检测5'-甲硫腺苷磷酸化酶缺陷型哺乳动物细胞的方法

专利名称：检测5'-甲硫腺苷磷酸化酶缺陷型哺乳动物细胞的方法
技术领域：
本发明涉及检测哺乳动物细胞5′-甲硫腺苷磷酸化酶的方法，该酶的状态是这些细胞是否处于恶性状态的标志。检测出了对所述酶有缺陷的细胞，就可以在化疗靶去这些细胞，这一化疗中利用了这些细胞不能将5′-甲硫腺苷转化为甲硫氨酸的特性。
背景技术：
甲硫氨酸(MET)是正常和恶性细胞生长所必需的。在某些恶性细胞中，这种需求是绝对必要的，即没有合适的MET供应，细胞就死亡。
在哺乳动物细胞中，MET有三种来源。即可从食物中获得，或者通过从L-高半胱氨酸(高半胱氨酸)或5′-甲硫腺苷(MTA)(聚胺生物合成途径的一种产物)生化合成MET。在后一种情况下，由5′-甲硫腺苷磷酸化酶(MTSse；EC 2.4.2.28)将MTA转化为MET。
在过去的十年中，研究者们已经鉴别了丧失了MTA酶因此不能将MTA转化为MET的许多恶性细胞系。例如，Katamari等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，781219-1223(1981)报道的3个人恶性肿瘤细胞系中有23％丧失了可检测的MTA酶，而在所研究的16个非恶性细胞系中每个细胞都存在MTA酶活性。已有报道认为，MTA酶缺乏是非小细胞肺癌(参见，Nobori等人，Cancer Res.531098-110(1991))6个淋巴瘤系和白血病细胞系(同上)，脑肿瘤细胞系和原发性脑肿瘤组织样品(同上)，以及其他恶性肿瘤(参见，例如，Kries，et al.，Cancer Res.331866-1869(1973)，Kries，et al.，Cancer Trmt.Rpts.631069-1072(1979)，以及Rangione等人，Biochem.J.281533-538(1992))中的特征。MTA酶阳性的细胞主要通过将高半胱氨酸转化而满足对MET的需要。但是，当得不到高半胱氨酸时，细胞通常会死亡。
已知L-甲硫氨酸-L-去氨基-Y-巯基甲烷裂解酶(ED 4.4.1.11；MET酶)不仅能降解MET，而且也降解高半胱氨酸。因此，从理论上讲，可通过用MET酶降解血浆MET和高半胱氨酸而使丧失MTA酶的恶性细胞(即MTA酶阴性细胞)处于饥饿状态。预期正常的MTA酶阳性细胞通过将MTA连续转化为MET而满足对MET的需求。
研制使恶性细胞MET饥饿的方法的一个障碍是需要鉴定出适于用作治疗靶目标的恶性细胞，即那些MTA酶阴性的恶性细胞。为此目的，已研制出了一种检测方法，该方法通过测定一个细胞培养物是否具有催化活性而预测该恶性细胞是否MTA酶阴性(Seidenfeld等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.951861-1866，1980)。但是，由于该检测方法中需要的放射性化学物质从商业途径购买不到，将这种方法用于常规评估目前来说是行不能的。而且，该检测方法只检测该细胞培养物中是否存在该酶，而不管在检测进行时该酶是否有催化活性，因而这种检测方法不考虑该MTA酶的体外催化活性的不稳定性。
通过研制一种免疫检测法可避免该活性检测法的局限性，所述免疫检测法对检测相当少量的酶具有足够的灵敏性。但是，从天然来源纯化MTA酶用于制备在MTA酶的免疫检测中使用的抗体已证明是一个费力的方法，该方法产率很低(Rangione等人，J.Bid.Chem，26112324-12329，1986)。
缺乏检测MTA酶缺陷细胞的简单、有效的方法是造成还不能获得使MTA酶缺陷性恶性细胞在体内选择性地处于MET饥饿状态的有效治疗方法的部分原因。本发明通过提供用于检测一个样品中编码MTA酶的基因的存在的方法以及通过提供重组来源的MTA酶来解决这一问题。

发明内容
本发明的目的是提供用于检测MTA酶缺陷型细胞的方法(所述缺陷型细胞被认为是那些在其中不存在可检测到的有催化活性或不具催化活性的MTA酶蛋白的细胞)。本发明的方法是以下列假设为基础MTA酶的缺失是由于从具有MTA酶阴性恶性肿瘤的哺乳动物的基因组中缺失了编码MTA酶的基因引起的。因此本发明方法涉及检测哺乳动物基因组中MTA酶蛋白质编码区内的多核苷酸，如果存在这种多核苷酸则产生MTA酶，如果不存在，则成为MTA酶缺陷型细胞。
更具体地讲，本发明提供了一种用于检测MTA酶的方法，该方法包括下列步骤(a)从恶性肿瘤中获得可检测样品，(b)使该样品处于有利于编码MTA酶的核酸选择性扩增的条件下，(c)向该样品中加入与编码MTA酶的核酸进行特异性杂交的寡核苷酸探针，该加入过程是在允许该探计与该样品中存在的任何这样的核酸进行可检测杂交的条件下进行的。并且(d)检测该样品中是否存在该核酸。
本发明的另一方面包括一种由合适的载体从编码MTA酶的多核苷酸表达MTA酸而获得的重组MTA酸。重组MTA酶的获得使得相对于分离和纯化天然MTA酶的Rangione方法(见上文)来说，可更容易和更大量地制备高度纯化的MTA酶。


图1显子MTA酶的基因图谱，并指明了该多核苷酸中外显子的位置。底下划线处为推测的外显子；推测的内含子由替代该多核苷酸序列中的碱基的一个或多个“N”表示。图1中描述的序列对应于本文所附的SEQ IDNo.1中含有的序列。
具体实施例方式
A.用于扩增细胞样品中存在的任何MTA酶的方法如上所述，本发明假设细胞缺失MTA酶是由于从哺乳动物基因组中缺失正常编码MTA酶的基因引起的。因为本发明涉及检测一个被怀疑是MTA酶阴性的细胞样品中是否存在该基因，所以最好将该样品中的核酸进行扩增以提高该检测方法的灵敏度。尽管在聚合步骤中使用链反应不是绝对必需的，但是该扩增过程最好是使用聚合酶链反应(PCR)来完成。
为了用于本发明方法中，获得被怀疑其含有MTA酶缺陷型细胞的生物样品。例如，该样品含有来自一个细胞系，组织或肿瘤的体液或细胞。利用临床医学上已知方法可得到这样的样品，例如通过活组织检查或外科切除术获得肿瘤细胞。优选地，该细胞基本上没有“污染”，即不含有可能影响本发明方法结果的细胞，蛋白质和类似成分。例如，当以实体肿瘤用作为基因组MTA酶DNA的来源时，可将正常非恶性细胞以及在获得生物样品操作过程中从这些细胞中释放的MTA酶认为是污染物。
样品中被扩增的核酸通常存在于被认为含有MTA酶的基因组或野生型DNA中。该待扩增的DNA(下文中称作为“靶DNA”)可从真核细胞，优选的是哺乳动物获得。更优选地，从人获得基因组DNA。
根据本领域内已知方法例如由Maniatis等人描述的方法可分离基因组DNA(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Habor Laboratory，1982)。本文提供了说明人MTA酶的基因组克隆分离的操作的例子，其中利用下文中进一步描述的MTA酶cDNA基因探针筛查粘粒基因文库。但是，本领域技术人员将认识到也可使用其他合适方法获得本发明DNA。
附后的序列表中SEQ ID No.1提供了MTA酶的基因组克隆的全长核苷酸序列；附图1中描绘了该序列中的外显子。含有大鼠MTA酶的全长基因组DNA的大肠杆菌菌株于1993年12月30日保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为55536(外显子“TC3”；MTA酶基因的核苷酸616-720)；55538(外显子“1.1”；MTA酶基因的核苷酸254-421)；55537，55539和55540(分别为“IX-7”，“4-3”和“7-2”，它们为MTA酶基因的剩余部分)。每一保藏物的宿主是大肠杆菌。我们不认为该保藏物是实施发明所必需的。但是在适用于本发明的专利法要求的期限内，该保藏物将保持存活。
