专利名称：微藻细胞溶剂化补碳与气浮法采收相耦合的培养方法
技术领域：
本发明涉及微藻细胞的培养，特别涉及一种将溶剂化补碳与生物量采收进行耦合的微藻细胞溶剂化补碳与气浮法采收相耦合的培养方法。
微藻如螺旋藻、盐藻、小球藻等由于富含蛋白质、脂肪酸、碳水化合物以及其它生理活性物质，具有很高的营养和药用价值，因而受到世界各国的重视，成为研究和开发的热点。近几年来，我国以螺旋藻为主的微藻产业得到了迅猛发展，遍布全国的100多个螺旋藻养殖厂，其生产已达到年产千吨干粉的规模。随着微藻产业化开发进程的加快，作为生产过程两个重要环节的培养与采收技术也得到了快速发展。其中，开放式培养生产(如跑道池)存在着工艺落后、产率低、成本高、易污染等缺点，人们已相继研究并开发出形式多样、结构新颖的密闭式光生物反应器，如管道式光生物反应器和板箱式光生物反应器等。在生产工艺方面也开展了许多有益的尝试，如采用有机碳源进行异养或混合营养方式培养微藻细胞等。采收方面，在采用传统固液分离技术如离心、絮凝、沉淀、过滤等的基础上，根据培养体系中细胞生物量浓度通常较低、密度与水体相当等特点，研究人员已开发出诸如泡载、气浮、等电聚焦等新颖采收与分离方法，并取得一定成效。
现有各种形式的微藻生产过程和工艺，普遍存在着以下几个问题，即细胞浓度偏低，采收困难；碳源消耗量较大，利用效率低下，培养成本偏高；培养和采收过程分立，生产过程缺乏连续性，设备利用效率低。这些现象的产生主要有以下几个原因①微藻细胞属光能自养型生物，光照水平直接影响着藻细胞的生长，光强过弱，光通量不足，细胞增殖缓慢，培养周期长，细胞浓度低，给生物量的采收带来困难；光照过强，不仅造成能源浪费，还将对细胞的正常生长产生抑制作用。而目前的绝大多数培养装置都不能为藻细胞的生长提供适宜的光照；②作为光合作用的主要基质，培养液中的碳源水平同样影响着藻细胞的生长。目前，微藻细胞生长的生产过程中，所需的碳源补给方式主要有两种一种是直接向培养体系添加NaHCO3，其缺陷在于，NaHCO3的补碳效果不如CO2，而且培养成本较高；并且随着细胞的生长，环境pH值将逐渐上升，会对细胞产生抑制和毒害作用；另一种方法则是定量补给CO2气体，但由于CO2在藻液中的溶解度较低，气/液传质阻力较大，CO2气体的利用效率低下，造成生产成本上升；③采收效率低下。由于现有微藻生产的细胞浓度普遍偏低，其密度与水体相当，传统的固液分离手段如离心、絮凝、沉淀、过滤往往存在效率低下和成本偏高等问题。而为了提高采收效率，往往需要添加外源性物质如絮凝剂等，这一方面影响着细胞的后续浓缩过程和产品品质，另一方面改变了培养液组成，降低了培养液的再利用价值；④微藻细胞生产的目的主要不是追求细胞产率而是追求细胞浓度的最大化。而实际的生产情况往往是，当藻细胞生物量浓度积累到一定程度时，由于光通量降低，细胞生长速度将明显减慢，形成反馈抑制现象。如不及时加以采收，细胞将会老化、沉淀、自溶、变质，甚至对整个培养体系造成破坏。
⑤生物量采收的非连续性及其与细胞培养过程的分立，导致生产过程缺乏连续性和统一性，大大降低了生产设备的综合利用效率。
本发明的目的在于，克服上述微藻细胞生产工艺和生产设备存在的诸多缺陷，而提供一种简易、经济、高效的将藻液补碳和采收有机整合实现微藻细胞养殖工业化和资源合理利用的微藻细胞的溶剂化补碳与气浮法采收耦合培养方法，以提高生产效率、降低生产成本，具有重要的实用价值。
