专利名称：锌指蛋白－dna相互作用的遗传筛选模型及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域的一种遗传模型及其应用，特别是涉及研究锌指蛋白-DNA相互作用的遗传模型及其应用。
本发明所提供的锌指蛋白-DNA相互作用的遗传筛选模型，是含有报导质粒的大肠杆菌，所述报导质粒含有壮观霉素抗性基因aadA，壮观霉素抗性基因aadA的上游含有aadA基因自身启动子PaddA，壮观霉素抗性基因aadA的下游含有方向与启动子PaddA相反，且强度高于PaddA的组成性启动子；在所述组成性启动子的操纵序列中插入锌指蛋白小鼠转录因子Zif268的结合序列。
为了更利于操作，所述报导质粒是单拷贝的。
本发明巧妙地以经典型锌指小鼠转录因子Zif268为材料，利用转录干扰现象(Elledge SJ，et al.Position and density effects on repression by stationaryand mobile DNA-binding proteins.Genes Dev.1989，3(2)185-197；Elledge SJ，et al.Genetic selection for genes encoding sequence-specific DNA-bindingproteins.Proc Natl Acad Sci U S A.1989，86(10)3689-3693)，在大肠杆菌中建立了一种简单、通用的研究锌指蛋白-DNA相互作用的遗传筛选模型，可以用来揭示锌指蛋白的DNA识别规律，筛选、设计序列特异性的DNA结合蛋白，对特定基因如HIV等致病基因的表达进行人为干预，实现特定疾病的有效预防与治疗，具有重要的理论和实践意义。
本发明的原理如
图1所示报导质粒上含有壮观霉素抗性基因aadA，在该基因的上、下游各含有一个启动子PaddA、PconII，其中上游的启动子PaddA是aadA基因自身的启动子，下游的启动子PconII是一个合成的组成性启动子，强度上要远高于上游的启动子，方向与之相反，因此正常情况下，下游的启动子会组成性干扰aadA基因的转录，使得含有报导质粒的宿主表现为壮观霉素敏感Sps，此即所谓的转录干扰。在组成性启动子PconII相应于操纵序列Op的位置插入Zif268的结合序列，使PconII由组成性启动子变成了可调节启动子，用PconII-ZF表示，即构建了一个可被锌指蛋白调节的报导质粒，含有该报导质粒的宿主表现为壮观霉素敏感Sps，如果向宿主中再引进一个表达文库，其中有一个克隆可以产生一个锌指蛋白突变体，该突变体可以特异性的识别并结合0p位点，此时，PconII-ZF启动的转录就会被阻断，aadA基因就会在自身启动子的作用下转录，宿主就转变为壮观霉素抗性Spr。根据壮观霉素抗性的出现，就可以筛选得到识别特定位点的锌指蛋白突变体。
本发明的报导质粒可以特异性地从约104-105的混合物中将表达质粒筛选出来，具有充分的灵敏性。本发明构建的体内遗传筛选模型，无论是在可建立文库大小、揭示氨基酸-碱基作用规律还是在真实反映生理条件下锌指蛋白-DNA作用特点等方面都比噬菌体显示具有一定的优越性。
图2为报导质粒pConII-ΔZB的序列测定电泳图。
图3为Zif268的DNA结合区的PCR扩增电泳图。
图4为表达质粒pGEX-D的双酶切鉴定(EcoR I+BamH I)电泳图谱。
图5为表达质粒pGEX-D的序列测定图谱。
图6为融合蛋白GST-D纯化后的电泳图谱。
图7为锌指蛋白DNA结合区的凝胶滞留试验电泳图谱。
图8为锌指蛋白突变文库的重叠式PCR扩增结果电泳图。
表达锌指蛋白的LB-Zif培养基其组成为在LB的基础上添加100μM ZnCl2，100μg/ml L-酪氨酸，20mM的HEPES(用NaOH调pH 7.0)以及不同浓度的IPTG，氨苄青霉素100μg/ml。工具酶、常用生化试剂等为Biolab、Promega等公司及国产分析纯产品。常规分子生物学技术参见《分子克隆实验指南》(科学出版社，1992)