一旦获得了基因组DNA，就可将含有该DNA的样品置于有利于靶核酸选择性扩增的条件下。优选的是，靶核酸是编码MTA酶的基因的一个多核苷酸部分(即“靶多核苷酸”)。扩增该靶多核苷酸的优选的方法是PCR方法。PCR方法是利用寡核苷酸引物体外酶促合成特定DNA或RNA序列的方法，所述引物与特定核酸序列杂交并位于靶核酸中目的区域两端。在进行了模板变性，引物退火和退火引物的酶促延伸一系列重复循环，可使引物的5′末端所限定的特定核酸片段呈指数积累。在一个循环中合成得到的产物(PCR产物)具有作为下一个循环的模板的作用；因此，靶核酸拷贝的数目在每一循环中约增加一倍。
在Mullis等人的美国专利4,683,195和4,683,202中描述了基本的PCR技术，这两专利公开的内容引入本文中作为实施PCR的常规技术的实例。但是，本发明并不局限于使用Mullis等人的′202专利中教导的PCR技术。自从Mullis等人的技术出现后，已经开发出了许多基于PCR的检测方法。这些方法使用了经过修饰的所述技术。这些经修饰的方法是本领域内已知的，因此在本文中不再描述。但是，为了描述该领域内公知技术范围，下文中描述了几种经修饰的方案。
在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)872725-2729(Gilliand et al.，作者)中描述了一种PCR技术，该技术利用一种竞争性模板，提供了一种内容扩增标准，所述模板在序列和大小上与靶核酸不同。在Nuc.Acids.Res.213469-3472(1993)，(Kohsaka等人，作者)描述了进行“竞争性”PCR的另一技术，给技术利用序列不同但大小相同的模板。该技术是将其用于酶连免疫吸附检测(ELISA)技术分析扩增的核酸的特别优选技术。在Proc.Natl.Acacl.Sci.USA(1989)866230-6234(Saiki，等人，作者)中描述了一种非竞争性PCR技术，所述技术利用位点特异性寡核苷酸来检测基因的突变或多态性，该技术也可用于本发明的方法。这些技术中每一种比利用杂交探针的技术具有优势，它可消除在PCR期间出现由于非特异性扩增而产生的假阳性结果。
进一步就背景技术而言，本领域内技术人员希望参照Innis等人，“Qptimization of PCP′s”PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications(Acad.Press，1990)。该出版物概括了将会影响预期的PCR产物的特异性，精确度和产率的技术。
应选用能与MTA酶靶多核苷酸的任一侧(即5′和3′)的一段碱基对(即，“侧面序列”)特异性杂交的寡核苷酸引物(至少一个引物对)。本领域内技术人员能够容易地基于序列表中列出的SEQ ID No.1和图1提供的多核苷酸序列信息不经过过多的试验可选出合适的引物。
设计引物时，引物内不含有能与它本身杂交的互补碱基是很重要的。为了消除在样品中可能存在的污染物质的扩增，优选的是将引物设计成跨越外显子(对于MTA酶基因，显子于图1中)。
如上文所述，为了适当地扩增样品中的核酸，在该聚合步骤中使用链反应并不是必要的。例如，当使用Kohsaka等人上文描述的技术时，聚合步骤是在固相支持物上进行的，并且随后用靶多核苷酸特异性探针进行杂交。由于该检测手段的灵敏度高，该靶多核苷酸的一次聚合反应就已足够了。
一旦扩增步骤完成，对PCR产物进行分析，以确定在该样品中是否存在编码MTA酶的基因。优选地，将双链PCR产物结合到固相物上，以便通过变性将其链分离开，从而基本上按照Kohsaka等人，上文描述的方法使序列特异性探针与PCR产物的被束缚的反义链进行杂交以便检测该基因。另一种可选方法，在加入探针与双链PCR产物进行杂交之前，从反应环境中取出以及从扩增混和物中分离出PCR产物。在后一种方法中，根据本发明领域内已知方法例如凝胶排阻，电泳式亲和层析，可从扩增混合物中分离PCR产物。
利用与一种可检测标记物稳定结合的杂交探针可检测经扩增的产物。标记物是一种共价结合到或坚固地结合到一种核酸探针上的物质，结合后可以检测该探针。例如，一种标记物可以是放射性同位素、一种酶底物或抑制剂、一种酶、一种不透射线的物质(包括胶体金属)、一种荧光剂、一种化学发光分子、含有上述标记物的脂质体或者一种特性结合对成员。一种合适的标记物在扩增期间不会丧失其可被检测的特性。
诊断领域内熟练技术人员对用于体外检测分析的合适的可检测标记是熟悉的。例如，体外使用的合适的放射性同位素包括3H，125I，131I，32P，14C，35S。采用γ-计数器或者采用放射自显影密度计检测法，或与密度检测相结合的扩增片段的Sonthern印迹分析法可直接检测采用放射性同位素标记的扩增片段。合适的化学发光分子的例子包括吖啶或鲁米诺。与由吖啶酯衍生的探针杂交的靶序列可抵抗由于插入而发生的水解。合适的荧光剂的例子是荧光素，藻胆蛋白，稀土螯合剂，丹酰或若丹明。
合适的酶底物或抑制剂的例子是那些与辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。β-半乳糖苷酸，丙酮酸激酶或碱性磷酸酶，乙酰胆碱酯酶特异性结合的化合物。不透射物质的例子是胶体全或磁粒。
特异性结合对包括两种不同的分子。其中一种分子在其表面或空腔内有一区域，该区域与另一分子的特定空间和极化结构特异性地结合。经常将特异性结合对的成员标作为配体和受体，或者称为配体和抗配体。例如，如果受体是抗体，则配体是相应的抗原。其他特异性结合对包括激素受体对，酶底物对，生物素-抗生物素蛋白对以及糖蛋白-受体对。包括保留了结合特异性的特异性结合对的片段或组成部分，如免疫球蛋白的片段，包括Fab片段等等。抗体可以是单克隆或多克隆。如果特异性结合对的一个成员被用作标记物，则优选的分离步骤包括亲和层析。
如果在上面描述的检测分析中没有检测到经扩增的产物，则表明该样品中存在的细胞为MTA酶缺陷型。因为认为正常(非恶性)细胞具有可检测量的MTA酶，则MTA酶缺陷型的发现表明该被分析的基因组DNA是从恶性细胞中获得的。本发明的检测方法特别适用于诊断目的，例如用于诊断与瘤形成特别是恶性瘤形成相关的MTA酶缺陷型。
如果需要，利用Seidenfeld等人，Biocbem.Biophys.Res.Commun.，951861-1866(1980)；也可参见下文的实施例I描述的方法对样品的MTA酶催化活性进行预筛查。然后利用本发明的检测方法确定该样品的细胞中是否存在编码MTA酶的基因。为了筛查样品中是否存在污染物即非恶性细胞。再对样品进行分析看其是否存在具催化活性或不具催化活性的蛋白质。关于这一点可使用Nobori等人，Cancer Res.531098-1101(1991)和在审U.S专利申请(流水号为No.08/176,413，申请日为1993年12月29日)描述的合适的免疫检测法。
B.合成的或重组的MTA酶多核苷酸和肽的生产本发明的另一方面提供了能够使MTA酶特异的核酸序列进行扩增的多核苷酸(特别是，寡核苷酸)。设计所述寡核苷酸的方案将考虑上面提到的几个方面。所述的寡核苷酸特别适用于诊断与MTA酶的缺陷相关的恶性肿瘤。
本发明还提供了合成和重组MTA酶和MTA酶肽，以及编码MTA酶和MTA酶肽的多核苷酸。本文中使用的“多核苷酸”是指以分离的片段形式或以较大结构的成份的形式存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合体。可从提供在重组转录单位中可进行表达的合成基因的寡核苷酸或cDNA片段装配编码本发明MTA酶或MTA酶肽的DNA。本发明的多核苷酸序列包括DNA，RNA和cDNA序列。可从遗传密码推测多核苷酸序列，但是，必须考虑遗传密码的简异性。本发明的多核苷酸包括由于遗传密码简异性而产生的序列。本发明的肽和多核苷酸包括MTA酶，MTA酶肽以及编码包括的核苷酸的各自的功能衍生物。“功能衍生物”是指一个分子的“片段”，“变异体”，“类似物”，或者“化学衍生物”。一个分子的“片段”，例如本发明的任一个多核苷酸，包括所述分子的核苷酸的片段的集合。所述分子的“变异体”是指天然存在的基本上与整个分子或其片段相类似的分子。一种分子的“类似物”是指基本上与整个分子或其片段相类似的非天然分子。
