抗IBDV血清型I的VP2(1.4)、血清型II的VP3(T-75)或血清型I的VP3(B10和C3)的单克隆抗体，在免疫过氧化物酶单层分析(IPMA)中检测这些病毒感染QM5或原始囊细胞的能力；nd是指未确定IBDV病毒 所衍生的质粒 在如下细胞上的复制 单克隆抗体A节段 B节段QM5细胞 囊 1.4 T75 B10 C3rCEF94pHB-36W pHB-34Z + + + -++rD6948pHB-60 pHB-55 - + + -++srIBDV-DACB pHB-60 pHB-34Z - + ndnd nd ndsrIBDV-CADB pHB-36W pHB-55 +nd ndnd nd ndmCEF94-vvVP2 pHB36-vvVP2 pHB-34Z - + ndnd nd ndmCEF94-vvVP3 pHB36-vvVP3 pHB-34Z +nd ndnd nd ndmCEF94-vvVP4 pHB36-vvVP4 pHB-34Z +nd ndnd nd ndmCEF94-s2VP3 pHB36-s2VP3 pHB-34Z +nd + +- +/-mCEF94-s2VP3C pHB36-s2VP3CpHB-34Z +nd + +- +/-mCEF94-s2VP3N pHB36-s2VP3NpHB-34Z +nd ++/- +-mD6948-s2VP3C1pHB60-s2VP3C1 pHB-55 - + + +- +/-表6 用野生型、rIBDV、srIBDV或mIBDV分离株感染的21日龄小鸡的临床数据(12组，每组10只小鸡)。除阴性对照组(PBS)之外，每一小鸡用1000 ELD50IBDV接种，每一组在单独的分离器中保持。在感染后第9天测定安乐死小鸡的腔上囊重和体重。括号中给出标准差以及用于测定所得数值的动物数(n)。计算每一动物的腔上囊重/体重比，并给出每组平均值(标准差)。IBDV病毒 死亡数(9天后) 体重(克) 腔上囊重(克) 腔上囊重/体重(×1000)PBS 0 305(29，n＝10) 1.9(0.4，n＝10) 6.1(1.2)CEF940 341(16，n＝6)2.0(0.6，n＝6) 6.0(1.8)D69483 245(56，n＝7)0.4(0.1，n＝7) 1.7(0.6)rCEF94 0 317(15，n＝6)1.3(0.5，n＝6) 4.2(1.3)rD6948 5 261(24，n＝5)0.4(0.1，n＝5) 1.7(0.2)srIBDV-DACB 2 263(35，n＝8)0.4(0.1，n＝8) 1.5(0.3)srIBDV-CADB 0 314(13，n＝6)1.8(0.8，n＝6) 5.7(2.7)mCEF94-vvVP2 0 309(27，n＝6)0.6(0.2，n＝6) 1.9(0.4)mCEF94-vvVP3 0 325(33，n＝6)2.0(0.3，n＝6) 6.2(0.7)mCEF94-vvVP4 0 330(23，n＝6)1.5(0.5，n＝6) 4.4(1.3)mCEF94-s2VP3C0 320(11，n＝6)1.3(0.4，n＝6) 4.1(1.3)mD6948-s2VP3C1 0 315(26，n＝6)0.6(0.2，n＝6) 1.9(0.6)表7 IBDV分离株的来源和表型分离株 参考文献 毒力D6948 Boot等，未发表 极烈性rD6948 Boot等，未发表 极烈性UK661 Brown和Skinner，1996 极烈性5123 Ter Huurne等，未发表 极烈性96-B4 Ter Huurne等，未发表 无毒96-C4 Ter Huurne等，未发表 无毒96-C5 Ter Huurne等，未发表 无毒96-C6 Ter Huurne等，未发表 极烈性97-B3 Ter Huurne等，未发表 无毒97-B4 Ter Huurne等，未发表 极烈性97-B5 Ter Huurne等，未发表 极烈性97-B6 Ter Huurne等，未发表 极烈性Zoontjes Ter Huurne等，未发表 极烈性HungaryTer Huurne等，未发表 极烈性OKYM Yamaguchi等，1996极烈性OKYMT Yamaguchi等，1996无毒TKSM Yamaguchi等，1996极烈性TKSMT Yamaguchi等，1996无毒HK46 Lim等，1999 极烈性HK46-NTLim等，1999 未确定表8 不同IBDV分离株VP2的高变区的氨基酸序列。