实施例1、报导质粒的构建选择Zif268的核心识别序列5’-AGCGTGGGCGG-3’作为操纵序列，合成两条互补的寡核苷酸片段P1、P2。合成片段混合退火，DNA聚合酶大片段聚合延伸。延伸片段经Not I、Hind III酶切消化、15％聚丙烯酰胺凝胶纯化后，与用同样限制性内切酶消化并经电泳纯化的质粒pNN389大片段连接、转化大肠杆菌。挑取单克隆，经酶切鉴定、序列测定，得到序列正确的报导质粒pConII-ΔZB(其鉴定图谱如图2所示)。在报导质粒中，Zif268的结合位点作为启动子ConII的操纵序列，位于-4位。
P15’-GGTGGCAAGCTTGCATG-3’P25’-GGTAGCGGCCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGCAAGCGTGGGCGGCTGCAGGCATGCAAGCTTGCCACC-3’P2中自5’端第5-12位碱基为Not I位点，自5’端第70-75位碱基为HindIII位点，自5’端第47-57位碱基为Zif268的结合位点ZB。
实施例2、报导质粒的壮观霉素敏感性试验将报导质粒pConII-ΔZB转化JM109后，挑取单克隆培养过夜，取过夜培养物稀释后进行铺板试验，结果如表1所示。
表1、不同报导质粒的壮观霉素敏感性实验 质粒 抗生素浓度(μg/ml)组别 Cm40 Sp50Sp80 Sp120 Sp150 Sp200 Sp3001pNN389 + ++ + + + +2pConII-ΔZB+ ++ - - - -3pConII-1 + +- - - - -+grow；- not grow pConII-1positive contra由表1可以看出由于pNN389含有氯霉素抗性基因，壮观霉素抗性基因aadA正常表达，因此JM109(pNN389)在所有抗性平板上都稳定生长(实验2)，与预期一致。报导质粒pConII-ΔZB与阳性对照pConII-1一样(pConII-1的操纵序列为434抑制物的结合位点)，对壮观霉素的敏感性(120μg/ml，80μg/ml)都低于原始质粒pNN389(300μg/ml)，说明在没有转录抑制物即Zif268时，含有ZB作为操纵序列的启动子能够有效启动，反向干扰壮观霉素抗性基因aadA的转录，使得报导质粒表现为不同程度的壮观霉素敏感性，而且pConII-ΔZB具有较宽的筛选“窗口”(120-300μg/ml)。
作为一个报导质粒，还有一个需要考虑的问题就是由于与染色体整合、拷贝数增加、回复突变等导致的“背景噪声”，而表2则进一步表明pConII-ΔZB在壮观霉素为120μg/ml时的“回复”突变频率极低，完全可以用作遗传筛选的报导质粒，为下一步进行胞内的实验打下了基础。
表2、报导质粒pConII-ΔZB的“背景噪声”克隆数目*质粒 Cm40 Sp120pConII-ΔZB1 (25±3.2)×10-6pNN389 1 1pConII-1 1 (13.1±4.2)×10-6*以Cm平板对应的克隆数为1 N＝3实施例3、Zif268的DNA结合区在大肠杆菌中的表达Zif268的DNA结合区域由三个串联的锌指蛋白组成，根据Zif268的序列，合成引物PDN、PDC，两端分别添加EcoR I、BamH I酶切位点，PDC的末尾添加终止密码TGA、TAA。其序列如下PDN5’-AAGGATCCGAACGCCCATATGCTTG-3’，对应于DNA结合区的氨基端PDC5’-ACGGAATTCTTATCAGTCCTTCTGTCTTAAATGG-3’，对应于DNA结合区的羧基端以PDN、PDC为引物，以含有zif268全长cDNA的质粒pBKS-Zif268为模板，53℃退火，72℃延伸得到含有三个锌指的DNA结合区片段D(结果如图3所示)。PCR扩增片段采用Promega公司WizardTMPCR Preps DNA纯化系统进行纯化，纯化后的产物经BamH I、EcoR I酶切以后插入到pGEX-2T的相应位点，连接转化大肠杆菌DH5αMCR，挑取单克隆，进行质粒大小、酶切鉴定及序列测定，得到序列完全正确的表达质粒pGEX-D，检验结果如图4、图5所示)。
挑选单克隆接种5ml LB-Zif培养基，培养过夜，按2％的比例取过夜培养物接种于摇瓶培养2-3小时至OD600＝0.3-0.5，用40μM的IPTG诱导，25-30℃诱导培养3-4hr，结果证实(如图6所示)目的蛋白在大肠杆菌中获得了表达。