一种分子基本上类似“于另一种分子是指由两种分子产生的氨基酸序列或者就多核苷酸而言产生的核苷酸序列基本上是相同的。基本上类似的氨基酸分子具有相类似的生物学活性。因此，即使一种分子含有另一种分子中不存在的其他氨基酸残基或者如果氨基酸残基的序列是不相同的，只要两种分子具有相似活性，则它们可被认为是本文中该术语所指的变异体。
如本文中使用的，如果一种分子含有通常不是该分子一部分的其他化学部分则认为该分子是另一种分子的“化学衍生物”。所述部分可以改善分子的溶解性，吸附性，生物半衰期等等。或者所述部分降低了该分子的毒性，消除或降低了该分子的任何不需要的副作用等等。例如在Remington′sPharma ceutical Sciences，16th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Penn.(1980)公开了能介导所述效果的化学部分。
对MTA酶的一级氨基酸序列进行微小改变就可产生具有与本文所述的MTA酶和肽基本上等同活性的蛋白质。所述的改变可以是预先计划好的，如采用位点特异性诱变，或者是自发产生的，只要仍存在MTA的生物学活性则本文中包括由这种改变作用产生的所有蛋白质和肽。再者，一个或多个氨基酸的缺失也可以导致所得到的分子的结构改变而不显著改变其生物活性。这可导致产生具有更广泛用途的较小的活性分子。例如，可以除去该酶发挥所需的催化或抗原活性不需要的氨基或羧基末端氨基酸。
本文中使用的术语“保守变异”是指由另一种生物学活性类似的残基替代一种氨基酸残基。保守变异的例子包括用例如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸的疏水或残基代替代另一个疏水残基，或者以一种极化残基替代另一个极化残基，例如精氨酸替代赖氨酸，容氨酸替代天冬氨酸，或者容氨酰胺替代天冬酰胺等等。术语“保守变异”还包括使用被取代的氨基酸代替未被取代的亲本氨基酸，只要针对被取代多肽的抗体也与未被取代的多肽发生免疫反应。
用于产生本发明的MTA酶和MTA肽的DNA序列也可由几种方法获得。例如，利用本领域内熟知的杂交步骤可分离该DNA。这包括但不限于1)将探针与基因组或cDNA文库进行杂交以检测共同具有的核苷酸序列；2)用抗体筛查表达文库以便检测共有的特征结构以及3)采用聚合酶链反应(PCR)进行合成。
通过使用经标记的合成寡核苷酸探针混合物将杂交步骤用于筛查重组克隆，在所述探针混合物中，每种探针都可能与杂交样品中的特定DNA序列完全互补，所述杂交样品含有经变性的双链DNA的异源混合物。在这种筛查中，优先地在单链DNA或变性的双链DNA上进行杂交。所述杂交特别适用于检测来自于存在与所需多肽相关的非常低量的mRNA序列的来源的cDNA克隆。换句话说，通过使用针对避免非特异性结合的亚谨杂交条件，例如可以通过靶DNA与该混合物中的单个探针进行杂交而对特定的cDNA克隆进行放射自显影观察。
通过将由cDNA产生的各种mRNA注射到卵母细胞中，并给予足够的时间使之表达cDNA基因产物，并例如通过使用特异于MTA酶的抗体或者通过利用针对重复基序(motif)的探针以及具MTA酶特性的组织表达模式而检测存在的所需cDNA表达产物，对含有MTA酶的cDNA文库进行筛查。换另一种方法，利用特异与下述多肽的抗体而间接筛选一个cDNA文库中的至少具有一个表位决定基的MTA酶肽。如下文C节所述的，所述抗体是多克隆的或单克隆的并用于检测表明MTA酶cDNA存在的表达产物。
依赖于核酸杂文的筛选步骤可以分离本来自于任何生物体的基因序列，条件是可以得到合适的探针。对应于编码所需蛋白质的序列的一部分的寡核苷酸探针可采用化学方法合成。这要求必须知道一段短的寡肽氨基酸序列。从遗传密码推导编码该蛋白质的DNA序列，但是，必须考虑遗传密码的简并性。如果该序列是简并的则可以加入多种序列的混合物。这包括变性的双链DNA的异源混合物。对于上述筛选步骤，优先地是在一条单链DNA或变性的双链DNA上进行杂交。
编码MTA酶或其片段的特定DNA序列可通过1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学方法制备一个DNA序列以提供所需多肽的必要密码子；以及3)通过将从真核供体细胞中分离的mRNA进行逆转录而体外合成双链DNA序列获得。对于后一种情况，最后形成了mRNA的互补双链DNA，通常被称为cDNA。
在本发明中，可将编码MTA酶的多核苷酸及其变异体插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”是指本领域内已知的质粒、病毒或其他载体。这些载体中经过操作插入或掺入了合适的遗传序列。所述表达载体含有促使被插入的遗传序列在宿主中有效转录的启动子序列。
采用如本领域内已知的常规技术也可以完成用重组DNA转化宿主细胞。该宿主细胞可以是真核(例如中国仓鼠卵巢细胞)或原核(例如细菌或酵母)。如果宿主是原核，例如大肠杆菌，则通过在指数生长期之后收集细胞，随后根据本领域内已知步骤用CaCl2法处理而制备能够摄取DNA的感受态细胞。另一种方法，可使用MgCl2或RbCl。在将宿主细胞形成原生质体之后或者采用电击穿方法也可完成转化。
由本领域内熟练的技术人员采用的常规技术，包括制备性层析和涉及单克隆或多克隆抗体的免疫分离可以将微生物表达的本发明的MTA酶或其片段进行分离和纯化。
基于SEQ ID No.1中含有的信息，可容易地推导出MTA酶的全长氨基酸序列。利用该信息，可以采用常用方法，例如t-BOC或FMOC保护α-氨基方法，不经过多的试验也可以合成MTA酶和MTA酶肽。两种方法都涉及分步合成，从肽的C末端开始每一个步骤增加一个氨基酸(参见，Coligan，et al.，Cwrrent Protocols in Immunology-Wiley Interscience，991，Unit9)。采用各种熟知的固相肽合成法，例如由Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149(1962)描述的方法，以及Stewart和Young，Solid Phase PeptidesSythesis，(Freeman，San Francisco，27-62，1969)描述的方法，利用含有0.1-1.0mmol胺/每克聚合体的一种共聚体(苯乙烯-二乙烯基苯)也可以合成本发明的肽。
在后一种方法中，完成化学合成后，在0℃，用液体HF-10％甲氧基苯处理约1/4-1小时而从该聚合体上将肽去保护并切割掉。在将试剂蒸发之后，用1％乙酸溶液从该聚合体中提取肽，然后冷冻干燥而产生粗产品。通常可采用这样的技术如用5％乙酸作为溶剂在Sephadex G-15上凝胶过滤进行纯化。将该柱子的合适级分冷冻干燥并生匀质肽或肽衍生物，然后采用诸如氨基酸分析，薄层层析，高效液相层析，紫外吸收分光分析，摩尔施光度，溶解度可对肽进行急性分析，并且可采用固相埃德曼降解进行定量测定。