极烈性分离株D6948的亲水区(下划线)和疏水区的序列(氨基酸214-328)用作亲本分离株以与其它序列进行对比。相同氨基酸用-号表示。D6948 214AADDYQFSSOYQAGGVTITLFSANIDAITSLSIGGELVFQTSVQGLILGATIYLIGFDGTAVITRAVAADNGLTAGTDNLMPFNIVIPTSEITQPITSIKLEIVTSKSGGQAGDOMSWS328rD6948 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------UK661-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------5123 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------96-B4------------P-------------------V-------------V------------T-------N-----T-----L---------N-----------------------------96-C4------------L--------------------------N------A-N----------T------S------T-I-------------N-----------------------------96-C5------------P-------------------V-------------V--------------------Y-----T-----L---------N-----------------------------96-C6-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------97-B3-------------------------------------------------------------------N---------------------------------------------------97-B4-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------97-B5-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------97-B6-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Zoontjes -------------------------------------------------------------------------------------------T---------V-----------------Hungary -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------OKYM -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------OKYMT----------------------T----------------------------------------------N----T------------------------------F-------------TKSM -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TKSMT----------------H--------D-------------------------------------------N----T--------------------------------------------HK46 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------HK46-NT ---------------------------------------------------------------------N----T--------------------------------------------表9病毒A节段质粒 