专利名称：假囊酵母属微生物的连续培养方法
技术领域：
本发明涉及一种假囊酵母属微生物的连续培养方法以及以这种方法制得的产物。
酵母或具有酵母性质成长发育的真菌类，诸如酵母属或珠菌属各种的培养方法在文献中有许多描述，它们既有针对分批-或补料分批-的方法，也有连续发酵的方法。这里的连续生物工艺过程特别有利于减少停歇时间，常具有较高的生产效率以及能连续制造出产品。
迄今，丝状真菌假囊酵母属gossypii(同义词Ashbyagossypii；Kurtzman，C.P；J.Ind.Microbiol.，1995，14523-530)由于其生产核黄素的能力已获得了生物工程的意义(Vandamme E.J.，J.Chem.Tech.Biotechnol.，1992，53313-327)。因此通过假囊酵母属gossypii以及亲缘相近的真菌假囊酵母属ashbyi的发酵制造核黄素是已知的(Merck公司目录，Windholz等，eds.Merck & Co.，1983，1183页；Bacher A.等，Angew.Chem.，1969，393页)，由于真菌假囊酵母属gossypii比假囊酵母属ashbyi具有较好的遗传稳定性，使前者优选用于代谢作用产品的工业生产(Demain，A.L.；Annu.Rev.Microbiol.，1972，26369-388)。
但是，关于培养假囊酵母属的丝状真菌的方法的描述迄今都是分批的培养方法，也就是说细胞是用所谓的分批-或补料分批-培养的方式生长的。
通常在连续培养过程中丝状真菌的培养非常复杂，并带来一系列问题，例如这里在培养过程中主要是大量地生成菌丝体。Wongwicharn等(Biotechnol.Bioeng.，1999，65(4)416-424)和Christensen等(J.Biotechnol.，1995，42(2)95-107)描述了曲霉素-或青霉素类的连续方法，但这些方法都不适于大规模生产过程。只对镰孢菌属graminearum描述过一种用于丝状类菌连续培养的工业可行的方法(Trinci，A.P.，Microbiology，1994，140(Pt9)2181-2188)。
迄今还未发现能用于假囊酵母属的丝状发育真菌的这样的连续方法，而这种真菌日益增长的经济意义又极需要这种方法。
本发明涉及一种假囊酵母属微生物的培养方法，其中细胞以从大于0至0.8h-1的流动速率在连续发酵中进行培养。
按本发明该方法优选在0.001至0.8h-1的流动速率下实施，优选的流动速率为0.01至0.7h-1，特别优选是在0.05至0.6h-1。
在传统方法中，发酵过程的分批操作的特点是微生物从起始阶段进入指数表达的增长阶段、稳定阶段和死亡阶段，这就意味着对每一时间点要掌握不同的培养条件，培养条件需不断变化。与此相反的是连续发酵的特征要求调节到一平衡状态(流动平衡)，即存在一持续相同的培养条件。在文献中描述的丝状真菌，例如青霉素或镰孢菌属各中，在含葡萄糖培养基中的连续培养最大的比生长速率在0.15至0.25h-1的范围(Christensen等，J.Biotechnol.，1995，4295-107；Wiebe等，Microbiology，1994，1403015-3021)。令人惊奇的是本发明方法的特征是，假囊酵母属微生物在0.5-0.6h-1的范围，尤其是在0.55h-1达到最大比生长速率。
按本发明方法的这种快速生长的一个优点是从大规模工业应用方面考虑具有明显的经济意义。
本发明还涉及一种方法，其中在一定的时间间隔段，将流动速率交替地调节为恒定不变的较高或较低数值。
此处流动速率交替时间间隔的选择，一方面要保证系统的稳定性(建立稳态)，而另一方面要达到所希望的最大生产效率。但这取决于所进行的培养过程的既定目的。
作为恒定调节的较高流动速率的实例，其数值在0.1至0.8h-1的范围，优选为0.12至0.5h-1；恒定调节的较低流动速率的数据范围例如在0.01至0.2h-1，优选在0.02至0.1h-1的范围，特别优选的流动速率约为0.05h-1。