C.抗-MTA酶抗体的生产采用常规技术可以测定MTA酶肽的抗原特性，该常规技术用来确定已用该肽免疫接种的动物的抗体应答的强度。通常，用于制备抗-MTA酶抗体的MTA酶肽应该是那些诱导高效价抗体产生的肽，而所产生的抗体与MTA酶具相当高的亲和性。利用例如在Rangione et al.，(J.Biol.Chem见上文)中描述的方法或者上文中描述的用于获得MTA酶肽的方法可以纯化出这样的肽用作为免疫原。
一旦制备了抗原肽，通过将该肽导入到哺乳动物(例如兔，鼠或大鼠)中来制备抗免疫接种的肽的抗体。为了说明该目的，在本文所附的序列表中的SEQ ID No.2和3中提供了两种抗原MTA酶肽的氨基酸序列。接种这些肽的兔产生的抗体显子对以1∶1500和1∶4000稀释的纯MTA酶溶液的应答分别为最大值的50％。
对于用抗原MTA酶肽接种动物时优选使用的是多次注射的免疫接种方案(参见，例如，Langone et al.，eds.，“Production of Antisera with SmallDoses of ImmunogenMultiple Intradermal Injections”，Methods ofEnzymology(Acad.Press，1981)。例如，通过皮内注射1mg抗原MTA酶肽(悬浮于完全佛氏佐剂中)，随后几个星期通过注射一次或多次加强剂量的相同抗原(于不完全佛氏佐剂中)可从兔中获得良好的抗体应答。
如果需要，利用本领域内已知技术通过接合将免疫接种肽偶合到载体蛋白上。这种普遍使用的化学偶合到该肽上的载体包括钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)，甲状腺球蛋白，牛血清白蛋白(BSA)以及破伤风类毒素。然后将该偶合的肽用于接种动物(例如小鼠或兔)。由于目前认为MTA酶在哺乳动物种内是保守的，使用一种加强MTA酶蛋白的疫原性的载体蛋白是优选的。
例如通过结合到一种基质上并从其上洗脱可进一步纯化由动物产生的多克隆抗体，所述基质上结合了制备该抗体的肽。本领域技术人员将会知道在多克隆抗体和单克隆抗体的纯化和/或浓缩的免疫技术领域内常用的各种技术(参见，例如，Coligan，et al.，Unit 9，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1991)。
为了制备单克隆抗体，优先的是免疫接种一种小鼠或小鼠。本发明中使用的“抗体”是指能够结合到表位决定基上的完整分子及其片段，例如Fab和F(ab′)2。在本文中“本发明的mAb′s”是指与MTA酶具特异性的单克隆抗体。
用于生产分泌单克隆抗体(“mAb”)的杂交瘤的常规方法是公知的(Kohler和Milstein，Nature，256495，1975)。简单地说，如Kohler和Milstein所述，该技术包括由外科标本获得淋巴细胞，所述淋巴细胞是从患有不同癌症的5个患者的局部排液淋巴结(regional draining lymph node分离的，这5个患者分别患有黑色素瘤，畸胎瘤癌或宫颈癌，神经胶质瘤或肺癌。将这些淋巴细胞集合在一起，然后与SHFP-1融合。筛选产生与瘤细胞系结合的抗体的杂交瘤。
利用常规筛选技术(例如酶连免疫吸附检测反应或“ELISA”)证实mAb中MTA酶的特异性，从而确定目的mAb的基本反应模式。
通过确定所检测的mAb是否能阻止本发明的mAb与上文中描述的方法分离到的MTA酶结合，可以在不经过过多试验情况下确定一种mAb是否与本发明的mAb具相同特异性。如果所检测的mAb与本发明的mAb进行竞争，如显子出使本发明的mAb的结合降低，那么这两种单克隆抗体是结合到相同或密切相关的表位决定簇上。
确定一种mAb是否具有本发明mAb的特异性的另外一种方法是，将本发明mAb与对所检测mAb具正常反应性的一种抗原进行预保温，并确定所检测的mAb是否被抑制了其结合该抗原的能力。如果所检测的mAb受到了抑制，则极有可能该mAb与本发明mAb具有相同的或密切相关的表位决定基特异性。
D.MTA酶检测试剂盒可以制备在实验室和临床上使用的MTA酶检测试剂盒，它包括上文描述的方法中使用的试剂，例如，用于上文A节所述方法中的试剂盒优选包括寡核苷酸引物(如在上文B节中制备的)，可检测标记的杂交探针以及试剂包被的微滴板。该检测试剂盒还可包括上文C节中描述的用于MTA酶蛋白质免疫检测的抗体(如在审专利申请，序列号No.08/176,413，申请日为1993年12月29日中的描述)。
上文中已详细描述了本发明，下文中提供了说明实施方法的实施例。这些实施例只是举例说明，不限制本发明的范围。
在实施例中，使用了下列缩写AS＝反义，DTT＝二硫苏糖醇；min＝分钟；MTA酶＝5′-脱氧-5′-甲硫腺苷磷酸化酶；PCR＝聚合酶链反应；S＝有义；SSc＝0.3M NaCl，0.03M柠檬酸钠＝水合物；v/v＝体积/体积；SDS＝十二烷基硫酸钠。
实施例I
在一个样本中检测MTA酶催化活性通过检测从[甲基-14C]5′-脱氧-5′-甲硫腺苷形成的[甲基-14C]5-甲硫核糖-1-磷酸盐可测定MTA酶的磷酸解活性(Seidenfeld等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.95，1861-1866，1980)。在200μl的总体积中，标准反应混合物含有50mM磷酸钾缓冲液，pH7.4，0.5mM[甲基-14C]5′脱氧-5′-甲硫腺苷(2×105CPM/mmol)，1mM DTT以及所示量的酶。在37℃保温20分钟之后，通过加入50μl的3M三氯乙酸而终止反应，并将200μl样品加到用水平衡的0.6×2cm的“Dowex”50-H*柱上。将[甲基-14C]5-甲硫核糖-1-磷酸盐直接洗脱到含2ml的0.1M HCl的闪烁计数小瓶中。
实施例II从大鼠肝脏中纯化天然的MTA酶采用经修改的Rangione等人的方法(J.Biol.Chem.261，12324-12329，1986)从大鼠肝脏中分离MTA酶。在加有4倍体积的含1mM DTT的10mM磷酸钾缓冲液，pH7.4(缓冲液A)的Waring Blendor中，将50克的新鲜大鼠肝脏进行匀浆化处理。将该匀浆液离心(以15,000×g离心1小时)，并将得到的上清液进行硫酸铵分级分离。通过离心(15,000×g离心20分钟)收集55和75％饱和度之间的沉淀，并溶于最小体积的缓冲液A中。然后将样品在经三次替换的100份体积的相同缓冲液中渗析过夜。
通过以15,000×g离心30分钟而使样品澄清，然后上样到预先用缓冲液A平衡过的DEAE-Sephacyl柱(1.5×18cm；Pharmacia)。在用80ml平衡缓冲液洗涤之后，用线性梯度(80ml)或溶于缓冲液A中的0-0.3M NaCl洗脱。在0.1和0.15M NaCl之间洗脱出MTA酶。通过超过滤(Amicon PM-10 Diflow膜)将含有至少0.06单位/mg蛋白质的组分浓缩20倍，并在含1mM DTT的25mM磷酸钾缓冲液，pH7.4(缓冲液B)中充分渗析。然后将该样品加到羟基磷灰石柱(1×12cm)(Bio-Rad)上。在用缓冲液B洗脱未吸附的蛋白质之后，用含1mM DTT的40ml 50mM磷酸钾缓冲液，pH7.4洗脱柱子。
然后用50-250mM磷酸钾，pH7.4线性梯度(40ml)洗脱MTA酶。通过超过滤将具MTA酶活性的组分浓缩30倍，通过重复浓缩和用50mM磷酸钾缓冲液，pH7.4稀释去除二硫苏糖醇。然后将部分纯化的酶加到用50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4平衡的有机汞琼脂糖(Bio-Rad)柱(0.8×3cm)上。用a)50mM磷酸钾缓冲液，pH7.4；b)50mM磷酸钾缓冲液，pH7.4，2M Kcl；以及c)50mM磷酸钾缓冲液，pH7.4，2M Kcl，40mM 2-巯基乙醇对该柱逐步进行洗脱。然后用50mM磷酸钾缓冲液，pH7.4，2M KCl，200mM 2-巯基乙醇洗脱酶。收集至少含3单位/mg蛋白质的组分，通过超过滤浓缩到1ml，并于1000倍体积的10mM Tris/HCl，pH7.4，1M DTT(缓冲液C)中透析过夜。作为一个最终纯化步骤，以1ml/分的流速将样品(1ml)注射到“MONO Q”柱(Pharmacia)，该柱用含1mM DTT的10mM Tris/HCl，pH7.4进行预平衡，收集0.5ml组分。于缓冲液C中0.08-0.14M NaCl之间洗脱出MTA酶活性。通过超过滤将该级分浓缩到0.5ml并于1000倍体积的缓冲液B中渗析。
