专利名称：一种大肠埃希氏菌rb3菌株及用它液态发酵制备乙酰酯酶的方法
技术领域：
本发明涉及大肠埃希氏菌属的一株新菌株及用它液态发酵制备乙酰酯酶的方法。
背景技术：
半纤维素的彻底降解与木质纤维素资源转化与利用密切相关。半纤维素是仅次于纤维素的第二大植物多糖，由木糖、阿拉伯糖等单元构成的不均一多糖。在大多数植物细胞壁中，半纤维素以木聚糖为骨架，木糖残基的C-2或者C-3均有不同程度乙酰化，乙酰基的存在使木聚糖酶水解作用受到阻碍。半纤维素降解涉及到多种酶的协同作用，例如，β_内切木聚糖酶、β -木糖苷酶、乙酰酯酶等。乙酰酯酶(acetylesterase,EC 3. I. 1.6)在半纤维素降解过程，水解木糖残基的乙酰酯键，将半纤维素的部分侧链水解去除，减小木聚糖主链降解时酶作用的空间位阻效应。在木质纤维素糖化过程中，乙酰酯酶与其他半纤维素酶具有协同作用，优化乙酰酯酶和木聚糖酶的协同作用，可以提高糖 广泛的应用前景。根据文献报道，产乙酰酯酶的微生物主要有Penicillium notatum[1]、
[2
Neocallimastix frontalis 、 Trichoderma reesei, Aspergillus awamori、A.niger、A. oryzae>Schizophyllum commune、Fibrobacter succinogenes [3]，大多数为真菌，只有少数为细菌。目前关于半纤维素酶系的研究集中于降解半纤维素主链的木聚糖酶和β_1，4木糖苷酶，而对降解侧链的酶例如乙酰酯酶研究较少。目前生产乙酰酯酶的方法主要是采用液态发酵的方式，但是由于选用菌种不同，所产乙酰酯酶的活力均不同，乙酰酯酶活力低是普遍问题。曹阳春等人报道瘤胃厌氧真菌Neocallimastix frontalis所产乙酰酯酶活力最高为O. 165U/mL[2]。Yue et al.报道瘤胃厌氧真菌Neocallimastix sp.YQ2所产乙酉先酯酶最高酶活力达到O. 018U/mL[4]。以玉米芯粉为液态发酵碳源,Candida guiIIiermondii所产乙酰酯酶活力最高达到O. 28U/mL左右[3]。以桦木木聚糖或者玉米苞叶粉为碳源液态发酵，Streptomyces sp. PC22所产乙酰酯酶活力最高达到O. 3U/mL[5]。液态发酵添加玉米芯粉,Bacillus pumilus所产乙酰酯酶活力最高达到O. llU/mL左右[6]。因此,开发一种适合工业性批量生产具有较高酶活力的乙酰酯酶的方法，具有显著的实际应用价值。参考文献[l]Atta S，Ali S，Akhtar MN,et al. Determination of some significant batchculture conditions affecting acetyl-xylan esterase production by Penicilliumnotatum NRRL-1249. BMC Biotechnology,2011,11 :52.[2]曹阳春，杨红建，沈博通.高产纤维降解酶牦牛瘤胃厌氧真菌分离株的筛选与鉴定.中国农业大学学报，2010，15 (3) :70-74.[3]Basaran P，Hang YD. Purification and characterization of acetylesterase from Candida guilliermondii. Letters in Applied Microbiology，2000，30 :167-171.
[4]Yue Q,Yang HJ, Cao YC,et al. Feruloyl and acetyl esterase productionof an anaerobic rumen fungus Neocallimastix sp. YQ2 effected by glucose andsoluble nitrogen supplementations and its potential in the hydrolysis offibrous feedstuff's. Animal Feed Science and Technology, 2009,153 :263-277.[5]Chungool ff,Thongkam ff,Raweesri P,et al. Production,purification,andcharacterization of acetyl esterase from Streptomyces sp. PC22 and its actionin cooperation with xylanolytic enzymes on xylan degradation. World Journal ofMicrobiology and Biotechnology,2008, 24 :549-556. [6]Degrassi G, Okeke B, Bruschi C, et al. Purification andcharacterization of an Acetyl Xylan Esterase from Bacillus pumilus. Applied andEnvironmental Microbiology,1998,64(2) :789-792.
