纯化的乳糖酶的制作方法

专利名称：纯化的乳糖酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及纯化的乳糖酶和它的生产。
背景技术：
乳糖酶或β半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)是一种酶，它能够把乳糖(双糖)转变成单糖葡萄糖和半乳糖。乳糖存在于乳制品中，特别存在于奶、脱脂奶、奶油及其他奶制品中。乳糖的分解靠天然存在的乳糖酶发生在人体(和其它哺乳动物)的肠壁中。
很多人(和其它哺乳动物)在他们的消化系统中缺少或部分地缺少乳糖酶而患有乳糖不耐受。在乳糖是食物或饲料的一部分的情况下，对乳糖的减弱消化可以导致肠道疾病。
现在将乳糖酶加入奶品中以分解其中的乳糖。乳糖酶可以在巴氏消毒或灭菌之前，或之后加入奶品中。通常在巴氏消毒或灭菌处理过程中乳糖酶将会被灭活。当在灭菌前将乳糖酶加入时，大量的乳糖酶可能是必需的，以减少加入乳糖酶和巴氏消毒/灭菌之间的存储时间。尽管乳糖酶是一种活性酶，应注意奶品一般在0℃-8℃的温度下进行加工和贮存。
另一种可能是在奶品巴氏消毒或灭菌之后和包装之前加入这种酶。在这种情况下，由于在奶品被消费前至少要经过10至24小时，可以加入较少量的乳糖酶。这种酶能够消化乳糖，该过程可以存在于工厂的运输和存储期间、商店和消费者的冰箱中。
有几种方法可使乳糖酶灭菌，例如用化学和/或热处理的方法。但是，由于乳糖酶在食品或饲料中应用，过滤除菌是优选的选择。
在期刊Voedingsmiddelentechnologie 13(1980)，23中，进一步阐明了一种方法，在英国专利说明书1477087中亦有叙述。乳糖酶，通常在乳制品加工工业中作为水溶液来应用，其中可以加入一种或多种稳定剂，例如甘油，并且在使用前被过滤。过滤后的酶溶液通过无菌过滤器泵入，然后经过计量设备注入预先灭菌的奶或巴氏消毒的奶的生产线中，之后与奶品混合，接着在无菌条件下被包装在统一的包装中。
然而，在实践中，由于被降解的蛋白质、多糖和寡糖遗留在该酶溶液中(尽管已经过滤)，无菌过滤器经常阻塞。根据EP145092，对于在使用前贮存时间较长的酶，上述降解一般增加，并且，在该酶的生产和其在乳制品加工工业中的使用之间相当长的时间周期内上述降解可以被促进。无菌过滤器的重复清洁处理或更换不是选择，因为停止整个过程以后再次开始之前需要灭菌。
EP145092叙述了一种自被生产出起14天内乳糖酶过滤除菌的方法。EP145092叙述应当在通过发酵生产的乳糖酶的回收和提纯之后，但在足以阻塞无菌过滤器的降解产物形成之前，进行其无菌过滤。但是，用过滤灭菌新鲜生产的乳糖酶溶液的方法，不能满足对乳糖酶溶液能够在线过滤并且能够将其加入到灭菌奶/巴氏消毒奶中的需要。在EP145092中述及的乳糖酶来自在乳制品工业中得到广泛应用的克鲁维氏酵母菌属(Kluyveromyces)酵母。多糖很可能是在回收工序期间形成的宿主细胞壁的部分。
发明概述本发明提供了一种乳糖酶溶液，它含有小于10g/kg多糖和寡糖。
本发明还提供了一种乳糖酶溶液的生产方法，由此可以将存在于未经处理的溶液中的多糖和寡糖从乳糖酶溶液中分离出来。
本发明还提供了一种含乳糖酶的奶的生产方法，由此可以将乳糖酶在加入奶品之前灭菌。
本发明还提供了一种灭菌乳糖酶溶液，并且还提供了包含灭菌乳糖酶溶液的乳制品。
发明详述本发明涉及纯化的乳糖酶，特别是涉及生产不含多糖和寡糖的乳糖酶的新方法。多糖和寡糖的去除使得乳糖酶溶液的过滤灭菌更容易，因为过滤器不会被多糖和寡糖堵塞。从而，能够将纯化的乳糖酶在乳制品生产过程中过滤杀菌，由此，不存在上述那种反复清除过滤器堵塞的需要。