本发明的实施方案如下本发明提供的微藻细胞溶剂化补碳与气浮法采收相耦合的培养方法，其工艺步骤如下1)批式培养微藻细胞①在120-125℃温度下对装于培养装置中的培养基进行灭菌处理25-35min；②按0.01-0.1g/L的接种浓度将藻种细胞接种于上述培养装置中的培养基中，进行细胞培养；培养装置中的光强为1.5-5.0mw/cm2，温度为25-35℃，通气量为5-10vvm；2)在溶剂化补碳/气浮采收耦合池中对上述藻液进行溶剂化补碳与气浮采收相耦合的连续培养
当上述步骤②中的微藻细胞的生长处于对数生长期至稳定期时，将藻液泵入密闭的溶剂化补碳/气浮采收耦合池中，并同时使用溶气释放器将溶气罐中的富含CO2的溶气水从耦合池底部通入，对藻液进行补碳，并在耦合池中完成藻液的溶剂化补碳与气浮采收相耦合的连续培养；藻液在耦合池中，通过溶气水气化过程中释放气泡的浮力作用下上行，上行过程中，含水量为30-50％浓藻液自耦合池顶部流出，经3000-4000rpm离心脱水处理后，送入喷雾干燥器中进行干燥处理后制得微藻成品；再气化的溶气由耦合池顶部排出，当溶气中所含CO2的浓度高于烟道气中CO2的浓度时，将该再气化溶气返流至溶气罐实现循环使用；所述耦合池中的部分稀藻液作为溶剂水返流至溶气罐中；其余的稀藻液返流至培养装置循环培养；所述富含CO2的溶气水为富含CO2的稀藻液、培养基或稀藻液和培养基及水的混合物，溶气水中CO2与溶剂水的体积比为1-10％；所述溶气罐中富含CO2的溶气水的制备方法为将稀藻液、培养基或稀藻液和培养基及水的混合物从溶气罐顶部流入，并同时从溶气罐底部通入经加压内含1-10％ CO2的烟道气或富含CO2的空气，流入的溶剂水经过喷头或溢流板被分散，并与溶气快速混合而制成溶气水；所述的溶气罐、耦合池、培养装置三者的体积比为1∶3-5∶10-15；所述的藻种为螺旋藻、小球藻、聚球藻或盐藻；所述的培养装置为鼓泡塔式反应器、板箱式反应器、管道式反应器或气升式反应器；所述的溶气释放器为TS型溶气释放器、TJ型溶气释放器或针形阀。
本发明提供的微藻细胞的溶剂化补碳与气浮法采收相耦合的培养方法，其发明效果如下与常规的在板箱式、管道式或气升式反应器中的培养微藻细胞的培养技术相比，采用本发明的溶剂化补碳与细胞生物量气浮采收相耦合的微藻细胞培养新方法，可明显提高细胞产率，降低培养成本，稳定细胞生长环境，提高设备利用效率①在板箱式、管道式或气升式反应器中采用标准培养基连续培养螺旋藻、盐藻、小球藻时，藻细胞生产率一般为0.2-0.8g干重/L/d，而本方法由于一方面可以为藻细胞的生长有效提供易于吸收的溶剂化的碳源，另一方面通过适量采收使体系的细胞浓度始终维持在一合理的水平，最大限度地发挥其生长潜力，因而可显著提高生产效率(5-20倍)和细胞产率(1.0-2.8g干重/L/d)；②培养螺旋藻、盐藻或小球藻时，传统的标准培养基中的碳源主要为NaHCO3、葡萄糖或其它有机碳源，其缺点在于培养体系的pH波动较大，特别是有机碳源易造成培养过程的污染；而本方法由于以CO2作为碳源，能为细胞生长提供稳定的pH环境(8.5-9.5)，且不存在污染问题；③传统的以NaHCO3、葡萄糖或其它有机碳源作为碳源，成本较高；采收过程中所添加的一些外源性物质如絮凝剂，将降低培养液的后续利用价值，使培养成本上升；而本方法使用的碳源是烟道气，一方面其来源广泛、价格低廉，另一方面它是以溶剂化的方式进行碳源补给的，可反复循环利用，从而降低生产成本20-50％；④本方法简单，工艺流程明晰、科学，操作方便，运行稳定，放大容易，适宜于藻类及其它光合生物细胞的工业化高效培养；还由于该耦合培养将细胞培养与采收有机整合，增进培养过程的连续性，可降低能耗20-35％，并提高装置的综合利用效率30-48％。
实施例1.