实施例4、融合蛋白的纯化离心收集培养菌体，菌体超声破菌，添加Triton X-100至终浓度1％，温和搅拌助溶。离心，保留含有目的蛋白的上清，与准备好的谷胱甘肽Sepharose 4B混合，使目的蛋白与之结合。一部份用含有谷胱甘肽的洗脱液洗脱，得到融合蛋白，另一部份用凝血酶切割，再行洗脱分离，分别得到谷胱甘肽转移酶及锌指DNA结合区，纯化结果表明(如图6所示)利用亲和层析可以得到特异的融合蛋白GST-D，而且融合蛋白在凝血酶的作用下，可在融合位点处特异的被切割，得到游离的目的蛋白D。此外，在超声破菌上清含有明显的融合蛋白，这表明在特定的培养条件下，目的蛋白在胞内呈部份可溶性表达。
实施例5、Zif268 DNA结合区的DNA结合特性取纯化得到的含有Zif268的DNA结合区的融合蛋白GST-D、或单独DNA结合区蛋白，进行DNA结合凝胶迁移迟滞实验，对其体外的结合特性进行分析。结果如图7所示，图中A部分是单独的DNA结合区，B部分是融合蛋白，表明无论是融合蛋白，还是单独的DNA结合区，都保持了与特定靶位点结合的特性，由于整个纯化过程中，并没有对目的蛋白进行复性等步骤，这表明Zif268 DNA结合区在大肠杆菌中得到了功能性表达，并且GST与DNA结合区的融合，没有明显影响锌指蛋白的DNA结合特性。
实施例6、体内遗传筛选模型的建立取pGEX-D(锌指蛋DNA结合区的表达质粒)、pGEX-2T(谷胱苷肽转移酶融合表达载体)分别转化含有报导质粒pConII-ΔZB以及pConII-1、pNN389的大肠杆菌JM109，进行铺板实验，结果如表3所示。
表3、锌指蛋白的体内遗传筛选模型实验 JM109所含不同质粒 转化子数目％组别 AprCmrAprSprAprSpr/AprCmr1无质粒0 0-2pGEX-2T 0 0-3pGEX-D0 0-4pNN3890 0-5pConII-1 0 0-6pConII-ΔZB 0 0-7pNN389+pGEX-2T1/1 1/1 100/1008pNN389+pGEX-D 1/1 1/1 100/1009pConII-1+pGEX-2T 1/1 10-5/10-5010 pConII-1+pGEX-D 1/1 10-5/10-5011 pConII-ΔZB+pGEX-2T 1/1 10-5/10-5012 pConII-ΔZB+pGEX-D1/1 1/10-5100/0N/MIPTG诱导/IPTG不诱导下的克隆数目或百分比，以AprCmr上的转化子数为1由实验1-6发现单独JM109或只含有一种质粒时，在双抗平板AprSpr、AprCmr均不能生长，与预期一致，这表明所选择的宿主、质粒不存在明显的“背景噪声”。
在组别7-11中，JM109同时含有表达、报导两种质粒时，在AprCmr上稳定生长，说明两种质粒的抗性标记良好，且是相容性质粒，可在JM109中稳定共存，而且无论有无IPTG诱导，在两种双抗平板上生长无明显差别，说明GST及其融合蛋白的表达，不会非特异地影响质粒pNN389、pConII-1、pConII-ΔZB的复制、抗性基因的表达等功能。
在实验7-8中，JM109在AprSpr、AprCmr两种双抗平板上生长无差异，而实验9-11中，AprSpr平板上几乎无菌落出现。这是由于pNN389中无反向启动子，壮观霉素抗性基因会组成性表达，因此表现为壮观霉素抗性，而质粒pConII-1、pConII-ΔZB由于含有反向启动子，壮观霉素基因的表达得到抑制，因此在AprSpr平板上只有极少量菌落出现(10-5)，这也同时表明报导质粒pConII-1、pConII-ΔZB的“背景噪声”极低，与实施例2结果相符。
在实验12中，JM109中含有锌指蛋白特异的表达质粒和报导质粒，当没有IPTG诱导时，在AprSpr平板上也只有少量菌落生长，属于pConII-ΔZB的“背景噪声”，但是当有IPTG诱导时，所有AprCmr克隆都会呈现为AprSpr抗性(AprSpr/AprCmr＝100％)。实验1-12共同表明质粒pGEX-D介导的锌指蛋白DNA结合区的表达特异性地与报导质粒pConII-ΔZB上的锌指结合位点结合，阻止反向启动子PconII-ΔZB的组成性启动，使得抗性基因aadA得以在自身启动子的启动下表达，表现为壮观霉素抗性，这也说明至此已经建立了锌指蛋白的体内遗传筛选模型。
