专利名称：一种用于临床细菌检测的生物芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物芯片，特别是涉及一种用于临床细菌检测的生物芯片。
背景技术：
尽管病毒性感染如艾滋病、肝炎和出血热等有愈演愈烈之势，细菌感染仍然是人类健康的一大威胁。例如结核病造成的死亡人数仍然位居世界第一位，并且有卷土重来的迹象；B族链球菌感染对于两个月以内的新生儿往往是致命的；食物来源的沙门氏菌、李斯特氏菌和大肠杆菌等是造成腹泻的重要因素；大型全封闭建筑的空调通风系统往往孕育着嗜肺军团菌，一种军团病的病原菌；引起肺炎的几种病原如肺炎克雷伯氏菌、肺炎双球菌、肺炎衣原体、肺炎枝原体等往往对抵抗力低下、年老或年幼人群构成极大威胁；铜绿假单胞菌感染是烧伤、战伤患者中最常见的感染类型，而且比较难以控制；流感嗜血杆菌是上呼吸道感染中的常见菌，很难分离培养；金黄色葡萄球菌感染十分顽固，而且耐药性十分普遍；脑膜炎球菌对抵抗力尚不十分完善的儿童威胁较大。细菌性感染的诊断和检测对于临床治疗有着重要的指导意义。尽管有各种各样广谱抗生素，但所谓的广谱也是有一定作用范围的，不是对所有临床细菌都有效；而且抗生素滥用问题越来越突出，一味使用新型广谱抗生素可能为以后的抗生素治疗埋下隐患，当再次使用该类抗生素时，其功效便不能再正常发挥。
一旦确立了是哪一种细菌的感染，就可以拿出针对性强的治疗方案，细菌感染很快就会得到有效控制。因此感染性细菌种类的检测具有十分重要的临床指导意义。细菌的检测方法多种多样，定性检测当然是临床检验的首要目标；定量检测对于细菌数目和感染程度会有更深入的了解。有的方法既可以定性又可以定量，如酶联免疫吸附试验(ELISA，enzyme-linkedimmunosorbent assay)、聚合酶链反应(PCR，polymerase chain reaction)和核酸杂交等。每种细菌检测手段都有自己的优缺点，不能依靠单一手段来对细菌进行定性，任何一种检测方法都是临床确证众多方法中的一个因素。经典方法存在两个较明显的缺陷一是检测时间普遍较长，二是属于一对一的检测模式即一次试验只能检测一种细菌。
发明内容
本发明目的在于提供一种寡核苷酸组合探针微阵列生物芯片，可用于多种病原细菌的一次性检测，提高检测的准确性和可靠性，缩短经典检测所需的时间。
本发明目的是通过如下技术方案实现的本发明所涉及生物芯片是以细菌16S核糖体核酸为扩增靶标而设计。16S核糖体核酸广泛存在于细菌这类原核生物中，例如古细菌、真细菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体和放线菌中都存在16S核糖体核酸序列。核糖体核酸序列由保守序列和可变序列交替排列构成，我们所设计的寡核苷酸组合探针就位于可变区内。选择了核糖体核酸可变区变化较大的特异性序列设计探针，针对每种细菌设计4条，分别对应细菌核糖体核酸的4个特征性可变区。应用相应生物信息学软件设计出多种病原细菌的探针，然后将探针与GenBank数据库进行比较，根据返回信息初步确定探针可行性。探针确定后交由商业化公司进行核酸序列合成。合成好的探针使用GSI Flexys高密度点样仪进行点样。
具体步骤如下1 组合探针设计利用GenBank数据库，检索多种细菌的核糖体核酸基因序列，细菌数目可以根据实际应用需要而定，例如50-100种。使用Primer Premiere，DNAStar，Clustal-X等软件进行引物、探针设计和序列比较，常规合成所有涉及到的寡核苷酸序列。每种细菌设计4条探针。
本发明组合探针设计中以16SrRNA为扩增靶标，通用扩增引物为S15’-AGA GTT TGA TC(A/C)TGG CTC AG-3’和S25’-CCG TCA ATT C(A/C)T TT(A/G)AGT TT-3’，扩增片段大小为890-bp-930-bp。
2 点样将合成好的探针用40-60％DMSO溶解，最终浓度为1-3g/l。将生物芯片置于GSI Flexys点样仪中，设置点样程序，布阵点样，如附图点样形式。制成本发明的基因芯片。