实施例III大鼠MTA酶的部分氨基酸序列的测定将纯化样品冻干，溶于50μl载体缓冲液(1％+二烷基硫酸钠(SDS)，10％甘油，0.1M DTT以及0.001％溴酚蓝)并上样到0.5mm厚10％SDS聚丙烯酰胺凝胶(Bio Rad“MINIGEL”仪)。电泳后，按照Towbin等人描述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76，4340-4345，1979)利用转移缓冲液(15mM Tris，192mM甘氨酸以及20％甲醇，pH8.3)在一个Bio-Rad转印系统中将该蛋白质电印迹2小时至硝基纤维素膜(0.45μm孔径，Millipore)。
在转移之后，按照Sailinovich和Montelaro描述的经过修改的方法(Anal.Biochem.156，341-347，1987)，用Ponceau S(Sigma)将蛋白质可逆染色。然后将该硝基纤维素膜在溶于1％乙酸水溶液中的0.1％Ponsean S染料溶液中浸60秒。通过于1％醋酸水溶液中缓慢振荡1-2分钟而从印迹上除去过多染料。将由染色检测到的含蛋白质的区域切下，转移到Eppedorf管(1.5ml)，并且蒸馏水洗涤，并在37℃于溶于100mM乙酸中的0.5％聚乙烯的吡咯烷酮(平均分子量＝40,000；PVP-40，Sigma)的1.2ml溶液中保温30分钟，以便阻止蛋白酶在消化期间吸附到硝基纤维素膜上。通过用水彻底地洗涤(至少5次)而去除过量的PVP-40。
然后将硝基纤维素膜切成约1mm×1mm的小片并放回到同一个管中。如前面描述方法(Los等人，Science 243217-220，1989)将硝基纤维素膜片上的蛋白质进行消化。加入溶于100μl的100mM Tris-HCl，pH8.2/乙腈，95∶5(v/v)中的胰蛋白酶(10pmol)，并于37℃保温过液。在消化之后，用30μl 10％三氟乙酸将含肽的上清液酸化，并于Vortex上快速旋转一下，以15,000×g离心1分钟。除去上清液，并立即注射到装备了BrownleeAquapore Bu-300分析柱(2.1×100mm)的反相HPLC系统(Beckmann)中。
以200μl/分钟的流速将洗脱液D 0.1％三氟乙酸(测序用级别，溶于水中)泵入柱子5分钟，然后将流速降至100μl/分，并用洗脱液E(0.08-0.095％三氟乙酸，溶于乙腈/H2O，70∶30(w/v))开始梯度洗脱。基于在215nm处UV吸收值，通过手工操作将含有肽的组分收集到Eppendorf管中。将具代表性的组分60和77进行氨基酸测序(ABI 477A Protein Sequencer，它带有120A Online PTH-AA Analyzer)。由此获得了大鼠MTA酶的独立的部分氨基酸序列。在SEQ ID No.5-6中描述了被称为肽1(级分60)和肽2(级分77)的氨基酸序列。
实施例IV编码部分人MTA酶基因的DNA片段的扩增基于肽1(SEQ ID No.4)和2(SEQ ID No.5)的部分氨基酸序列，合成2套具不同极性的寡核苷酸引物。将每个寡核苷酸设计成在其5′-末端包含唯一限制性位点(EcoRI或BamHI)，以便利被扩增的DNA片段进行随后的克隆。为了用于PCR扩增，利用“λ-TRAP”试剂盒(Clontech)从1×106噬菌斑形成单位(pfu)的人胎盘cDNA基因文库(Clontech)中分离总cDNA。在100μl总体积中进行PCR反应，所述总体积含有来自人胎盘cDNA基因文库的1μg总cDNA，1×PCR缓冲液(10mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3，2.5mM MgCl2)，各0.2mM的各种dNTP，有义和反义引物各100mg以及10单位的Taq DNA聚合酶，Stoffel片段(“AMPLITAQ”，Perkin-Elmer Cetus)。
用“GENE AMP”PCR系统9600(Perkin-Elmer Cetus)进行四十个循环，各个循环包括变性(92℃，1分钟)，退火(55℃，2分钟)以及延伸(72℃，2分钟)。通过在0.8％琼脂糖凝胶上于1×TA缓冲液(40mM Tris-乙酸盐，20mM乙酸钠，2mM EDTA，pH7.9)中电泳而分离PCR产物，扩增了一个450bp的DNA片段。用限制性酶EcoRI/BamHI对PCR扩增产物进行双消化，在0.8％琼脂糖凝胶上于1×TA缓冲液中分离，并用“GENE CLEAN”试剂盒(Bio 101)从凝胶上回收，将回收产物亚克隆到EcoRI/BamHI切割的pBluescript载体SK+(Stratagene)上并根据双脱氧终止法利用通用的测序引物(“SEQUENASE”Version 1.0 DNA测序试剂盒，USB)进行测序。
实施例V人胎盘cDNA基因文库的筛查对PCR扩增的产物(实施例IV)进行序列分析结果证明与肽1(SEQ IDNo.5)的C-末端氨基酸序列完全一致。利用450bp DNA片段作为杂文探针，筛查人胎盘cDNA基因文库(Clontech)。为此，将大肠杆菌菌株Y1090宿主细胞在含0.2％麦芽糖和10mM MgSP的LB培养基(每升含10克胰蛋白胨，5克酵母抽提物，10克NaCl)中于37℃激烈振荡培养过夜。对于每个培养平板，将0.3ml宿主细胞培养物与3×104pfu噬菌体混合并在37℃温育20分钟。将宿主细胞和噬菌体的混合物加到8ml含0.7％琼脂糖(LB顶级琼脂糖(LB-top-agarvose))的LB培养基中，所述培养基中会有的琼脂糖预先在48℃温热，再倾至20个琼脂平板上(135×15mm)。在37℃培养6-8小时之后肉眼可以噬菌斑，将平板冷却至4℃保持1小时。将噬菌斑转移至菌落/噬菌斑筛选尼龙转移膜(NEN Research Proclucts，Dupont Boston，MA)上3分钟，然后变性(在0.5N NaOH中变性2分钟2次，)，变性(于1.0M Tris-HClpH7.5中2分钟2次，)，通过风干而固定。在各含有10个膜的2个塑料袋中，利用20ml的预杂交缓冲液(1％SDS，2×SSC，10％糖酐酯，50％去离子甲酰胺)于42℃将20个膜预杂交4小时。
利用缺口转译试剂盒(Boehringer Mannheim)，以[α-32P]dATP(3.00Ci/mmol)对部分人MTA酶基因的450bp EcoRI-BamHI片段进行标记，并在NICK柱(Pharmacia)上将它与未掺入的放射活性分离开，通过在96℃加热10分钟而变性，于冰上冷却，加到含浓度为106dpm/ml的探针的塑料袋中的膜上。经标记的探针的比活为约108dpm/μg。在42℃进行杂交反应过夜。完成杂交之后，用过量2×SSC在室温下将膜洗三次5分钟，然后在65℃用2×SSC，0.1％SDS洗20分钟，在室温下用0.2×SSC，0.1％SDS洗一次20分钟。洗涤之后的膜量于X-射线膜下过夜。