发明内容
本发明目的旨在提供一株新菌株及用它液态发酵制备乙酰酯酶的方法，以克服目前各种方法得到的乙酰酯酶酶活力低的问题。本发明人通过大量试验研究，按以下方式培养获得一株新菌株I.牛瘤胃液的采集及处理瘤胃液取自吉林省皓月集团新鲜屠宰的肉牛，收集新鲜瘤胃液置于预先灭菌的保温瓶，四层纱布过滤，装入内充CO2的保温瓶中，迅速带回实验室，滤液作为筛选菌种来源。2.细菌富集培养取ImL上述瘤胃液接种于9mL完全培养基，制成KT1稀释液，厌氧瓶内充入氮气和CO2，厌氧培养箱内39°C恒温培养3d。所述的完全培养基构成如下缓冲液A 165mL，缓冲液B 165mL，无细胞瘤胃液170mL, NaHC035. Og,蛋白胨I. Og,酵母浸出膏I. 5g,葡萄糖I. Og, L-半胱氨酸盐酸盐
I.5g(通气30min后加入),O. lg/L刃天青溶液I. OmL,蒸懼水定容至IOOOmL,调节pH7. O,I X IO5Pa 灭菌 30min。所述的缓冲液A :KH2P043g、(NH4)2S043g、NaCl 6g、CaCl2 · 2H20 O. 4g、MgSO4 · 7H200. 6g，蒸馏水定容至 lOOOmL。所述的缓冲液B =K2HPO4 · 3H20 4g，蒸馏水定容至lOOOmL。所述的无细胞瘤胃液的制备将新鲜瘤胃液8000g离心IOmin所得到的上清液。3.菌株的筛选培养取富集后的培养液用无菌水分别稀释至10_2、10_4和10_6倍，涂布于筛选培养基平板，充入氮气和CO2,密封,置于厌氧培养箱内39°C恒温培养7d。待长出菌落后，选取稀释倍数最高的平板，挑取疑似单菌落于筛选培养基上反复划线培养，得到单菌落，选取形态饱满的菌株作为本发明采用的菌种。在筛选过程中，得到3株产乙酰酯酶的菌株，分别是RBI、RB3和RB6，其中菌株RB3的乙酰酯酶活力最高，作为本发明采用的菌株。所述的筛选培养基构成如下缓冲液A 165mL，缓冲液B 165mL，无细胞瘤胃液170mL, NaHC035. Og,碱木质素粉I. Og,琼脂20g,0. lg/L刃天青溶液I. OmL,蒸懼水定容至IOOOmL,调节pH7. O。另外添加放线菌酮(0. 05mg/mL)和制霉菌素(200U/mL)。I X IO5Pa灭菌 30min。
所述的缓冲液A :KH2P043g、(NH4)2S043g、NaCl 6g、CaCl2 · 2H20 O. 4g、MgSO4 · 7H200. 6g，蒸馏水定容至 lOOOmL。所述的缓冲液B =K2HPO4 · 3H20 4g，蒸馏水定容至lOOOmL。所述的无细胞瘤胃液的制备将新鲜瘤胃液8000g离心IOmin所得到的上清液。4.菌株的驯化培养将筛选得到的单菌落，接种于装有70mL驯化培养基的厌氧发酵瓶内，瓶内充入氮气和CO2，密封，39°C厌氧培养箱培养，培养3d转接至新鲜培养基内，转接一次为一代，至第十二代，获得本发明细菌菌株。试验证明，该菌株具有在厌氧条件下发酵制备酶活力较高的乙酰酯酶的特征。
所述的驯化培养基构成如下缓冲液A 165mL，缓冲液B 165mL，无细胞瘤胃液170mL,碱木质素粉I. 0g, L-半胱氨酸盐酸盐I. 5g，0. lg/L刃天青溶液I. OmL,蒸馏水定容至 IOOOmL,调节 ρΗ7· O。I X IO5Pa 灭菌 30min。本发明所获得的上述细菌菌株RB3，经生工生物工程(上海)有限公司进行菌种鉴定，定名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)RB3。该菌株已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)保藏，编号为CGMCC No. 5252，保藏日期2011年9月17日。