螺旋藻细胞的溶剂化补碳与气浮法采收相耦合的细胞培养，其步骤如下1.制作螺旋藻细胞光密度值ODλ与干重浓度x(g/L)关系的标准曲线取螺旋藻细胞培养液，在普通离心机上以3000-4000rpm的转速离心处理10-20min；弃上清，再以蒸馏水清洗得到的细胞浓缩液，再离心；如此反复3-6次，取试管10支，各注入细胞浓缩液10，9，8，7，6，5，4，3，2，1ml，再分别往其中加入蒸馏水0，1，2，3，4，5，6，7，8，9ml；以培养基为对照，在721或752型分光光度计上，根据螺旋藻细胞的吸收波长λ，分别测定上述不同稀释度藻液的光密度值ODλ；与此同时，取上述不同浓度的藻液各5ml，置于洁净的称量瓶中，在普通烘箱上烘干8-16hr至恒重(处理温度为105-110℃)；通过称量得到的细胞干重质量m和藻液体积v，再结合藻液光密度值，即可得到该藻液光密度值与细胞干重浓度的标准曲线；
2.批式培养螺旋藻细胞藻种为螺旋藻；培养装置为内循环气升式光反应器，其体积为10升；①在121℃温度下对装于内循环气升式光反应器中的培养基进行灭菌处理30min；本实施例的培养基为不含碳源的Zarrouk培养基；②按0.1g/L的接种浓度将螺旋藻藻种接种于内循环气升式光反应器中的培养基中，进行细胞培养，反应器中的光强为2.25mw/cm2，温度为30℃，通气量为7.5vvm；3.在溶剂化补碳/气浮采收耦合池中对螺旋藻藻液进行溶剂化补碳与气浮采收相耦合的连续培养当上述步骤②中的螺旋藻细胞的生长处于对数生长期至稳定期时，将藻液泵入密闭的溶剂化补碳/气浮采收耦合池中，并同时使用针形阀将溶气罐中的富含CO2的溶气水从耦合池底部通入，对藻液进行补碳，并在耦合池中完成藻液的溶剂化补碳与气浮采收相耦合的连续培养，耦合池的体积为2.25升；其富含CO2的溶气水为富含CO2的稀藻液，溶气水中CO2与溶剂水的体积比为10％；藻液在耦合池中，通过溶气水气化过程中释放气泡的浮力作用下上行，上行过程中，含水量为30-50％浓藻液自耦合池顶部流出，经3200rpm离心脱水处理后，送入喷雾干燥器中进行干燥处理后制得微藻成品。
本实施例的溶气罐中富含CO2的溶气水的制备方法为将稀藻液从溶气罐顶部流入，并同时从溶气罐底部通入经加压内含1％ CO2的烟道气，流入的稀藻液经过喷头或溢流板被分散，并与溶气快速混合而制成溶气水，溶气罐的体积为0.75升；再气化的溶气由耦合池顶部排出，当溶气中所含CO2的浓度高于烟道气中CO2的浓度时，将该再气化溶气返流至溶气罐实现循环使用；所述耦合池中的部分稀藻液作为溶剂水返流至溶气罐中；其余的稀藻液返流至培养装置循环培养。
本实施例螺旋藻细胞的采收率为0.05％时，耦合体系的藻细胞产率为2.1g/干重/L/d，比单立的气升式反应器提高了7.2倍，培养成本下降了34％。设备的利用效率提高了40.5％。
实施例2.
小球藻细胞的溶剂化补碳与气浮法采收相耦合的培养，其步骤如下1.制作小球藻细胞光密度值ODλ与干重浓度x(g/L)关系的标准曲线取小球藻细胞培养液，在普通离心机上以3000-4000rpm的转速离心处理10-20min；弃上清，再以蒸馏水清洗得到的细胞浓缩液，再离心；如此反复3-6次，取试管10支，各注入细胞浓缩液10，9，8，7，6，5，4，3，2，1ml，再分别往其中加入蒸馏水0，1，2，3，4，5，6，7，8，9ml；以培养基为对照，在721或752型分光光度计上，根据小球藻细胞的吸收波长λ，分别测定上述不同稀释度藻液的光密度值ODλ；与此同时，取上述不同浓度的藻液各5ml，置于洁净的称量瓶中，在普通烘箱上烘干8-16hr至恒重(处理温度为105-110℃)；通过称量得到的细胞干重质量m和藻液体积v，再结合藻液光密度值，即可得到该藻液光密度值与细胞干重浓度的标准曲线；2.