B节段质粒 特征rCEF94 pHB-36WpHB-52 拯救的CEF94mCEF94-s2VP3pHB36-s2VP3pHB-52 拯救的镶嵌IBDV，其编码由源自CEF94的氨基酸1-723和源自TY89的氨基酸724-1012组成的多蛋白；已交换了760个核苷酸，其中102个是不同的(13％)mCEF94-s2VP3N pHB36-s2VP3N pHB-52 拯救的镶嵌IBDV，其编码由源自CEF94的氨基酸1-723和857-1012和源自TY89的氨基酸724-856组成的多蛋白；已交换了398个核苷酸，其中65个是不同的(16％)mCEF94-s2VP3C pHB36-s2VP3C pHB-52 拯救的镶嵌IBDV，其编码由源自CEF94的氨基酸1-856和源自TY89的氨基酸857-1012组成的多蛋白；已交换了371个核苷酸，其中37个是不同的(16％)表10病毒 转染后TCID50最大*TCID50实验1 实验2 实验3 平均rCEF94 4.95.64.75.17.0mCEF94-s2VP3 2.00.31.01.16.0mCEF94-s2VP3N3.03.52.93.16.1mCEF94-s2VP3C5.05.04.34.86.9*在最初拯救的病毒传代3次后测定表11单克隆抗体所抗的抗原 IBDV蛋白在免疫过氧化物酶单层分析中的反应CEF94 TY89 rCEF94mCEF94-s2VP3 mCEF94-s2VP3N mCEF94-s2VP3C1.4 VP2，血清型I + - ++ + +9.8 VP2，血清型I + - ++ + +9.7 VP3，血清型I + + ++ + +IV VP3，血清型I + - +- + -I/G4 VP3，血清型I + - +- + -VII VP3，血清型II- + -+ - +17/80VP3，血清型I + + ++ + +表12 所用病毒的描述名称所基于的质粒2主要特征CEF94 n.r. 血清型I，细胞培养物适应的经典IBDV毒株D6948 n.r. 血清型I，极烈性IBDV野毒株TY89n.r. 原型血清型II IBDV野毒株rCEF94 pHB-36W+pHB-34Z 拯救的CEF94细胞培养物适应的经典IBDVrD6948 pHB-60+pHB-55 拯救的D6948极烈性IBDVmCEF94-s2VP3pHB36-s2VP3+pHB-34Z 具有杂合多蛋白的拯救镶嵌IBDV；CEF94的氨基酸1-723及TY89的氨基酸723-1012mCEF94-s2VP3N pHB36-s2VP3N+pHB-34Z 具有杂合多蛋白的拯救镶嵌IBDV；CEF94的氨基酸1-723和857-1012及TY89的氨基酸723-856mCEF94-s2VP3C pHB36-s2VP3C+pHB-34Z 具有杂合多蛋白的拯救镶嵌IBDV；CEF94的氨基酸1-856及TY89的氨基酸857-1012mD6948-s2VP3N1pHB60-s2VPN+pHB-55编码杂合多蛋白的镶嵌IBDV cDNA；D6948的氨基酸1-723和857-1012及TY89的氨基酸723-856mD6948-S2VP3C1 pHB60-s2VP3C1+pHB-55 具有杂合多蛋白的拯救镶嵌IBDV；D6948的氨基酸1-543，CEF94的氨基酸544-856及TY89的氨基酸857-1012mD6948-s2VP3C3 pHB60-s2VP3C3+pHB-55 具有杂合多蛋白的拯救镶嵌IBDV；D6948的氨基酸1-856及TY89的氨基酸857-10121这一病毒不能被拯救2n.r.不相关表13 小鸡感染实验1和2的实验数据病毒 CODE死亡率 Idexx抗体效价2VN效价3腔上囊重量(g)4腔上囊重/体重5HBLS6实验1 99.161PBSGr.10/100(0，10，0) 0.0(0.0) 1.9(0.4，10)6.1(1.2) 1.0(0.0，9)CEF94 Gr.20/10207(507，6，1) 6.5(1.2) 2.0(0.6，6) 6.0(1.8) 1.6(1.1，10)rCEF94 Gr.40/10260(290，6，3) 9.7(1.8) 1.3(0.5，6) 4.2(1.3) 1.9(0.7，10)mCEF94-s2VP3C Gr.11 0/10824(433，6，6) 10.8(1.5) 1.3(0.4，6) 