专利名称：从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及从植物中提取蒜酶生物制剂的方法，是一种从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺。
背景技术：
大蒜(Allium sativum L.)是历史悠久的药食两用植物。大蒜又名胡蒜，为百合科葱属植物蒜(Allium sativum L.)的地下鳞茎。近代研究发现，大蒜具有抗癌、降血脂、杀灭真菌等作用，成为德、美、日等国研究的热点。蒜酶(Alliinase，EC 4.4.1.4)又名蒜氨酸裂解酶、烷基硫代半胱氨酸酶。存在于细胞的液泡中。为六个磷酸吡哆醛和两个亚单位组成。在280、430nm处有最大吸收。等电点pH4.9。目前公认蒜酶催化蒜氨酸(Alliin，2-烯丙基半胱氨酸亚砜)产生大蒜辣素(Allicin，二烯丙基硫代亚磺酸酯)、阿霍烯(ajoenes)等系列挥发性含硫有机化合物而发挥多种药效。
最佳催化温度37℃、pH5.0-8.0，10分钟即可将80％蒜氨酸转化为大蒜辣素(Allicin，ally 2-propenethisulfinate)。又名二烯丙基硫代亚磺酸酯或蒜素。
蒜酶与蒜氨酸分别独立的存在于大蒜的鳞茎中，捣碎后这两种物质相互接触，迅速发生分解反应。因此，从大蒜中提取到蒜酶是十分困难的。
发明内容
本发明提供了一种从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺。
本发明的技术方案是这样来实现的一种从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺，按以下步骤进行第一步蒜瓣加蒜酶提取液打浆分离出清液先将蒜瓣温度控制在-5℃至5℃范围内，并控制温度在-5℃至5℃范围内，加入蒜酶提取液并磨成100至200目的蒜浆，蒜酶提取液的加入量为蒜瓣重量的0.8至1.2倍，并进一步分离出第一清液；第二步分步沉淀得到粗蒜酶控制温度在-5℃至5℃范围内，在搅拌下将硫酸铵加入第一清液中，使其全部溶解并用比重计控制硫酸铵浓度在20％至30％重量体积百分比浓度范围内，然后分离出第二清液；在搅拌下将硫酸铵加入第二清液中，使其全部溶解并用比重计控制硫酸铵浓度在40％至50％重量体积百分比浓度范围内，然后分离出第一糊状沉淀物粗蒜酶；第三步透析脱盐-调节等电点-冷冻干燥得到蒜酶将第一糊状沉淀物装入聚氨酯袋，于流动的-5℃至5℃范围内的冰水透析槽中透析40小时至50小时，然后用磷酸调节等电点pH到4.9后分离出第二糊状沉淀物即糊状蒜酶。
上述提取液含有络合剂、抗氧剂、缓冲剂及丙三醇的水溶液。
上述络合剂可为乙二胺四乙酸二钠；上述抗氧剂可为巯基丙醇；上述缓冲剂可为磷酸盐。
蒜酶提取液可为在磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中加入按缓冲液体积加入0.1％至0.3％的二乙胺四乙酸二钠、0.02％至0.06％的巯基乙醇，0.3％至1.0％的氯化钠、5％至15％的丙三醇。
在上述生产工艺中，可将第二糊状沉淀物放入冷冻干燥机进行干燥，使水分含量低于2.0％，得到冻干蒜酶，然后用氮气或惰性气体进行密闭保存。
上述分离所用设备可采用冷冻密闭式浆渣自分离磨浆机或离心摔干机或低温管式离心分离机。
本发明适宜于以鲜蒜为原料批量化生产药用蒜酶。本发明所得蒜酶产品经过SDS-凝胶电泳证明其具有较高的纯度。依据与标准蛋白(C分子量14400～97400)比移值计算其蒜酶产品单聚体分子量为67000道尔顿。米氏常数Km为3.6mmol/L。其产品平均活力为765U/g。
附图1为蒜酶(A、B)、标准蛋白(C，3mg/mL)电泳图；附图2为底物(蒜氨酸)和反应产物(丙酮酸、大蒜辣素)高效液相色谱分析(即HPLC)色谱图；附图3为蒜酶催化蒜氨酸反应动力学曲线。
具体实施例方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据上述本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。