批式培养小球藻细胞藻种为小球藻；培养装置为鼓泡塔式光反应器，其体积为10升；③在121℃温度下对装于内循环气升式光反应器中的培养基进行灭菌处理30min；本实施例的培养基为不含碳源的Zarrouk培养基；④按0.2g/L的接种浓度将小球藻藻种接种于内循环气升式光反应器中的培养基中，进行细胞培养，反应器中的光强为2.4mw/cm2，温度为30℃，通气量为5.5vvm；3.在溶剂化补碳/气浮采收耦合池中对小球藻藻液进行溶剂化补碳与气浮采收相耦合的连续培养当上述步骤②中的小球藻细胞的生长处于对数生长期至稳定期时，将藻液泵入密闭的溶剂化补碳/气浮采收耦合池中，并同时使用针形阀将溶气罐中的富含CO2的溶气水从耦合池底部通入，对藻液进行补碳，并在耦合池中完成藻液的溶剂化补碳与气浮采收相耦合的连续培养，耦合池的体积为5升；其富含CO2的溶气水为富含CO2的稀藻液，溶气水中CO2与溶剂水的体积比为8％；藻液在耦合池中，通过溶气水气化过程中释放气泡的浮力作用下上行，上行过程中，含水量为30-50％浓藻液自耦合池顶部流出，经3500rpm离心脱水处理后，送入喷雾干燥器中进行干燥处理后制得微藻成品。
本实施例的溶气罐中富含CO2的溶气水的制备方法为将稀藻液从溶气罐顶部流入，并同时从溶气罐底部通入经加压内含1％ CO2的烟道气，流入的稀藻液经过喷头或溢流板被分散，并与溶气快速混合而制成溶气水，溶气罐的体积为1升；再气化的溶气由耦合池顶部排出，当溶气中所含CO2的浓度高于烟道气中CO2的浓度时，将该再气化溶气返流至溶气罐实现循环使用；所述耦合池中的部分稀藻液作为溶剂水返流至溶气罐中；其余的稀藻液返流至培养装置循环培养。
本实施例螺旋藻细胞的采收率为0.07％时，耦合体系的藻细胞产率为1.5g/干重/L/d，比单立的气升式反应器提高了5.3倍，培养成本下降了28％。设备的利用效率提高了37％。
实施例3.
聚球藻细胞的溶剂化补碳与气浮法采收相耦合的培养，其步骤如下1.制作聚球藻细胞光密度值ODλ与干重浓度x(g/L)关系的标准曲线取聚球藻细胞培养液，在普通离心机上以3000-4000rpm的转速离心处理10-20min；弃上清，再以蒸馏水清洗得到的细胞浓缩液，再离心；如此反复3-6次，取试管10支，各注入细胞浓缩液10，9，8，7，6，5，4，3，2，1ml，再分别往其中加入蒸馏水0，1，2，3，4，5，6，7，8，9ml；以培养基为对照，在721或752型分光光度计上，根据聚球藻细胞的吸收波长λ，分别测定上述不同稀释度藻液的光密度值ODλ；与此同时，取上述不同浓度的藻液各5ml，置于洁净的称量瓶中，在普通烘箱上烘干8-16hr至恒重(处理温度为105-110℃)；通过称量得到的细胞干重质量m和藻液体积v，再结合藻液光密度值，即可得到该藻液光密度值与细胞干重浓度的标准曲线；2.批式培养聚球藻细胞藻种为聚球藻；培养装置为鼓泡塔式光反应器，其体积为4.8升；①在121℃温度下对装于内循环气升式光反应器中的培养基进行灭菌处理30min；本实施例的培养基为不含碳源的Zarrouk培养基；②按0.12g/L的接种浓度将小球藻藻种接种于内循环气升式光反应器中的培养基中，进行细胞培养，反应器中的光强为4.4mw/cm2，温度为30℃，通气量为4.5vvm；3.在溶剂化补碳/气浮采收耦合池中对聚球藻藻液进行溶剂化补碳与气浮采收相耦合的连续培养当上述步骤②中的聚球藻细胞的生长处于对数生长期至稳定期时，将藻液泵入密闭的溶剂化补碳/气浮采收耦合池中，并同时使用针形阀将溶气罐中的富含CO2的溶气水从耦合池底部通入，对藻液进行补碳，并在耦合池中完成藻液的溶剂化补碳与气浮采收相耦合的连续培养，耦合池的体积为1.2升；其富含CO2的溶气水为富含CO2的稀藻液，溶气水中CO2与溶剂水的体积比为8％；藻液在耦合池中，通过溶气水气化过程中释放气泡的浮力作用下上行，上行过程中，含水量为30-50％浓藻液自耦合池顶部流出，经3500rpm离心脱水处理后，送入喷雾干燥器中进行干燥处理后制得微藻成品。