在本发明的一种特定的实施变体中流动速率约为0.16h-1，在调节到稳态以后流动速率则降到约0.05h-1的数值。在进入新的流动平衡的“稳定化过程”中测定生成的干生物物质(TBM)的量，在约8小时内干生物物质由1.63g/l增加到3.93g/l，流动速率下降的结果是在平衡态干生物物质明显超过调节的数值3.05g TBM/l。在上述方法的另一实施操作中流动速率是由约0.20h-1或约0.30h-1开始以同样方式降低。
令人惊异的是按本发明的该方法非常适用于在连续培养真菌时提高核黄素的生产能力，在图2中表示了干生物物质和核黄素浓度的变化。
按本发明方法的另一优点是细胞经过数周时间，优选2至8周，尤其优选2至4周，特别是大于2.5周(相当于大于400小时)能连续稳定培养。
按本发明在流动速率从大于0至0.2h-1时，优选在0.01至0.20h-1时，细胞的生长主要是作为单个细胞的增加和/或生成孢子。在该培养阶段产物的生成主要是生长非依赖的。
另外按本发明方法的突出特点是微生物在流动速率≥0.20-0.70h-1时主要生成菌丝状菌丝体和/或这种菌丝经松弛结构形成直径为1至3mm菌丝体球丸，在这一阶段的培养主要是生长依赖性的。
此处菌丝体球丸的形成是非常有利的，因为该球丸能相对快地和定量地沉积下来，而无需在设备工程上消耗较高的费用，易于在下一工序将生物物质从培养基中分离出来，从而简化了后面对所需的代谢产物的加工处理。
在本发明的方法中优选加入一种假囊酵母属gossypii的物种，在本发明的一种特别优选的实施方案中，添加的是一种对野生假囊酵母属gossypii(同义词Ashbya gossypii)ATCC10895进行遗传改变的微生物。
按本发明的这种遗传改变是天然的，即自发产生的或人工产生的变异，人工产生的变异例如可通过用变异剂或通过辐照尤其是紫外线辐照处理真菌实现的，这种变异也称为非定向变异。
此外，本发明还包括有针对性地通过遗传工程方法产生的遗传改变的微生物。
一般而言，变异包括一个或多个可以是源自同种或异种的核苷酸基团的替代、加入、除去、交换或插入。这种变异可影响基因表达或对基因产物的活性有减弱或增强的影响。变异可使染色体编码的或以多次复制数存在于所谓的副染色体的基因结构(媒介物)上。
按本发明，除了对个别基因的遗传改变之外，也包括同时使在一生物内的多个基因产生改变，例如可用这种方法引导向所需求的产物方面加强微生物的代谢(代谢设计)。
按本发明用上述方法可生成细胞本身的和/或非细胞的产物，例如多糖酶、脂肪酶或蛋白酶以及糖或氨基酸等有机酸，也可制造由同源组分和异源组分混合物构成的异源基因产物，例如融合蛋白质。
本发明还涉及在按本发明的方法中制造的一种假囊酵母属的微生物。
本发明同样涉及在上面描述的发明方法中制造的能量代谢的初级代谢产物或最终产物，例如乙醇，醋酸盐(酯)、乳酸酯、丙酮或丁醇等。按本发明在流动速率为0.06至0.40h-1范围，优选在0.09至0.32h-1，特别优选在0.25至0.32h-1时可生产乙醇(表1)。
通过本发明，对于一种丝状生长的微生物第一次观察到产生Crabtree效应，即在过量供氧时由葡萄糖生成乙醇(需氧发酵)。
本发明同样还涉及用本发明的工艺方法制造的次级代谢产物，例如抗生素或赤霉素等，中间代谢产物如氨基酸、柠檬酸或维生素；贮能产物例如类脂、多糖如糖原、葡聚糖或黄原胶或多羟基丁酸等以及胞外或胞内酶，例如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶或β-半乳糖苷酶等。
本发明还涉及按本发明方法制得的微生物或者上述按本发明的代谢产物在化学工业、制药、医学、食品和/或饲料工业领域以及农业和/或植物保护方面的应用。本发明同样还涉及按本发明的代谢产物用于上述领域中制造治疗疾病的药物的应用。
通过下述实施例对本发明作进一步阐明，但这些实施例并不对本发明进行限制。
1.试剂应用Darmstadt的Merck公司，瑞士的Fulka Chemie公司和München的Sigma Chemie公司的试剂。
2.分析方法在下文中描述的并且在连续发酵时测定的参数的结果列在表1中。
2.1.核黄素为了测定培养物中核黄素的浓度，取500ml培养液，加入50μl溶解酶溶液(50mg/ml)以将细胞原生质化，在Eppendorf-摇动器中于30℃时培育1小时，而后添加450μl蒸馏水，使原生质破裂，将匀浆过滤(微孔尺寸0.2μm，Gelman Sciences)，滤液借助Merck的高压液相色谱仪测定核黄素含量，选择下述分离条件(Schmidt等，Microbiology，1996，142419-426)。
