专利名称：一种口蹄疫双价多肽疫苗基因合成及高效表达方法
技术领域：
本发明涉及一种编码口蹄疫双价多肽疫苗基因的核苷酸序列及其合成方法和包含上述口蹄疫双价多肽疫苗基因核苷酸序列的载体的构建以及高效表达该段核苷酸编码多肽的方法。
2.背景技术口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot andmouth disease virus，FMDV)感染引起的致偶蹄类动物的一种急性、高度接触性、发热性、毁灭性传染病，以流行广、传播快、发病率高而著称(柳纪省，中国兽医科技.1999，29(3)17-20)。由于猪、牛、羊等主要家畜均可感染此病并形成全球规模流行，被联合国粮农组织和国际兽医局(IEO)列为16种A类传染病之首。口蹄疫的危害性很大，可引起大面积牲畜的死亡，严重影响畜牧业生产和动物及其产品的国际贸易，给农业、畜牧业、国民经济造成巨大的损失(江鹏斐，中国农业科学.1999，32(6)93-100)。因此，预防、控制和消灭口蹄疫的发生显得尤为重要。
预防口蹄疫，注射口蹄疫疫苗是防治口蹄疫的有效方法。由于口蹄疫有不同的血清免疫类型，各类型之间的疫苗不能提供交叉保护，因此，预防口蹄疫，多采用与当地流行的病毒类型相匹配的口蹄疫疫苗。口蹄疫现已发现有7种血清免疫类型，以及65个以上的亚型。7种类型分别是A、O、C、亚洲1型(Asia 1)和南非I、II、III型，其中以A型及O型口蹄疫最为普遍，我国即以O型及A型为主。如何能提供足够数量，并能有效进行免疫的疫苗，对易感寄主进行综合免疫，是控制和根除这种疾病的主要方法。
目前，我国抗口蹄疫病毒疫苗的传统制备方法是采用组织培养法繁殖口蹄疫病毒，即利用鼠肾细胞系(BHK)传代细胞系方法来生产灭活疫苗，还有一种方法是通过各种减毒方法制得弱毒疫苗。这两种疫苗虽然都有较好的免疫能力，但是制备的安全性较差，因为在生产过程中需培养大量病毒，而该种病毒可通过空气传染，生产过程中与病毒接触过的工具或器皿都有散毒的危险。而且传统的灭活疫苗与弱毒疫苗一旦灭活或减毒不完全，在大规模对动物的免疫过程中，可能会导致极少量被免疫动物发病而成为疾病流行的病源中心与媒介(易建中，黄海斌，杨志军，等，复旦学报(自然科学版)，1997，36(5)23-27)。因此，急需改变传统的疫苗制备方法，建立安全有效的疫苗制备新技术体系。研究开发新型安全有效的口蹄疫疫苗，以控制和消灭口蹄疫。
利用基因工程技术进行口蹄疫疫苗的研究受到了广泛的重视，目前所进行的疫苗基因研究包括单价、多价合成多肽疫苗基因、亚单位疫苗基因，即以病毒颗粒中的亚单位-VP1蛋白(具有免疫源性)的基因用作疫苗基因序列；还有报道用非结构蛋白基因等。目前研究较多的是合成肽疫苗基因，合成肽是人工合成的类似于天然抗原的小肽，由这种小肽制成的疫苗安全性好；或以多价的合成肽的DNA序列作为目的基因，通过原核表达系统表达疫苗组份。由于这种方法生产疫苗不是由病毒直接制备而成的，不涉及病毒本身，没有感染性，所以不存在未灭活病毒释放的问题，还可避免一些与特异性免疫无关的成分存在。所以可以确保是安全的(杨永钦，王家驹，云南畜牧兽医，1997，127-29；赵凯，邹士平，张震宇，等。中国免疫学杂志，2002，1889-92)。因此，采用安全的合成肽疫苗进行口蹄疫防治，受到国内外学者广泛重视，合成肽类疫苗不仅安全性好，而且生产与运输都很方便。
随着对口蹄疫病毒的基因结构及其病毒颗粒空间结构更进一步的认识，发现VP1蛋白是FMDV最主要的抗原蛋白，VP1蛋白功能区包含FMDV的主要抗原位点，特别是在位点1，即VP1蛋白的141-160位氨基酸和200-213位氨基酸残基序列所组成FMDV的主要抗原区，能诱导动物产生中和抗体，是决定各种亚型FMDV免疫原性的主要抗原决定簇片断，(杨永钦，王家驹，云南畜牧兽医，1997，127-29；Dus Santos MJ，Vccine 2002，201141-1147)。所以利用VP1蛋白或其抗原决定簇部份成为FMD新型疫苗研究的主要途径。国外有人发现化学合成的VP1的141-160位氨基酸和200-213位氨基酸的肽段能引起一定的免疫反应(Kleid DG，Science，1981，214(1525)1125-1129)。