本发明基因芯片的使用方法是，将各种临床标本包括血、脑脊液、腹水、痰、漱口液、胸积液等经过处理后提取核酸，采用聚合酶链反应(PCR)的方法将荧光素(Cy5-dCTP)掺入到PCR产物中，PCR产物经过热变性加到生物芯片上进行杂交反应。反应后的芯片使用芯片扫描仪扫描，根据杂交结果判定病原细菌的种类。
本发明生物芯片利用核酸体外扩增技术，结合核酸杂交的特异性，使检测时间能够在6小时内完成；并且可以轻松容纳成百上千个特异探针，一次试验可以检测多个靶标，无需重复，因此所需样品量也只有一份。使用组合探针提高了检测的特异性。细菌核糖体核酸尽管具有一定的种属鉴别意义，但是由于其保守性，某些进化上十分近源的种类其核糖体核酸十分相似。单独采用一条探针区分这些近源细菌十分困难，依靠4条探针的组合来对应一种细菌，大大提高了检测的准确性。这对于克服常规方法杂交所产生的交叉反应和假阳性结果具有十分重要的意义。
本发明实施例所涉及细菌都是在临床上具有重要意义的致病菌。常规检测手段费时费力，且准确程度不高，本发明生物芯片由于一次反应就可以检测出所涉及的细菌，无需重复和尝试，因而在临床检验中具有很大的优越性。另外，在我国存在有引起重要传染病的病原，如在牧区引起人畜共患疾病的炭疽杆菌和布氏杆菌、暴发流行危险呈逐年上升的鼠疫、每年都有发生的肠道流行病、细菌性食物中毒等。对于这些烈性病原体的诊断，国内还没有简便快速的诊断试剂商品。本发明生物芯片同样可以用于海关检疫、卫生防疫、环境监测、食品检测等多项领域，因而具有巨大的市场前景。
恐怖分子利用烈性病原体作为生物恐怖手段制造的生物恐怖事件给国家和社会安全造成极大的威胁，生物安全和生物恐怖防御已成为今天各国政府和广大人民普遍关注的国家与社会安全大事。快速检测出生物恐怖事件中的烈性病原体对采取正确手段消除恐怖事件造成的危害至关重要，本发明生物芯片将有助于提高我们应对突发生物事件的能力，而有效地预防和控制生物恐怖事件可平息人们的心理恐慌、防止造成社会动荡、保证社会安全，其产生的社会作用与影响十分巨大。除生物恐怖事件外，烈性传染病的爆发流行，往往会使很多人感染、甚至夺去很多人的生命，也会造成人们巨大的心理恐慌及社会动荡，快速做出诊断、采取措施控制疾病流行同样会产生强大的社会作用与影响。
本发明优点具体表现为特异准确由于本发明采用了组合探针，由多条探针指向一个细菌，因此大大增加了检测特异性。
快速本发明生物芯片检测包括样品前处理、PCR扩增和芯片杂交，总共耗时6小时左右，常规的细菌分离培养需要3天左右，而且临床细菌分离成功率较低，更有甚者有些细菌分离培养需要半个月至一个月，如结核分枝杆菌。本发明可以缩短诊断时间。
灵敏本发明生物芯片结合了PCR扩增技术，因此具有较高的灵敏度。
一对多检测模式一次试验检测目的标本中的所有细菌，减少样品量，同时减少了由于多次尝试带来的高成本和时间。虽然一次性成本相对稍高，但是如果考虑到是几十种细菌的同时检测，其相对成本仍然是非常低的。下面实验例用于进一步说明本发明。
实验例1细菌纯培养物的杂交按照相关文献培养80种细菌。使用QIAGEN DNeasy Tissue Kit(Cat.No.69504)提取细菌染色体DNA。使用S1和S2引物扩增相应细菌染色体DNA，10mM Tris-HCl(pH 8.4)；50mM KCl；1.5mM MgCl2；gelatin 0.01％；TritonX-100 0.1％；Tween 20 0.01％；40μM of dATP，dTTP and dGTP，30μm ofdCTP(Promega)，10μM of Cy5-dCTP(Amersham Pharmacia Biotech)，0.1μM of each primer，2 U of Taq polymerase(上海生工生物工程有限公司)，和15ng扩增模板。PCR参数为预变性95℃，15min，然后是94℃，10s；63℃，10s；72℃，15s；29个循环。产物使用Amicon Microcon-PCR colums(Millipore，USA)纯化，最终洗脱体积为25μl。取荧光标记并纯化后的扩增产物10μl加入到90μl杂交液中形成杂交工作液，将芯片放入GSI GeneTACHybridization Station杂交仪中进行杂交，在80℃加入探针，预变性10min，杂交温度为45℃，杂交时间1小时。完毕后取出生物芯片，使用GSI GeneTAC1000生物芯片扫描仪扫描、分析和保存结果。利用细菌纯培养物的杂交结果表明本发明生物芯片可以将大部分涉及细菌鉴定至种的位置。