4.1(1.3) 1.1(0.3，10)D6948 Gr.33/101626(690，7，7) 10.3(1.4) 0.4(0.1，7) 1.7(0.6) 5.0(0.0，7)rD6948 Gr.55/101549(791，4，4) 10.3(1.5) 0.4(0.1，5) 1.7(0.2) 5.0(0.0，4)mD6948-s2VP3C1 Gr.12 0/10956(326，6，6) 10.8(1.2) 0.6(0.2，6) 1.9(0.6) 5.0(0.0，8)实验2 99.18PBSGr.10/150(0，15，0) 0.0(0.0) 2.3(0.7，15)6.1(1.8) 1.4(1.3，10)D6948 Gr.28/152489(948，7，7) 11.7(1.6) 0.3(0.2，7) 0.8(0.7) 5.0(0.0，8)rD6948 Gr.3+6 7/302308(905，23，23) 10.0(1.5) 0.3(0.1，23)1.0(0.4) 5.0(0.0，20)mD6948-s2VP3C1 Gr.41/152122(1300，14，14) 9.0(1.8) 0.9(0.2，14)2.7(0.7) 4.7(0.7，10)mD6948-s2VP3C3 Gr.50/151760(880，15，15) 8.8(1.6) 0.5(0.1，15)1.6(0.4) 5.0(0.0，10)1感染后前5天累积的死亡数/受攻击的小鸡总数2平均值(标准差，所用小鸡样品数，阳性样品数)3中和抗体的存在用CEF94IBDV毒株确定；效价以2Log值(标准差)给出4给出每组小鸡的平均腔上囊重量(×1000)(标准差，动物数)5计算每一动物的腔上囊重量/体重比，并给出每组平均值(标准差)6给出感染后存活的小鸡的根据Bayvari等(1996)的平均组织病理囊损害评分(HBLS)(标准差，记录的腔上囊数)表14 用mD6948-s2VP3C3感染前和感染后的IBDV特异抗体效价(Idexx)p.h.天数1组12组2 组3 组4 组57 1997(300，17，17)2991(543，17，17) 3332(691，18，18)3657(676，17，17)3970(446，14，14)15 18(75，17，1)361(101，17，16) 576(65，18，18) 899(150，17，17) 1283(154，14，14)18 感染 感染 感染 感染 感染22 0(0，17，0) 0(0，17，0) 0(0，17，0) 0(0，17，0) 95(261，14，2)25 391(600，12，4) 822(1261，12，5) 477(1166，13，2) 479(750，12，4) 516(1084，9，3)32 1587(852，12，11)1468(746，12，12) 367(882，12，2) 0(0，11，0) 0(0，9，0)42 3241(905，11，11)2877(1177，10，10)149(227，11，4) 132(234，11，2) 2809(633，9，9)1p.h.＝孵化后2给出的抗体效价是阳性动物平均值，带标准差(括号中的第一个值)，所用动物样品数(括号中第二个值)，阳性样品数(括号中的第三个值)，数值的测定是在给定孵化后天数对每组中每一小鸡重复测定的。表15 用mD6948-s2VP3C3感染前和感染后测定的IBDV中和抗体效价p.h.天数1组12组2 组3 组4 组5157.2(0.8，17) 8.8(1.0，17) 9.3(1.4，15)9.3(1.4，15)9.9(1.2，14)18感染 感染 感染感染感染255.8(1.9，12) 4.8(1.6，12) 6.4(1.5，8) 7.6(1.6，7) 7.3(0.9，9)3210.9(1.1，12)10.8(1.4，12)5.3(1.2，12)5.4(0.7，11)5.6(0.7，9)429.8(1.6，11) 10.0(1.3，10)3.6(0.9，11)3.7(0.7，11)9.3(1.3，9)1p.h.