我国学者对口蹄疫合成肽疫苗也进行了研究，郑兆鑫等(郑兆鑫，贺沛富，严维耀，等，病毒学报，1989，5(1)41-45)将O型FMDV编码VP1蛋白的141-160位氨基酸和200-213位氨基酸串联为20AA-14AA-20AA类型，并与β-半乳糖甘酶基因相连，在大肠杆菌中表达的融合蛋白，经动物实验证明具有很强的免疫原性，成为安全有效的基因工程疫苗。易建中等(易建中，黄海斌，杨志军，等，复旦学报(自然科学版)，1997，36(5)23-27)将A型FMDV编码VP1蛋白的141-160位氨基酸和200-213位氨基酸串联为20AA-14AA-20AA类型，经斑点ELISA证明，大肠杆菌中表达的融合蛋白，具有A型FMDV抗原活性。然而用O型和A型FMDV编码VP1蛋白研制双价多肽疫苗方面，到目前为止尚未见报道。
我国口蹄疫的发生，以O型和A型口蹄疫病毒为主，因此，尽快研制O-A型双价疫苗，用于边界防疫及应急储备，是防治FMD亟待解决的问题(张永光，王永录，等。中国兽医科技.1996，26(5)3-5)。
3.发明内容本发明的一个目的是提供一种编码口蹄疫双价多肽疫苗基因的核苷酸序列及其编码蛋白及该口蹄疫双价多肽疫苗核苷酸序列的合成方法。
在对口蹄疫双价多肽疫苗的设计中首先选取来自中国的O型病毒的O58株系的第140-160氨基酸和200-213氨基酸组成的多肽，即O58的20肽、14肽，将其与A型病毒的A62株系第140-160氨基酸和200-213氨基酸组成的多肽，即A62的20肽、14肽，相互串联起来，即成为O58系(20肽-14肽)-A62系(20肽-14肽)串联序列，简称O-A型序列，即为SEQ ID NO1所示的序列。
还选取来自中国的A型病毒的A62株系为材料，以其第140-160氨基酸和200-213氨基酸组成的多肽，与O58株系第140-160氨基酸和200-213氨基酸组成的多肽，即O58株系的20肽、14肽，相互串联起来，成为A62(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)串联序列，简称A-O型序列，即为SEQ ID NO2所示的序列。
然后再将SEQ ID NO1及SEQ ID NO2所示的基因序列与绿色荧光蛋白基因相连，其表达产物即可用作疫苗。
经过设计，分别先合成如下各个序列的片段，然后再进行连接片段AO58株系病毒VP1蛋白的第141-160氨基酸的编码序列。
5’gtg acc aaa gtg aga ggc gat ctg cag gtg ctg gcg cag aaa gcg gca cgc tctctg ccg片段BO58株系病毒VP1蛋白的第200-213氨基酸的编码序列5’aga cat aaa cag aag att gtg gca cca ggc aaa cgc ctg ctg片段EA62株系病毒VP1蛋白的第141-160氨基酸的编码序列5’aac gcg ggc cgt cgc ggc gat ctg ggc tct ctg gcg gcg cgt gtg gcg cagctg ccg gcg片段FA62株系病毒VP1蛋白的第200-213氨基酸的编码序列cgc cat aaa cag cgt att att gcg ccg gcg aaa cag ctg ctg以O-A、A-O的方式串联起来，如图1所示。分别得到SEQ ID NO1及SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是构建包含该口蹄疫双价多肽疫苗基因的原核表达载体以及高效表达该双价多肽疫苗基因编码多肽的方法。将上述两个口蹄疫双价多肽疫苗基因直接构建到原核表达载体或将上述两个口蹄疫双价多肽疫苗基因与GFP(绿色荧光蛋白)基因串联，构建融合基因，并将该两种融合基因分别构建到原核表达载体中。采用人工合成方法合成这些多肽的基因片段，由于这些基因片段过小，所以还需要将它们与其它蛋白基因串联，从而产生稳定性更好的融合蛋白。目前，广泛采用绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因，如将其与疫苗多肽基因串联，从而构建成融合基因，其表达产物可能发出绿色萤光，从中筛选转化体就十分方便，两种双价多肽疫苗核苷酸序列与GFP基因串联方式详见SEQ ID NO5及SEQID NO6。SEQ ID NO1与GFP融合基因核苷酸序列为SEQ ID NO5。SEQ ID NO2与GFP融合基因核苷酸序列为SEQ ID NO6对上述多肽疫苗蛋白进行的免疫原性测定表明，合成基因具有较好的免疫原活性。牲畜经免疫后，可能预防A型及O型两种口蹄疫，而且还可能用于制备检测A型及O型两种口蹄疫抗原。
4.