本发明提供了一种乳糖酶溶液，它能够被贮藏，并且贮藏之后依然不含会堵塞的化合物，如多糖和/或寡糖。优选的是，该溶液从发酵工序中回收和提纯之后，能够贮藏至少15天，优选的超过30天，更优选的超过120天。
不含多糖和寡糖的意思是存在于乳糖酶溶液中的多糖和寡糖小于10g/kg。存在于乳糖酶溶液中的多糖和寡糖，优选的小于5g/kg，更优选的小于2g/kg，最优选的小于1g/kg。
本发明的乳糖酶溶液非常适合过滤除菌，因为低浓度的如多糖和寡糖的化合物，使乳糖酶溶液能以较小的堵塞过滤器的可能，进行过滤除菌。过滤器能够长时间的使用，与不是基本上不含多糖的乳糖酶溶液的使用情况相比，长至少4倍。
乳糖酶溶液最好是乳糖酶水溶液。乳糖酶溶液一般会含有10-100000NLU/g，优选地为100-10000NLU/g。
乳糖酶溶液可以含有一种或多种溶剂或其它添加剂，以使该酶的活性达到期望的水平，并且可以进一步稳定该酶。合适的溶剂例如是山梨糖醇和甘油。将这类溶剂加入乳糖酶溶液的浓度可以是10-70w/w％，或更优选地是30-70％w/w。合适的添加剂(稳定该酶之用)是例如水解乳糖、葡萄糖、甘露醇和盐缓冲剂。根据本发明一个实施方案，大体上不含如多糖的会堵塞的化合物的乳糖酶溶液，能够通过层析的方法提纯未处理的乳糖酶溶液来获得，由此可以将全部会造成过滤器堵塞的化合物从乳糖酶溶液中分离。
即使在层析工序之前未处理的乳糖酶溶液已储存至少15天，甚至多于30天的情况下，经过纯化的乳糖酶溶液仍能够很容易地得到过滤灭菌而不堵塞过滤器。
意想不到的是，层析的应用使去除全部可以堵塞无菌过滤器的化合物(多糖、寡糖、蛋白质、肽类等等)成为可能。出乎意料的发现是，仅仅需要一个层析步骤来去除造成无菌过滤器堵塞的全部多糖和全部其他未知非蛋白化合物。有一点必须考虑到，从发酵培养液中回收和提纯的乳糖酶溶液，其会至少含有多糖，而多糖至少部分转化为降解产物。在未处理的乳糖酶溶液中一般多糖的浓度为10-100g/kg。
商业乳糖酶制剂可以含有40-60％w/w的甘油。所以乳糖酶制剂的粘度应该与存在的甘油的含量相关。但是我们已经发现，从乳糖酶制品中去除多糖能够显著地降低乳糖酶制品的粘度。这种粘度的降低，使得与根据现有的方法未纯化处理的乳糖酶溶液相比较，乳糖酶制品能够在过滤器处以较小的压力差通过过滤器或以相似的压力差使更多的乳糖酶溶液通过过滤器。本发明提供的乳糖酶溶液含有10-70w/w％的甘油，优选为30-70w/w％，且更优选为40-70w/w％，粘度小于100mPa，优选的小于80mPa，更优选的甚至小于60mPa。
从乳糖酶溶液中分离会堵塞的化合物，可以通过使乳糖酶与合适的层析树脂结合而实现。能够应用于从乳糖酶溶液中分离会堵塞的化合物的合适的树脂是阴离子和阳离子交换树脂。当pH值大于它的等电点的乳糖酶溶液应用于在相同pH值平衡的阴离子交换剂时，可以应用阴离子交换剂，如Q-琼脂糖(Q-sepharose)。乳糖酶，而不是会堵塞的化合物，与树脂结合。用提高离子强度和/或改变阴离子交换树脂的pH值，能够把结合的不含会堵塞的化合物的乳糖酶从树脂中洗脱出来(解吸)。在解吸或洗脱时，离子强度和/或pH值的变化能够逐步地或在连续的梯度下发生。
用阳离子交换剂，如SP-琼脂糖(SP-sepharose)，能够实现同样的分离，其中乳糖酶制品是在树脂的等电点之下与之接触。我们已经发现，HAP(羟基磷灰石)层析不能使多糖和寡糖从乳糖酶中分离。一种可能的解释是，多糖和寡糖也可以结合到羟基磷灰石基体上。
优选的树脂是疏水相互作用介质(HIC)。在HIC介质上，基于疏水性的差别能够获得分离。可以利用不同的HIC树脂，它们含有不同配体，例如乙基、丙基、丁基、苯基和辛基。在容许乳糖酶结合到树脂上的条件下，使其与乳糖酶水溶液接触，将会堵塞的化合物与乳糖酶分离是可能的。