实施例，按下述步骤进行第一步在蒜瓣中加蒜酶提取液打浆分离出清液先将蒜瓣温度控制在-5℃至5℃范围内，并控制温度在-5℃至5℃范围内，加入蒜酶提取液并磨成100至200目的蒜浆，蒜酶提取液的加入量为蒜瓣重量的0.8倍或1.2倍，并进一步分离出第一清液；第二步分步沉淀得到粗蒜酶控制温度在-5℃至5℃范围内，在搅拌下将硫酸铵加入第一清液中，使其全部溶解并用比重计控制硫酸铵浓度在20％至30％重量体积百分比浓度范围内，然后分离出第二清液；在搅拌下将硫酸铵加入第二清液中，使其全部溶解并用比重计控制硫酸铵浓度在40％至50％重量体积百分比浓度范围内，然后分离出第一糊状沉淀物粗蒜酶；第三步透析脱盐-调节等电点-冷冻干燥得到蒜酶将第一糊状沉淀物装入聚氨酯袋，于流动的-5℃至5℃范围内的冰水透析槽中透析40小时至50小时，然后用磷酸调节等电点pH到4.9后分离出第二糊状沉淀物即糊状蒜酶。
最好将第二糊状沉淀物放入冷冻干燥机进行干燥，使水分含量低于2.0％，得到冻干蒜酶，然后用氮气或惰性气体进行密闭保存，这样有利于长期保存。
在上述实施例中提取液为含有络合剂、抗氧剂、缓冲剂及丙三醇的水溶液；络合剂可为乙二胺四乙酸二钠；抗氧剂可为巯基丙醇；缓冲剂可为磷酸盐；蒜酶提取液最好为在磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中加入按缓冲液体积加入0.1％或0.3％的二乙胺四乙酸二钠、0.02％或0.06％的巯基乙醇，0.3％或1.0％的氯化钠、5％或15％的丙三醇。
分离所用设备采用冷冻密闭式浆渣自分离磨浆机或离心摔干机或低温管式离心分离机。
下面是对上述实施例所得产品即蒜酶的确认一、SDS凝胶电泳测定蒜酶产品纯度及分子量SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)条件采用10％分离胶，4.5％浓缩胶制板。点样量20μL。CC型垂直电泳槽，甘油-羟甲基胺基甲烷—HCl-十二烷基磺酸钠缓冲液。电压20mA电泳展开，考马斯亮蓝染色。结果显示一根条带。依据与标准蛋白(C分子量14400～97400)比移值得回归方程Y＝-1.7297X+5.6399(r＝0.97)。
计算蒜酶样品(批号A011105、B020120)单聚体分子量为67000道尔顿。如附图1所示。
二、蒜酶活力效价
建立HPLC同时测定底物蒜氨酸、产物大蒜辣素及丙酮酸的方法。如附图2所示。蒜酶产品0.100g，纯化水超声30秒使溶解，制成1.00mg/ml供试液。以蒜氨酸(Indofine Chemical Company，Inc.USA含量99.5％。)作标准对照品。Hypersil-BDS-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5um)，柱温35℃，流动相甲醇-水(3∶2)，流率0.8ml/min，214nm检测。进样量10l测定。以相邻的蒜氨酸和丙酮酸色谱峰计算产品(蒜酶)的活力效价。实施例所得五批蒜酶产品催化活力平均为765U/g。
1蒜酶活力单位(U)＝每分钟裂解 mol蒜氨酸(底物)需要的酶量( )。五批蒜酶产品平均蒜酶活力为765U/g。1蒜酶活力单位(U)=W'×n177.2×5×W]]>三、酶促反应动力学曲线和参数蒜酶产品加底物(蒜氨酸)分别配成试液。超声混合30秒，35℃水浴保温。分别于5、15、25min，及1、3、5、7、9、11、13hr吸取反应液适量，加甲醇混匀。过0.45μm滤膜，HPLC进样10μl，得到色谱图。计算蒜氨酸、丙酮酸及大蒜辣素含量。绘制酶促反应曲线，如附图3所示。
显示蒜酶的特性反应曲线5分钟以内为酶促反应初速度(呈现一级反应S+E→P。其速度方程为-d[S]/dt＝k1[S])；25分钟达到最大反应速度(呈现混合级反应E+SES→E+P。)。大蒜辣素随时间浓度增加，15分钟至13hr其浓度基本稳定(25分-13hr接近零级反应)。
催化裂解反应符合米氏方程1/V＝0.129/[S]+0.0358。
回归方程Y＝35.78+0.129X(r＝0.996)最大反应速度Vmax＝27.9mol·min-1·mg-1米氏常数Km＝3.6mmol/L。
权利要求