图1合成的原始片段串联方式示意2合成的原始片段及具体拼接示意3以O-A连接后的环形DNA链图4以A-O连接后的环形DNA链图5pUCm-F1滞后质粒电泳检测结果。
3为pUCm-F1滞后质粒，其余为pUCm-T质粒图6pUCm-F1双酶切及PCR验证1-NcoI/EcoRI酶切质粒pUCm-F1，2，3-PCR结果，4，DGL2000DNA Maker图7FMDV双价疫苗基因的原核表达载体构建8原核表达载体pET-FM1示意图5.具体实施方式
实施例1.口蹄疫双价多肽疫苗基因的获得与原核表达1.口蹄疫双价多肽疫苗基因的获得随着对口蹄疫病毒的基因结构及其病毒颗粒空间结构更进一步的认识，发现VP1蛋白是FMDV最主要的抗原蛋白，VP1蛋白功能区包含FMDV的主要抗原位点，特别是在位点1，即VP1蛋白的141-160位氨基酸和200-213位氨基酸残基序列所组成FMDV的主要抗原区，能诱导动物产生中和抗体，是决定各种亚型FMDV免疫原性的主要抗原决定簇片断，(杨永钦等，1997；Dus Santos MJ，2002)。所以利用VP1蛋白或其抗原决定簇部份成为FMD新型疫苗研究的主要途径。国外有人发现化学合成的VP1的141-160位氨基酸和200-213位氨基酸的肽段能引起一定的免疫反应(Kleid DG，Yansura DJ，Bachrach HI，Science，1981，214(1525)1125-1129)。选取来自中国的O型病毒的O58(GeneBank号FDI131469)和A型病毒的A62株系(GeneBank号FDI 131666)，口蹄疫O58型病毒的VP1蛋白的第140-160氨基酸和200-213氨基酸组成的多肽，即O58型病毒的VP1蛋白的20肽、14肽相串联起来的多肽，与A62型病毒的VP1蛋白的第140-160氨基酸和200-213氨基酸组成的多肽，即A62型病毒的VP1蛋白的20肽、14肽相串联起来的多肽，以两种方式串联起来，成为O58(20肽-14肽)-A62(20肽-14肽)，简称为O-A的串联序列，及A62(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)，简称为A-O的串联序列，分别得到SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。虽然设计好的多肽片段的核苷酸序列不是很长，但仍很难直接合成全长序列，故将其分段合成。由上海博亚生物技术公司合成。
片段1是病毒O58及A62株系VP1蛋白基因序列(O58来源于GenBankFDI131469，A62来源于GenBank FDI 131666)上不存在的序列，在本工作中用于合成片段的环化及扩增引物，由于其序列5’端与片段6和片段16互补，3’端与片段2和片段11互补，故可使合成片段成为环状。
gaa ttc taa tag ctc gag gtc gac aag ctt acc atgEcoRI SalI HindIII NcoI片段2用于片段A与片段1连接用，其中一部分序列与片段1互补，另一部分与片段A互补。为分析方便，在下面显示的是片段2的互补链。
gtc gac aag ctt acc atg gtg acc aaaSalI HindIII NcoI片段3下面所示是片段3的互补序列，可以看出片段3与片段A的10-45碱基序列一致。
gtg aga ggc gat ctg cag gtg ctg gcg cag aaa gcg(需反转)片段4用于连接片段A和片段B的互补链。下面所示为片段4的互补序列，它的一部分序列(15bp)与片段A的后15碱基互补，另一部分序列(37bp)和片段B头部序列互补gca cgc tct ctg ccg-aga cat aaa cag aag att atg gca cca(需反转)片段6用于连接片段B和片段1的互补链序列。以下显示的是片段6的互补序列，其中一部分序列与片段B的3’端的15bp序列互补，另一部分与片段1的5’端18bp序列互补。
ggc aaa cgc ctg ctg-gaa ttc taa tag ctc gag(需反转)片段11用于连接片段E和片段1的互补链序列。以下显示的是片段11的互补序列，其中一部分序列与片段1的3’端的18bp序列互补，另一部分与片段E的5’端9bp序列互补。
gtc gac aag ctt acc atg-aac gcg ggc(需反转)片段12是片段E的互补序列。以下显示的是片段12的互补序列，序列与片段E的10-46碱基序列互补。
cgt cgc ggc gat ctg ggc tct ctg gcg gcg cgt gtg(需反转)片段13用于连接片段E和片段F的互补链序列。以下显示的是片段13的互补序列，其中一部分序列与片段E的3’端的15bp序列互补，另一部分与片段F的5’端45bp序列互补。
gcg cag ctg ccg gcg-cgc cat aaa cag cgt att att gcg ccg(需反转)片段14用于连接片段F和片段A的互补链序列。以下显示的是片段13的互补序列，其中一部分序列与片段F的3’端的15bp序列互补，另一部分与片段A的5’端45bp序列互补。
gcg aaa cag ctg ctg-gtg acc aaa(需反转)片段15用于连接片段B和片段E的互补链序列。以下显示的是片段15的互补序列，其中一部分序列与片段B的3’端的15bp序列互补，另一部分与片段E的5’端9bp序列互补。
ggc aaa cgc ctg ctg-aac gcg ggc(需反转)片段16
用于连接片段F和片段1的互补链序列。以下显示的是片段16的互补序列，其中一部分序列与片段F的3’端的15bp序列互补，另一部分与片段1的5’端18bp序列互补。
