专利名称：一种抗血液肿瘤的反义vegf基因序列及其重组真核表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸反义技术，具体地说，涉及一种含反向序列的444碱基的VEGF121基因片段重组真核表达载体的制备及体内外的应用。
本发明之目的是要寻找一种有效的基因治疗方法下调白血病细胞内源性VEGF的分泌，从而达到抑制血管新生和降低对化疗药物的耐受性，促进白血病细胞的凋亡，以克服当前白血病临床治疗中存在毒副作用大，耐药性强，缓解率低和复发率高等缺点。具体地说，本发明提供了一种能在mRNA水平即和VEGF基因互补，阻断其蛋白翻译，从而下调白血病细胞内源性VEGF分泌的反义VEGF基因片段，构建重组真核表达载体作为基因治疗组合物。
本发明选用了反义VEGF基因片段的序列(SEQ ID NO.1)。本发明根据已知序列，设计了引物进行PCR扩增，上游引物5’GGG CTC GAG TCA CCG CCTCGG CTT GTA AC 3’(SEQ ID NO.2)；下游引物5’GGG GGA TCC ATG AACTTT CTG CTG TCT TG 3’(SEQ ID NO.3)。扩增后获得一444bp的基因片段。将该基因片段籍Xho I和BamH I位点克隆到pIRES2载体(购自Clontech公司)，获得的重组载体质粒经酶切检测和双脱氧法DNA序列测定确定了方向性和完整性。测序鉴定后，按QIAGEN质粒纯化试剂盒操作说明，纯化重组的pIRES2-反义VEGF载体(
图1)和pIRES2空载体以备转染K562细胞系。进一步按照Lipofactamine 2000试剂的操作说明，脂质体转染上述两个载体到K562细胞，转染的K562细胞甲基纤维素半固体培养，G418筛选两周后挑选阳性克隆，96-孔板培养，逐级扩增。扩增的转染携带反义VEGF的重组质粒和空载体对照质粒的K562细胞通过荧光显微镜或流式细胞仪检测以及对转染的细胞进行RT-PCR检测插入的反义片段，并进一步进行体内及体外的活性检测。
本发明经过上述过程克隆反义VEGF基因片段，构建重组的pIRES2载体，转染K562细胞，G418筛选并扩增阳性克隆，采用RT-PCR，ELISA和Western blot方法证明目的基因片段在K562细胞内表达，并且从mRNA水平和蛋白水平下调了内源性的VEGF的表达，获得了低水平表达VEGF的K562细胞株，并在体外细胞培养水平和体内裸鼠移植瘤水平进行了多参数的研究。实验证明(1)表达反义VEGF的K562细胞的培养上清可显著抑制脐静脉内皮细胞的增殖和转移；(2)表达反义VEGF的K562细胞在无血清培养条件下增殖被抑制，细胞凋亡水平增高；(3)裸鼠移植瘤实验观察到实验组移植瘤的发生率低，生长速度明显缓慢，移植瘤中新生血管的密度明显降低，凋亡细胞数明显增多。结果证实pIRES2介导的反义VEGF基因具有抑制脐静脉内皮细胞体外增殖和转移，以及白血病细胞自身的增殖，促进其凋亡，在体内抑制肿瘤生长和新生血管形成的作用。
以下列举部分实施例用于对本发明的进一步说明，但不限制本发明。实施例1K562阳性克隆细胞表达反义VEGF效果测定和内源性VEGF在mRNA水平及蛋白水平表达的分析分别将K562-反义VEGF、K562-空载体细胞以1.5×106/mL接种于6孔板，在无血清的培养液培养3天，离心沉淀每孔细胞，收集培养上清-20贮存，以备后用。分别提取K562-反义VEGF、K562-空载体细胞的基因组DNA和细胞总RNA，用PCR和RT-PCR方法外源基因的整和和内源性VEGF的mRNA表达情况。结果在K562-反义VEGF细胞中检测到目的条带，而K562-空载体细胞未见特异条带，说明重组载体携带的反义基因片段已成功地整合到K562细胞基因组中。RT-PCR的结果发现K562-反义VEGF细胞的内源性VEGF的mRNA水平相比于K562-空载体明显下降，可能是反义VEGF基因片段在RNA水平特异性地和VEGF基因序列互补，引起RNA的降解。
ELISA和western blot检测K562-反义VEGF细胞和K562-空载体细胞培养上清中VEGF蛋白分泌水平，两者结果一致，均发现K562-反义VEGF细胞的内源性VEGF蛋白分泌水平明显低于K562-空载体细胞，说明K562细胞表达反义VEGF能够有效的阻断VEGF蛋白的翻译过程，下调内源性VEGF蛋白分泌水平(图2)。实施例2K562阳性克隆细胞的培养上清对脐静脉内皮细胞体外增殖、迁移的影响脐静脉内皮细胞以5×103/mL接种于96孔板，以含8％胎牛血清和体积分数为50％的K562-反义VEGF细胞或K562-空载体细胞培养上清的M199培养液培养2天后MTT法计数每孔加入100μL MTT，孵育4小时后，每孔加入10μLDMSO终止反应，570nm波长下测定吸光度值(图3)。