柱子 Merch公司的LiChrospher100 RP-18(5μm)洗脱剂50mM NaH2PO41mM氯化四甲基铵12％(v/v)乙腈用H3PO4调至pH3流速 1ml/min洗脱 恒溶剂洗脱法检测 270nm2.2.葡萄糖用圆形滤纸(Schleicher & Schuell)过滤培养液，滤液中的葡萄糖含量是用UV-试验法检测D-葡萄糖(Roche Diagnostics)得到的，该方法是基于D-葡萄糖与ATP的酶催化反应生成葡萄糖-6-磷酸酯和ADP(酶己糖激酶)。该酶-葡萄糖-6-磷酸酯脱氢酶将D-葡萄糖-6-磷酸酯氧化成D-葡糖酸酯-6-磷酸酯，同时发生NADP+转化成NADPH。NADPH的生成量与加入的D-葡萄糖的量呈当量关系，生成的NADPH用UV光谱仪(UV-160，Shimadzu)在340nm测定。
2.3.生物物质为了确定干生物物质(TBM)的含量，用干燥过和称重的圆形滤纸(Schleicher & Schnell)过滤30至200ml培养液，滤纸用蒸馏水洗涤，在110℃干燥至恒重并称量(Menschan N.，Heinrich-Heine大学的博士论文1998)。
2.4.乙醇和醋酸盐用气相色谱测定乙醇和醋酸盐(Schmidt，Heinrich-Heine大学的博士论文)。与测定葡萄糖相同，将培养液过滤(圆形滤纸SchleicherSchnell)，滤液用于分析。往500μl滤液中加500μl内标物，它含有一定量的甲醇，在其基础上取色谱数据时，例如可校准注入容积的误差，将500μl乙醇/醋酸盐-标准溶液+500μl内标的样品用于校准。
内标物 1.6g/l甲醇在0.2M HCl中乙醇/醋酸盐标准物0.81g/l乙醇1.64g/l醋酸钠(相当于1.18g/l醋酸盐)该测定采用Hewlett Packard公司的HP5890系列11，炉温为155℃，用氮气作载气。
2.5.废气中的二氧化碳在发酵池排放的废气中CO2-含量是采用红外光谱法测定的(Stanbury & Whitaker，OxfordPergamon Perss，1984)，红外-CO2检测仪是用Hartmann & Braun公司产的URAS 10E，分析前需将气流冷却和干燥，用氩(0％(v/v)CO2)和一含5％(v/v)CO2的校准气体作两点校准。
2.6.培养过程中的氧分压氧分压(pO2)是采用的pO2-电极(Mettler Toledo)测定的(Demain & Solomon，Manual of Industrial Microbiology andBiotechnology，Washington，D.C.，1986)。两点校准是在具有固定搅拌转数(650rpm)的控温的培养基中在接种前直接进行的。为了调整零点，用氩气将培养基脱气直至达到稳定电极信号，通过用压缩空气通气处理直至达到恒定电极信号而调到最大值(pO2＝100％)。
2.7培养物的pH值用复合的Ingold pH-电极(pH-单杆电极)测定pH-值，在压热前用市售的标准溶液(pH4和pH7)进行校准。
2.8细胞内脂肪滴(Fetttropfen)的检测利用尼罗红染色法检验菌丝中的脂肪沉积(Stahmann等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，1994，42121-127)，该染料与水性培养基不同，在疏水环境中具有较好的溶解性，在疏水条件下(例如脂类沉积)有强的发射萤光能力，在450至500nm区激发，发射光波长＞528nm。
为实现染色，将约50μl的尼罗红溶液(1ml丙酮中含1mg尼罗红)加至500μl培养液中，在萤光显微镜下(照相-和萤光显微镜，Zeiss)可检验细胞内脂肪滴中包含的染料的荧光。