实验例2敏感性试验用LB斜面转接金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，37℃培养12小时。用接种环刮取一环到5ml 0.03mol/L PBS中，然后做10倍系列稀释直至10-9。利用平板涂抹法对两种细菌进行菌落计数。取各个稀释度进行芯片杂交实验，观察细菌系列稀释后芯片杂交灵敏度。取嗜肺军团菌染色体DNA 15ng/ml，1.5ng/ml，150pg/ml，15pg/ml，1.5pg/ml四个稀释度分别进行PCR扩增和Cy5荧光素标记，然后用荧光素标记物与芯片杂交，观察染色体稀释后杂交灵敏度。经过平板计数，计算出菌液原始浓度。金黄色葡萄球菌为2.35×107CFU/ml(colony forming unit)，铜绿假单胞菌为2.0×107CFU/ml。对于两种菌液来说，生物芯片检测灵敏度为235和200 CFU。而模拟血标本灵敏度，150pg/ml染色体经过PCR可以观察到阳性信号，而15pg/ml虽然PCR已经观察不到条带，但生物芯片仍然可以检测到阳性信号，生物芯片比PCR-电泳法灵敏度高10倍。
实验例3特异性试验使用牛分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌和蟾分枝杆菌这几个与结核分枝杆菌相近的菌种进行芯片杂交，观察与结核分枝杆菌交叉情况。试验结果表明，与结核分枝杆菌近缘的牛分枝杆菌和胞内分枝杆菌与结核分枝杆菌4条探针中的3条发生杂交，蟾分枝杆菌和鸟分枝杆菌只与2条探针发生杂交。也就是说，组合探针在这里起到了关键性的鉴别作用，如果不使用组合探针，很难区分这么多种类相近的细菌。
实验例4实际应用本发明生物芯片经过了模拟血标本和双盲法测试，证明其具有相当大的可靠性。将实验例2中系列稀释的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌液20μl加入到180μl马血中，形成系列浓度的模拟血标本。按照QIAamp全血DNA提取试剂盒操作说明提取DNA，并以此为模板进行Cy5荧光素标记，按照上述方法进行芯片杂交，观察模拟血标本杂交灵敏度。模拟血标本灵敏度分别为23500和2000CFU。
取3个未知样品的染色体DNA，标号为1，2和3。进行1，2，3，1+2，1+3，2+3和1+2+3组合，其中组合顺序和方式未知，由另外一人完成样品组合。此8份样品(含水)进行模拟盲测，然后与组合方式对照，判断多样品检测的可行性。混合标本盲测实验结果表明，样品中如果存在一个以上的待测对象也可以同时检测出来。两种细菌混合能同时检测出来，三种菌混合起来一般能同时检测出其中占优势的两种菌。如果实际感染中的几种细菌浓度大致一致，则生物芯片可以同时将它们检测出来。
实验例5某医院送检标本两份，怀疑有铜绿假单胞菌。经过生物芯片杂交之后，发现一株菌与铜绿假单胞菌的4条探针发生杂交，而另一株菌则与伤寒沙门氏菌的4条探针发生杂交。因而分别判定为铜绿假单胞菌和伤寒沙门氏菌。细菌培养后发现前者产生绿色色素，而后者没有，这与铜绿假单胞菌的特征相符合。然后用经典细菌鉴定程序和核酸鉴定方法证明与生物芯片的判定相吻合。
附图1是组合探针式生物芯片排列图，其中实线框内的点为阳性对照点。
具体实施例方式
实施例1、探针设计利用GenBank数据库，检索80种细菌的核糖体核酸基因序列，使用Primer Premiere，DNAStar，Clustal-X等软件进行引物、探针设计和序列比较，所有涉及到合成的寡核苷酸序列均由上海生工生物工程有限公司合成。16S rRNA通用扩增引物为S15’-AGA GTT TGA TC(A/C) TGGCTC AG-3’和S25’-CCG TCA ATT C(A/C)T TT(A/G) AGT TT-3’，扩增片段大小为890-bp-930-bp。80种细菌共计设计320条探针(见附表2)。每种细菌设计4条探针。