500μL K562-反义VEGF细胞或K562-空载体细胞培养上清加入穿孔板的下层，105脐静脉内皮细胞重新悬浮于100μL M199培养液，孵育4小时后，流式计数迁徙到穿孔板下层的脐静脉内皮细胞数。结果表明K562-反义VEGF细胞的培养上清促进脐静脉内皮细胞的体外增殖和迁徙作用明显弱于K562-空载体细胞培养上清(图4)。实施例3K562阳性克隆细胞体外自身的增殖和凋亡K562-反义VEGF细胞或K562-空载体细胞以1×104/mL接种于96孔板，无血清培养基培养，从接种第一天开始每24小时各取4孔直至培养到72小时，MTT法测定细胞的生长曲线。或者K562-反义VEGF细胞或K562-空载体细胞以1×105/mL接种于6孔板，无血清培养基培养，每24小时个取3孔，胎盘蓝染色计数活细胞直至72小时。结果表明表达反义VEGF的K562细胞在体外自身增殖能力低于转染空载体的K562对照细胞(图5A)。
K562-反义VEGF细胞或K562-空载体细胞以1×105/mL接种于6孔板，无血清培养基培养72小时，离心沉淀细胞，标记annexinV，流式检测annexinV+的凋亡细胞。结果表明表达反义VEGF的K562细胞体外无血清培养的凋亡水平高于转染空载体的K562对照细胞(图5B)。实施例4K562阳性克隆细胞在体内的生长购买雌性，6-8周龄的胸腺免疫缺陷小鼠，无病原菌条件下饲养。实验分2组，每组5只。裸鼠以4Gy137Cs的剂量进行全身照射，在裸鼠右侧前肢皮下分别接种1.5×107/200μL的K562-反义VEGF细胞或K562-空载体细胞。每周两次观察裸鼠肿瘤的生长情况，并用游标卡尺测量，按照椭圆体积公式计算肿瘤体积体积＝π/6×长径×短径×短径。2周或3周后处死裸鼠，剥取肿瘤，固定肿瘤组织，做免疫组化染色CD31标记瘤组织的微血管密度和TUN-EL检测瘤组织细胞凋亡水平。结果表明接种K562-反义VEGF细胞移植瘤生长速度明显慢于接种K562-空载体细胞移植瘤(图6)，与对照组相比，瘤组织微血管密度低，凋亡细胞数多。
图1重组pIRES2-反义VEGF载体的构建图2K562-反义VEGF细胞内源性VEGF在RNA和蛋白水平的下调图3K562-反义VEGF细胞培养上清对脐静脉内皮细胞体外增殖的作用图4K562-反义VEGF细胞培养上清对脐静脉内皮细胞体外迁徙的作用图5K562-反义VEGF细胞体外增殖和凋亡图6裸鼠K562-反义VEGF细胞移植瘤平均生长曲线(SEQ ID NO.1)基因序列CTCGAGTCACCGCCTCGGCTTGTCACATTTTTCTTGTCTTGCTCTATCTTTCTTTGGTCTGCATTCACATTTGTTGTGCTGTAGGAAGCTCATCTCTCCTATGTGCTGGCCGTGGTGAGGTTTGATCCGCATAATCTGCATGGTGATGTTGGACTCCTCAGTGGGCACACACTCCAGGCCCTCGTCATTGCAGCAGCCCCCGCATCGCATCAGGGGCACACAGGATGGCTTGAAGATGTACTCGATCTCATCAGGGTACTCCTGGAAGATGTCCACCAGGGTCTCGATTGGATGGCAGTAGCTGCGCTGATAGACATCCATGAACTTCACCACTTCGTGATGATTCTGCCCTCCTCCTTCTGCCATGGGTGCAGCCTGGGACCACTTGGCATGGTGGAGGTAGAGCAGCAAGGCAAGGCTCCAATGCACCCAAGACAGCAGAAAGTTCATGGATCC
权利要求
1.一种抗血液肿瘤的反义VEGF基因序列，通过真核载体介导，具有靶向性抑制血液肿瘤的生长和转移作用，其特征在于所说的基因序列系由444个碱基组成(SEQ ID NO.1)。
2.一种用于表达反义VEGF基因序列的重组真核载体，其特征在于该载体含有权利1所述的DNA分子。
3.按照权利2所述的重组真核载体，其特征在于将所述的DNA分子以合适的酶切位点克隆至真核表达载体如pIRES2，获得重组真核表达载体。
4.一种含反向序列的VEGF基因片段重组真核表达载体在制备基因治疗制剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种抗血液肿瘤的反义VEGF基因序列及其重组真核表达载体，提供了一种真核载体介导的抗白血病VEGF基因治疗方法，具有靶向性抗血管新生，促进白血病细胞凋亡，从而达到抑制白血病和其它血液肿瘤的发展和转移的作用。
文档编号C12N15/63GK1431304SQ0310065
公开日2003年7月23日 申请日期2003年1月20日 优先权日2003年1月20日
发明者韩忠朝, 何睿 申请人:中国医学科学院血液学研究所