实施例7、体内遗传筛选模型的筛选效率评估由于最终目的是利用上述实验，进行突变体的筛选，因此需要确定整个试验的特异性、敏感性。为了考察利用上述试验从巨大文库中筛选稀有克隆的潜力，将质粒pGEX-D用不同量的pGEX-2T稀释，然后进行铺板，探讨能否特异性地将表达锌指蛋白的质粒从一个混合物中筛选出来，结果发现报导质粒可以特异性地从约104-105的混合物中将表达质粒筛选出来，具有充分的灵敏性，已经足够突变文库的筛选之用。对于那些稀有克隆(1/108)，经过多轮筛选(3-4轮)，即可以从一个文库中被筛选出来。
实施例8、锌指1关键位置完全随机化突变文库的建立为较为彻底地探讨识别螺旋中氨基酸—碱基之间的相互作用，同时考虑到可操作文库的大小，在维持识别螺旋中保守性His+7不变的情况下，使+4位的氨基酸为leu或Arg，+9位的氨基酸为Arg或Lys，将-1-+8位其它位置随机化。据此设计引物PMS、PMR，用于锌指1的突变，其序列如下PMS3’ CGC CTA -5’PMR5’- CT/CTKNN (KNN)2AA/CG(KNN)4AGAAAAGCGGCGCTAGCAGGA-3’采用重叠式PCR技术，通过三次PCR反应，对锌指1(ZF1)的关键位置的核苷酸进行突变，其PCR结果如图8所示。由图中可以发现在重叠式PCR中，第二次扩增产物约为240bp，与预期一致，以第一、二次产物为模板的第三次扩增产物D*虽然大小上约280bp，但不是呈现紧密单一条带，推测是因为PCR产物本身具有较大的分子多样性，达到1011，而不同分子之间的电荷性质具有微小的差别，因此在泳动性上表现不均一。
PCR产物回收后，经E.coR I、BamH I酶切，与经同样限制性内切酶处理过的表达载体pGEX-2T连接，连接产物经用0.5×TE重新溶解降低电导以后，选择2.4KV、4kΩ条件电击、转化MC1061。同时电击转化10次，获得了约108-109的转化子，此即初级文库。
回收所有转化子，在含有100μg/ml的1L LB培养基中大量培养过夜，扩增初级文库。收集过夜培养物，进行质粒的大量制备与纯化，得到表达质粒文库pGEX-D*，分成不同等份，-20℃保存备用。
实施例9、识别保守亚位点GCG同功突变体的筛选取含有报导质粒的大肠杆菌JM109(pConII-ΔZB)，制备电转化感受态，然后用制备好的表达质粒文库DNA进行电转化、筛选。
由于报导质粒偶尔会由于拷贝数增加、整合以及点突变等导致表型由壮观霉素敏感改变为壮观霉素抗性即假阳性的出现，使“背景噪声”提高，为排除这一干扰，我们在每一轮筛选以后，都将表现为壮观霉素抗性的克隆重新制备质粒，转化到含有报导质粒的菌株中，进行下一轮的筛选。另外，由于抗性转化子中同时含有表达质粒和报导质粒，在制备DNA重新转化时，有可能会同时将含有的报导质粒转化进同一个大肠杆菌宿主，为克服这一影响，选择报导质粒上特有的限制性内切酶Hind III进行消化，使之变成线形，然后再转化。
经过以上处理以后，如表5所示，随着筛选的进行，抗性克隆所占的比例(AprSpr/Apr比值)明显增高。四轮以后，富集倍数达到104，AprSpr/Apr比值已经接近1，挑取单克隆，进行质粒制备，Hind III消化，转化JM109，再进行质粒制备，序列测定，得到20个克隆，其序列及相关特性如表6、7所示。
表5、突变体的筛选筛选轮数 富集效率(Aprspr/AprCmr)1 10-62 2×10-43 0.024 0.85表6、突变体的序列及特性 fGCG体内结合特异性常数，用不同突变体重新转化含有报导质粒的JM109时阳性克隆所占比例即AprSpr/ApfCmr表7、锌指1中不同位置上氨基酸的偏性位置 氨基酸PePfδ32(Pf-Pe)/δ32-1 R(Arg) 3/32 12/20 0.052 9.73K(Lys) 1/32 6/20 0.031 8.68D(Asp) 1/32 1/20 0.031 0.61Q(Gln) 1/32 1/20 0.031 0.61+2 D(Asp) 1/32 9/20 0.031 13.5C(Cys) 