一种典型的促进结合或吸附到HIC树脂的方案是，让在非变性pH值和相对较高的离子强度之下的乳糖酶水溶液与树脂接触。高离子强度可以通过向乳糖酶溶液中加盐来获得。合适的盐是例如硫酸铵、氯化钠和硫酸钠。
在结合或吸附步骤之后，降低离子强度能够洗脱或解吸乳糖酶。在洗脱或解吸时，离子强度和/或pH值的变化能够逐步地或在连续的梯度下发生。其他合适的树脂是例如凝胶过滤介质和疏水电荷诱导介质(HIC和离子交换层析的组合)。
本发明提供的乳糖酶是用酵母，优选用克鲁维氏酵母菌株，更优选用乳克鲁维氏酵母(K.lactis)或脆壁克鲁维氏酵母(K.fragilis)而生产的。上述乳糖酶是根据本发明进行提纯，所得到的乳糖酶溶液易于灭菌。引起无菌过滤器堵塞的化合物的全部去除是非常惊人的，因为在发酵工序之后，经过回收和提纯的乳糖酶会含有多糖，而多糖至少部分转化为降解产物。因此，相信乳糖酶溶液中亦存在的蛋白酶和其它污染蛋白质在层析工序去除。优选用于乳糖酶溶液灭菌的无菌过滤器一般存在于奶品在线生产过程中。就奶品生产工艺而言，过滤灭菌处理最适于在线进行，其中，一个或多个薄膜滤器被采用。合适的无菌过滤器为例如孔径0.22μm的薄膜滤器。
根据本发明所述的乳糖酶溶液有利于在巴氏消毒奶的制备中应用。
实施例1本实施例叙述乳糖酶的一般层析提纯方法，其采用苯基琼脂糖LS作为层析树脂。
将含有5000NLU/g的商品Maxilact5000LX(从荷兰DSM可买到)用软化水稀释5倍，加入硫酸铵到最终浓度为1M后，pH值调到7.5。
将样品20ml在线性流速150cm/h下加至20ml HiPrep苯基16/10反应柱，该柱直径16mm长10cm。用100mM Tris(pH7.5)的1M硫酸铵平衡该柱。加样之后，用平衡缓冲剂以150cm/h流速洗涤柱，直至达到基线为止。乳糖酶的洗脱在150cm/h(100mM Tris pH7.5)的分级梯度下完成。乳糖酶洗脱之后，将乳糖酶溶液脱盐并且浓缩至大约10.000NLU/g的最终活性。浓缩之后，用甘油以50％w/w的最终浓度配制乳糖酶溶液，配制后的乳糖酶最终活性大约为5.000NLU/g。
乳糖酶活性是通过测定底物邻硝基苯-β-半乳吡喃糖苷(ONPG)水解为邻硝基苯基和半乳糖来测定的。此反应由加入碳酸钠终止。所生成的邻硝基苯基的吸光度，在碱性介质中呈黄色，被用于测试酶的活性(表示为NLU/g)。该测试方法发表于FCC，fourth edition，July1，1996，page 801 to 802/乳糖酶(中性)(β半乳糖苷酶)的活性(Lactase(neutral)(β-galactosidase)activity)。
表1列出了测试结果表1
多糖和寡糖的含量，用测定游离糖的量和测定多糖转化后存在的糖量的方法来测定。
多糖含量是用高效液相色谱(HPLC)测定的。检测用RI(折光指数)检测器来进行。所用色谱柱是BioRad Aminex HPX 87N，长度30cm，内径7.8mm，在85℃下恒温。流动相是一种把0.71g硫酸钠加入到1升水中的溶液，以每分钟0.68ml的流速流动。
进行了两种不同样品的预处理，二者均用酸转化和不用酸转化。未经酸转化的样品预处理进行如下取5g放入50ml容量瓶中，在流动相中溶解，注射5μl到色谱柱。
经酸转化的样品预处理进行如下取2g样品放入离心管，加入水3.00ml和2.58mol/l的盐酸2.50ml，100℃下加热75分钟，加入2.58mol/l的氢氧化钠2.50ml。把所得溶液5μl注射到色谱柱。
葡萄糖的含量，是以50ml流动相中含400mg葡萄糖的标准溶液来计算。三糖、双糖和果糖的浓度用以葡萄糖为标准的反应系数来计算。
实施例2本实施例叙述乳糖酶溶液的过滤灭菌。
把一个注射器用1ml Maxilact LX 5000装满，并在注射器顶部安置一个无菌过滤器，其为Millipore的Millex GV 0.22μm，表面积4.91cm2。施加手压之后，该产品不能通过该过滤器过滤，增加压力导致过滤器损坏。