＝孵化后2给出的值是属于相同组的动物的个体2Log病毒中和抗体效价平均值，括号中数值分别是标准差和所用血清数表16 质粒和病毒的描述名称 所基于的质粒*主要特征质粒pUC18-Ribo pUC18含有丁型肝炎病毒核酶pHB-22RpGEM-T D6948 A节段cDNA(共有序列)pHB-60 pUC18-Ribo D6948 A节段cDNA，包括一遗传标记pHB-36WpUC18-Ribo CEF94 A节段cDNA，包括一遗传标记pHB-34ZpUC18-Ribo CEF94 B节段cDNA(共有序列)pHB-55 pUC18-Ribo D6948 B节段cDNA(共有序列)pHB36-vvVP2pHB-36W CEF94 cDNA的pVP2被D6948的pVP2替换(453个氨基酸)pHB36-vvVP3pHB-36W CEF94 cDNA的VP3被D6948的VP3替换(289个氨基酸)pHB36-vvVP4pHB-36W CEF94 cDNA的VP4被D6948的VP4替换(270个氨基酸)病毒CEF94 n.r. 细胞培养物适应的经典IBDV分离株(PV1衍生物)D6948 n.r. 极烈性IBDV野毒株(荷兰，1989)rCEF94 pHB-36W+pHB-34Z 拯救的IBDV细胞培养物适应的经典IBDVrD6948 pHB-60+pHB-55拯救的IBDV极烈性IBDVsrIBDV-CADBpHB-36W+pHB-55 拯救的节段重配IBDV(A节段＝CEF94，B节段＝D6948)srIBDV-DACBpHB-60+pHB-34Z 拯救的节段重配IBDV(A节段＝D6948，B节段＝CEF94)mCEF94-vvVP2 pHB36-vvVP2+pHB-34Z 拯救的镶嵌IBDV，pVP2源自D6948，其余部分来自CEF94mCEF94-vvVP3 pHB36-vvVP3+pHB-34Z 拯救的镶嵌IBDV，VP3源自D6948，其余部分来自CEF94mCEF94-vvVP4 pHB36-vvVP4+pHB-34Z 拯救的镶嵌IBDV，VP4源自D6948，其余部分来自CEF94*n.r.不相关表17 用1000 ELD50的野生型、rIBDV、srIBDV或mIBDV分离株攻击的21日龄小鸡的实验数据病毒*死亡率1腔上囊重量(g)2腔上囊重量/体重3HBLS4IBDV抗原5抗体效价6(Idexx)(×1000)PBS 0/10 1.9(0.4，10)6.1(1.2) 1.0(0.0，9) - 0(0，10，0)CEF94 0/10 2.0(0.6，6) 6.0(1.8) 1.6(1.1，10)+ 207(507，6，1)D6948 3/10 0.4(0.1，7) 1.7(0.6) 5.0(0.0，7) nd1626(690，7，7)rCEF940/10 1.3(0.5，6) 4.2(1.3) 1.9(0.7，10)+ 260(290，6，3)rD69485/10 0.4(0.1，5) 1.7(0.2) 5.0(0.0，4) + 1549(791，4，4)srIBDV-DACB 2/10 0.4(0.1，8) 1.5(0.3) 5.0(0.0，6) + 833(415，8，8)srIBDV-CADB 0/10 1.5(0.4，5) 4.7(1.0) 1.9(1.3，10)+ 400(619，6，2)mCEF94-vvVP2 0/10 0.6(0.2，6) 1.9(0.4) 5.0(0.0，10)+ 953(186，6，6)mCEF94-vvVP3 0/10 2.0(0.3，6) 6.2(0.7) 1.4(0.5，10)nd454(399，6，4)mCEF94-vvVP4 0/10 1.5(0.5，6) 4.4(1.3) 1.5(0.5，10)+ 431(356，6，4)1在感染后前9天死亡的累积数/受攻击的小鸡的总数2给出了小鸡的平均腔上囊重量(感染后9天)(标准差，动物数)3计算每一动物的腔上囊重量/体重比，并给出每组平均值(标准差)4给出攻击后存活的小鸡的平均组织病理学囊损害评分(HBLS)(标准差，记分的腔上囊囊数)5测定囊分隔(coupes)中VP4/VP3抗原的存在(nd＝未测定)6在感染后9天安乐死的小鸡的IBDV抗体效价(Idexx)(标准差，所用小鸡数，阳性小鸡数)*黑体字示出的病毒不能在QM5细胞上生长这一组的一个小鸡的值被剔除，因为这只小鸡具有非同寻常的大腔上囊(3.4g)
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权利要求
1.一种基本上不能在非囊细胞或其衍生的细胞中生长的重组传染性腔上囊病病毒(rIBDV)。
2.一种保留极烈性传染性腔上囊病病毒(vvIBDV)的至少一部分极烈性性质的传染性rIBDV。
3.权利要求1的一种rIBDV，其保留极烈性传染性腔上囊病病毒(vvIBDV)的至少一部分极烈性性质。