1/32 3/20 0.031 3.84Q(Gln) 1/32 1/20 0.031 0.61+3 D(Asp) 1/32 6/20 0.031 8.68E(Glu) 1/32 5/20 0.031 7.06V(Val) 2/32 6/20 0.043 5.52+4 L(Leu) 3/32 17/20 0.052 14.5R(Arg) 3/32 3/20 0.052 1.08+6 R(Arg) 3/32 15/20 0.052 12.6T(Thr) 2/32 2/20 0.043 1.23K(Lys) 1/32 1/20 0.031 0.61+9 R(Arg) 3/32 14/20 0.052 11.7K(Lys) 1/32 6/20 0.031 8.68Pe在完全随机文库中，预期出现频率；Pf在所有20个克隆中实际出现频率，δ标准方差，[Pe(1-Pe)/n]1/2，n＝32即NNK所代表的32种密码子。
实施例10、识别保守亚位点GCG同功突变体的序列分析由表6、表7中的统计结果可以发现，对于识别GCG亚位点的同功锌指突变体，+4、+9位相对固定，此外，-1、+2、+3、+6四个位置显示出对特定氨基酸的偏爱，具有较大的保守性，由于保守性意味着功能性，说明上述四个位置在DNA识别中具重要作用。
-1位，主要是Arg、Lys两个带正电荷的氨基酸，二者几乎以同样频率出现，但是也出现了带负电荷的Asp以及中性的Gln。在Zif268与保守DNA结合位点形成复合物的晶体结构中[8]，-1位的氨基酸是与5’-GCG-3’中3’的G作用，由于在G∶C碱基配对中，电荷分布不均匀，G呈负电性，因此带正电荷的Arg、Lys与G之间会通过氢健HB相互作用。但是早期的噬菌体显示实验中，-1位的氨基酸或者多为Arg、或者多为Lys(Jamieson AC，et al.In vitro selection of zinc fingers with alteredDNA-binding specificity.Biochemistry.1994 May 17；33(19)5689-5695)，理论上，二者都可以很好地与G作用，出现上述差异的原因可能是噬菌体显示实验中样本数较小，也可能是文库构建方法不同。
与-1位相反，+2位主要是带负电荷的Asp，其次是Cys。正负电荷之间正可以形成盐桥，而且Asp还可以对Arg-1、Lys-1的长的侧链起到支撑作用，稳定整个DNA-蛋白复合物的结构，这与晶体结构中的结果相一致。但是在MT15中，情况刚好相反，是Gln-1His+2，+2位的His带正电荷，很可能在咪唑基与酰胺基之间也可以形成HB。
+3位，主要是Asp、Glu、Val，三者出现频率几乎一致，此外也出现了Leu、Thr、Gin等其它氨基酸，与Barbas CF 3 rd、Klug A(Choo Y，et al. Selection of DNAbinding sites for zinc fingers using rationally randomized DNA reveals codedinteractions.Proc Natl Acad Sci U S A.1994 Nov 8；91(23)11168-11172，WuH，et al.Building zinc fingers by selectiontoward a therapeutic application.Proc Natl Acad Sci U S A.1995 Jan 17；92(2)344-348)等人的结果一致。在晶体结构中，+3位的氨基酸与DNA双螺旋结构最接近，因此该位置上氨基酸可能会受到空间位阻效应的影响，由于在GCG中，中间的C较小，所以既可以接纳较大的氨基酸如Leu、Gln、Glu，也可以接纳较小的氨基酸如Val、Thr、Asp，但是由于C带有正电极性，带负电荷的Asp、Glu在该位置的高频出现，说明+3位的氨基酸在与碱基作用中，可能同时受到化学互补、立体化学互补的双重因素的限制，这是以前的实验所未揭示的。此外，Jamieson AW等利用噬菌体显示实验发现该位置主要是Asp，但是其在文库构建中只是将-1、+2、+3、+6位突变，其它位置固定不变(Jamieson AC，et al.In vitroselection of zinc fingers with altered DNA-binding specificity.Biochemistry.1994May 17；33(19)5689-5695)，而本发明则是将更多位置突变，得到了更为多样的氨基酸分布，满足构建更大文库之必要，而且也表明在锌指蛋白中，的确存在识别螺旋内的氨基酸间的相互作用，这种作用又会间接地影响锌指蛋白的DNA识别。