把另一个注射器用1ml含有50％w/w甘油(最终浓度)的按照实施例1所述而制备的纯化乳糖酶装满，并在注射器顶部安置一个无菌过滤器，其为Millipore的Millex GV 0.22μm，表面积4.91cm2。施加手压之后，令人吃惊的是至少1ml乳糖酶溶液容易地通过了该过滤器而进行了过滤灭菌。
因此，层析的应用使全部可堵塞无菌过滤器的化合物被去除掉，从而，过滤灭菌不再成为问题。
实施例3本实施例叙述配制的乳糖酶溶液的粘度测定。
可购买到的商品Maxilact LX 5000和用50％w/w甘油(最终浓度)按照实施例1所述而配制的纯化乳糖酶的粘度被测定。可购买到的商品Maxilact也含有50％w/w甘油。
用Physica UDS 200在25℃用MK 21圆锥探头测定粘度。
表2显示，用50％w/w甘油(最终浓度)配制的5.000NLU/g纯化乳糖酶，由于全部会堵塞的化合物的去除，其粘度降低。
表2粘度测定结果
权利要求
1.一种乳糖酶溶液，它含有小于10g/kg多糖和寡糖。
2.根据权利要求1所述的乳糖酶溶液，其在贮藏至少15天后，优选为30天后，含有小于10g/kg多糖和寡糖。
3.根据权利要求1或2所述的乳糖酶溶液，其是一种水溶液。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的乳糖酶溶液，进一步含有稳定溶剂。
5.根据权利要求4所述的乳糖酶溶液，其中稳定溶剂是山梨糖醇或甘油。
6.根据前面的权利要求中任意一项所述的乳糖酶溶液，进一步含有至少一种稳定添加剂。
7.根据权利要求6所述的乳糖酶溶液，其中的添加剂选自水解乳糖、葡萄糖、甘露醇和盐缓冲剂。
8.根据前面的权利要求中任意一项所述的乳糖酶溶液，其中乳糖含量为10-100,000NLU/g。
9.乳糖酶溶液，含有10-70w/w％甘油并且粘度小于100mPa，优选的小于80mPa。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的乳糖酶溶液，其中乳糖酶是由克鲁维氏酵母菌株生产的。
11.根据权利要求1-10任意一项所述的乳糖酶溶液的生产方法，其中把在未经处理的乳糖酶溶液中存在的多糖和寡糖从乳糖酶溶液中分离出来。
12.根据权利要求11所述的方法，其中采用层析方法从未经处理的乳糖酶溶液中除去多糖和寡糖。
13.一种灭菌乳糖酶溶液，其中权利要求1-10任意一项所述的乳糖酶溶液在无菌过滤器中灭菌。
14.一种乳制品，其中包含根据权利要求13所述的灭菌乳糖酶溶液。
15.一种含乳糖酶的奶的生产方法，由此根据权利要求1-10任意一项所述的乳糖酶溶液在加入奶品之前灭菌。
16.根据权利要求15所述的方法，其中灭菌在至少一个过滤器上进行，该过滤器安置在奶品生产工艺线中。
17.根据权利要求15或16所述的方法，由此奶品是巴氏消毒奶或灭菌奶。
18.一种无菌乳糖酶的生产方法，由此根据权利要求1-10任意一项所述的乳糖酶溶液优选用无菌过滤器灭菌。
19.层析方法的应用，以把多糖和寡糖从乳糖酶溶液中分离出来。
全文摘要
本发明涉及一种乳糖酶溶液，它含有少于10g/kg多糖和寡糖，还涉及一种从未经处理的乳糖酶溶液生产上述乳糖酶溶液的方法和无菌乳糖酶溶液，此外还涉及一种含有无菌乳糖酶的奶品生产方法，由此，上述乳糖在奶品生产过程中过滤灭菌。
文档编号A23C9/12GK1500143SQ02807286
公开日2004年5月26日 申请日期2002年4月3日 优先权日2001年4月4日
发明者R·F·W·C·范比克霍文, R F W C 范比克霍文, P·A·范帕里顿, 范帕里顿 申请人:Dsmip资产有限公司