3.营养培养基HA-全培养基(Stahmann等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，1994，42121-127)D(+)-单水葡萄糖 10g/l酵母抽提物(粒状)10g/lHA-全培养基-琼脂板D(+)单水葡萄糖 10g/l酵母提取物(粒状)10g/l琼脂(粒状) 20g/l无机盐-最低限度培养基(Monschan N.，Heinrich-Heine大学博士论文1998，有更改)溶液A(100倍)用8M KOH将KH2PO4200g/l调至pH6.7溶液B(10倍) NH4Cl15g/lL-天冬酰胺(单水物)5g/lNaCl 2g/lMgSO4×7H2O4g/lMnSO4×H2O 0.5g/lCaCl2×2H2O0.4g/l肌醇 1g/l烟酰胺2.5g/lD(+)-单水葡萄糖 10g/l酵母抽提物(粒状) 1g/l甘氨酸15mM为避免难溶化合物沉淀，将100倍的浓溶液A在最后才加入。
4.培养方法4.1菌珠保存和预培养假囊酵母属gosspii ATCC10895野生型的菌珠可在HA-全培养基-琼脂板上在4℃贮存，每隔14天往新板上接种。
为制备预培养物，使用500ml的摇动瓶(Schott玻璃厂)，其中含有100ml HA-全培养基，为了便于通入氧气，在该瓶中装有2个隔板。包含培养基的摇动瓶的灭菌是通过压热进行。用菌珠保存板上的菌丝接种，通过5mm直径的玻璃珠强烈破碎，在30℃和120转/分的摇动器中过夜培养，为制备接种物将预培养物在接种到发酵池和摇动瓶系列之前同样直接用玻璃珠将其匀浆化。
4.2在实验室发酵池中培养Infors公司提供的LABFORS-系统可用作在实验室发酵池中的培养试验，玻璃搅拌釜的最大工作容积为5升，两层带6个叶片的圆盘式搅拌器可保证培养物的充分混合。用磁力偶合联接系统可减小诸如采用滑环密封所引起的污染危险性，发酵池还装有4层隔板，用可调风速的压缩空气经通气管使其通风，采用集成控制仪通过调节搅拌转数即可实现pO2的调控。用发酵池的双层保温套使培养液保温，可使用废气冷却器(4℃)以减少挥发物(如乙醇)随气流移出。连续过程的取样及收取产物是通过升降管来实现的，将取样管的管口置于96％(v/v)的乙醇中，在连续运行中所用的收集部分由于其有足够长度勿需再另行采用灭菌措施。经一定时间间隔用显微镜检查培养样品有可能出现的污染情况，必要时可借助浸液泵(PRECIDOR-TYP5003，Infors AG，流速2≥0.4ml/h)加入消泡剂。
pO2，pH，温度和转数的在线测定数据可用数据收集软件MEDUSA1.2(第二生物工程研究所，Jülich公司研究中心)记录和存贮。CO2-废气分析的数据用一自动记录仪收集。
4.3.在实验室发酵池中连续培养在实验室发酵池中连续培养的试验设备表示在图1中。在连续运行时借助一蠕动泵(4)(Watson Marlow)不断将无菌的营养培养基从贮罐(2)(NALGENE20l容积)输入到发酵池(1)中，通过选择泵的功率[ml/h]可调节加料流速，培养液的容积严格讲为发酵池的重量用收获泵(3)(B.Braun公司)使其保持恒定。可将发酵池放置在一秤(5)上(Bioengineering公司)控制重量。为了能长时间提供均匀的培养基，在贮罐(2)上装有一磁力搅拌器(15)进行搅拌混合。
由培养基的过滤段、贮罐、发酵池和产物收集段组成的发酵系统，是经过压力加热进行灭菌。培养基经灭菌过滤器(7)(SARTOBRAN-PCAPSULE，Sartorius公司)用泵输送到贮罐(2)中，从中取31培养基充入发酵池(1)中，在连接好所有电极线和管接头以及加满反应釜夹套之后，将秤(5)定准，借此保持恒重。用约90ml匀化的预培养液施以接种。以间断操作起动培养过程，利用培养液在指数表达生长阶段适宜的生理状态经过约8小时后并且干生物物质含量约为1g/l时换成连续运行。培养条件为工作体积 3l通气 5l/minpO2 ≥80％(用搅拌器转数调节)温度 28℃pH6.7搅拌器转数650rpm±350rpm(取决于pO2)营养培养基无机盐-最低限度培养基为了调节到稳态的条件需等候5次停留时间，至少取样30ml，在低的生物物质浓度时可高达200ml。从产物收集段接收培养液(20)，将收集容器置于冰上。每一平衡状态的试验都按至少6个测量点进行，时间间隔至少为1小时。