+4位，显示对Leu的强烈偏爱，+9位，Arg、Lys同等频率出现。+6位主要是Arg，可以与G相互作用，与晶体结构一致。+1、+5位则具有较大的随意性，在DNA识别中可能不具直接作用。
比较而言，在-1、+2、+3、+6四个位置中，-1、+6位的保守性明显强于+2、+3位，而且+6为最严格，在所用15个突变体中，绝大多数为Arg，与WT的一致。结构上，由于-1、+6位分别与GCG的5’、3’端的碱基作用，因此在稳定单一锌指-三联体亚位点识别中起锚定作用，有更重要的地位。早期的噬菌体显示实验指出对于识别任何一个三联体亚位点的单一锌指，实际上只有-1、+3、+6位中的两个位置比较保守(Rebar EJ，et al.Zinc finger phageaffinity selection of fingers with new DNA-bindingspecificities.Science.1994 Feb 4；263(5147)671-673)，而我们的结果却证实上述三个位置都比较固定，且+2位起辅助性作用。我们的结果还说明，在锌指蛋白与DNA作用过程中，有些碱基可同不止一个氨基酸接触如G可以与Arg、His、Gln、Ser、Lys等作用，在氨基酸---碱基之间并不存在一个简单的一一对应关系，也反映出锌指蛋白DNA识别作用中的复杂性。
此外，在电荷性质上，本发明得到的克隆其整个识别螺旋带有强的正电荷，而Jamieson AW等认为主要是电中性的(Jamieson AC，et al.In vitro selection of zincfingers with altered DNA-binding specificity.Biochemistry.1994 May 17；33(19)5689-5695)。由于在DNA大槽中，GC配对中的电极性分布，GCG亚位点总体上带有负电性质，因此带正电荷的识别螺旋深入到大槽中，与带负电的GCG作用，识别作用会更加稳定，也更合理。这又一次说明对更多位置进行突变，是完全必要的。
而且，所有噬菌体显示实验，都未能筛选到野生型的序列，而本发明的实验却两次得到，表明体内筛选模型的确比噬菌体显示更真实地反映了生理条件下的作用过程。利用噬菌体显示进行亲和筛选时，根据的是一种群体作用，最终的结果完全有可能是低特异性、低亲和力却具有高表达优势的个体，相反那些高特异、高亲和力、表达劣势的个体却有可能被淘汰。
权利要求
1.锌指蛋白-DNA相互作用的遗传筛选模型，是含有报导质粒的大肠杆菌，所述报导质粒含有壮观霉素抗性基因aadA，壮观霉素抗性基因aadA的上游含有aadA基因自身启动子PaddA，壮观霉素抗性基因aadA的下游含有方向与启动子PaddA相反，且强度高于PaddA的组成性启动子；在所述组成性启动子的操纵序列中插入锌指蛋白小鼠转录因子Zif268的结合序列。
2.根据权利要求1所述的遗传筛选模型，其特征在于所述报导质粒是单拷贝的。
3.权利要求1所述遗传筛选模型在筛选锌指蛋白突变体中的应用。
全文摘要
本发明公开了锌指蛋白－DNA相互作用的遗传筛选模型及其应用，目的是提供一种建立在大肠杆菌中的，简单、通用的研究锌指蛋白－DNA相互作用的遗传筛选模型。本发明所提供的锌指蛋白－DNA相互作用的遗传筛选模型，是含有报导质粒的大肠杆菌，所述报导质粒含有壮观霉素抗性基因aadA，壮观霉素抗性基因aadA的上游含有aadA基因自身启动子P
文档编号C12N1/21GK1438323SQ0310017
公开日2003年8月27日 申请日期2003年1月8日 优先权日2003年1月8日
发明者赵志虎, 马清钧 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所