将含有一个阳性信号周围的几个噬菌斑的琼脂块移到1ml无菌噬菌体稀释液(50mM Tris-HCl，pH7.5，0.1M NaCl，8mM MgSO4，0.01％明胶，并按如上方法再次筛选，直至获得纯阳性噬菌斑。从约0.5×106个噬菌斑筛选结果看，获得6个相互独立的阳性克隆。在LB平板上扩增之后，利用“λ-TRAP”试剂盒(Clontech)纯化阳性克隆的每个噬菌体DNA。纯化到的噬菌体DNA用EcoRI酶切割，得到整个插入物，但由于该插入物内存在一个EcoRI位点，从所有克隆都切割出两条带。
将来自各为MTAp-1的典型噬菌体克隆得到的两个EcoRI插入片段(850bp和1100bp)亚克隆到EcoRI切割的pBluescript SK+载体(Stratagene)。将这些亚克隆分别命名为MTAP-2(850bp)和MTAP-3(1100bp)。对这两个亚克隆进行限制性分析和DNA测序分析显子，MTAP-2亚克隆具有编码254个氨基酸的开放阅读框架，在该氨基酸序列的C-末端含有对应于肽3的氨基酸序列(同源性90％)。从人的MTA酶的分子量为32KDa的计算(F.D.Rangione et al.，J.Biol.Chem.26112324-12329，1986)来看，包覆盖了总蛋白的85％以上。缺失了约50个氨基酸(以DNA水平上计算至少是150bp)。
实施例VI获得MTA酶的缺失的5′末端cDNA的引物的延伸为了获得5′末端缺失的DNA片段，使用RACE(cDNA末端的快速扩增)(Loh等人，Sciece.243217-220，1989；Frohman，et al.，PNAS 858998，1988)。将人胎盘的1μg聚(A+)RNA(Clontech)溶于6.25μl H2O中，在65℃加热5分钟，置于冰上冷却，并加到由4μl 5×RTC缓冲液(250mM Tris-HCl，pH8.15，30mM MgCl2，200mM KCl，5mM DTT)；4μl(0.4mg/ml)的放线菌素D(Boehringer)，各1μl的各种dNTP(20mM)，0.25μl(10个单位)的RNasin(Boehringer)，1μl的[α-25S]dATP(1443 Ci/mmol)，1μl的人MTA酶特异的反义寡核苷酸3 AS和10单位鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶(Boehringer)组成的混合物中。将该混合物在42℃保温2小时。
按如下方法除过量引物和dNTP将20μl cDNA集合物加到NICK-柱(Pharmacia)上，并收集两滴组分。收集与放射活性的第一峰值相关的组分5-8，在-80℃用1/10体积的7.5M NHOAC和2.5体积的乙醇沉淀2小时，在4℃以15,000×g离心30分钟，用0.5ml的80％乙醇洗涤，在减压条件(Speedvac)下干燥并溶于20μl的H2O中。为了加尾，加入1.5μl的dGTP(20mM)，2.4μl的CoCll2(25mM)，6μl的5×加尾缓冲液(1mM砷酸钾，125mM Tris-HCl，pH6.6，1.25mg/ml(牛血清白蛋白)以及0.5μl的(15单位)末端脱氧核酰基转移酶(Boehringer)。
将该混合物在37℃保温一小时，在65℃加热15分钟，用同样体积的TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，0.1mM EDTA)提抽一次，所述TE缓冲液用酚饱和，然后如上面所述用乙醇沉淀。将加了尾的cDNA集合物溶于20μl的H°中并用1μl进行PCR扩增。为了进行扩增合成二种其他引物。一种引物是MTA酶特异性反义引物，该引物定位于寡核酸3 AS位置上游180bp处。另一引物是针对聚(G)末端的引物。按如上所述扩增进行40个循环。每个循环由变性(92℃，1分钟)，退火(50℃，2分钟)和延伸(72℃，0.5分钟)组成。
在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离PCR产物。特异性地扩增了所得到的520bp DNA片段。在0.8％琼脂糖制备性凝胶上纯化之后，用NotI和BclI消化(在延伸的DNA片段和亚克隆MTAP-2的原始片段之间的重迭区中存在的相关限制性位点)该520bp DNA片段并亚克隆到NotI/BamHI切割的pBlueseript SK+载体(Stratagene)上。对分别命名为MTAP-4，MTAP-5和MTAP-6的三个独立的亚克隆进行序列分析的结果显子，每个克隆在重迭区中含有完全区配氨基酸序列。
这三个引物延伸的cDNA亚克隆的长度稍有差异。这表明，它们是相互独立的PCR产物，并且它们的序列反映出正确的mRNA序列，在PCR扩增过程中没有任何错误掺入。具有起始密码子ATG(编码甲硫氨酸)的新上游序列与亚克隆MTAP-2的下游序列结合，产生了编码283个氨基酸的开放阅读框。
实施例VII重组人MTA酶在大肠杆菌中的表达通过利用其共同的限制性位点Hind II，将亚克隆MTAP-4的引物延伸的cDNA片段(实施例VI中获得的含有三个亚克隆的最大插入物)加到亚克隆MTAP-2的DNA插入物的5′末端而构建人MTA酶的全长cDNA。将来自亚克隆MTAP-4的NotI/Hind II-DNA片段以及来自亚克隆MTAP-2的大Hind II/EcoRI片段混合，并亚克隆到NotI/EcoRI切割的pBluescript载体SK+(Srtagene)上。将获得的含有人MTA酶的全长cDNA的亚克隆命名为MTAP-7。为了核实该cDNA克隆的可靠性，利用装备了Taq启动子(Pharmacia)的大肠杆菌表达载体pKK223-3表达该重组蛋白质。
为了在该cDNA片段的5′末端产生新的EcoRI位点以及在该cDNA片段的3′末端产生一个PstI位点，得用含有Shine-Dalgarno(SD)序列的5′-引物寡核苷酸以及另一3′引物进行PCR。按上面所述扩增20个循环，每个循环由变性(92℃，1分钟)，退火(55℃，1分钟)和延伸(72℃，1分钟)组成。用限制性酶EcoRI/PstI消化该PCR产物，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳纯化，并亚克隆到EcoRI/PstI切割的pBluescript载体SK+(Stratagene)中。
在核实了称为MTAP-8的亚克隆中的插入物的全长序列之后，切下EcoRI/PstI片段，并亚克隆到EcoRI/PstI切割的pKK223-3载体中，产生含有人MTA酶cDNA的大肠杆菌表达载体，将命名为MTAP-9的亚克隆转化到大肠杆菌JM105菌株中。对有或没有异丙基-β-D-硫半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导情况下转化细胞的总蛋白质谱带和酶促活性进行分析。将一个单转化菌落接种到2ml的LB培养基中并在37℃培养过夜，将位培养过夜的20μl培养物加到两个塑料管中，每个管含有2ml新鲜LB培养基(1/100稀释)。
在37℃培养1小时之后，向一个试管中加入20μl 0.1M IPTG进行诱导，以得到1mM IPTG的终浓度，并在37℃再培养4小时。通过在15,000×g离心5分钟收集细胞之后，将细胞悬浮于100μl磷酸盐缓冲液(50mM磷酸钾，pH7.5，1mM DTT)中，通过在步骤3中于冰上超声处理0.5分钟破碎细胞，通过在15,000×g离心10分钟而获得粗细胞提取物。
利用Bradford方法(Bio-Rad，Protein Assay)确定蛋白质浓度。分析有或没有IPTG诱导的相同量的样品的酶促活性，并在10％SDS聚丙烯酶胺凝胶上电泳。从IPTG诱导的细胞获得的粗提取物显子的MTA酶活性比未诱导细胞的MTA酶活性高5倍以上。此外，在SDS凝胶上，检测到新诱导的蛋白质带(31KDa)。