gcg aaa cag ctg ctg-gaa ttc taa tag ctc gag(需反转)正链、互补链分成几段合成，正链为4段，编码的分别为病毒O58株系VP1蛋白上有免疫位点的20肽、14肽和A62株系的20肽、14肽，其核苷酸长度为60bp和42bp两种，正链5’端全部磷酸化；互补链为了合成的方便，设计了多个链，其中不仅有与正链完全对应的片断，也有与正链部分有互补关系的片断。另外根据多肽基因的序列设计了引物，用以扩增已合成的片断，而且在引物上加了限制性内切酶的识别序列。设计好的多肽基因及引物交由DNA合成公司合成。
(1)小片段拼接合成的寡核苷酸片段用双蒸水溶解，其中用于合成基因的均稀释到约800ng/μl，用作引物的合成片段溶解并稀释到80ng/nl。然后按图2所示方式进行拼接。
在图2中，片段A和B分别代表O58株系的20肽和14肽的正链，E和F分别代表A62的20肽和14肽的正链寡核苷酸片段。1代表的是一个人工设计的正链寡核苷酸片段，主要是提供酶切序列和作引物用，同样它的5’端磷酸化，2、3、4、6、11、12、13、14、15、16代表的分别是合成的互补链寡核苷酸片段，其中有些链能同时与不同的正链相互补，以便用于拼接不同株系的正链，其中片段1、6、16还将用作引物来扩增合成链。
按O58(20肽-14肽)-A62(20肽-14肽)(简称O-A)多肽顺序的基因拼接操作分别将片段A、2、3为一组；片段B、4、15为一组；片段E、F、1、12、13、16为一组，按等摩尔混合。
按A62(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)(简称A-O)多肽顺序的基因拼接操作分别将片段E、11、12为一组；片段F、13、14为一组；片段A、B、1、3、4、6为一组，按等摩尔混合。
混合好的片段溶液10μl放于已升温到95℃的水浴锅中，断电后自然冷却10小时。
(2)片段连接分别将O-A、A-O多肽顺序三组拼接产物各取适量混合，取5μl加入等量的快速连接酶I(大连宝生生物公司产品)，于16℃连接16小时以上。将连接产物用TE缓冲液稀释100倍，-20℃保存。
连接后的片段实际上是两个环形DNA链。如图3、图4所示即是分别按O-A、A-O多肽顺序连接的基因片段。
分别按O58(20肽-14肽)-A62(20肽-14肽)、A62(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)多肽顺序的基因片段，由于片段正链寡核苷酸链5’端磷酸化，所以连接成一完整的环形DNA单链。下链在寡核苷片段间仍是缺口，分别利用片段1、16、1、6作为两对引物，通过PCR可对其进行扩增。
(3)合成片段的PCR扩增
利用引物序列对上述连接产物进行PCR扩增。PCR反应体系10xPCR缓冲液5μl，10mmol/L dNTP4μl，Pfu DNA聚合酶2U，分别用片段1，片段16；片段1，片段6作为两对引物，引物浓度为80ng/μl，各加入2μl，连接产物O-A及A-O分别加入1μl，分别加水到总体积50μl。PCR程序为95℃预变性5分钟；然后94℃变性1分钟，65℃复性1分钟，72℃延伸2分钟，循环30次。
2.口蹄疫双价多肽疫苗基因原核表达载体的构建(1)口蹄疫双价多肽疫苗基因的克隆以O-A、方式连接产物为模板，用片段1，片段16作为引物；以A-O方式连接产物为模板，用片段1，片段6作为引物，经PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，切出204bp的带，用DNA纯化回收试剂盒(购自鼎国公司)进行回收纯化，用T4DNA连接酶(上海生工公司)，与载体pUCm-T Vector(上海生工公司)连接，16℃连接过夜，以O-A、A-O方式的连接产物，得到的克隆载体分别为pUCm-F1及pUCm-F2(pUCm-F1为以O-A方式连接产物构建的载体；pUCm-F2为以A-O方式连接产物构建的载体；)。
(2)转化连接产物pUCm-F1及pUCm-F2通过热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
转化用感受态大肠杆菌的制备挑取DH5α的单菌落于10ml液体LB培养基中，37℃ 250rpm培养过夜。取1ml培养菌液加到100ml新鲜LB培养基中，37℃ 300rpm培养3h左右至OD600值为0.5-0.6。冰浴菌液30min，4℃ 6000rpm离心5min，收集菌体。弃掉上清，加入10ml冰浴无菌的0.1mol/LCaCl2溶液中悬浮菌体细胞，冰浴15min。4℃ 6000rpm离心5min。弃掉上清，将菌体重悬于2ml0.1mol/LCaCl2溶液中。分装到预冷的1.5ml无菌Eppendorf管中(200μl/管)，加入15％的无菌甘油于-70℃贮存备用。连接产物按以下方法进行大肠杆菌转化分别取1μl的连接反应产物pUCm-F1及pUCm-F2，于200μl DH5α感受态细胞溶液中，混匀后，冰浴30min。42℃水浴热击90sec，立即置冰浴中1-2min。加入800μl LB液体培养基，37℃ 150rpm摇床培养1h。在附加AMP50ug/mlLB的固体平板上，涂布40μl X-gal(20μg/μl)和4μl IPTG(200μg/μl)溶液。从1ml转化菌液中取100μl菌液涂布于平板上，风干。
37℃培养16小时，平板上出现兰色和白色菌落，挑取白色菌落进行重组克隆的鉴定。
(3)转化子鉴定首先对克隆载体pUCm-F1及pUCm-F2进行质粒DNA的提取。按Sambrook等(1989)碱法制备pUCm-F1(pUCm-F2)载体质粒DNA。随机挑取含有pUCm-F1及pUCm-F2的载体的DH5α菌落，分别接种于3ml含卡那霉素100mg/L的LB细菌培养基中，37℃摇动过夜。在1.5ml的Eppendorf管中，12000rpm离心2min，重复一次，收集3ml菌体。
加入100μl溶液I(25mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl，pH8.0，10mmol/L EDTA)，震荡均匀。加入200μl溶液II(0.2mmol/L NaOH，1％SDS)，颠倒离心管数次混合内容物，放置冰上3min。