本发明所获得的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)RB3CGMCC No. 5252菌株具有以下微生物学特性革兰氏染色结果表明，该菌株为革兰氏阴性，杆状细菌。柠檬酸盐利用试验结果表明，该菌株不能利用柠檬酸盐。甲基红试验结果为阳性。在伊红美蓝培养基上的特征为紫色、光滑、湿润的圆形菌落。以上试验结果均为大肠埃希氏菌的典型特征。本发明液态发酵制备乙酰酯酶的方法，是将上述的大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)RB3CGMCC No. 5252菌株接种在以玉米秸杆粉为碳源、pH值为8. O的液态培养基中，在40°C、厌氧条件下发酵4d，发酵产物离心，上清液即为乙酰酯酶粗酶液；所述的液态培养基构成如下玉米秸杆粉10g，无细胞瘤胃液170mL，缓冲液A165mL,缓冲液B 165mL,蛋白胨I. Og,酵母浸出膏I. 0g, L-半胱氨酸盐酸盐I. 5g,蒸懼水定容至 IOOOmLo I X IO5Pa 灭菌 30min。所述的缓冲液A :KH2P043g、(NH4)2S043g、NaCl 6g、CaCl2 · 2H20 0. 4g、MgSO4 · 7H200. 6g，蒸馏水定容至 1000mL。所述的缓冲液B =K2HPO4 · 3H20 4g，蒸馏水定容至1000mL。所述的无细胞瘤胃液的制备将新鲜瘤胃液8000g离心IOmin所得到的上清液。通过上述本发明方法所获的乙酰酯酶酶活力最高达到0. 59U/mL。高于目前文献报道的菌株所产乙酰酯酶活力，克服了目前方法所产乙酰酯酶活力低的缺点。另外，本发明采用玉米秸杆粉作为碳源，利于实现木质纤维素生物质资源的有效利用。本发明方法具有以下优点I.发酵采用的菌株为课题组筛选菌株，产乙酰酯酶活力高，最高酶活力达到
0.59U/mL,高于目前文献报道菌种所产乙酰酯酶活力。2.发酵采用玉米秸杆粉作为碳源，能够诱导菌株产乙酰酯酶，提高乙酰酯酶活力，利于实现秸杆类木质纤维素资源的有效利用。3.所生产的乙酰酯酶在木质纤维素资源的生物转化与降解、反刍动物粗饲料加工、造纸制浆等领域具有广泛的应用前景。
图I是本发明方法制备的乙酰酯酶活力动态曲线图；图2是本发明方法中液态培养基pH值对乙酰酯酶活力影响曲线图；图3是本发明方法中温度对乙酰酯酶活力影响曲线图。
具体实施例方式通过借助以下实施例进一步详细说明本发明制备乙酰酯酶的方法。但并不是对本发明的唯一限定。实施例I 采用本发明提供的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)RB3 CGMCC No. 5252菌株液态发酵制备乙酰酯酶。将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)RB3菌株接种至完全培养基,40°C厌氧培养箱中活化培养3d，吸取ImL菌悬液，转接入装有IOOmL发酵产酶液态培养基的厌氧瓶内，厌氧培养箱中40°C恒温发酵4d，将发酵液1000g、4°C低温离心lOmin，上清液即为粗酶液。所述发酵产酶液态培养基构成如下玉米秸杆粉10g，无细胞瘤胃液170mL，缓冲液A165mL，缓冲液B 165mL，蛋白胨I. 0g，酵母浸出膏I. 0g，调节pH为8. 0，L-半胱氨酸盐酸盐I. 5g (通气30min后加入),蒸懼水定容至IOOOmL, I X IO5Pa灭菌30min。所述缓冲液A :KH2P043g、(NH4)2S043g、NaCl 6g、CaCl2 · 2H20 0. 