点样将合成好的探针用适量50％DMSO溶解，最终浓度为2g/l。生物芯片置于GSI Flexys点样仪中，设置点样程序，布阵点样，点成如附图样形式。其中80种细菌的点样对应关系如表1所示表1组合式寡核苷酸探针与附图对应关系
注A1至A4代表E.coli的1到4号探针，A5至A8代表Citrobacter koseri的1到4号探针，余类推。
附表280种细菌16S rRNA特异性探针
权利要求
1.一种生物芯片，其特征在于该芯片含有寡核苷酸组合探针。
2.如权利要求1所述的一种生物芯片，其特征在于该芯片组合探针设计中以16S rRNA为扩增靶标。
3.如权利要求2所述的一种生物芯片，其特征在于该芯片组合探针设计中通用扩增引物为S15’-AGA GTT TGA TC(A/C)TGG CTC AG-3’和S25’-CCG TCA ATT C(A/C)T TT(A/G)AGT TT-3’，扩增片段大小为890-bp-930-bp。
4.如权利要求3所述的一种生物芯片，其特征在于该芯片组合探针设计是利用GenBank数据库，检索50-100种细菌的核糖体核酸基因序列，使用Primer Premiere，DNAStar，Clustal-X软件进行引物、探针设计和序列比较，常规合成所有涉及到的寡核苷酸序列，每种细菌设计4条探针。
5.如权利要求4所述的一种生物芯片，其特征在于该芯片组合探针设计是利用GenBank数据库，检索50-100种细菌的核糖体核酸基因序列，使用Primer Premiere，DNAStar，Clustal-X等软件进行引物、探针设计和序列比较，常规合成所有涉及到的寡核苷酸序列，每种细菌设计4条探针；将合成的探针用40-60％DMSO溶解，最终浓度为1-3g/l，生物芯片置于GSI Flexys点样仪中，设置点样程序，点成布阵式。
6.如权利要求5所述的一种生物芯片，其特征在于该芯片组合探针设计是利用GenBank数据库，检索80种细菌的核糖体核酸基因序列，使用Primer Premiere，DNAStar，Clustal-X等软件进行引物、探针设计和序列比较，合成所有涉及到的寡核苷酸序列；16S rRNA通用扩增引物为S15’-AGA GTT TGA TC(A/C)TGG CTC AG-3’和S25’-CCG TCA ATT C(A/C)T TT(A/G)AGT TT-3’，扩增片段大小为890-bp-930-bp；80种细菌共计320条探针；点样将合成好的探针用适量50％DMSO溶解，最终浓度为2g/l；将生物芯片置于GSI Flexys点样仪中，设置点样程序，点成布阵式。
7.如权利要求6所述的一种生物芯片，其特征在于该芯片组合探针分别由说明书附表2所述基因序列组成。
8.如权利要求7所述的一种基因芯片，其特征在于该芯片含有附表2所述320种探针当中的任意组合。
9.如权利要求7所述的一种基因芯片，其特征在于该芯片含有附表2所述全部320种探针。
10.如权利要求1-9所述的任一权利要求，其特征在于该基因芯片用于细菌检测。
全文摘要
本发明公开了一种生物芯片，其特征在于该芯片组合探针设计是利用GenBank数据库，检索50－100种细菌的核糖体核酸基因序列，使用Primer Premiere，DNAStar，Clustal－X等软件进行引物、探针设计和序列比较，常规合成所有涉及到的寡核苷酸序列，每种细菌设计4条探针；将合成的探针用40－60％ DMSO溶解，最终浓度为1－3g/l，生物芯片置于GSI Flexys点样仪中，设置点样程序，点成布阵式。本发明优点为特异准确、快速、灵敏并体现了一对多检测模式。
文档编号C12Q1/68GK1519328SQ0310067
公开日2004年8月11日 申请日期2003年1月21日 优先权日2003年1月21日
发明者翟俊辉, 杨瑞馥, 宋亚军, 郭兆彪, 王津 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所, 中国人民解放军军事医学科学院微生物