本实施例的溶气罐中富含CO2的溶气水的制备方法为将稀藻液从溶气罐顶部流入，并同时从溶气罐底部通入经加压内含1％ CO2的烟道气，流入的稀藻液经过喷头或溢流板被分散，并与溶气快速混合而制成溶气水，溶气罐的体积为0.32升；再气化的溶气由耦合池顶部排出，当溶气中所含CO2的浓度高于烟道气中CO2的浓度时，将该再气化溶气返流至溶气罐实现循环使用；所述耦合池中的部分稀藻液作为溶剂水返流至溶气罐中；其余的稀藻液返流至培养装置循环培养。
本实施例螺旋藻细胞的采收率为0.032％时，耦合体系的藻细胞产率为1.42g/干重/L/d，比单立的气升式反应器提高了3.3倍，培养成本下降了31％。设备的利用效率提高了42％。
权利要求
1.一种微藻细胞溶剂化补碳与气浮法采收相耦合的培养方法，其工艺步骤如下1)批式培养微藻细胞③在120-125℃温度下对装于培养装置中的培养基进行灭菌处理25-35min；④按0.01-0.1g/L的接种浓度将藻种细胞接种于上述培养装置中的培养基中，进行细胞培养；培养装置中的光强为1.5-5.0mw/cm2，温度为25-35℃，通气量为5-10vvm；2)在溶剂化补碳/气浮采收耦合池中对上述藻液进行溶剂化补碳与气浮采收相耦合的连续培养当上述步骤②中的微藻细胞的生长处于对数生长期至稳定期时，将藻液泵入密闭的溶剂化补碳/气浮采收耦合池中，并同时使用溶气释放器将溶气罐中的富含CO2的溶气水从耦合池底部通入，对藻液进行补碳，并在耦合池中完成藻液的溶剂化补碳与气浮采收相耦合的连续培养；所述富含CO2的溶气水为富含CO2的稀藻液、培养基或稀藻液和培养基及水的混合物，溶气水中CO2与溶剂水的体积比为1-10％；所述的溶气罐、耦合池、培养装置三者的体积比为1∶3-5∶10-15；藻液在耦合池中，通过溶气水气化过程中释放气泡的浮力作用下上行，上行过程中，含水量为30-50％浓藻液自耦合池顶部流出，经3000-4000rpm离心脱水处理后，送入喷雾干燥器中进行干燥处理后制得微藻成品。
2.按权利要求1所述的微藻细胞溶剂化补碳与气浮法采收相耦合的培养方法，其特征在于，所述溶气罐中富含CO2的溶气水的制备方法为将稀藻液、培养基或稀藻液和培养基及水的混合物从溶气罐顶部流入，并同时从溶气罐底部通入经加压内含1-10％ CO2的烟道气或富含CO2的空气，流入的溶剂水经过喷头或溢流板被分散，并与溶气快速混合而制成溶气水。
3.按权利要求1所述的微藻细胞溶剂化补碳与气浮法采收相耦合的培养方法，其特征在于，再气化的溶气由耦合池顶部排出，当溶气中所含CO2的浓度高于烟道气中CO2的浓度时，将该再气化溶气返流至溶气罐实现循环使用。
4.按权利要求1所述的微藻细胞溶剂化补碳与气浮法采收相耦合的培养方法，其特征在于，所述耦合池中的部分稀藻液作为溶剂水返流至溶气罐中；其余的稀藻液返流至培养装置循环培养。
5.按权利要求1所述的微藻细胞溶剂化补碳与气浮法采收相耦合的培养方法，其特征在于，所述的藻种为螺旋藻、小球藻、聚球藻或盐藻。
6.按权利要求1所述的微藻细胞溶剂化补碳与气浮法采收相耦合的培养方法，其特征在于，所述的培养装置为鼓泡塔式反应器、板箱式反应器、管道式反应器或气升式反应器。
7.按权利要求1所述的微藻细胞溶剂化补碳与气浮法采收相耦合的培养方法，其特征在于，所述的溶气释放器为TS型溶气释放器、TJ型溶气释放器或针形阀。
全文摘要
本发明涉及微藻细胞溶剂化补碳与气浮法采收相耦合的培养方法,其步骤为:首先对培养器中培养基进行灭菌处理;将藻种细胞接种于培养基中,进行批式培养;在微藻细胞生长处于对数生长期至稳定期时,将藻液泵入密闭的溶剂化补碳/气浮采收耦合池中,并同时从耦合池底部通入富含CO
文档编号C12N1/12GK1376777SQ0110993
公开日2002年10月30日 申请日期2001年3月26日 优先权日2001年3月26日
发明者曾文炉, 李浩然, 石红, 蔡昭铃, 欧阳藩 申请人:中国科学院化工冶金研究所