4g、MgSO4 · 7H200. 6g，蒸馏水定容至 IOOOmL所述缓冲液B =K2HPO4 · 3H20 4g，蒸馏水定容至1000mL。所述无细胞瘤胃液的制备将新鲜瘤胃液8000g离心IOmin所得到的上清液。发酵结束后测定乙酰酯酶活力，结果表明乙酰酯酶酶活力在0. 30-0. 59U/mL之间，该菌株所产乙酰酯酶的最适pH为8. 0，最适温度40°C,酶活力最高达到0. 59U/mL。图I是本发明方法制备的乙酰酯酶活力动态曲线图，采用液态发酵方式，菌株乙酰酯酶活力在发酵初期呈现上升趋势，发酵至第4d时酶活力达到最高，为0. 5U/mL左右，然后开始下降。因此采用本发明方法生产乙酰酯酶，发酵时间为4d较适宜。图2是本发明方法中液态培养基pH值对乙酰酯酶活力影响曲线图，从图中可以看出，该菌株产乙酰酯酶的最适PH为8，此时乙酰酯酶活力达到0. 59U/mL，pH值高于8时，乙酰酯酶活力迅速下降。图3是本发明方法中温度对乙酰酯酶活力影响曲线图，从图中可以看出，该菌株产乙酰酯酶的最适温度为40°C，此时乙酰酯酶活力达到0. 56U/mL，温度高于40°C，乙酰酯酶活力迅速下降，因此采用本发明方法生产乙酰酯酶，发酵温度应该控制在40°C。乙酰酯酶酶活力的测定方法为粗酶液稀释6倍，底物为2mmol/L对-硝基苯乙酯，50mmol/L磷酸钠缓冲液。向50 μ L稀释后粗酶液中加入100 μ L磷酸钠缓冲液和50 μ L底物，40°C反应30min，在415nm波长处测定吸光度。根据对-硝基苯标准曲线计算乙酰酯酶活力。酶活力单位定义1个酶活力单位(U)定义为在以上酶促反应条件下，ImL酶液在Imin内从底物生成I μ mo I对-硝基苯所需要的酶量。
权利要求
1.一种大肠埃希氏菌RB3CGMCC No. 5252菌株，它具有在厌氧条件下发酵制备酶活力较高的乙酰酯酶的特征。
2.一种液态发酵制备乙酰酯酶的方法，其特征在于将权利要求I所述的大肠埃希氏菌RB3 CGMCC No. 5252菌株，接种在以玉米秸杆粉为碳源、pH值为8. O的液态培养基中，在.40°C、厌氧条件下发酵4d，发酵产物离心，上清液即为乙酰酯酶粗酶液； 所述的液态培养基构成如下玉米秸杆粉10g，无细胞瘤胃液170mL，缓冲液A 165mL,缓冲液B 165mL,蛋白胨I. Og,酵母浸出膏I. Og, L-半胱氨酸盐酸盐I. 5g,蒸懼水定容至IOOOmL ； I X IO5Pa 灭菌 30min ； 所述的缓冲液 A =KH2PO4 3g、(NH4)2SO4 3g、NaCl 6g、CaCl2 · 2H20 0. 4g、MgSO4 · 7H200. 6g，蒸馏水定容至 IOOOmL ； 所述的缓冲液B =K2HPO4 · 3H20 4g，蒸馏水定容至IOOOmL ； 所述的无细胞瘤胃液的制备将新鲜瘤胃液8000g离心IOmin所得到的上清液。
全文摘要
本发明涉及一种大肠埃希氏菌RB3菌株及用它液态发酵制备乙酰酯酶的方法。该方法是将本发明所提供的一株大肠埃希氏菌RB3 CGMCC No.5252接种在以玉米秸秆粉为碳源、pH值为8.0的液态培养基中，在40℃、厌氧条件下发酵4d，发酵产物离心，上清液即为乙酰酯酶粗酶液。本发明采用玉米秸秆为发酵培养基碳源，资源丰富。与目前发表文献比较，采用该菌株所生产的乙酰酯酶的酶活力较高，最高达到0.59U/mL。
文档编号C12N1/20GK102719370SQ20111041323
公开日2012年10月10日 申请日期2011年12月10日 优先权日2011年12月10日
发明者佟金, 周皓芹, 梁彦龙, 赵寿经, 邢岩, 陈玉香 申请人:吉林大学