实施例VIIIMTA酶基因组克隆的克隆和部分特征为了诊断目的而采用PCR最有效地扩增DNA片段，片段的大小优选低于500bp。cDNA序列反映外显子的总和，而外显子常被内含子分隔开，这使得从cDNA序列中找到具合适大小的正确序列是困难的。为了克服这个问题，分离人MTA酶的基因组克隆。利用MTA酶cDNA基因探针(从MTAP-7亚克隆得到的NotI/EcoRI片段)对从人胎盘DNA构建的粘粒基因文库(Clontech)进行筛选。以1-2×104/135×15mm平板的菌落密度将该文库的转化大肠杆菌细胞培养于含氨苄青霉素(50mg/升)的LB平板上。
按实施例IV描述完成下列步骤。从1/2×106菌落分离出单个阳性菌落，命名为MTAP-10，并采用PCR分析和直接测序法进行部分定性。合成两个引物，一个有义寡核苷酸，定位于终止密码子上游120bp，一个反义寡核苷酸，定位于终止密码子下游20bp处，并用于PCR分析。PCR反应进行25个循环，每个循环由变性(92℃，1分钟)，退火(55℃，2分钟)以及延伸(72℃，5分钟)组成。在0.8％琼脂糖凝胶上分离PCR产物。
附图1中描绘了利用上面介绍的技术到目前为止在MTA酶基因中鉴别到的处显子的位置。
实施例IX将MTA酶序列特异的寡核苷酸应用到恶性细胞系中以便检测其中是否存在MTA酶为了检测寡核苷酸的用途，将PCR方法应用到已知含有MTA酶阳性和阴性细胞的几个细胞系中。按实施例VIII描述分离基因组DNA并将1μg该DNA用于PCR反应。按如上所述扩增40个循环，每个循环包括变性(92℃，1分钟)，退火(55℃，1分钟)以及延伸(72℃，1/2分钟)。在1.5％琼脂糖凝胶上分析该PCR产物。在已知是MTA酸阴性的细胞系中未检测到MTA酶，而在MTA酶阳性细胞系中检测到了MTA酶。
序列概述SEQ ID No.1是甲硫腺苷磷酸化酶(MTA酶)的基因组克隆。
SEQ ID No.2是抗原MTA酶肽(“肽40”)。
SEQ ID No.3是抗原MTA酶肽(“肽51”)。
SEQ ID No.4是MTA酶基因进行PCR扩增的引物(“肽1”)。
SEQ ID No.5是MTA酶基因进行PCR扩增的一种引物(“肽2”)。
序列表(1)一般资料(i)申请人THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA(ii)发明名称检测5′-甲硫腺苷磷酸化酶缺陷型哺乳动物细胞的方法(iii)序列数5(iv)通信地址(A)收信人Robbins，Berliner & Carson(B)街道201 N.Figueroa street，5th Floor(C)城市Los Angeles(D)州California(E)国家USA(F)邮编90012(v)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBMPC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，Version #1.25(vi)现有申请资料(A申请号(B)申请日(C)分类号(viii)律师/代理人资料(A)姓名Berliner，Robert(B)登记号20，121(C)案号5555-287(ix)电信资料(A)电话213-977-1001(B)传真213-977-1003(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度2763个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vii)直接来源(B)克隆甲基腺苷磷酸酶(ix)特征(A)名称/关键词(NAME/KEY)CDS(B)位置1..2763(xi)序列描述SEQ ID NOlTTTATACAGA GCATGACAGT GGGGTCCTCA CTAGGGTCTG TCTGCCACTC TACATATTTG 60AAACAGGAGT GGCTTCTCAG AATCCAGTGA ACCTAAATTT TAGTTTTAGT TGCTCACTGG 120ACTGGGTTCT AGGAGACCCC CTGTGTTAGT CTGTGGTCAT TGCTAGSAGA ATCACTTAAT 180TTTTTCTAGA CTCTAGGAGA AAACAGTTGG TGGTGTACTC ATCACGGGTT AACAATTTCT 240TCTCTCCTTC CATAGGCATG GAAGGCAGCA CACCATCATG CCTTCAAAGG TCAACTACCA 300GGCGAACATC TGGGCTTTGA AGGAAGAGGG CTGTACACAT GTCATAGTGA CCACAGCTTG 360TGGCTCCTTG AGGGAGGAGA TTCAGCCCGG CGATATTGTC ATTATTGATC AGTTCATTGA 420CANNNNNNNN NNNNNNNNNN GAGGTCGACG GTATCGATAA GCTTTGTAAA CAATTGTCTT 480TAGCTTATCC AGAGGAATTG AGTCTGGAGT AAAGACCCAA ATATTGACCT AGATAAAGTT 540GACTCACCAG CCCTCGGAGG ATGGAAAGAT GGCCTTAAAA TAAAACAAAC AAAAACCTTT 600TTTGCTTTAT TTTGTAGGAC CACTATGAGA CCTCAGTCCT TCTATGATGG AAGTCATTCT 660TGTGCCAGAG GAGTGTGCCA TATTCCAATG GCTGAGCCGT TTTGCCCCAA AACGAGAGAG 720GTGTGTAGTC TTTCTGGAAG GTGTACCAGA ATAAATCATG TGGGCTTGGG GTGGCATCTG 780GCATTTGGTT AATTGGCAGA CGGAGTGGCC CCATACCCTC ACTCAAGTTT GCTTTGTATT 840ATGCAAGTTT ATGGAGAGTT ATTTCCTGTT GCTAATAATT TNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 900AAGTGCAGCC TTAAGTTGTG CATGTGCTAG TATGTTTTGA AGTTTCTGGT TTTTCTTTTC 960TAGGTTCTTA TAGAGACTGC TAAGAAGCTA GGACTCCGGT GCCACTCAAA GGGGACAATG1020GTCACAATCG AGGGACCTCG TTTTAGCTCC CGGGCAGAAA GCTTCATGTT CCGCACCTGG1080GGGGCGGATG TTATCAACAT GACCACAGTT CCAGAGGTGG TTCTTGCTAA GGAGGCTGGA1140ATTTGTTACG CAAGTATCGC CATGGGCACA GATTATGACT GCTGGAAGGA GCACGAGGAA1200GCAGTAGGTG GAATTCTTTT CTAAGCACAT ATAGCATGGG TTTCTGGGTG CCAATAGGGT1260GTCTTAACTG TTTGTTTCTA TTACGTTAGT TTCAGAAAGT GCCTTTCTAC AAGGTTTTGA1320AGTTGTTAAT ATTTTCTGTA GTTCCATTGG AAGGTAAGAA CAAAGATCAA AAGAAAGAAA1380GAGACACTTT TACCCAAGGA TCAGTAGTGA AAATAGTACA TTGTAGGCAT GTAGATGTGT1440TGAGAATCAT ACTAAGACTT GGGCCTTANN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNTACCCTAC1500ATTGAGGATT CGGTTTCAGC AGATAAATTT GAGGGACACA AACATTTAGG CTGTAGCAAG1560