加入150μl溶液III(5mmol/L醋酸钾60ml，冰醋酸11.5ml，蒸馏水28.5ml)，混合均匀，放置冰上。12000rpm离心10min，取上清移至新的Eppendorf管中。加入等体积酚∶氯仿(1∶1)，充分混合，12000rpm离心5min，取上清。加入1/10体积3mol/L醋酸钠(pH5.2)和两倍体积预冷的无水乙醇，-20℃放置30min。
离心弃上清，冰预冷的70％乙醇洗沉淀两次，充分吹干。加入20-50μl TE(pH8.0)，溶解pUCm-F1及pUCm-F2质粒。
a.电泳法鉴定将提取的转化菌落载体pUCm-F1及pUCm-F2质粒，通过电泳确定质粒的大小，提取的质粒大于原始的pUCm-T质粒，符合克隆有目的基因的候选质粒比对照质粒增大的预期设想，见图5。
b.酶切验证用限制性内切酶NcoI和EcoRI对pUCm-F1及pUCm-F2质粒进行酶切，验证目的基因O-A、A-O是否已经在pUCm-T载体中得到克隆，酶切产物进行电泳，检测切出片段在204bp的为目的基因(即O-A、A-O双价多肽疫苗基因)，见图6。
c.测序法鉴定质粒将含有转化质粒pUCm-F1及pUCm-F2的菌株DH5α用甘油管保存，交上海申友测序公司测序，测序引物为pUCm-T质粒上的T7启动子区的引物。测序结果表明，目的基因O-A及A-O两段基因片断已正确插入载体pUCm-T中，两段目的基因O-A及A-O核苷酸序列分别为SEQ ID NO 1及SEQ ID NO 2，在DNAMAN中推测其氨基酸序列分别为SEQ ID NO 3及SEQ ID NO 4。鉴定结果表明，带有目的基因的pUCm-F1(pUCm-F2)载体已导入到生产型原核表达宿主菌DH5α中。
(4)口蹄疫双价多肽疫苗基因原核表达载体的构建经过测序、酶切及PCR验证，以O58(20肽-14肽)-A62(20肽-14肽)、A62(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)两种连接方式分别得到双价多肽疫苗基因片段O-A、A-O，已经克隆进载体pUCm-T中，分别得到含有多肽疫苗基因片段O-A的克隆载体pUCm-F1及含有多肽疫苗基因片段A-O的pUCm-F2。用限制性内切酶NcoI和EcoRI从克隆载体pUCm-F1(pUCm-F2)上切出FMDV双价基因O-A(A-O)约200bp的片段，用T4DNA连接酶，与经过同样酶切质粒pET28a(+)所得的约5200bp的线性片段进行连接，得到含有双价基因O-A的原核表达载体pET-28fmv1及含有双价基因A-O的原核表达载体pET-28fmv2，转化于感受态大肠杆菌BL21，见图7。
(5)口蹄疫双价多肽疫苗基因表达的蛋白检测多肽基因的诱导表达和包涵体制备方法按pET技术说明书(Novagen公司)进行用质粒pET28fmv1(pET28fmv2)转化大肠杆菌BL21，用IPTG进行诱导表达，收集菌体，分离并纯化蛋白，用SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰R-250染色，鉴定表达产物的分子量和表达水平，结果表明，表达产物以包涵体的形式存在于细胞内，诱导3小时达到表达量的最高峰，重组蛋白表达水平占菌体总蛋白的20％左右。Westernblotting分析表明，该含有双价疫苗基因O-A及A-O基因表达的纯化蛋白能与FMDV O型及A型阳性血清发生反应，说明含有双价疫苗基因O-A及A-O基因的表达产物具有较好的免疫原活性。实施例2.FMDV双价疫苗基因与GFP基因的原核表达载体的构建1.GFP基因的获得及克隆GFP基因以一种融合蛋白的形式表达，可作为安全有效的报告基因用于原核生物的遗传转化，含有GFP表达盒的转化材料，能在蓝光激发下发出绿色荧光，便于检测。
根据GenBank号#U55762上GFP的核苷酸序列，以质粒pEGFP-N1(CLONTECH Laboratories Inc.#6085-1)为模板DNA，设计如下一对引物引物55’GCGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG 3’EcoRI引物65’CGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC 3’SalI采用小量碱法提取质粒pEGFP-N1，作为模板，用引物5和6进行扩增。PCR程序为95℃预变性5分钟；然后94℃变性1分钟，65℃复性1分钟，72℃延伸3分钟，循环25次。反应结束后取10μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
电泳回收PCR产物约750bp的片段，用T4DNALigase与pUCm-T载体连接，得到载体pUCm-gfp。
将克隆载体pUCm-gfp转化感受态大肠杆菌DH5α，用蓝白斑筛选克隆载体，采用小量碱法提取质粒pUCm-gfp，电泳进行质粒DNA检测，同时用PCR扩增进行验证、限制性内切酶EcoRI/SalI双酶切验证、以及上海开瑞测序公司测序验证，均证明目的基因GFP已插入到载体pUCm-T中。
2.FMDV双价疫苗与GFP融合基因的构建及克隆采用小量碱法提取质粒pUCm-F1(pUCm-F2)，用NcoI/EcoRI双酶切，电泳检测并用回收试剂盒回收纯化所得的约200bp的片段；提取质粒pUCm-gfp，用EcoRI/SalI双酶切，电泳检测并用回收试剂盒回收纯化约750bp片段；提取质粒pUCm-T，用NcoI/SalI双酶切，回收纯化线性片段，约2000bp。将以上所得的约200bp、750bp及约2000bp的三个片段，用T4连接酶进行连接，得到含有双价基因O-A及GFP基因的克隆载体pUCm-FM1及含有双价基因A-O的克隆载体pUCm-FM2。用此载体转化感受态大肠杆菌DH5α。用蓝白斑筛选克隆载体，采用小量碱法提取质粒pUCm-FM1(pUCm-FM2)，电泳进行质粒DNA检测，同时用PCR扩增进行验证、双酶切验证、以及测序公司测序验证，序列为SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6.经检测证明目的基因FMDV双价疫苗基因O-A及A-O与GFP融合基因已插入到载体pUCm-T中。