4.权利要求1-3任一项的rIBDV，其基本上不能在CEF细胞，VERO细胞或QM5细胞中生长。
5.权利要求1-4任一项的rIBDV，其中VP2蛋白的氨基酸序列在第279位不是天冬酰胺。
6.权利要求5的rIBDV，其中VP2蛋白的氨基酸序列在第279位是天冬氨酸。
7.权利要求1-6任一项的rIBDV，其中VP2蛋白的氨基酸序列在第284位不是苏氨酸。
8.权利要求7的rIBDV，其中VP2蛋白的氨基酸序列在第284位是丙氨酸。
9.权利要求8的rIBDV，其中VP2蛋白的氨基酸序列至少包含vvIBDV分离株的279-289、优选229-314，最优选214-328位氨基酸的一段氨基酸序列，如表8所示。
10.一种获得在非囊细胞衍生的细胞上基本不能生长的感染性重组传染性腔上囊病病毒(rIBDV)的方法，包括用包含至少部分衍生自IBDV的IBDV基因组的核酸转染至少一个第一种细胞，在培养基中温育所述第一种细胞，从所述转染的第一种细胞或所述培养基中回收rIBDV，并在至少一个第二种细胞中增殖所述回收的rIBDV，该第二种细胞是所述rIBDV的允许细胞。
11.一种获得感染性重组传染性腔上囊病病毒(rIBDV)的方法，所述病毒保留极烈性传染性腔上囊病病毒(vvIBDV)的至少一部分极烈性性质，所述方法包括用包含至少部分衍生自vvIBDV的IBDV基因组的核酸转染至少一个第一种细胞，在培养基中温育所述第一种细胞，从所述转染的第一种细胞或所述培养基中回收rIBDV，并在至少一个第二种细胞中增殖所述回收的rIBDV，该第二种细胞是所述rIBDV的允许细胞。
12.权利要求11或12的方法，其中所述第一种细胞是非囊细胞衍生的细胞。
13.权利要求10-12任一项方法，其中所述第二种细胞是囊细胞衍生的细胞。
14.权利要求10-13任一项的方法，其中所述的第一种细胞如CEF细胞，VERO细胞或QM5细胞是vvIBDV的非允许细胞。
15.权利要求10-14任一项的方法，其中一种肝炎病毒或其衍生的病毒蛋白被另外提供给所述第一种细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述的病毒蛋白包括T7聚合酶。
17.权利要求10-16任一项的方法，其中所述的rIBDV至少保留在vvIBDV非允许细胞如VERO，QM5或CEF细胞上基本不能增殖的能力。
18.权利要求10-17任一项的方法，其中所述第二种允许细胞是原始囊细胞。
19.权利要求10-18任一项的方法，其中所述rIBDV包括至少一种衍生自vvIBDV基因组节段A的至少一部分的核酸。
20.权利要求19的方法，其中所述核酸编码至少VP2蛋白的功能部分。
21.权利要求10-20任一项的方法，其中所述rIBDV包括至少一种衍生自血清型IIIBDV的核酸。
22.权利要求10-21任一项的方法，其中所述rIBDV缺失至少一个特异于血清型IIBDV的优势免疫表位。
23.一种包括rIBDV的感染性镶嵌IBDV(mIBDV)，其中至少一个基因组节段包含衍生自至少两个不同双RNA病毒分离株的核酸。
24.权利要求23的mIBDV，其中至少一个所述分离株是vvIBDV。
25.权利要求23或24的mIBDV，特征在于其基本不能在vvIBDV非允许细胞如VERO，QM5或CEF细胞上增殖。
26.权利要求23-25任一项的mIBDV，特征在于其基本能在vvIBDV允许细胞如原始囊细胞上增殖。
27.权利要求23-26任一项的mIBDV，其中至少一个所述分离株是血清型IIIBDV。
28.权利要求23-27任一项的mIBDV，其缺失至少一个特异于血清型IIBDV的优势免疫表位。
29.包含权利要求1-9或23-28任一项的rIBDV的疫苗。
全文摘要
本发明涉及重组传染性腔上囊病病毒(IBDV)及其衍生的疫苗。本发明提供了基本上不能在非衍生自囊细胞的细胞中生长的感染性重组传染性腔上囊病病毒(rIBDV),或保留了极烈性传染性腔上囊病病毒(vvIBDV)的至少一部分极烈性特征的感染性rIBDV。
文档编号C12N7/04GK1373807SQ00812836
公开日2002年10月9日 申请日期2000年7月13日 优先权日1999年7月14日
发明者亨德里克·约翰尼斯·布特, 安娜·阿格奈斯·亨德里卡·玛丽亚·特尔胡尔内, 伯纳德斯·彼得鲁斯·胡贝图斯·佩特斯 申请人:Id-莱利斯塔德动物育种及动物保健研究所公司