1.一种从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺，其特征在于按以下步骤进行第一步在蒜瓣中加蒜酶提取液打浆分离出清液先将蒜瓣温度控制在-5℃至5℃范围内，并控制温度在-5℃至5℃范围加入蒜酶提取液并磨成100至200目的蒜浆，蒜酶提取液的加入量为蒜瓣重量的0.8至1.2倍，并进一步分离出第一清液；第二步分步沉淀得到粗蒜酶控制温度在-5℃至5℃范围内，在搅拌下将硫酸铵加入第一清液中，使其全部溶解并用比重计控制硫酸铵浓度在20％至30％重量体积百分比浓度范围内，然后分离出第二清液；在搅拌下将硫酸铵加入第二清液中，使其全部溶解并用比重计控制硫酸铵浓度在40％至50％重量体积百分比浓度范围内，然后分离出第一糊状沉淀物粗蒜酶；第三步透析脱盐-调节等电点-冷冻干燥得到蒜酶将第一糊状沉淀物装入聚氨酯袋，于流动的-5℃至5℃范围内的冰水透析槽中透析40小时至50小时，然后用磷酸调节等电点pH到4.9后分离出第二糊状沉淀物即糊状蒜酶。
2.根据权利要求1所述的从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺，其特征在于蒜酶提取液为含有络合剂、抗氧剂、缓冲剂及丙三醇的水溶液。
3.根据权利要求2所述的从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺，其特征在于络合剂为乙二胺四乙酸二钠；抗氧剂为巯基丙醇；缓冲剂为磷酸盐。
4.根据权利要求1或2或3所述的从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺，其特征在于蒜酶提取液为在磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中加入按缓冲液体积加入0.1％至0.3％的二乙胺四乙酸二钠、0.02％至0.06％的巯基乙醇，0.3％至1.0％的氯化钠、5％至15％的丙三醇。
5.根据权利要求1或2或3所述的从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺，其特征在于将第二糊状沉淀物放入冷冻干燥机进行干燥，使水分含量低于2.0％，得到冻干蒜酶，然后用氮气或惰性气体进行密闭保存。
6.根据权利要求4所述的从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺，其特征在于将第二糊状沉淀物放入冷冻干燥机进行干燥，使水分含量低于2.0％，得到冻干蒜酶，然后用氮气或惰性气体进行密闭保存。
7.根据权利要求1或2或3或6所述的从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺，其特征在于分离所用设备采用冷冻密闭式浆渣自分离磨浆机、离心摔干机及低温管式离心分离机。
8.根据权利要求4所述的从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺，其特征在于分离所用设备采用冷冻密闭式浆渣自分离磨浆机、离心摔干机及低温管式离心分离机。
9.根据权利要求5所述的从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺，其特征在于分离所用设备采用冷冻密闭式浆渣自分离磨浆机或离心摔干机或低温管式离心分离机。
全文摘要
一种从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺，按以下步骤进行第一步加蒜酶提取液打浆分离出清液；第二步分步沉淀得到粗蒜酶；第三步经透析脱盐，调节等电点及冷冻干燥得到蒜酶。适宜于以鲜蒜为原料批量化生产药用蒜酶。本发明所得蒜酶产品经过SDS－凝胶电泳证明其具有较高的纯度。依据与标准蛋白(C分子量14400～97400)比移值计算其蒜酶产品单聚体分子量为67000道尔顿。米氏常数K
文档编号C12N9/88GK1424397SQ03100419
公开日2003年6月18日 申请日期2003年1月13日 优先权日2003年1月13日
发明者陈坚, 王伟萍, 王轶睿, 苟萍 申请人:陈坚