3.口蹄疫双价多肽疫苗与GFP融合基因的原核表达载体的构建采用小量碱法提取质粒pUCm-F1(pUCm-F2)，用NcoI/EcoRI双酶切，电泳检测并用回收试剂盒回收纯化所得的约200bp的片段；提取质粒pUCm-gfp，用EcoRI/SalI双酶切，电泳检测并用回收试剂盒回收纯化约750bp片段；提取质粒pET28a(+)，用NcoI/SalI双酶切，回收纯化线性片段，约5200bp。将以上所得约200bp、750bp及约5200bp的三个片段，用T4连接酶进行连接，得到含有双价疫苗基因O-A与GFP融合基因的原核表达载体pET-FM1及含有双价疫苗基因A-O与GFP融合基因的原核表达载体pET-FM2。将表达载体分别转化于感受态大肠杆菌BL21，进行SDS-PAGE蛋白检测。含有原核表达载体pET-FM1及pET-FM2的克隆菌BL21，既能在卡那霉素培养基上生长，又能在蓝光下激发出绿色荧光。说明载体pET-FM1及pET-FM2含有双价疫苗基因O-A与GFP融合基因及双价疫苗基因A-O与GFP融合基因，见图8。实施例3.原核表达产物免疫原性的检测首先将构建好的双价多肽和GFP的融合基因诱导表达并进行蛋白纯化(方法按Novagen公司pET-28a(+)技术说明书进行)，然后检测表达产物的免疫原性。
1.纯化蛋白将含有原核表达载体pET-FM1及pET-FM2的克隆菌BL21细菌培养液在4℃、6500g条件下离心15min，以收集菌体，去上清。用原培养液1/10体积的1XIB缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH7.5，10mmol/L EDTA，1％TritonX-100)重悬沉淀。溶菌酶加超声裂解加入溶菌酶至终浓度100μg/mL，30℃放置15min。搅拌后将样品缓冲液置于冰浴中，利用超声仪(国产新芝牌)，200-300W功率，按1秒钟超声，3秒种间隔的方式进行60-90次。再加蛋白酶抑制剂(PSMF)。在4℃下，10000g离心10min。去上清，用原培养液1/10体积的1XIB缓冲液重悬沉淀。上述步骤重复2次。然后，将悬液移入已知重的离心管中。在4℃ 10000g离心10min。彻底去上清。称重，计算产量。
2.SDS-PAGE电泳SDS-PAGE电泳检测对含有原核表达载体pET-FM1及pET-FM2的克隆菌BL21的蛋白表达产物按常规方法进行SDS-PAGE电泳，分离胶浓度8％，考马斯亮兰R-250染色，甲醇-乙酸脱色。
结果表明，含有原核表达载体pET-FM1及pET-FM2的克隆菌BL21的纯化蛋白大小大于30KD，即大于GFP蛋白的大小，确认是目的蛋白。
3.Western blotting分析溶液的配制电转移缓冲液含39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris·HCL(pH6.8)，037％SDS，20％甲醇。
配制1000mL称取甘氨酸2.9g，Tris碱5.8g，SDS0.37g，溶解于750mL重蒸水后，加入200mL甲醇，定容至1000mL。
洗液溶液150mmol/L NaCL，50mmol/L Tris·HCL pH7.5；封闭液10mL PBST+0.3g BSA；0.5％氨基黑10B染液称取氨基黑10B 0.5g，加入甲醇45mL，冰乙醇10mL，重蒸水45mL；氨基黑漂洗液45mL 95％的乙醇，5mL冰乙酸，50mL无离子水；底物溶液(30mL)30mL PBST中溶解15mg的DAB(二氨基联苯胺)和9mg CoCL2，再加入10μL 30％H2O2。
电转移剪6张与上述电泳凝胶大小一致的滤纸及一张NC膜，并用转移缓冲液浸泡3-5min。依次将海绵、滤纸3张、凝胶、NC膜、滤纸3张、海绵放好，然后用筛孔板固定好，插入电转移槽中，加入转移缓冲液，确定凝胶在阴极，NC膜在阳极方向。接通电源，电压为50-100V，4℃下电泳2-3h。电转移完毕，取出NC膜，用铅笔或剪去一角以标记膜的方向。切下标准分子量Marker，置氨基黑染液浸染5min，取出后用漂洗液脱色，直至蓝色背景脱尽。其余NC膜用PBS冲洗，加10mL封闭液浸泡，室温震荡1-3h，以封闭未吸附蛋白质的位点。
免疫学检测封闭结束后，将转化含有双价疫苗基因O-A及A-O与GFP融合基因表达的融合蛋白的NC膜用PBS漂洗液漂洗4-5次，每次5min。将NC膜转至一塑料袋内，分别加入PBST1∶800稀释的FMDO型及A型(是O还是A型，具体一点)阳性血清10mL(0.1mL/cm2)，封口。37℃轻微震荡结合1.5h，用PBST冲洗4-5次，每次在摇床缓慢摇动。然后加入1∶800稀释的兔抗猪IgG(二抗)，室温下轻摇孵育1h，取出用PBST冲洗3-4次，每次10min。以除去未结合的二抗。
将NC膜转入到底物溶液，室温避光轻摇5-10min，观察显色情况，等出现条带时，立即转入PBST缓冲液终止反应。室温保存，照相。
4.结果经Western blotting分析，含有双价疫苗基因O-A及A-O与GFP融合基因在原核表达载体pET-FM1及pET-FM2中表达的纯化蛋白，能被O型及A型口蹄疫阳性血清所识别，证明含有双价疫苗基因O-A及A-O与GFP融合基因的表达产物具有免疫学活性。