图1假囊酵母属的微生物在实验室发酵池中连续培养试验装置的示意图1发酵池2培养基贮罐(无菌)3产品培养液采集泵4蠕动泵5秤6无菌过滤器(气相)7无菌过滤器(液相)8冷阱9培养基(未灭菌的)10压缩空气5l/min
11热-/冷水12冷却水4℃13废气14蠕动泵15磁力搅拌器16温度测量仪17pO2测量仪18pH测量仪19CO2测量仪20培养液图2流速(D)由在a)0.16h-1，b)0.2h-1和c)0.3h-1时的稳态下降到0.05h-1后假囊酵母属gosspii ATCC10895的干生物物质(TBM)和核黄素浓度随时间(t)变化的关系图。
表1假囊酵母属gosspii ATCC10895连续发酵时所测定的各种参数汇总。
D流动速率[h-1]TBM干生物物质(g/l)n.d不可检测[＜0.1mg/l]
表1D TBM葡萄糖核黄素 乙醇丙醇[h-1] [g/l][g/l][mg/l] [g/l] [g/l]0.05 2.88 0.07 20.280.050.09 2.50 1.10 10.890.210.10 1.84 2.52 10.890.220.20 1.47 4.24 10.980.280.25 1.18 4.60 n.d. 1.060.200.28 0.96 4.82 n.d. 1.160.190.32 0.91 4.95 n.d. 1.180.190.35 0.86 5.76 n.d. 0.780.220.41 0.54 7.58 n.d. 0.130.200.45 0.56 7.65 n.d. 0.100.210.50 0.40 7.87 n.d. 0.070.18
权利要求
1.一种假囊酵母属微生物的培养方法，其特征在于，在连续发酵的流动速率从大于0到0.8h-1范围时培养细胞。
2.按权利要求1的方法，其特征在于，在流动速率0.001到0.8h-1范围实施该方法。
3.按权利要求1或2任一项的方法，其特征在于，在流动速率0.01到0.7h-1的范围，优选在0.05到0.6h-1之间实施该方法。
4.按权利要求1或3任一项的方法，其特征在于，在确定的时间间隔将流动速率交替地调至恒定的较高或较低值。
5.按权利要求1到4任一项的方法，其特征在于在0.5-0.6h-1，特别是在0.55h-1时达到最大的比生长率。
6.按权利要求1到5任一项的方法，其特征在于，细胞能在多周，优选在2至8周，尤其优选在2至4周，特别是在大于2.5周(相当于大于400小时)连续稳定地培养。
7.按权利要求1到6任一项的方法，其特征在于，细胞在流动速率从大于0至0.2h-1的范围，优选在0.01至0.2h-1时占主导地位的是个别细胞生长和/或生成孢子。
8.按权利要求1到7任一项的方法，其特征在于，细胞在流动速率≥0.20-0.70h-1范围时主要作为菌丝状的菌丝体生长和/或生成菌丝体球丸。
9.按权利要求1到8任一项的方法，其特征在于，生成细胞本身的和/或非细胞的和/或异源的基因产物。
10.按权利要求1到9任一项的方法，其特征在于，使用假囊酵母属gosspii种的真菌。
11.按权利要求1到10任一项的方法，其特征在于，使用对野生型假囊酵母属gosspii ATCC10895进行过遗传改变的微生物。
12.在按权利要求1到11任一项的方法中制备的假囊酵母属的微生物。
13.在按权利要求1到11任一项的方法中制备的初级代谢产物。
14.在按权利要求1到11任一项的方法中制备的次级代谢产物。
15.在按权利要求1到11任一项的方法中制备的中间代谢产物。
16.在按权利要求1到11任一项的方法中制备的能量贮存物质。
17.在按权利要求1到11任一项的方法中制备的酶。
18.按权利要求12的微生物或按权利要求13到17任一项的代谢产物在化学工业、制药业、医学、食品工业和/或饲料工业以及农业和/或植物保护领域的应用。
全文摘要
本发明涉及一种假囊酵母属微生物的连续培养方法以及用所述微生物制备的产物和其应用。
文档编号A23L1/30GK1409769SQ00817112
公开日2003年4月9日 申请日期2000年12月14日 优先权日1999年12月16日
发明者S·弗雷耶尔, H·阿尔特菲, K·－P·施塔曼, A·维森博格, C·盖特根斯, H·萨姆 申请人:Basf公司, 于利奇研究中心有限公司