GCTGGAGCTC AGAAAAATGT TTTATGACAA GCAGTGGAAT TTTAAGTTCT AGTAACCTCC 1620AGTGCTATTG TTTCTCTAGG TTTCGGTGGA CCGGGTCTTA AAGACCCTGA AAGAAAACGC 1680TAATAAAGCC AAAAGCTTAC TGCTCACTAC CATACCTCAG ATAGGGTCCA CAGAATGGTC 1740AGAAACCCTC CATAACCTGA AGGTAAGTGC AGCCATGGAC AATCAGGCAT GTCTGTAGAC 1800TCTCTATTGT CTTCTTTTCT TACTTGCATT TCACCTTTGG TCCTCATGTA TTTTTTGCCA 1860GCCTAGATGT TTTCAACAAG TTTTTGTGAC ATCTACTACT ACCATACCAA CCACTTGTGA 1920AACTGAGTAG TCTTATTTTC TTGGCTGGTA GTGCAGANNN NNNNNNNNNN NNAATAAACA 1980ATAATCCAGG CTGGGCTGGT ATGGCAATAA GTGATTATCA GAACAATGCT CTGAGATAAG 2040CATTATTAAC CTCACTTTAC AGGAAAGGGA GGTGAGGAAC CAAGAGTTTA GAGTACCCGA 2100AGTTCCACAT CTGGTTAGTG AACTTGAAAA TTTTCTGTAG AATTTATTTA AAGTGTATGT 2160TTCCTGCGTC CTCACTTTGA TCTAGAAAAT CAAAATCTGT TTTTTTTTTT AACAAACATC 2220TCAGTAATTA CGCCAACATG TGAATATCAC TGCCTCCTTT CTTCCTTTCA GAATATGGCC 2280CAGTTTTCTG TTTTATTACC AAGACATTAA AGTAGCATGG CTGCCCAGGA GAAAAGAAGA 2340CATTCTAATT CCAGTCATTT TGGGAATTCC TGCTTAACTT GAAAAAAATA TGGGAAAGAC 2400ATGCAGCTTT CATGCCCTTG CCTATCAAAG AGTATGTTGT AAGAAAGACA AGACATTGTG 2460TGTATAGAGA CTCCTCAATG ATTTAGACAA CTTCAAAATA CAGAAGAAAA GCAAATGACT 2520AGTAACATGT GGGAAAAAAT ATTACATTTT AAGGGGGAAA AAAAACCCCA CCATTCTCTT 2580CTCCCCCTAT TAAATTTGCA ACAATAAAGG GTGGAGGGTA ATCTCTACTT TCCTATACTG 2640CCAAAGAATG TGAGGAAGAA ATGGGACTCT TTGGTTATTT ATTGATGCGA CTGTAAATTG 2700GTACAGTATT TCTGGAGGGC AATTTGGTAA AATGCATCAA AAGACTTAAA AATACGGACG 2760TAC 2763(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(vii)直接来源(B)克隆甲基腺苷磷酸酶肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..17(xi)序列描述SEQ ID NO2Ile Gly Ile Ile Gly Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu Glu Gly
15 10 15(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度13个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(vii)直接来源(B)克隆甲基腺苷磷酸酶肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..13(xi)序列描述SEQ ID NO3Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro Gln Ile Gly Ser Met Glu1 5 10(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(vii)直接来源(B)克隆甲基腺苷磷酸酶引物(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..8(xi)序列描述SEQ ID NO4Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys1 5
(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(vii)直接来源(B)克隆甲基腺苷磷酸酶引物(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..9(xi)序列描述SEQ ID NO5Thr Trp Gly Ala Asp Val Ile Asn Met1 权利要求
1.一种分离的多核苷酸，它编码具有说明书序列表中SEQ.ID.NO.1所示核酸序列的MTA酶。
2.一种重组表达载体，含有权利要求1所述的多核苷酸。
3.由权利要求2的重组表达载体表达的MTA酶。
4.一种重组表达载体，含有权利要求1的编码肽的多核苷酸片段。
5.由权利要求4的重组表达载体表达的MTA酶肽。
6.用权利要求5的MTA酶肽免疫动物产生的抗体。
7.根据权利要求6所述抗体，其中所述抗体是由被免疫动物的细胞形成的杂交瘤产生的单克隆抗体。
8.一种分离的根据权利要求1的多核苷酸，仅包括本文所附序列表中SEQ.ID.NO.1所示核酸序列的外显子编码区。
9.含有权利要求8的多核苷酸的重组表达载体。
10.一种由含有MTA酶编码核酸的重组表达载体转化的大肠杆菌，其可由保藏于马里兰州Rockville的美国典型培养物保藏中心，ATCC保藏号55536，55537，55538，55539和55540的存活保藏物提供。
全文摘要
检测一个细胞样品中是否存在催化活性形式或非催化活性形式的甲基腺苷磷酸酶(MTA酶)的方法。一方面，该方法包括向该样品中加入寡核苷酸探针，在有利于进行杂交的条件下该探针能与样品中的编码MTA酶的核酸特异性地杂交。在样品中没有MTA酶是恶性肿瘤的指示。本发明还提供了编码MTA酶的多核苷酸，MTA酶肽和抗该MTA酶的抗体以及实施本发明方法的试剂盒。
文档编号C12N15/09GK1513997SQ0215786
公开日2004年7月21日 申请日期1994年12月22日 优先权日1993年12月29日
发明者楚特穆·诺伯里, 楚特穆 诺伯里, A 卡森, 丹尼斯·A·卡森, 塔卡巴亚什, 肯吉·塔卡巴亚什 申请人:加利福尼亚大学董事会