SEQ ID NO 1的信息序列特征(A)(长度)204个碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)(拓扑结构)线性(1)分子类型cDNA(2)序列描述SEQ ID NO 1(3)gtg acc aaa gtg aga ggc gat ctg cag gtg ctg gcg cag aaa gcg gca cgc tct ctg ccg aga cat aaa cagaag att gtg gca cca ggc aaa cgc ctg ctg aac gcg ggc cgt cgc ggc gat ctg ggc tct ctg gcg gcg cgtgtg gcg cag ctg ccg gcg cgc cat aaa cag cgt att att gcg ccg gcg aaa cag ctg ctgSEQ ID NO 2的信息序列特征(A)(长度)204个碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)(拓扑结构)线性序列描述SEQ ID NO 2aac gcg ggc cgt cgc ggc gat ctg ggc tct ctg gcg gcg cgt gtg gcg cag ctg ccg gcg cgccat aaa cag cgt att att gcg ccg gcg aaa cag ctg ctg gtg acc aaa gtg aga ggc gat ctg caggtg ctg gcg cag aaa gcg gca cgc tct ctg ccg aga cat aaa cag aag att gtg gca cca ggcaaa cgc ctg ctg(4)SEQ ID NO 3的信息序列特征(A)(长度)68个氨基酸(B)类型多肽(C)链性单链(D)(拓扑结构)线性序列描述SEQ ID NO 31 V T K V R G D L Q V L A Q K A A R S L P21R H K Q K I V A P G K R L L N A G R R GD L G S L A A R V A Q L P A R H K Q R I61 I A P A K Q L LSEQ ID NO 4的信息序列特征
(A)(长度)68个氨基酸(B)类型多肽(C)链性单链(D)(拓扑结构)线性序列描述SEQ ID NO 41 N A G R R G D L G S L A A R V A Q L P A21R H K Q R I I A P A K Q L L V T K V R GD L Q V L A Q K A A R S L P R H K Q K I61V A P G K R L LSEQ ID NO 5的信息序列特征(A)(长度)924个碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)(拓扑结构)线性序列描述SEQ ID NO 51 GTGACCAAAG TGAGAGGCGA TCTGCAGGTG CTGGCGCAGA AAGCGGCACG CTCTCTGCCG61 AGACATAAAC AGAAGATTGT GGCACCAGGC AAACGCCTGC TGAACGCGGG CCGTCGCGGC121GATCTGGGCT CTCTGGCGGC GCGTGTGGCG CAGCTGCCGG CGCGCCATAA ACAGCGTATT181ATTGCGCCGG CGAAACAGCT GCTGATGGTG AGCAAGGGCG AGGAGCTGTT CACCGGGGTG241GTGCCCATCC TGGTCGAGCT GGACGGCGAC GTAAACGGCC ACAAGTTCAG CGTGTCCGGC301GAGGGCGAGG GCGATGCCAC CTACGGCAAG CTGACCCTGA AGTTCATCTG CACCACCGGC361AAGCTGCCCG TGCCCTGGCC CACCCTCGTG ACCACCCTGA CCTACGGCGT GCAGTGCTTC421AGCCGCTACC CCGACCACAT GAAGCAGCAC GACTTCTTCA AGTCCGCCAT GCCCGAAGGC481TACGTCCAGG AGCGCACCAT CTTCTTCAAG GACGACGGCA ACTACAAGAC CCGCGCCGAG541GTGAAGTTCG AGGGCGACAC CCTGGTGAAC CGCATCGAGC TGAAGGGCAT CGACTTCAAG601GAGGACGGCA ACATCCTGGG GCACAAGCTG GAGTACAACT ACAACAGCCA CAACGTCTAT661ATCATGGCCG ACAAGCAGAA GAACGGCATC AAGGTGAACT TCAAGATCCG CCACAACATC721GAGGACGGCA GCGTGCAGCT CGCCGACCAC TACCAGCAGA ACACCCCCAT CGGCGACGGC781CCCGTGCTGC TGCCCGACAA CCACTACCTG AGCACCCAGT CCGCCCTGAG CAAAGACCCC841AACGAGAAGC GCGATCACAT GGTCCTGCTG GAGTTCGTGA CCGCCGCCGG GATCACTCTC901GGCATGGACG AGCTGTACAA GTAA(斜体部分为O-A型FMD双价疫苗基因正体部分为GFP基因)SEQ ID NO 6的信息序列特征(A)(长度)924个碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)(拓扑结构)线性序列描述SEQ ID NO 61AACGCGGGCC GTCGCGGCGA TCTGGGCTCT CTGGCGGCGC GTGTGGCGCAGCTGCCGGCG61 CGCCATAAAC AGCGTATTAT TGCGCCGGCG AAACAGCTGC TGGTGACCAAAGTGAGAGGC121GATCTGCAGG TGCTGGCGCA GAAAGCGGCA CGCTCTCTGC CGAGACATAAACAGAAGATT181GTGGCACCAG GCAAACGCCT GCTGATGGTG AGCAAGGGCG AGGAGCTGTTCACCGGGGTG241GTGCCCATCC TGGTCGAGCT GGACGGCGAC GTAAACGGCC ACAAGTTCAGCGTGTCCGGC301GAGGGCGAGG GCGATGCCAC CTACGGCAAG CTGACCCTGA AGTTCATCTGCACCACCGGC361AAGCTGCCCG TGCCCTGGCC CACCCTCGTG ACCACCCTGA CCTACGGCGTGCAGTGCTTC421AGCCGCTACC CCGACCACAT GAAGCAGCAC GACTTCTTCA AGTCCGCCATGCCCGAAGGC481TACGTCCAGG AGCGCACCAT CTTCTTCAAG GACGACGGCA ACTACAAGACCCGCGCCGAG541GTGAAGTTCG AGGGCGACAC CCTGGTGAAC CGCATCGAGC TGAAGGGCATCGACTTCAAG601GAGGACGGCA ACATCCTGGG GCACAAGCTG GAGTACAACT ACAACAGCCACAACGTCTAT661ATCATGGCCG ACAAGCAGAA GAACGGCATC AAGGTGAACT TCAAGATCCGCCACAACATC721GAGGACGGCA GCGTGCAGCT CGCCGACCAC TACCAGCAGA ACACCCCCATCGGCGACGGC781CCCGTGCTGC TGCCCGACAA CCACTACCTG AGCACCCAGT CCGCCCTGAGCAAAGACCCC841AACGAGAAGC GCGATCACAT GGTCCTGCTG GAGTTCGTGA CCGCCGCCGGGATCACTCTC901GGCATGGACG AGCTGTACAA GTAA(斜体部分为A-O型FMD双价疫苗基因，正体部分为GFP基因)
权利要求
1.编码一种口蹄疫双价疫苗的核苷酸序列，其特征在于，该段核苷酸序列由两部分串联构成一部分是编码口蹄疫A型病毒的第140-160氨基酸和200-213氨基酸的核苷酸序列，即编码A型病毒的20肽、14肽的核苷酸序列相串联起来核苷酸序列；另一部分是编码O型病毒的第140-160氨基酸和200-213氨基酸的核苷酸序列，即编码O型病毒的20肽、14肽的核苷酸序列相串联起来核苷酸序列；这两部分核苷酸序列再串联成为A62(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)或O58(20肽-14肽)-A62(20肽-14肽)的串联核苷酸序列。
2.一段如权利要求1所述的编码口蹄疫双价疫苗的核苷酸序列，其特征在于，它具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
3.一段如权利要求1所述的编码口蹄疫双价多肽疫苗的核苷酸序列编码的多肽，其特征在于该多肽具有SEQ ID NO3或SEQID NO4所示的氨基酸序列。
4.一种构建A62(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)或O58(20肽-14肽)-A62(20肽-14肽)的核苷酸序列相串联序列的方法，其特征在于，采用多个片段拼接的方法，将编码A型病毒的20肽、14肽的核苷酸序列与编码O型病毒的第140-160氨基酸和200-213氨基酸的核苷酸序列共同串联起来。
5.一种包含权利要求1-4任意一项所述的核苷酸序列的原核表达载体。
6.一种如权利要求5所述的原核表达载体，其特征在于，该原核表达载体包含A62(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)或O58(20肽-14肽)-A62(20肽-14肽)的核苷酸串联序列；或者包含该核苷酸串联序列与报告基因—绿色荧光蛋白(Greenfluorescence protein，GFP)基因的串联序列。
7.一种如权利要求5或6所述的原核表达载体，其特征在于，该载体为pET28fmv1或pET28fmv2或pET-FM1或pET-FM2。
8.一种利用权利要求5-7的任意一项所述的含有口蹄疫双价疫苗的核苷酸序列的原核表达载体生产口蹄疫双价疫苗的方法，其特征在于，将权利要求5-7任意一项所述的原核表达载体转化到工程菌中，进行诱导表达，然后提取、纯化表达的重组蛋白。
9.一种权利要求1所述的口蹄疫双价多肽疫苗的核苷酸序列编码多肽的用途，其特征在于，该多肽可作为疫苗预防O型及A型两种口蹄疫。
全文摘要
本发明涉及一种合成的A型及O型口蹄疫双价多肽疫苗的基因序列及合成方法，合成的基因序列为SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的序列，以及根据这两个序列分别可推导出其编码的氨基酸序列SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的序列。将该两段基因序列分别与绿色荧光蛋白基因串联，使之成为双价多肽疫苗融合基因。将该两段双价多肽疫苗融合基因分别构建到原核表达载体中，并使该两段融合基因表达为两种双价多肽疫苗蛋白，该两种蛋白的免疫原性测定表明，合成的两段多肽疫苗基因具有较好的免疫原活性。如牲畜经免疫注射后，可预防A型及O型两种口蹄疫，而且该两段双价多肽疫苗基因可以用于制备检测A型及O型两种口蹄疫的抗原。
文档编号C12N15/63GK1468958SQ0310058
公开日2004年1月21日 申请日期2003年1月20日 优先权日2003年1月20日
发明者周长生, 陶玲, 张勇, 陈正华 申请人:甘肃亚盛盐化工业集团有限责任公司